Αφηρημένο

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η δεύτερη πιο κοινή μορφή καρκίνου και η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο. Παρά τις πρόσφατες προόδους στην ανάπτυξη στοχευμένων θεραπειών, οι ασθενείς με προχωρημένη νόσο παραμένουν ανίατη, κυρίως επειδή μεταστατικό μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) τελικά να γίνει ανθεκτικό σε αναστολείς της τυροσινικής κινάσης (TKIs). Κινάσης αναστολείς έχουν το δυναμικό για ασυδοσία στόχου, επειδή η σούπερ κινάση της οικογένειας είναι η μεγαλύτερη οικογένεια των γονιδίων druggable που δεσμεύεται σε ένα κοινό υπόστρωμα (ΑΤΡ). Ως αποτέλεσμα, συχνά TKIs αναπτυχθεί για ένα συγκεκριμένο σκοπό έχουν βρεθεί να δρουν σε άλλους στόχους. χρωματογραφία συγγένειας φάρμακο έχει χρησιμοποιηθεί για να δείξει ότι το dasatinib αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα ΤΟΡβ τύπου Ι (TβR-Ι), μία κινάση σερίνης-θρεονίνης. Για τον προσδιορισμό του δυναμικού βιολογική σημασία αυτής της σύνδεσης, μελετήσαμε τις συνδυασμένες επιδράσεις του dasatinib και TGFβ σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα. Βρήκαμε ότι η θεραπεία με dasatinib μόνο είχε πολύ μικρή επίδραση? Ωστόσο, όταν κυτταρικές γραμμές NSCLC υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ένα συνδυασμό των ΤΟΡβ και dasatinib, η απόπτωση που επάγεται. Συνδυασμένη θεραπεία ΤΟΡβ-1 + dasatinib δεν είχε καμία επίδραση στη δραστηριότητα της Smad2 ή άλλων μη κανονικών ΤΟΡβ ενδοκυτταρική μεσολαβητές. Είναι ενδιαφέρον ότι, σε συνδυασμό ΤΟΡβ και θεραπεία dasatinib είχε ως αποτέλεσμα μια παροδική αύξηση της ρ-Smad3 (φαίνεται μετά από 3 ώρες). Επιπλέον, όταν τα κύτταρα NSCLC υποβλήθηκαν σε θεραπεία με το συνδυασμό αυτό, η προ-αποπτωτική πρωτεΐνη ΒΙΜ ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω. Knockdown της έκφρασης Smad3 χρησιμοποιώντας Smad3 siRNA οδήγησε επίσης σε μείωση της ΒΙΜ πρωτεΐνη, υποδηλώνοντας ότι ΤΟΡβ-1 + dasatinib-επαγόμενη απόπτωση διαμεσολαβείται από ρύθμιση Smad3 του BIM. Dasatinib είναι αποτελεσματική μόνο στη θανάτωση μεταλλαγμένα κύτταρα EGFR, η οποία φαίνεται μόνο το 10% των NSCLCs. Ως εκ τούτου, η παρατήρηση ότι η άγριου τύπου καρκίνους του πνεύμονα EGFR μπορεί να χειραγωγηθεί ώστε να καταστούν ευαίσθητες στη θανάτωση από το dasatinib θα μπορούσαν να έχουν σημαντικές συνέπειες για την επινόηση καινοτόμων και δυνητικά πιο αποτελεσματική στρατηγικές θεραπείας για την ασθένεια αυτή

Παράθεση:. Γόρδιο Ε, Li J, Pevzner Υ, Mediavilla-Varela Μ, Luddy Κ, Ohaegbulam Κ, et al. (2014) Το dasatinib Αντίσταση Transforming Growth Factor β Σηματοδοσίας Προσπερνάει στον καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 9 (12): e114131. doi: 10.1371 /journal.pone.0114131

Επιμέλεια: Arun Ρίσι, Πολιτειακό Πανεπιστήμιο Wayne, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 27, Μάρτη, 2014? Αποδεκτές: 3 Οκτώβρη του 2014? Δημοσιεύθηκε: 11η Δεκεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 γόρδιο et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας SPORE Grant P50 CA119997-02-S2. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η δεύτερη πιο κοινή μορφή καρκίνου και αντιπροσωπεύει περίπου το 15% όλων των διαγνώσεων καρκίνου. Παρά τις πρόσφατες προόδους στην ανάπτυξη στοχευμένων θεραπειών, οι ασθενείς με προχωρημένη νόσο παραμένουν ανίατη. Λόγω της γενετικής ποικιλότητας εντός των όγκων, κύτταρα με ενεργό εναλλακτικές οδούς ανάπτυξης τελικά προκύψει? κατανόηση έτσι τους μηχανισμούς με τους οποίους οι διάφορες οδοί ανάβουν και να σβήνουν, είναι σημαντικό για την επινόηση νέων στοχευμένων θεραπειών. Παρά το γεγονός ότι ορισμένοι καρκίνοι είναι αρχικά πολύ ευαίσθητα σε τυροσίνης αναστολείς κινάσης (TKIs), η αντίσταση εξελίσσεται τελικά. Για παράδειγμα, η πλειοψηφία των μεταστατικό μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) ασθενείς με μεταλλάξεις του EGFR που ενεργοποιεί ανταποκρίνονται στη θεραπεία με erlotinib? Ωστόσο, όλοι οι ασθενείς τελικά πρόοδο. Συνεπώς, εναλλακτικές θεραπείες χρειάζονται επειγόντως για ασθενείς με μεταλλάξεις του EGFR που ανταποκρίνονται αρχικά σε θεραπείες EGFR TKIs αλλά τελικά αναπτύσσουν αντοχή, καθώς και για τους ασθενείς που εμφανίζουν το γονότυπο EGFR φυσικού τύπου [1]. Αυτή η αντίσταση θα μπορούσε να είναι εν μέρει λόγω της πολυπλοκότητας που χαρακτηρίζει την σηματοδότηση αυτών των τύπων των πρωτεϊνών καθώς και την ετερογένεια του πνεύμονα αδενοκαρκινώματα [2]. Dasatinib, ένα ΤΚΙ με πολλαπλούς στόχους κινάση, αυτή τη στιγμή δοκιμάζεται για τη θεραπεία διαφόρων κακοηθειών, όπου υπερεκφράζονται οι στόχοι αυτοί, συμπεριλαμβανομένης της χρόνιας μυελογενούς λευχαιμίας και του μαστού και του καρκίνου του πνεύμονα [3], [4], [5]. Κλινικές μελέτες έχουν δοκιμαστεί η αποτελεσματικότητα του dasatinib σε NSCLC ως μοναδικός παράγοντας [6], σε συνδυασμό με τις σήμερα χρησιμοποιούμενες αγωγές χημειοθεραπείας όπως αναστολέα erlotinib υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) [7], και σε ασθενείς που έχουν αναπτύξει αντίσταση σε erlotinib και gefitinib [8]. Song

κ.ά.

απέδειξαν ότι dasatinib επάγει απόπτωση σε έναν αριθμό κυττάρων NSCLC που εμφανίζουν ένα μεταλλαγμένο φαινότυπο EGFR? Ωστόσο, αυτή η επίδραση δεν παρατηρήθηκε σε κυτταρικές σειρές NSCLC με φαινότυπο EGFR φυσικού τύπου [9].

Ο αυξητικός παράγοντας εξαλλαγής β (ΤΟΡβ) είναι μια κυτοκίνη που εμπλέκονται σε πολυάριθμες κυτταρικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων ανάπτυξη, πολλαπλασιασμό, προσκόλληση , τη μετανάστευση και την απόπτωση. Επιπλέον, η απώλεια της ανταπόκρισης προς ΤGFβ-1 έχει συσχετισθεί με ογκογονικότητα σε πολλούς διαφορετικούς τύπους καρκίνου [10]. ΤΟΡβ μεταγωγής σήματος αρχίζει με δέσμευση συνδέτη με τον τύπο II υποδοχέα ΤΟΡβ (TβR-ΙΙ) που ακολουθείται από την πρόσληψη του υποδοχέα τύπου Ι (TβR-I) και σχηματισμό ενός ετερο-ολιγομερικό σύμπλεγμα των ΤΟΡβ-1, TβR-ΙΙ, και TβR -I [11]. Μετά το σχηματισμό συμπλόκου, η συστατικώς αυτοφωσφορυλιωμένης TβR-ΙΙ φωσφορυλιώνει TβR-I, έναρξη καταρράκτη φωσφορυλίωσης του κατάντη κυτταροπλασματικής υποστρωμάτων, συμπεριλαμβανομένων των πρωτεϊνών Smad, με επακόλουθη ενεργοποίηση των γονιδίων στόχων [10]. Ο σταυρός ομιλία μεταξύ της οδού ΤΟΡβ και πολλές άλλες οδούς μεταγωγής σήματος οδηγεί σε τροποποίηση του αρχικού σήματος ΤΟΡβ μέσω μη κανονικών μονοπατιών και χρησιμοποιείται για να εξηγήσει τις πολλαπλές επιδράσεις του ΤΟΓβ [12], [13], [14]. Σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα, ΤΟΡβ αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και επάγει την απόπτωση, λειτουργώντας έτσι ως καταστολέας όγκου? Ωστόσο, σε πολλούς τύπους καρκίνου, ΤΟΡβ δρα ως προαγωγός όγκων (κυτταρική εισβολή, μετάσταση, ανοσορύθμιση, και τροποποίηση μικροπεριβάλλον) [15].

πειράματα χρωματογραφίας συγγένειας Drug αποκάλυψε ότι dasatinib, που αρχικά αναπτύχθηκε ως αναστολέας SRC [16], αλληλεπιδρά με πάνω από 40 κινάσες, συμπεριλαμβανομένων των κινασών τυροσίνης, κινάσες τυροσίνης υποδοχέα, κινάσες σερίνης /θρεονίνης, και ΜΑΡ κινασών. Μία από τις κινάσες σερίνης /θρεονίνης που αναγνωρίστηκε χρησιμοποιώντας αυτή την προσέγγιση ήταν ο τύπος Ι υποδοχέα ΤΟΡβ (TβR-I) [17]. Προκειμένου να προσδιοριστεί η πιθανή βιολογική σημασία αυτής της σύνδεσης, μελετήσαμε τις συνδυασμένες επιδράσεις του dasatinib και TGFβ σε NSCLC κυτταρικές σειρές. Βρήκαμε ότι η θεραπεία με dasatinib μόνο είχε πολύ μικρή επίδραση? Ωστόσο, όταν κυτταρικές γραμμές NSCLC υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ένα συνδυασμό των ΤΟΡβ και dasatinib, η απόπτωση που επάγεται. Dasatinib είναι μόνο αποτελεσματικό στη δολοφονία μεταλλαγμένα κύτταρα EGFR [9], η οποία αντιπροσωπεύει το 10% των NSCLCs? Ως εκ τούτου, η παρατήρηση που μπορεί να χειραγωγηθεί καρκίνων του πνεύμονα να καταστούν ευαίσθητα στην θανάτωση από το dasatinib θα μπορούσαν να έχουν σημαντικές συνέπειες για την επινόηση καινοτόμων και δυνητικά πιο αποτελεσματική στρατηγικές θεραπείας για την ασθένεια αυτή.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρική καλλιέργεια

το αδενοκαρκίνωμα ανθρώπινου πνεύμονα NCI Η292 και κυτταρικές γραμμές Α549 λήφθηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA) και καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI-1640 (Thermo Scientific, Waltham, ΜΑ) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (Atlanta Biologicals, Inc, Lawrenceville, GA), 100 U /mL πενικιλλίνη, 100 μg /mL στρεπτομυκίνη, και 1 mM γλουταμίνη. Οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε υγρό επωαστήρα στους 37 ° C και 5% CO

2.

Αντισώματα και ενώσεις

Πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-Shc1 ελήφθη από Thermo Scientific Pierce (Rockford , IL), και πολυκλωνικό αντι-MADH7 () αντίσωμα Smad7 αγοράστηκε από Abcam Inc. (Cambridge, ΜΑ). Anti-HDAC2 αγοράστηκε από την Millipore (Billerica, ΜΑ). Τα ακόλουθα αντισώματα τα προμηθευτήκαμε από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ): αντι-pSma2 (συνδέτης και ειδική φωσφορυλίωση COOH), αντι-Smad2, αντι-pSmad3, αντι-Smad3, αντι-ρΑΚΤ, αντι-pERK, αντι-BIM, αντι-PARP, και αντι-GAPDH. Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη πρωτεΐνη ΤΟΡβ-1 αγοράστηκε από την R &? D Systems (Minneapolis, ΜΝ) και επανασυστάθηκε σε 4 mM HCL και διάλυμα ορού βοοειδών λευκωματίνη 1 mg /mL. Το dasatinib και erlotinib ελήφθησαν από ChemieTek (Indianapolis, ΙΝ) και αραιώνεται σε DMSO. LY-364947 ήταν αγορά από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ). AZD0530 λήφθηκε από την AstraZeneca (London, UK)

μελέτες σύνδεσης TβR-Ι

Η κρυσταλλική δομή του TβR-1 σε συνδυασμό με το πεπτίδιο FKBP12 και dorsomorphin (ΠΣΠ ID: 3H9R). Χρησιμοποιήθηκε για την έναρξη συντεταγμένες [18]. Όλα τα άτομα που δεν ανήκουν στην πρωτεΐνη χειροκίνητα διαγράφονται χρησιμοποιώντας Maestro [19] το περιβάλλον μοριακής μοντελοποίησης Schrodinger του. Η πρωτεΐνη παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο παρασκεύασμα πρωτεΐνης Schrodinger [20]. Το αρχικό στάδιο της παρασκευής πρωτεΐνης περιλαμβάνονται προσθήκη της εκχώρησης άτομα υδρογόνου της κατάλληλης παραγγελιών δεσμού με όλων των ατόμων, που ακολουθείται από δημιουργία δισουλφιδικών δεσμών, την προσθήκη πλευρικών αλυσίδων που λείπουν χρησιμοποιώντας Prime [21] λογισμικό, και τη διαγραφή όλων των μορίων του νερού. Μετά την αρχική προετοιμασία, η δομή της πρωτεΐνης βελτιστοποιήθηκε ώστε να αντικατοπτρίζει ένα ρΗ 7,0 χρησιμοποιώντας PROPKA [22], [23] το λογισμικό που ακολουθείται από ελαχιστοποίηση του συνόλου της δομής μέχρι βαρέα άτομα συγκλίνει προς ρίζα-μέση τετραγωνική απόκλιση 0.30 Å.

Με τη χρήση του Desmond [24], [25] το λογισμικό, το παρασκευασμένο δομή πρωτεΐνης διαλυμένες σε ένα λουτρό που περιέχει TIP3P [26] τα μόρια του νερού και ιόντων χλωρίου σε ένα κυβικό κιβώτιο, έτσι ώστε να υπάρχει ένα ρυθμιστικό διάλυμα διαλύτη του 10 Α μεταξύ της επιφάνειας πρωτεΐνης και την άκρη του πλαισίου διαλύτη. Μια προσομοίωση μοριακή δυναμική Εν συνεχεία πραγματοποιήθηκε στο σύστημα. Χρησιμοποιώντας ένα είναι προεπιλεγμένη χαλάρωση και το πρωτόκολλο θέρμανσης Desmond, που θερμαίνεται το σύστημα σε 310 K και εξισορροπείται για ένα σύνολο χημικών χρόνου 10 ns χρησιμοποιώντας σταθερή πίεση και θερμοκρασία σύνολο. Interatomic κουλουμπική αλληλεπιδράσεις υπολογίστηκαν για ζευγάρια άτομο που χωρίζονται από έως και 13 Α, ενώ η λεία των σωματιδίων ματιών Ewald χρησιμοποιήθηκε για να αντιπροσωπεύουν τις αλληλεπιδράσεις πέρα ​​από το cutoff. Τροχιά ανάλυση έδειξε ότι το σύστημα έφθασε ισορροπία σε περίπου 4,5 ns χημικών χρόνο. Εννέα στιγμιότυπα του συστήματος που αντιστοιχούν σε 4.613 ns, 6.005 ns, 6.394 ns, 7.123 ns, 7.550 ns, 8.050 ns, 8.789 ns, 9.538 ns, και 10,00 ns επιλέχθηκαν τυχαία. Χρησιμοποιώντας μέση σενάριο δομή Maestro, το στιγμιότυπο που αντιπροσωπεύει το σύστημα σε 7.123 ns επιλέχθηκε ως εκπρόσωπος δομή και χρησιμοποιούνται στις μεταγενέστερες μελέτες σύνδεσης.

Οι συνδετήρες bosutinib, το dasatinib, dorsomorphin και LY-364947 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με LigPrep [27]. Η επεξεργασία εξασφαλίσει την κατάλληλη παραγγελίες δεσμό και, χρησιμοποιώντας το Epik [28], [29] ενότητα, που παράγονται όλα τα πιθανά ταυτομερή των συνδετήρων να αντικατοπτρίζουν ένα ρΗ στην περιοχή από 5,0 έως 9,0. SiteMap [30], [31] λογισμικό χρησιμοποιήθηκε για να διερευνήσει την επιφάνεια του TβR-1 για πιθανή θύλακες σύνδεσης. Εντοπίστηκαν συνολικά πέντε τσέπες δεσμευτικών? αυτά κατατάσσονται με βάση τα χαρακτηριστικά που περιλαμβάνονται υδροφοβικότητα, την έκθεση του διαλύτη, και δυνατότητα δημιουργίας δεσμών υδρογόνου. Αρχικές Glide [32], [33] SP (πρότυπο ακρίβεια) που ακολουθείται από XP (επιπλέον ακρίβεια) σύνδεσης των τεσσάρων ενώσεων διεξήχθη στις θέσεις δέσμευσης κορυφή 3. Με βάση αυτή την αρχική docking, Τόπος 1 επιλέχθηκε ως περιοχή πιο πιθανό δεσμευτική. Θέση 1, η οποία συσχετίζεται με την τσέπη όπου περιγράφεται dorsomorphin, επίσης κατετάγη υψηλότερο από SiteMap.

Μεταγενέστερες μελέτες σύνδεσης διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας Induced Fit σύνδεσης (IFD) [32], [34] ροή εργασίας σε Maestro. λογαριασμοί ροής εργασίας IFD για την ευελιξία υποδοχέα με δειγματοληψία προσανατολισμούς των αλυσίδων θέση εντός της περιοχής δεσμεύει σύνδεσης του συνδετήρα. Πολλαπλές συνδέτη διαμορφώσεις ελλιμενίστηκε με τέτοιο τρόπο και σκόραρε χρησιμοποιώντας Glide. Κάθε συνδέτη ήταν αγκυροβολημένο στην ιστοσελίδα 1 ορίζεται από τους καλύτερους βαθμολόγησης του συνδέτη που θέτουν από την αρχική σύνδεσης SP στην ιστοσελίδα 1. Για κάθε συνδέτη IFD σημείωσε και αναφέρθηκε πολλαπλές (-50) πρωτεΐνης-συνδετήρα διαμορφώσεων από τις οποίες υπολογίστηκε ο μέσος όρος IFD.

πολλαπλασιασμός Cytotoxiticy

κύτταρα /Α549 σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων σε 5 × 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο εις τριπλούν. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις ΤΟΡβ-1, dasatinib, ή TGFβ + dasatinib συνδυάζονται. Μετά από 48ωρη επώαση, ο πολλαπλασιασμός /κυτταροτοξικότητα μετρήθηκε με προσθήκη CellTiter 96 One Solution (Promega Corporation, Madison, WI). Μετά την προσθήκη, τα κύτταρα αφέθηκαν να επωαστούν για 1 ώρα, και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 490 nm σε αναγνώστη μικροπλάκας Biotek EL808 (BioTek Instruments Inc, Winooski, VT). Επεξεργασμένα δείγματα ομαλοποιήθηκαν σε χωρίς θεραπεία ελέγχους, με αποτελέσματα παρουσιάζονται ως ποσοστά.

κηλίδωση Western

εκχύλιση πρωτεΐνη ολόκληρου κυττάρου διεξήχθη με διάλυση των κυττάρων σε ψυχρό αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό 1Χ (PBS), που ακολουθείται από κατεργασία με υπερήχους και λύση σε 1Χ ρυθμιστικό CHAPS (Cell Signaling Technology). Για να προσδιοριστεί η υποκυτταρική εντόπιση των πρωτεϊνών Smads, τα κύτταρα κλασματοποιήθηκαν σε πυρηνικά και κυτταροπλασματικά συστατικά όπως περιγράφηκε προηγουμένως [35]. Οι πρωτεϊνικές συγκεντρώσεις προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας την δοκιμασία Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA). προϊόντα λύσης πρωτεΐνης αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση δωδεκύλ θειικού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE), μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη φθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Millipore Corporation, Billerica, ΜΑ), μπλοκαρίστηκαν για 1 ώρα σε 1 χ TBST που περιείχε 5% άπαχο γάλα, και επωάστηκαν όλη τη νύκτα σε αντίστοιχες πρωτογενές αντίσωμα στους 4 ° C. Οι κηλίδες τελείωσε με επώαση με το χρένο δευτερεύον αντίσωμα σημασμένο με υπεροξειδάση και αναπτύχθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Amersham ECL πρωθυπουργός Western Blotting ανίχνευσης (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburg, ΡΑ).

δοκιμασίας κασπάσης

κύτταρα Α549 ήταν σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων σε 5 × 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις ΤΟΡβ-1, dasatinib, ή TGFβ + dasatinib συνδυάστηκαν, and Cell Player 96 φρεατίων κινητική αντιδραστήριο κασπάσης 3/7 προστέθηκε ταυτοχρόνως (Essen Bioscience). Θεραπείες έγιναν εις τριπλούν. Η επώαση έγινε σε υγρό επωαστήρα στους 37 ° C και 5% CO

2 με το σύστημα IncuCyte ζωντανή απεικόνιση κυττάρων (Essen Bioscience), που μας επέτρεψε να συλλάβει μια εικόνα από κάθε φρεάτιο μέσω ενός × 20 αντικειμενική και φίλτρο GFP κύβος σε χρονικά διαστήματα 2 ωρών επί 48 ώρες. Η πρώτη και η τελευταία εικόνα της κάθε σειράς εικόνα εξήχθησαν για ανάλυση με Definiens Developer έκδοση 1.5 (Definiens Inc., Μόναχο, Γερμανία), και κασπάσης 3/7-θετικά κύτταρα εντοπίστηκαν και κατά διαστήματα με έναν αλγόριθμο autothreshold κατάτμησης. Η κατάτμηση αυτή βελτιώθηκε περαιτέρω από το μέγεθος αντικειμένου, και, τέλος, ο αριθμός των κασπάσης 3/7 κύτταρα απαριθμούνται. Οι τιμές παρουσιάζονται ως ο μέσος αριθμός των κασπάσης 3/7-θετικά κύτταρα από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Α549 κύτταρα σπάρθηκαν σε 3 χ 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες καλλιέργειας 6 φρεατίων. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 ng /mL ΤΟΡβ-1, 100 ηΜ dasatinib, ή φορέα (DMSO). Μετά την επεξεργασία, τα επιπλέοντα κύτταρα συλλέχθηκαν και αργότερα σε συνδυασμό με κύτταρα προσκολλημένα συλλέχθηκαν με τρυψινοποίηση. Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 1Χ PBS, σταθεροποιήθηκαν σε 2 mL παγωμένου 70% αιθανόλη, και επωάστηκαν για 2 ώρες στους -20 ° C. Οι σβώλοι κυττάρων συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση (5000 rpm για 5 λεπτά) και επαναιωρείται σε 400 μί ιωδιούχου προπιδίου (0,6 mM), Triton Χ-100 (0,1% ν /ν), και RNAse Α (0.2 mg /mL). Μετά από επώαση 30 λεπτών στους 37 ° C, τα κύτταρα αναλύθηκαν ως προς την περιεκτικότητα του DNA χρησιμοποιώντας FACS Calibur (BD Bioscience, San Jose, CA) και τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό ModFit LT V3.3.11 (Verity Software House, Topsham, ME).

πειράματα siRNA

ΓΙΑ TARGETplus SMART πισίνα siRNA εναντίον

Shc1

,

Smad3

και αρνητικού ελέγχου αγοράστηκαν από Dharmacon (Thermo Scientific) . Κάθε δεξαμενή ανασυστάθηκε σε ρυθμιστικό 1Χ siRNA (Dharmacon) και αραιώνεται σε νερό επεξεργασμένο με DEPC σε μια τελική συγκέντρωση 20 μΜ. Παροδικές επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen, Grand Island, ΝΥ). Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και επιμολύνθηκαν μετά 24 ώρες σε 60-70% συρροή. Η λιποφεκταμίνη RNAiMAX, OptiMEM (Invitrogen), και 200 ​​pmol του μίγματος siRNA επωάστηκαν για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και προστέθηκαν στα κύτταρα επωάστηκαν σε μέσα ελεύθερα ορού. Μετά από επώαση στους 37 ° C για 4 ώρες, το μέσο απομακρύνθηκε. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν μία φορά σε 1Χ PBS, και η ένωση που περιέχει μέσα προστέθηκαν στα κύτταρα. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση για την παρασκευή εκχύλιση πρωτεϊνών.

Αποτελέσματα

μελέτες σύνδεσης TβR-I

Πειράματα χρησιμοποιώντας χρωματογραφία συγγένειας φαρμάκου για την ταυτοποίηση μορίων που αλληλεπιδρούν άμεσα με dasatinib έχουν εντοπίσει πάνω από 40 κινάσες, συμπεριλαμβανομένων των κινασών τυροσίνης, κινάσες τυροσίνης υποδοχέα, κινάσες σερίνης /θρεονίνης, και ΜΑΡ κινασών. Μία από τις κινάσες σερίνης /θρεονίνης που προσδιορίζονται χρησιμοποιώντας αυτή την προσέγγιση είναι TβR-Ι [17]. TβR-Ι έχει πλούσιες σε κυστεΐνη Ν-τερματικό τομέα εμπλέκονται στη σύνδεση συμπλοκοποιητού, μία διαμεμβρανική έλικα, μία ρυθμιστική περιοχή κυτταροπλασματική παραμεμβρανική, και ένα Ο-τερματικό τομέα σερίνης θρεονίνης κινάσης [36]. Για να εξεταστεί η σύνδεση του dasatinib σε TβR-I, πραγματοποιήσαμε μελέτες σύνδεσης χρησιμοποιώντας την προηγουμένως αναφερόμενη κρυσταλλική δομή της κυτταροπλασματικής περιοχής TβR-Ι [18]. Όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι, στη θέση που ορίζεται ως θέση 1 επελέγη ως θέση πιο πιθανό δεσμευτική. Στις μελέτες μας, σε σύγκριση με την σύνδεση του dasatinib, bosutinib (δομικά σχετίζονται με dasatinib), LY-364947 (TβR-Ι κινάσης εμπορικά διαθέσιμος αναστολέας [37]), και dorsomorphin (χρησιμοποιήθηκε αρχικά στις μελέτες κρυστάλλωσης TβR-Ι). Κάθε συνδέτη ήταν αγκυροβολημένο στην ιστοσελίδα 1 ορίζεται από τους καλύτερους βαθμολόγησης του συνδέτη που θέτουν από το αρχικό πρότυπο σύνδεσης ακρίβειας στην ιστοσελίδα 1. Για κάθε σύνδεσμο, Induced Fit σύνδεσης (IFD) ήταν σκόραρε, με πολλαπλές (-50) πρωτεΐνης-συνδετήρα διαμορφώσεις που αναφέρθηκαν από την οποία ο μέσος όρος IFD υπολογίστηκε (Εικ. 1Γ). αποτελέσματα docking μας από τις τέσσερις συνδετήρες ενδιαφέρον έδειξαν ότι το dasatinib σημείωσε το υψηλότερο. πρωτόκολλο IFD ανέφεραν ότι TβR-I -dasatinib σχηματίζεται το καλύτερο συγκρότημα βαθμολογίας (σκορ IFD περίπου -14.742 kcal /mol), καθώς και απέδωσε καλύτερα κατά μέσο όρο (βαθμολογία IFD περίπου -14.694 kcal /mol) επί όλων των αναφερόμενων συγκροτήματα. Το καλύτερο TβR-Ι-dorsomorphin συγκρότημα είχε βαθμολογία IFD περίπου -14.519 kcal /mol με το μέσο όρο των -14.469 kcal /mol. Bosutinib και LY-364947 πραγματοποιήθηκε η φτωχότερη, με την καλύτερη σύμπλοκα πρωτεΐνης-συνδετήρα σκοράροντας σε περίπου -14 353 kcal /mol και -14.154 kcal /mol, αντίστοιχα, και κατά μέσο όρο -14 313 kcal /mol και -14.119 kcal /mol. Ανάλυση της θέτουν παράγεται από το εύκαμπτο μοντέλο σύνδεσης κορυφή αποκαλύπτει ότι η αλληλεπίδραση bosutinib με τη θέση σύνδεσης περιλαμβάνει τέσσερις δεσμούς υδρογόνου με τα υπολείμματα Pro-439, Thr-378, Asn-341 και Tyr-219 σε αποστάσεις 2,4, 2,18, 2,37 και 2,25 Α και με τις αντίστοιχες γωνίες 120,7, 144,8, 154,1 και 151,6 μοιρών (Σχ. 1Α). Αντίθετα, το dasatinib σχηματίζει τρεις δεσμούς υδρογόνου με Arg-218, Αδη-341 και His-284 σε αποστάσεις 1,97, 2,00 και 2,32 Α και γωνίες 145,9, 150,3 και 139,7 βαθμούς (Εικ. 1Β).

ρίζας διάγραμμα αλληλεπίδρασης (Α) bosutinib και (Β) dasatinib ελλιμενίζεται σε TβR-1. Συνδέτη εκπροσωπείται σε μαύρο χρώμα. Οι δεσμοί υδρογόνου έχουν επισημανθεί από τους αριθμούς δίπλα στο δεσμό. Οι αποστάσεις και τις γωνίες του κάθε δεσμού υδρογόνου, όπως επισημαίνονται στο διάγραμμα δίνονται στους πίνακες μέσα σε κάθε σχήμα. (C) Τόπος 1 αποτελέσματα IFD. Μέσος όρος (μαύρο) και καλύτερο (λευκό) IFD βαθμολογίες των τεσσάρων ενώσεων αγκυροβολημένο στο site 1 βασίζεται σε -50 αναφερθεί πόζες για κάθε ένωση. IFDScore πολλαπλασιάζεται με -1 για τη σαφήνεια της παρουσίασης.

Η

Το dasatinib επηρεάζει την απάντηση στο TGFβ-1 σε κυτταρικές σειρές NSCLC

Για τον προσδιορισμό του δυναμικού βιολογική σημασία της σχέσης μεταξύ dasatinib και TβR-Ι, Α549 καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα αναπτύχθηκαν σε πλήρες μέσο που περιέχει ΤΟΡβ-1 επωάστηκαν με την παρουσία ή απουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων του dasatinib όπως περιγράφηκε πριν από [9]. Ενιαία θεραπεία με πολλαπλασιασμό ΤGFβ-1 ή dasatinib ανέστειλε κύτταρο (45% και 34%, αντίστοιχα? Σχ. 2Α, αστερίσκοι). Είναι ενδιαφέρον, αυτή η αναστολή του πολλαπλασιασμού αυξήθηκε όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα συνδυασμό ΤGFβ-1 και dasatinib (75% αναστολή? Σχ. 2Α, διπλό αστερίσκοι). Η αύξηση στην αναστολή του πολλαπλασιασμού ήταν εξαρτώμενη από τη δόση dasatinib. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν όταν η βιωσιμότητα των κυττάρων χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί αριθμός κυττάρων (S1 Σχήμα). Για να κατανοηθεί περαιτέρω ο παρατηρούμενη αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, εξετάσαμε την επίδραση της συνδυασμένης αυτής θεραπείας στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Μετά από 48 ώρες επεξεργασίας με ΤGFβ-1 και dasatinib, η αύξηση των κυττάρων σε G1 δεν ήταν σημαντικά διαφορετική από όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΤΟΡβ-1 μόνη της (σχ. 2Β, συνεχής γραμμή). Ομοίως, με το διπλό θεραπεία, υπήρξε αύξηση στον αριθμό των κυττάρων σε G2 /M μετά ΤΟΡβ-1 θεραπεία, αλλά η αύξηση στα κύτταρα δεν ήταν διαφορετικό από όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία μόνο με dasatinib (Εικ. 2Β, διακεκομμένη γραμμή) . Ως εκ τούτου, η μείωση του αριθμού των κυττάρων μετά την θεραπεία συνδυασμού ΤΟΡβ-dasatinib δεν μπορεί να εξηγηθεί από τις αλλαγές στη κυτταρικού κύκλου.

(Α) κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO, διάφορες συγκεντρώσεις ΤΟΡβ-1 (0-10 ng /mL? λευκές ράβδοι), διαφορετικές συγκεντρώσεις του dasatinib (0-400 ηΜ? μαύρες μπάρες), ή ένας συνδυασμός των ΤΟΡβ-1 και dasatinib (διακεκομμένη bars) για 48 ώρες. Η επεξεργασία των κυττάρων με δύο παράγοντες οδήγησε σε αύξηση αναστολή (**), σε σύγκριση με όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με τον κάθε παράγοντα ξεχωριστά (*). (Β) κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO, 5 ng /mL ΤΟΡβ-1, 100 ηΜ dasatinib, ή ένας συνδυασμός των 5 ng /mL ΤΟΡβ-1 και 100 ηΜ dasatinib για 48 ώρες. Μετά από 48 ώρες, ιωδιούχο προπίδιο βαμμένα κύτταρα αναλύθηκαν για να προσδιοριστεί κατανομή κύκλου κυττάρου και αναλύθηκαν όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι.

Η

Αυξημένη απόπτωση σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με ΤΟΡβ σε συνδυασμό με dasatinib

ΤΟΡβ έχει ενοχοποιηθεί στην προ-αποπτωτικά αποκρίσεις, καθώς και αντι-αποπτωτική αποκρίσεις [38]? Ως εκ τούτου, εξετάσαμε εάν η αναστολή του πολλαπλασιασμού παρατηρήθηκε μετά από συνδυασμένη ΤΟΡβ + dasatinib σε κύτταρα Α549 ήταν το αποτέλεσμα αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Η απόπτωση μετρήθηκε με πολυ (ΑϋΡ-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) διάσπαση μετά τη θεραπεία με το συνδυασμό ΤΟΡβ-dasatinib. Dasatinib ή ΤGFβ-1 μόνο του δεν διεγείρει απόπτωση όπως μετράται με διάσπαση PARP (Σχ. 3Α). Αυτό είναι σε συμφωνία με αυτό που έχει αναφερθεί στο παρελθόν, όπου η θεραπεία των κυττάρων Α549 με dasatinib δεν οδήγησε σε απόπτωση [4]. Σε αντίθεση, ο συνδυασμός του ΤΟΡβ + dasatinib είχε ως αποτέλεσμα απόπτωση, ειδικά για συν-θεραπεία με dasatinib, όπως επώαση με έναν αναστολέα EGFR (erlotinib) ή άλλου αναστολέα SRC (AZD0530) δεν οδήγησε σε διάσπαση PARP (Εικ. 3Α). Για να αξιολογηθεί το κατά πόσον απαιτείται

de novo

σύνθεση πρωτεΐνης για τον ΤΟΡβ + dasatinib απόπτωση, κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε προ-αγωγή με 10 μg /mL κυκλοεξιμιδίου για 1 ώρα, που ακολουθείται από ΤΟΡβ-1 θεραπεία με ή χωρίς dasatinib. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Β, η προσθήκη κυκλοεξιμιδίου δεν ανέστειλε την αύξηση στην απόπτωση, υποδηλώνοντας ότι

de novo πρωτεϊνική σύνθεση

δεν απαιτείται. Εξετάσαμε την επίδραση της θεραπείας συνδυασμού σε 15 κυτταρικές γραμμές NSCLC (13 EGFR WT και 2 EGFR MU) και βρέθηκε αυξημένη διάσπαση PARP σε 5 από αυτά όταν υποβάλλονται σε επεξεργασία με το συνδυασμό ΤΟΡβ + θεραπεία dasatinib (S2 Σχήμα).

(Α) κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 ηΜ του dasatinib, 1000 ηΜ AZD0530, ή erlotinib με ή χωρίς 5 ng /mL ΤΟΡβ-1 για 48 ώρες. (Β) Α549 κύτταρα προ-επεξεργασία με 10 μg /mL κυκλοεξιμιδίου (CHX) για 1 ώρα, που ακολουθείται από ΤΟΡβ-1 συν ή μείον dasatinib. Μετά την επώαση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, λύθηκαν, και η διάσπαση PARP ανιχνεύεται με ανάλυση Western Blot. (Γ) Κύτταρα Α549 εμβολιάστηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε 5 × 10

3 ανά φρεάτιο.

C

ells υποβλήθηκαν σε θεραπεία, και τηλέφωνο Player 96-Καλά Κινητική κασπάσης 3/7 αντιδραστηρίου προστέθηκε ταυτόχρονα. Θεραπείες έγιναν εις τριπλούν. Οι τιμές παρουσιάζονται ως ο μέσος αριθμός των κασπάσης 3/7 θετικών κυττάρων από 3 ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Για να επιβεβαιώσετε την TGFβ + dasatinib απόπτωση, χρησιμοποιήθηκε ένα κασπάσης-3/7 δοκιμασία (Incucyte) για την ταυτόχρονη μέτρηση κυτταρικό θάνατο και τη δράση της κασπάσης 3/7. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3C, η θεραπεία συνδυασμού dasatinib ΤΟΡβ + είχε ως αποτέλεσμα μια σημαντική αύξηση (92%) στον αριθμό των κυττάρων που υφίστανται απόπτωση σε σύγκριση με είτε θεραπεία μόνο (22% και 19%, αντίστοιχα). Επιπλέον, ο συνδυασμός ΤΘΡβ-dasatinib είχε ως αποτέλεσμα την απώλεια της μιτοχονδριακής ηλεκτρικού δυναμικού και την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια (τα δεδομένα δεν φαίνονται), γεγονός που υποδηλώνει ότι η απόπτωση που παρατηρείται είναι το αποτέλεσμα της ενεργοποίησης του ενδογενούς (μιτοχονδριακού) αποπτωτικά μονοπάτια.

ΤΟΡβ-1-dasatinib επίδραση επί της δραστικότητας του ΤΟΡβ ενδοκυτταρικών μεσολαβητών

ΤΟΡβ έχει δειχθεί ότι διεγείρει διάφορες ενδοκυτταρικές οδούς, συμπεριλαμβανομένων της οδού Smad (κανονική οδός) και άλλων ενδοκυτταρικών μεσολαβητών, περιλαμβανομένου ρ38 μιτογόνο ενεργοποιημένη πρωτεϊνικής κινάσης (ΜΑΡΚ), ΑΚΤ, και ERK (μη κανονικών μονοπατιών) [39]. Ως εκ τούτου, έχουμε την επόμενη εξέτασε εάν η θεραπεία ΤΟΡβ-dasatinib ενεργοποιούνται αυτές τις οδούς με τη χρήση αντισωμάτων που ανιχνεύουν την φωσφορυλιωμένη (ενεργοποιημένη) μορφή των μεσολαβητών τόσο των κανονικών και μη κανονικών μονοπατιών. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4, η έκφραση του ενεργοποιημένου Smad2 ή Smad3 δεν παρατηρήθηκε σε ολόκληρο κυτταρικά εκχυλίσματα από είτε μη επεξεργασμένα ή dasatinib-επεξεργασμένα κύτταρα, αλλά δεν παρατηρήθηκε μετά από ΤGFβ-1 θεραπεία ή μετά τη θεραπεία με ΤΟΡβ + dasatinib. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα επίπεδα φωσφορυλιωμένης Smad3 μετά την αγωγή με ΤΟΡβ-dasatinib είναι υψηλότερα από τα επίπεδα που παρατηρούνται με τον ΤΟΡβ-1 θεραπεία μόνο. Η αύξηση των π-Smad3 δει μετά από 1 ώρα από τη θεραπεία συνδυασμού ΤΟΡβ-dasatinib στην ενεργοποίηση Smad3 είναι παροδική, δεδομένου ότι δεν μπορεί να δει 48 ώρες μετά τη θεραπεία (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτό είναι σε αντίθεση με φωσφορυλίωση Smad2, η οποία μπορεί να θεωρηθεί ως ήδη από 5 λεπτά και παραμένει φωσφορυλιωμένο μέχρι 48 ώρες. Αυτό θα μπορούσε να οφείλεται στην σημαντικά μικρότερη ημιζωή του Smad3 (4.7 ώρες) σε σύγκριση με Smad2 (12,5 ώρες) [40]. Προ-επεξεργασία με το TβR-Ι αναστολέα LY364947, μπλοκ Smad2 φωσφορυλίωση με την παρουσία ή απουσία του dasatinib (Εικ. 4Β). Όπως ήταν αναμενόμενο, η φωσφορυλίωση SRC αναστέλλεται με την παρουσία του dasatinib, και επώαση με ΤGFβ-1 δεν επηρεάζει αυτή την αναστολή.

κύτταρα NSCLC Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO, 5 ng /mL ΤΟΡβ-1, 100 ηΜ dasatinib , ή ένας συνδυασμός των 5 ng /mL ΤΟΡβ-1 και 100 ηΜ dasatinib για διαφορετικό χρονικό διάστημα (1 ώρα για την ανίχνευση των pSmad2 και pSmad3 και 48 ώρες για την ανίχνευση των pSrc). Μετά την επώαση, τα προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα.

Η

εντοπισμό και την δραστικότητα των πρωτεϊνών Smads εξαρτώνται από την κατάσταση φωσφορυλίωσης του COOH και περιοχές συνδετήρα [41]. Για να καθοριστεί εάν η αύξηση στην απόπτωση που παρατηρείται με τη θεραπεία συνδυασμού είναι λόγω μεταβολών στη θέση των Smads, εξετάσαμε την επίδραση της συνδυασμένης θεραπείας ΤΟΡβ-dasatinib για εντοπισμό των ενεργών Smads. Μετά από 48 ώρες ΤGFβ-1 ή συνδυασμός θεραπεία του ΤΟΡβ-dasatinib, κυτταρικά εκχυλίσματα κλασματοποιήθηκαν και τα φωσφορυλιωμένα Smads εξετάστηκαν σε κάθε κλάσμα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α, ο Smad2 φωσφορυλιωμένο στο καρβοξυ άκρα (ρ-Smad2 COOH) αυξάνει κυρίως στον πυρήνα. Η Smad2 φωσφορυλιώνεται στην περιοχή συνδέτη (ρ-Smad2 Συνδέτης) αυξάνει επίσης μετά την αγωγή με ΤΟΡβ-1, αλλά μια μεγαλύτερη ποσότητα παραμένει στο κυτταρόπλασμα. Είναι ενδιαφέρον ότι η ποσότητα φωσφορυλιωμένου Smad3 μετά ΤΟΡβ-1 θεραπεία συσσωρεύεται επίσης στον πυρήνα, ανεξάρτητα από τη θεραπεία με dasatinib (Εικ. 5Β).

κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO, 5 ng /mL ΤΟΡβ-1, 100 ηΜ dasatinib, ή ένας συνδυασμός των 5 ng /mL ΤΟΡβ-1 και 100 ηΜ dasatinib για 48 ώρες. Μετά τη θεραπεία, κυτταρολύματα συλλέχθηκαν και τα πυρηνικά και κυτταροπλασματικά κλάσματα διαχωρίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [35]. Μετά την κλασματοποίηση, λύματα υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα.

Η

Η θεραπεία με συνδυασμό TGFβ-dasatinib δεν είχε σημαντική επίδραση στην ERK μη κανονικής οδού TGFβ ενδοκυτταρική μεσολαβητές, ΑΚΤ, ή ρ38 (S3 Εικόνα). Επιπλέον, η θεραπεία με ΤΟΡβ-1 δεν είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση της ενεργοποίησης Shc σε κύτταρα Α549, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως για άλλους τύπους κυττάρων [42], [43], και knockdown της έκφρασης του ShcA χρησιμοποιώντας ShcA siRNA δεν είχε επίδραση στην απόπτωση σε ShcA-αρνητικά κύτταρα Α549 (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), υποδεικνύοντας ότι αυτή η οδός δεν εμπλέκεται στην απόπτωση που επάγεται από τη θεραπεία με ΤΟΡβ-dasatinib.

ΤΟΡβ-1-dasatinib απόπτωση προκαλείται από Smad3- επαγόμενη BIM

Smad3 έχει αναφερθεί να ευαισθητοποιήσει κύτταρα στα αποπτωτικά αποτελέσματα του ΤΟΡβ [40], και μια από τις προτεινόμενες μηχανισμών είναι η επαγωγή της έκφρασης της προ-αποπτωτική πρωτεΐνη ΒΙΜ (Bcl-2- αλληλεπιδρούν μεσολαβητής του κυτταρικού θανάτου) [44]. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Α, στις 24 ώρες μετά τη θεραπεία συνδυασμού, παρατηρήσαμε μια αύξηση στην έκφραση πρωτεΐνης ΒΙΜ του υψηλού μοριακού βάρους ισομορφής και του κατώτερου μοριακού και περισσότερο κυτταροτοξική BIM. Έχει πρόσφατα αναφερθεί ότι αποτελούν BIM πολυμορφισμοί διαγραφή (με αποτέλεσμα μια ισομορφή ΒΙΜ χωρίς την περιοχή ΒΗ3) που συμμετέχουν στην αντίσταση σε τυροσίνης αναστολείς κινάσης σε διάφορους τύπους καρκίνου του [45], [46]. Διαλογή των 15 κυτταρικών γραμμών χρησιμοποιώντας εκκινητές που περιγράφονται στην βιβλιογραφία [45] δεν ήμασταν σε θέση να ανιχνεύσει την ισομορφή BIM σε οποιαδήποτε από τις κυτταρικές σειρές μας (S5 Σχήμα). Ωστόσο, knockdown της έκφρασης του Smad3 χρησιμοποιώντας Smad3 siRNA είχε ως αποτέλεσμα μια μείωση στην ποσότητα του BIM μετά τη θεραπεία συνδυασμού, που δείχνει ότι η έκφραση Smad3 είναι απαραίτητη για την αυξημένη έκφραση του BIM (Εικ. 6Β). Έχει αναφερθεί ότι η έκφραση της Smad7 αποτρέπει την απόπτωση μέσω αναστολής της έκφρασης του BIM [47]. Όπως μπορεί να φανεί στο Σχ. 6Α με τη θεραπεία ΤΟΡβ-dasatinib που είχε ως αποτέλεσμα τη διάσπαση PARP, παρατηρήσαμε μειωμένη έκφραση του Smad7. Αυτή η μείωση της Smad7 προτείνει ένα μηχανισμό για τη διατήρηση του μονοπατιού ΤΟΡβ ενεργό. Τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι η θεραπεία συνδυασμού των ΤΟΡβ και dasatinib επάγει την απόπτωση με την αύξηση της ενεργοποίησης του ΤΟΡβ ΒΙΜ και προς τα κάτω ρύθμιση ΤΟΡβ οδού ανασταλτικά σήματα, όπως Smad7.

(Α) κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO, 5 ng /mL ΤΟΡβ-1, 100 ηΜ dasatinib, ή ένας συνδυασμός των 5 ng /mL ΤΟΡβ-1 και 100 ηΜ dasatinib για 48 ώρες. Μετά τη θεραπεία, λύματα ολόκληρων κυττάρων συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. (Β) siRNA κατά Smad3, και αρνητικός έλεγχος διαμολύνθηκαν σε κύτταρα Α549. Μετά από 4 ώρες επώαση, τα κύτταρα πλύθηκαν και μέσα που περιέχουν ενώσεις προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση για την παρασκευή εκχύλιση πρωτεΐνης και ανάλυση Western blotting.