επίπεδα

Αφηρημένο

Ιστορικό

Μέτρηση αγγελιαφόρο RNA (mRNA) με τη χρήση της αλυσιδωτής αντίδρασης ποσοτικής πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής (RT-qPCR) είναι κοινή πρακτική σε πολλά εργαστήρια. Ένα συγκεκριμένο σύνολο mRNAs ως γονίδια αναφοράς εσωτερικός έλεγχος θεωρείται ως η προτιμώμενη στρατηγική για την ομαλοποίηση των δεδομένων RT-qPCR. Η σωστή επιλογή των γονιδίων αναφοράς είναι ένα κρίσιμο ζήτημα, ειδικά σε καρκινικά κύτταρα που έχουν υποβληθεί σε διαφορετικές

in vitro

χειρισμούς. Αυτοί οι χειρισμοί μπορεί να οδηγήσει σε δραματικές αλλαγές στα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης, ακόμη και της υποτιθέμενης γονιδίων αναφοράς. Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε τα επίπεδα έκφρασης της 11ης χρησιμοποιούνται συνήθως γονίδια αναφοράς ως εσωτερικοί έλεγχοι για την ομαλοποίηση των 19 πειραμάτων που περιλαμβάνουν το νευροβλάστωμα, T-ALL, μελάνωμα, καρκίνο του μαστού, μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCL), οξεία μυελοειδή λευχαιμία (AML ), καρκίνο του προστάτη, καρκίνο του παχέος εντέρου, του τραχήλου της μήτρας και καρκινικές κυτταρικές γραμμές υποβάλλονται σε διάφορες διαταραχές.

Αποτελέσματα

Ο αλγόριθμος geNorm στην qbase πακέτο λογισμικού + χρησιμοποιήθηκε για την κατάταξη των γονιδίων υποψήφιος αναφοράς σύμφωνα με τους σταθερότητα έκφρασης. Παρατηρήσαμε ότι η σταθερότητα των περισσοτέρων από τα γονίδια υποψήφια αναφοράς ποικίλλει σημαντικά σε πειράματα διαταραχή. Εξέφρασε επαναλήψεις Alu παρουσιάζουν σχετικά σταθερή έκφραση ανεξάρτητα από την πειραματική κατάσταση. Αυτές οι επαναλήψεις Alu κατατάσσεται μεταξύ των καλύτερων δοκιμασίες αναφοράς σε όλα τα πειράματα διαταραχή και να εμφανίσει τις αποδεκτές τιμές σταθερότητα μέσο έκφρασης (Μ & lt? 0,5).

Συμπεράσματα

Προτείνουμε τη χρήση Alu επαναλαμβάνει ως σημείο αναφοράς δοκιμασία κατά την εκτέλεση των πειραμάτων διατάραξη των καρκινικών κυττάρων

Παράθεση:. Rihani Α, Van Maerken Τ, Pattyn F, Van Peer G, Beckers Α, De Brouwer S, et al. (2013) Αποτελεσματική Alu Επαναλάβετε RT-qPCR Κανονικοποίηση στον Καρκίνο Πειράματα κυττάρων διαταραχών. PLoS ONE 8 (8): e71776. doi: 10.1371 /journal.pone.0071776

Επιμέλεια: Jörg Δ Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Γερμανία

Ελήφθη: 5 Φεβ, 2013? Αποδεκτές: 3 Ιουλ 2013? Δημοσιεύθηκε: 14 Αυγούστου 2013

Copyright: © 2013 Rihani et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Ali Rihani υποστηρίζεται από ένα διδακτορικό υποτροφία από το ταμείο έρευνας Πανεπιστήμιο της Γάνδης (ΚΒΟ? 01D02210). Joni Van der Meulen και Evelien Μετς υποστηρίζονται από ένα διδακτορικό υποτροφία από το Ίδρυμα Ερευνών – Φλάνδρα (FWO? 1116412N και 3G020209, αντίστοιχα). Anneleen Beckers υποστηρίζεται από ένα διδακτορικό υποτροφία από το Ινστιτούτο για την προώθηση της καινοτομίας μέσω Επιστήμης και Τεχνολογίας στη Φλάνδρα (ΕΝ? 101506). Ο Tom Van Maerken, Pieter Mestdagh και Pieter Rondou υποστηρίζονται από μεταδιδακτορικές υποτροφίες από το FWO. SDB υποστηρίζεται από μια μεταδιδακτορική υποτροφία από το Πανεπιστήμιο της Γάνδης (GOA UGENT? 01G01910). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Ιστορικό

η αντίστροφη μεταγραφή ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-qPCR) έχει αποδειχθεί ότι είναι μια αξιόπιστη μέθοδος για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης του γονιδίου. Σωστή κανονικοποίηση είναι ένα κρίσιμο ζήτημα για την ακριβή ερμηνεία των αποτελεσμάτων RT-qPCR. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί χρησιμοποιώντας διάφορες στρατηγικές όπως η εξασφάλιση παρόμοιους αριθμούς κυττάρων, παρόμοιες ποσότητες RNA εισόδου, εφαρμόζοντας γονίδια εσωτερικός έλεγχος αναφορά σαν ριβοσωματικών RNA (rRNAs) ή αγγελιαφόρο RNA (mRNAs), ή συγχώνευση πολλαπλές στρατηγικές σε ένα πρωτόκολλο [1], [2].

Η χρήση των mRNA ως εσωτερικό γονίδια αναφοράς ελέγχου για την ομαλοποίηση των δεδομένων RT-qPCR εφαρμόζεται ευρέως [2] – [6]. Ωστόσο, αυτή η στρατηγική θα πρέπει να πραγματοποιείται με προσοχή καθώς η ακρίβεια της εξαρτάται άμεσα από την σταθερότητα έκφραση των επιλεγμένων γονιδίων αναφοράς. Σύμφωνα με τις ελάχιστες πληροφορίες για Δημοσίευση Ποσοτική Πειράματα Real-Time PCR (κατευθυντήριες γραμμές MIQE) [7], δεν είναι πλέον αποδεκτό να θεωρούν ότι ορισμένα γονίδια αναφοράς είναι σταθερά κατά συνθήκη. Η ομάδα μας έχει προηγουμένως αναφερθεί μια στρατηγική για την ακριβή κανονικοποίηση των δεδομένων RT-qPCR βασίζεται σε γεωμετρικού μέσου όρου των πολλαπλών σταθερώς εκφρασμένα γονίδια εσωτερικού ελέγχου [4]. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι η επιλογή αξιόπιστων εσωτερικών ελέγχων έχει ιδιαίτερη σημασία σε πειράματα που περιλαμβάνουν διατάραξη των καρκινικών κυττάρων. Θεραπεία καρκινικά κύτταρα με θεραπευτικούς παράγοντες ή RNAi-μεσολαβούν μόρια siRNA ή shRNA προκαλεί δραματικές αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης πολλών γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων των γονιδίων που χρησιμοποιούνται συνήθως αναφοράς. Το φαινόμενο αυτό οφείλεται σε (μη-ειδική) επιδράσεις εκτός στόχου που συναντώνται κατά την παράδοση αυτών των μορίων [8], ή έμμεση ρύθμιση μετά τη θεραπεία. Ως εκ τούτου, αξιολογήσαμε την έκφραση γονιδίων που χρησιμοποιούνται συνήθως αναφοράς και εκφράζεται ΑΙυ επαναλήψεων ως εσωτερικοί έλεγχοι για ομαλοποίηση σε πειράματα που περιλαμβάνουν διαταραγμένο καρκινικές κυτταρικές σειρές. Οι Alu επαναλήψεις βρίσκονται στις αμετάφραστες περιοχές αρκετών χιλιάδων γνωστών πρωτεϊνών που κωδικοποιούν γονίδια, και έχουν αναφερθεί ότι είναι χρήσιμη ως μοναδικό παράγοντα κανονικοποίησης για RT-qPCR αντιδράσεις [9].

Αποτελέσματα

Πειράματα Cancer Cell διαταραχών

η θεραπεία με νουτλίνη-3.

νουτλίνη-3 είναι ένα μικρό μόριο το οποίο μπορεί να αναστείλει ειδικά τη ρ53-MDM2 αλληλεπίδραση, η οποία οδηγεί σε ενεργοποίηση και σταθεροποίηση της ρ53 [ ,,,0],1], [2], [10]. Η θεραπεία με νουτλίνη-3 προκαλεί απόπτωση (Σχήμα 1Α), διακοπή του κυτταρικού κύκλου, διαφοροποίηση, ή γήρανση σε κύτταρα νευροβλαστώματος με άγριου τύπου

ΤΡ53

[2] -. [6], [11]

(Α), νουτλίνη-3 επεξεργασμένα κύτταρα NGP, 16 μΜ (δεξιά) και τον έλεγχο του οχήματος (αριστερά). (Β), ATRA κατεργασμένα κύτταρα NGP με επιμήκη νευρίτες (δεξιά) και τον έλεγχο του οχήματος (αριστερά). (C), δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας των IMR-32 και τα κύτταρα SK-N-SH μετά από θεραπεία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις withaferin-A για 24 ώρες. Οι ράβδοι σφάλματος, SD (η = 3). (D), δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας μετά από τη θεραπεία του CLB-GA και τα κύτταρα SK-N-SH με αυξανόμενες συγκεντρώσεις ΤΑΕ-684 για 24 ώρες. Οι ράβδοι σφάλματος, SD (η = 3). (Ε), τα δεδομένα έκφρασης RT-qPCR των PTK9 σε SH-EP, SK-N-SH, SH-SY5Y και SK-Ν-ΝΑ (2c) μετά από επιμόλυνση με miR-1 μιμούνται ή ομελέτα miRNA μιμούνται χρησιμεύει ως αρνητικός μάρτυρας (NC). Οι ράβδοι σφάλματος, το SEM (n = 2). (F), RT-qPCR δεδομένα έκφραση των Τ-UCR uc. 73 (αριστερά) και T-UCR uc.460 (δεξιά) 24 ώρες μετά την διαμόλυνση των κυττάρων SH-EP με siRNA έναντι Τ-UCR uc. 73 και siRNA εναντίον Τ-UCR UC. 460 αντίστοιχα. Λάθη μπαρ, SEM (n = 2).

Η

Η θεραπεία με ATRA.

All-

trans

ρετινοϊκό οξύ (ATRA) είναι ένα μικρό λιπόφιλο μόριο [7 ], [12] που αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και επάγει την διαφοροποίηση των κυττάρων νευροβλαστώματος [4], [13] – [15]. Εμείς αντιμετωπίζεται CLB-GA και NGP κύτταρα με 0 ή 5 μΜ ATRA για μία έως πέντε ημέρες, και παρατήρησε ότι ATRA προκαλεί την έκφυση των νευριτών (Εικόνα 1Β).

Η θεραπεία με withaferin-Α.

Withaferin-A είναι ένα στεροειδές λακτόνη καθαρίζεται από το φαρμακευτικό φυτό

βιθάνια

. Αυτή η ένωση επάγει απόπτωση σε κύτταρα νευροβλαστώματος και είναι ένα αντι-αγγειογόνο παράγοντα [8], [16]. Εμείς αγωγή SK-N-SH και IMR-32 κύτταρα νευροβλαστώματος με withaferin-Α και παρατηρήθηκαν μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων σε μία δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 1 C). Στη συνέχεια κατεργάζεται SK-N-SH και IMR-32 κυττάρων με 0 ή 1 μΜ withaferin-A για μία ημέρα για να αξιολογηθεί η σταθερότητα των γονιδίων αναφοράς.

Θεραπεία των κυτταρικών σειρών νευροβλαστώματος με ΤΑΕ-684.

ΤΑΕ-684 είναι ένα μικρό μόριο αναστολέας του ενεργοποιημένου αναπλαστικού λεμφώματος κινάσης (ALK) [9], [17] και μειώνει τη βιωσιμότητα των κυττάρων του

ALK

μεταλλαγμένα κύτταρα νευροβλαστώματος [18]. Μετά κατεργασία SK-N-SH και τα κύτταρα CLB-GA με ΤΑΕ-684, παρατηρήσαμε μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων σε μία δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 1 D). Εμείς στη συνέχεια κατεργάζεται αυτά τα 2 κυτταρικές σειρές με 0, 0,1, 0,3 και 1 μΜ ΤΑΕ-684 για 3, 6, 12, 24, και 48 ώρες για να αξιολογηθεί η σταθερότητα των γονιδίων αναφοράς.

Κατεργασία ενός NSCLC κυτταρική γραμμή με ΤΑΕ-684.

H3122 είναι μια κυτταρική γραμμή NSCLC με ένα

EML4-ALK

γονίδιο σύντηξης που υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΤΑΕ-684 με τον ίδιο τρόπο όπως περιγράφηκε παραπάνω.

Παροδικές επιμολύνσεις από νευροβλάστωμα κυτταρικές σειρές με miR-1 μιμούνται.

miR-1 στόχων η 3′-UTR του

PTK9

mRNA οδηγεί σε

PTK9

υποβάθμιση [19]. MiR-1 χρησιμοποιείται συχνά ως ένας θετικός έλεγχος σε πειράματα με miRNA μιμητικό επιμολύνσεις να αξιολογήσει mRNA του γονιδίου-στόχου κάτω ρύθμιση με qPCR. Πραγματοποιήσαμε παροδικές επιμολύνσεις από SK-N-BE (2γ), SK-N-SH, SH-EP, και SH-SY5Y κύτταρα νευροβλαστώματος με miR-1 μιμούνται, αρνητικό μάρτυρα (ένα κωδικοποιημένο miRNA απομίμηση), ή εικονικές επιμόλυνση για 24 ώρες (Σχήμα 1 Ε).

Παροδικές επιμολύνσεις των κυττάρων SH-EP με τα siRNA εναντίον μεταγραφεί ultraconserved περιοχές.

επιμολυσμένα κύτταρα SH-EP με siRNA έναντι αμφοτέρων των κλώνων των Τ-UCR uc.460 , και ένα siRNA κατά της αρνητικής έλικας του Τ-UCR uc.73.The αποδοτικότητα knockdown δείχνεται στο Σχήμα 1F. Περισσότερες λεπτομέρειες σχετικά με τον πειραματικό σχεδιασμό που βρέθηκαν στο S1 αρχείου.

παροδική επιμόλυνση των κυττάρων λευχαιμίας γραμμές με miR-223 μιμούνται.

MiR-223 βρέθηκε να είναι άκρως εκφράζεται σε Τ-κυττάρων οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία (Τ-ALL) [20]. Ωστόσο, τρεις-ΟΛΑ Τ κυτταρικές σειρές, η Ε.Π.Μ.-όλα, όλα-SIL και TALL-1 παρουσιάζονται με χαμηλό επίπεδο miR-223. Αναμέναμε ότι η υπερέκφραση του ογκογόνου miR-223 σε αυτές τις κυτταρικές σειρές θα αυξήσει την ικανότητα πολλαπλασιασμού των κυττάρων και να αποδείξει την ογκογόνο δυναμικό αυτής miRNA (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Βελτιστοποίηση της συγκέντρωση

PHF6

-targeting siRNA σε Τ-όλες τις κυτταρικές σειρές.

επιμολυσμένα

PHF6

άγριου τύπου T-ALL κυτταρική γραμμή Jurkat και αξιολόγησε το νοκ ντάουν απόδοσης σε επίπεδο mRNA (Σχήμα 2). Στη συνέχεια, παροδικά επιμολυσμένα το T-όλες τις κυτταρικές σειρές PF-382 (και τα δύο PHF6 άγριου τύπου) με PHF6 στόχευση siRNA HSB-2 και. Σημαντικές PHF6 γκρεμίσουμε επιβεβαιώθηκε από qPCR (φαίνεται στο Σχήμα 2). Περισσότερες λεπτομέρειες σχετικά με τον πειραματικό σχεδιασμό που βρέθηκαν στο S1 αρχείου

ΐυΚΚΑΤ κυτταρική σειρά μετά την επιμόλυνση του

PHF6

-targeting siRNA ή ομελέτα siRNA (αρνητικός μάρτυρας: NC).. Οι ράβδοι σφάλματος, το SEM (n = 2).

Η

Παροδική διαμόλυνση μιας κυτταρικής γραμμής μελανώματος με siRNA κατά κυκλοφιλίνης-Β.

WM9 είναι μια κυτταρική γραμμή μελανώματος που παροδικά επιμολυσμένα με 20 ηΜ και 50 ηΜ siRNA κατά κυκλοφιλίνης-Β (PPIB), ή ένα κωδικοποιημένο αρνητικό έλεγχο siRNA.

Θεραπεία του καρκίνου του μαστού, AML, καρκίνο του προστάτη, καρκίνο του παχέος εντέρου και κυτταρικές γραμμές με νευροβλάστωμα JQ1.

JQ1 είναι ένα μικρό μόριο ένωσης που αναστέλλει μια πρωτεΐνη που ονομάζεται bromodomain BRD4. Στόχευση αυτού του ογκογονιδίου οδηγεί σε αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυτταρικών γραμμών. Ένας γνωστός μηχανισμός είναι μέσω αρνητική ρύθμιση της MYCN. Εμείς αντιμετωπίζονται δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού (MCF-7 και SKBR3), μία κυτταρική σειρά AML (Κ562), ένα προστάτη καρκινική κυτταρική γραμμή (PC-3), ένα ορθοκολικό καρκίνο κυτταρική γραμμή (SW-620) και μία κυτταρική γραμμή νευροβλαστώματος ( SJNB-12) με 1 μΜ JQ1 για 24 και 48 ώρες.

MCF-7 και HeLa μεταγραφικό PCR Arrays

Χρησιμοποιήσαμε διατίθενται στο εμπόριο έτοιμες προς χρήση πλάκες cDNA από MCF7 (καρκίνος του μαστού κυτταρική γραμμή) και HeLa (τραχηλικό κυτταρική σειρά καρκίνου). Κάθε δείγμα cDNA έχει συντεθεί από RNA που εξάγεται από μια κυτταρική γραμμή που είχαν εκτεθεί σε ένα από τα 90 διαφορετικά χημικά αναστολέων. Αυτές οι χημικοί αναστολείς στοχεύουν σε ένα ευρύ φάσμα διαφορετικών οδών που προκύπτουν σε διάφορες διαταραχές του ένα δύο ευρέως χρησιμοποιούμενες κυτταρικές γραμμές καρκίνου. Οι χημικοί αναστολείς και τα γονίδια που στοχεύουν παρατίθενται στον Πίνακα S1.

Alu επαναλαμβάνει τα πιο εκφράζονται σταθερά αλληλουχία αναφοράς

mRNA επίπεδα δοκιμασίες αναφοράς 11 υποψήφιες μετρήθηκαν σε όλα τα παραπάνω περιγραφέντα πειράματα και ο μέσος σταθερότητα έκφραση υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο geNorm. GeNorm κατατάσσει τα γονίδια αναφοράς σύμφωνα με την αξία τους σταθερότητα (αναφέρεται ως Μ-αξία) και υπολογίζει το βέλτιστο αριθμό των γονιδίων που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί για την κανονικοποίηση σε ένα δεδομένο πείραμα χρησιμοποιώντας το V-value (Σχήμα S1). Οι M-τιμές μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την κατάταξη των γονιδίων από το λιγότερο με την πιο σταθερή ένα [4].

Σε 13 από τα 19 πειράματα διαταραχή που εκτελούνται, Alu επαναλαμβάνει (Alu-Sq) ήταν κατατάσσεται μεταξύ των τριών πιο σταθερή ανιχνεύσεις αναφοράς (Σχήμα 3). Η παρατήρηση αυτή μας ώθησε να αναλύσει περαιτέρω η δυνητική αξία των Alu επαναλαμβάνει σταθερή υποψήφιοι αναφοράς.

Χ-άξονας δείχνει την κατάταξη των γονιδίων αναφοράς, και το Υ-άξονας δείχνει geNorm Μ-αξίες. (Α), νουτλίνη-3 θεραπεία νευροβλαστώματος κύτταρα. (Β), ATRA κατεργασμένα κύτταρα νευροβλαστώματος. (C), withaferin ένα επεξεργασμένο νευροβλάστωμα κύτταρα. (D), ΤΑΕ-684 αγωγή νευροβλαστώματος κύτταρα. (Ε), κύτταρα νευροβλαστώματος επιμολυσμένα με siRNAs έναντι Τ-UCRs. (F), κύτταρα νευροβλαστώματος επιμολυσμένα με miR-1 μιμούνται. (G), Τ-όλες τις κυτταρικές σειρές (Ε.Π.Μ.-όλα, όλα-SIL, και TALL-1) επιμολυσμένα με miR-223 μιμούνται ή αρνητικό μάρτυρα miR μιμούνται. (H), T-ALL κυτταρική σειρά Jurkat επιμολυσμένα με

PHF6

-targeting siRNA ή αρνητικού ελέγχου siRNA. (Ι), ΟΛΑ-Τ κυτταρικές σειρές (HSB-2 και PF-382) επιμολυσμένα με

PHF6

-targeting siRNA ή αρνητικού ελέγχου siRNA. (J), κυτταρική σειρά NSCL (H3122) που έλαβαν θεραπεία με crizotinib. (Κ), κυτταρική γραμμή μελανώματος (WM-9) επιμολυσμένα με siRNA κατά κυκλοφιλίνης-Β. (L), AML κυτταρική γραμμή (Κ562) που έλαβαν θεραπεία με JQ1. (Μ), ο καρκίνος των κυττάρων του μαστού γραμμή (MCF-7) υποβάλλεται σε επεξεργασία με JQ1. (Ν), του καρκίνου του μαστού κυτταρική γραμμή (SKBR-3) που έλαβαν θεραπεία με JQ1. (O), κυτταρική σειρά καρκίνου του προστάτη (PC-3) που έλαβαν θεραπεία με JQ1. (P), του παχέος κυτταρική σειρά (SW-620) που έλαβαν θεραπεία με JQ1. (Q), κυτταρική γραμμή νευροβλαστώματος (SJNB-12) που έλαβαν θεραπεία με JQ1. (R), MCF-7 σε κατεργασία με 90 διαφορετικές χημικές αναστολέων. (S), του τραχήλου της μήτρας καρκίνου κυτταρική σειρά (HeLa) που έλαβαν θεραπεία με 90 διαφορετικές χημικές αναστολείς.

Η

Μια μέθοδος συνάθροισης κατάταξη με βάση τη θεωρία της ψηφοφορίας (Borda Count) χρησιμοποιήθηκε για να συνδυάσει το 19 κατάλογοι κατάταξης των υποψηφίων αναφοράς [21]. Η μέθοδος αυτή προσπαθεί να βρει μια ταξινομημένη λίστα των δοκιμασιών αναφοράς όσο το δυνατόν πλησιέστερα σε όλες τις ατομικές διέταξε καταλόγους με τον υπολογισμό απόστασης footrule του σταθμισμένου Spearman, καθώς και χρησιμοποιώντας ένα σταυρό-εντροπία Μόντε Κάρλο αλγορίθμου ή γενετικό αλγόριθμο [21]. Η ανάλυση των 19 πλήρεις καταλόγους γονίδιο, που παράγεται από τα 19 διαφορετικά πειράματα, κατέληξαν σε Alu επαναλήψεις κατατάσσεται στην πρώτη θέση (Σχήμα 4). Αυτό επιβεβαίωσε ότι Alu επαναλήψεις αντιπροσωπεύουν την πιο σταθερή δοκιμασία αναφορά σε όλα τα σύνολα δεδομένων.

αποτέλεσμα συνάθροισης Rank χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο σταυρό εντροπία με το πόδι-κανόνα σταθμισμένη απόσταση Spearman, η οποία δείχνει μια συναινετική σειρά των γονιδίων αναφοράς από την πιο σταθερή σε το λιγότερο σταθερό.

η

Συζήτηση

RT-qPCR είναι η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη μέθοδος για την ποσοτικοποίηση της γονιδιακής έκφρασης και ακριβή κανονικοποίηση καλείται να ερμηνεύσει σωστά τα δεδομένα RT-qPCR. Κανονικοποίηση με χρήση ενδογενών γονιδίων ελέγχου είναι μια ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος για τη διόρθωση για τις τεχνικές μεταβολές που συμβαίνουν κατά την διάρκεια αντιδράσεων RT-qPCR. Μέχρι πρόσφατα, ένα μόνο μη επικυρωμένη γονίδιο αναφοράς έχει σαν ρουτίνα χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Έχουμε αναφέρει προηγουμένως ότι η στρατηγική αυτή μπορεί να οδηγήσει σε εσφαλμένα δεδομένα με σφάλμα έως και 3 φορές σε 25% των περιπτώσεων [4]. Χρησιμοποιώντας πολλαπλά γονίδια αναφοράς ως εσωτερικοί έλεγχοι για την ομαλοποίηση των δεδομένων RT-qPCR καθώς επίσης και χρησιμοποιώντας τα κατάλληλα γονίδια αναφοράς για συγκεκριμένες πειραματικούς σκοπούς έχει ήδη σθεναρά στη βιβλιογραφία [2], [22]. Επικύρωση της σταθερή έκφραση των γονιδίων αναφοράς είναι ένα σημαντικό θέμα σε κάθε πειραματική διαδικασία από το κύτταρο χειρισμούς, όπως η θεραπεία με θεραπευτικές ενώσεις μπορεί να επηρεάσει δραματικά την έκφρασή τους.

Σε αυτή τη μελέτη, δίνουμε έμφαση στο γεγονός ότι η σωστή επιλογή τα γονίδια αναφοράς είναι σημαντική για την ερμηνεία των δεδομένων RT-qPCR και αποδεικνύουν ότι Alu επαναλήψεις αντιπροσωπεύουν την πιο σταθερή δοκιμασία αναφορά σε ένα ευρύ φάσμα πειραματικών συνθηκών σε οκτώ διαφορετικούς τύπους καρκίνου.

Έχουμε επιλέξει 11 γονίδια αναφοράς που είναι ευρέως που χρησιμοποιούνται στη λογοτεχνία και ότι ανήκουν σε διαφορετικές λειτουργικές κατηγορίες για να αποφευχθεί η συν-ρύθμιση. Έχουμε επιλέξει γονίδια που σχετίζονται με τη δομή (

ACTB

,

RPL13A

), τα γονίδια που σχετίζονται με το μεταβολισμό (

HPRT

,

GAPDH

), και τα γονίδια που σχετίζονται με τη μεταγραφή (

TBP

). Το υπόλοιπο των γονιδίων δεν χαρακτηρίζονται ειδικά σε μία λειτουργική κατηγορία. Επίσης περιλαμβάνονται εκφράζεται ΑΙυ επαναλήψεων, τα οποία είναι άφθονα διάσπαρτα σε όλο το γονιδίωμα. Μια συνηθισμένη παράγοντα κανονικοποίησης για πειράματα RT-qPCR στη λογοτεχνία είναι 18S rRNA. Το rRNA αποτελεί περισσότερο από το 90% των συνολικών RNA, και το γεγονός αυτό οδήγησε πολλούς ερευνητές να χρησιμοποιήσουν 18S rRNA ως έλεγχος για ομαλοποίηση των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης. Ωστόσο, έχει αποδειχθεί ότι ίσα κλάσματα του rRNA δεν εξασφαλίζουν κατ ‘ανάγκη ίσα κλάσματα του mRNA [23]. Αυτή η ανησυχία είναι ακόμη μεγαλύτερη σημασία σε πειράματα καρκινικών κυττάρων διατάραξη καθώς αυτές οι διαταραχές μπορεί να οδηγήσουν σε διαφορική έκφραση της RNA πολυμεράσης Ι και /ή II, ή διαφορική αποδόμηση των δύο πληθυσμών RNA [24], και κατά συνέπεια μπορεί να οδηγήσει σε περαιτέρω ανισορροπίες στην αναλογία rRNA /mRNA. Επιπλέον, η υψηλή ποσότητα rRNA σε σύγκριση με το mRNA καθιστά δύσκολη την αφαιρέσουμε το φθορισμό υποβάθρου στην ανάλυση των δεδομένων των δεδομένων RT-qPCR [4]. Εξαιτίας αυτών των λόγων, χρησιμοποιώντας 18S rRNA σαν μάρτυρας σε πειράματα RT-qPCR θα μπορούσε να οδηγήσει σε ψευδώς ερμηνεία των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης. Δεν έχουμε, ως εκ τούτου αξιολογούνται 18S rRNA στη μελέτη μας.

RT-qPCR διεξήχθη για τις δοκιμασίες αναφοράς 11 σε κυτταρικές σειρές 21 καρκίνου που προέρχεται από 9 διαφορετικές οντότητες του καρκίνου με χρήση SYBR πράσινη τεχνολογία. Οι κυτταρικές γραμμές εκτέθηκαν σε σκληρές συνθήκες θεραπείας, δημιουργώντας 19 διαφορετικά σύνολα δεδομένων με συνολικά 418 δείγματα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορα χημικά αναστολείς συμπεριλαμβανομένων προ-αποπτωτικά ενώσεων και, παράγοντες επαγωγής διαφοροποίησης, ή επιμολυσμένα με μιμείται miRNA ή siRNAs. Χρησιμοποιώντας geNorm [4] εφαρμόζεται σε qbase + [1], που υπολογίζεται η αξία σταθερότητα ή Μ-τιμής. Η τιμή Μ είναι ο μέσος όρος ανά ζεύγος διακύμανση (τυπική απόκλιση) των log-μετασχηματιστεί αναλογίες των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων σε συνδυασμό υποψηφίου αναφοράς. Αυτή η τιμή δεν είναι μόνο μας επέτρεψε να ταξινομήσει τα γονίδια αναφοράς όσον αφορά τη σταθερότητα τους, αλλά και για να συγκριθεί η σταθερότητα αυτών των γονιδίων αναφοράς σε διάφορες πειραματικές συνθήκες. Οι M-τιμές και οι κατατάξεις των γονιδίων αναφοράς σε όλα τα σύνολα δεδομένων παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Μ-τιμές μικρότερες από 0,5 ταξινομούνται ως καλές τιμές [1]. Διασπορά των Μ-αξιών του κάθε γονιδίου ανάμεσα σε όλα τα πειράματα παρουσιάζονται ως Θηκόγραμμα στο σχήμα S2.

Η

Μετά τον υπολογισμό των Μ-αξίες και την κατάταξη των γονιδίων αναφοράς, παρατηρήσαμε ότι οι Alu επαναλήψεις κατατάσσεται μεταξύ οι πιο σταθερές γονίδια αναφορά στη συντριπτική πλειοψηφία των συνόλων δεδομένων και γενικά έχουν χαμηλή Μ-αξίες. Στη συνέχεια εφαρμόστηκε μια στρατηγική συσσωμάτωση rank [3] για να προσδιοριστεί η βέλτιστη κατάταξη των γονιδίων αναφοράς σε όλες τις ομάδες δεδομένων 19. Αυτή η ανάλυση επιβεβαίωσε ότι Alu επαναλήψεις αντιπροσωπεύουν την πιο σταθερή δοκιμασία αναφοράς με αποδεκτή Μ-αξίες. Όλες οι μετρήσεις της γονιδιακής έκφρασης μας έγιναν χρησιμοποιώντας πράσινο SYBR. Διαφορετικές τεχνολογίες είναι διαθέσιμες σήμερα, και αρκετές μελέτες έχουν πραγματοποιηθεί συγκρίσεις ανάμεσα σε διαφορετικές πλατφόρμες που χρησιμοποιούνται [25]. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι SYBR πράσινο είναι σε πολύ καλή συμφωνία με τα ευρέως χρησιμοποιούμενα αναλύσεις της γονιδιακής έκφρασης TaqMan. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε κυτταρικές γραμμές που δίνουν μια καλή απόδοση του RNA και τέλεια ποιότητα (δοκιμάστηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα Experion από την Bio-Rad). Πιστεύουμε ότι η χρήση τέτοιας υψηλής ποιότητας RNA υλικό και τέτοια άφθονη γονίδια αναφοράς θα δημιουργήσει επαναλήψιμα αποτελέσματα ανεξάρτητα από την πλατφόρμα που χρησιμοποιείται. Τα αποτελέσματά μας τονίζουν με έμφαση τη σημασία της σωστής επιλογής των γονιδίων αναφοράς για τις διάφορες πειραματικές διατάξεις. Επιπλέον, δείξαμε ότι ΑΙυ επαναλήψεων μπορεί να χρησιμεύσει ως σταθερή αναφορά στις περισσότερες από τις πειραματικές συνθήκες.

Συμπεράσματα

Η αξιοπιστία των δεδομένων RT-qPCR βασίζεται στην ακριβή κανονικοποίηση της παραγόμενης δεδομένα χρησιμοποιώντας εσωτερικά γονίδια αναφοράς. Η σταθερότητα και η καταλληλότητα των υποθετικών γονιδίων ενδογενών έλεγχος είναι μια αναγκαιότητα για την ακριβή κανονικοποίηση και για τη σωστή ερμηνεία των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης. Σε αυτή τη μελέτη, αναφέρουμε ότι, μεταξύ των 11 που χρησιμοποιούνται συνήθως γονίδια αναφοράς, Alu επαναλήψεις είναι η πιο σταθερή αλληλουχία αναφοράς σε κυτταρικές σειρές από 9 διαφορετικούς τύπους καρκίνου που υποβλήθηκαν σε διαφορετικά πειράματα διαταραχή. Συνιστούμε επομένως να συμπεριλάβει Alu επαναλαμβάνει, ως πρώτο υποψήφιο για την εξομάλυνση των δεδομένων RT-qPCR.

Υλικά και Μέθοδοι

Η επιλογή των γονιδίων αναφοράς

Η επιλογή της εσωτερικής γονίδια ελέγχου αξιολογήθηκε σε αυτή τη μελέτη (Πίνακας 1) βασίζεται σε μια προηγούμενη μελέτη που δημοσιεύθηκε από την ομάδα μας [2], [4] – [6]. Τα γονίδια αυτά χρησιμοποιούνται συνήθως ως γονίδια αναφοράς στη βιβλιογραφία και ανήκουν σε διαφορετικές οδούς για να αποφευχθεί από κοινού ρύθμιση αυτών των γονιδίων σε διαφορετικές συνθήκες επεξεργασίας. Έχουμε επεκτείνει αυτή την επιλογή για να συμπεριλάβει εκφράζεται ΑΙυ επαναλήψεων.

Γραμμές κυττάρων και καλλιέργεια κυττάρων

Τα κύτταρα που χρησιμοποιούνται είναι εγκατεστημένες κυτταρικές σειρές από 9 τύπους όγκων, νευροβλάστωμα, T-ALL, μελάνωμα, καρκίνο του μαστού , οξεία μυελοειδή λευχαιμία, καρκίνο του προστάτη, ορθοκολικό καρκίνο, καρκίνο του πνεύμονα μη-μικρού κυττάρου, και τον καρκίνο του τραχήλου. Οι λεπτομέρειες σχετικά με την καλλιέργεια των κυτταρικών σειρών, και την πηγή τους, που αναφέρονται στο S2 αρχείου.

Φαρμακευτική αγωγή και Κυτταρικής Βιωσιμότητας

Αξιολόγησης

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 16 μΜ νουτλίνη-3 (Cayman Chemical, USA) ή ελέγχου του οχήματος (αιθανόλη) για 1 και 5 ημέρες, 16 μΜ ATRA (Sigma-Aldrich, Βέλγιο) ή ελέγχου του οχήματος (DMSO), 1 μΜ withaferin-Α ή ελέγχου του οχήματος (αιθανόλη), 0.1 μΜ, 0.3 μΜ ή 1 μΜ ΤΑΕ -684 (Novartis, Ελβετία) ή ελέγχου του οχήματος (DMSO), 1 μΜ JQ1 (Cayman Chemical, USA) ή ελέγχου του οχήματος (DMSO) για τις προαναφερθείσες χρονικά σημεία. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία CellTiter-Glo (Promega, Βέλγιο) ένα luminscent ΑΤΡ-βάση.

Η επιμόλυνση με τα siRNA και miRNA Μιμείται

SK-N-BE (2γ), SK-N -SH, SH-EP, και SH-SY5Y κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα μιμητικό miR-1 χρησιμοποιώντας Dharmafect-2 (Dharmacon, Ηνωμένο Βασίλειο) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν ολίγοις, 500.000 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεάτιο σε μέσο ελεύθερο αντιβιοτικών και τροφοδοτείται με 10% ορό εμβρύου μόσχου. 24 ώρες αργότερα, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας μια τελική συγκέντρωση 100 ηΜ του miR-1 μιμούνται και 0,2% του Dharmafect-2. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν μετά από 48 ώρες.

κύτταρα SH-EP επιμολύνθηκαν με τα siRNA έναντι Τ-UCRs (uc.73 και uc.460) χρησιμοποιώντας Dharmafect-2 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν ολίγοις, 100.000 κύτταρα καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω και επιμολύνονται χρησιμοποιώντας μια τελική συγκέντρωση 50 ηΜ siRNAs και 0,2% Dharmafect-2. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από 15, 24, 48 και 72 ώρες

Οι-ΟΛΑ Τ κυτταρικές σειρές ηλεκτροδιατρήθηκαν σε 250 V και 1000 μF (εκθετική παλμό αποσύνθεση) (GenePulser II?. Bio-Rad, Hercules, CA , USA) με 400 ηΜ, 100 ηΜ, 25 ηΜ και 10 ηΜ

PHF6-

στόχευση siRNA (ON-TARGETplus SMARTpool? Dharmacon, Lafayette, CO, USA) για κύτταρα Jurkat και με 400 ηΜ

PHF6-

στόχευση siRNA για HSB-2 και PF-382. ALL-SIL, T-ALL-1, και η Ε.Π.Μ.-ALL ηλεκτροδιατρήθηκαν με 600 nm του miR-223 μιμούνται. Ως μάρτυρας, εμείς ηλεκτροδιάτρηση των κυττάρων με παρόμοιες συγκεντρώσεις ενός κωδικοποιημένο siRNA (ON-TARGETplus Μη στόχευση πισίνα? Dharmacon, Lafayette, CO, USA) ή χωρίς siRNA. Εμείς που συγκομίζονται HSB- 2, PF-382, ALL-SIL, T-ALL-1, και η Ε.Π.Μ.-ALL κύτταρα 1, 24, 48, 72, και 96 ώρες μετά την ηλεκτροδιάτρηση και Jurkat κύτταρα μετά από 48 ώρες.

WM-9 κύτταρα επιμολυσμένα με 20 nM, και 50 ηΜ siRNA πισίνα κατά PPIB ή ομελέτα siRNA (ON-TARGETplus μη στοχεύουν στην πισίνα? Dharmacon, Lafayette, CO, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής).

Ο κατάλογος των οι χημικοί αναστολείς που χρησιμοποιούνται από Qiagen για τη θεραπεία MCF-7 και HeLa κύτταρα και τους κατάλογο των γονιδίων στόχων που παρατίθενται στον πίνακα S1.

RT-qPCR

Εκχύλιση του συνολικού RNA, επεξεργασία με ϋΝάση, cDNA σύνθεση, και SYBR Green Ι RT-qPCR από διαταραγμένο κύτταρα διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [4], [7]. Τα έτοιμα προς χρήση πλάκες cDNA του MCF-7 και HeLa παραγγέλθηκαν από Qiagen, Ολλανδία. Οι ακόλουθες αλληλουχίες εκκινητών είναι διαθέσιμες στη βάση δεδομένων RTPrimerDB (https://www.rtprimerdb.org) [4], [26]: ACTB (RTPrimerDB ID # 1), Β2Μ (# 2), GAPDH (# 3), HMBS (# 4), HPRT1 (# 5), RPL13A (# 6), SDHA (# 7), UBC (# 8), YWHAZ (# 9). Η αλληλουχία του ΑΙυ-SQ επαναλαμβάνει εκκινητές είναι CATGGTGAAACCCCGTCTCTA για την προς τα εμπρός εναρκτήρα και GCCTCAGCCTCCCGAGTAG για το αντίστροφο εκκινητή. Οι αλληλουχίες εκκινητών των εκκινητών ΤΒΡ ήταν όπως περιγράφεται [8], [27]. δείκτης ποιότητας του RNA. (RQI & gt? 8) εκτιμήθηκε για 20 δείγματα που επιλέγονται τυχαία χρησιμοποιώντας Experion (έκδοση λογισμικού 3.2, Bio-Rad, Ναζαρέτ Eke, Βέλγιο)

στατιστικών μετρήσεων και Δεδομένων

Ανάλυση

GeNorm διατίθεται σε qbase + (Biogazelle, https://www.qbaseplus.com) χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό των Μ-αξίες και την ποσοτικοποίηση των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης. GeNorm είναι ένας αλγόριθμος που υπολογίζει ένα μέτρο της σταθερότητας της γονιδιακής έκφρασης (M-value) των επιλεγμένων γονιδίων αναφοράς. Αυτό γίνεται με τον υπολογισμό της κατά ζεύγη παραλλαγή (τυπική απόκλιση των λογαριθμικά μετασχηματισμένων αναλογιών έκφραση) του κάθε γονιδίου αναφοράς με όλα τα άλλα γονίδια αναφοράς. Η χαμηλότερη M-τιμή υποδεικνύει το γονίδιο με την υψηλότερη σταθερότητα έκφρασης. Σταδιακή αποκλεισμός του γονιδίου με την υψηλότερη τιμή M-επιτρέπει την κατάταξη των γονιδίων από άποψη σταθερότητας έκφρασης. Η ανάλυση όλων των επιμέρους κατάλογοι κατάταξης γονιδίου έγινε με τη χρήση του πακέτου R συνυπολογισμό βαθμού ονομάζεται «RankAggreg» [21]. RankAggreg χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η πλέον σταθερή γονίδιο αναφοράς σε όλα τα πειράματα. Rankaggreg είναι ένα πακέτο R για ανάλυση συνάθροιση κατάταξη. Χρησιμοποιήσαμε αυτό το πακέτο για την ανάλυση των επιμέρους κατάλογοι κατάταξης γονίδιο. Οι κατάλογοι αυτοί γονίδιο κατατάχθηκαν από την άποψη του Μ-αξίες τους και η ανάλυση συνάθροιση τάξη μας επέτρεψε να βρούμε το δυνατόν πλησιέστερα λίστα με όλες τις μεμονωμένες λίστες που δημιουργούνται από τα επιμέρους πειράματα. Πιο συγκεκριμένα, χρησιμοποιήσαμε το Cross-Εντροπία (CE) Μόντε Κάρλο αλγόριθμο που εφαρμόζονται σε αυτό το πακέτο το οποίο ξεκινά με τη δημιουργία τυχαίων λίστες και στη συνέχεια συγκλίνει προς το καλύτερο βέλτιστη κατάλογο μέσω μιας διαδικασίας επανάληψης που χρησιμοποιεί μια συνάρτηση απόστασης. απόσταση footrule σταθμισμένο Spearman που χρησιμοποιείται για το σκοπό αυτό και στην περίπτωσή μας το βάρος που χρησιμοποιείται είναι το M-αξία που παράγεται από τον αλγόριθμο GeNorm για κάθε γονίδιο στις επιμέρους λίστες.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

GeNorm V-τιμές των επιμέρους πειράματα

. GeNorm τιμή V χρησιμοποιείται για να καθοριστεί ο βέλτιστος αριθμός των γονιδίων αναφοράς. GeNorm υπολογίζει τη ζεύγη διακύμανση μεταξύ 2 διαδοχικών παράγοντες κανονικοποίησης (NFS). Ο παράγοντας κανονικοποίησης είναι ο γεωμετρικός μέσος της έκφρασης των επιλεγμένων γονιδίων αναφοράς. Ο παράγοντας κανονικοποίησης NF

n + 1 είναι ο γεωμετρικός μέσος του ΝΡ

ν συν ένα επιπλέον γονίδιο αναφοράς. V

2/3 είναι η διαφορά μεταξύ του NF

2 και NF

3, και ούτω καθεξής. Vandesompele

et al.

[4] πρότεινε 0.15 ως αποκοπής κάτω από την οποία δεν υπάρχει ανάγκη να συμπεριληφθεί ένα επιπλέον γονίδιο αναφοράς. (Α), νουτλίνη-3 θεραπεία νευροβλαστώματος κύτταρα. (Β), ATRA κατεργασμένα κύτταρα νευροβλαστώματος. (C), withaferin ένα επεξεργασμένο νευροβλάστωμα κύτταρα. (D), ΤΑΕ-684 αγωγή νευροβλαστώματος κύτταρα. (Ε), κύτταρα νευροβλαστώματος επιμολυσμένα με siRNAs έναντι Τ-UCRs. (F), κύτταρα νευροβλαστώματος επιμολυσμένα με premiR-1. (G), Τ-όλες τις κυτταρικές σειρές (Ε.Π.Μ.-όλα, όλα-SIL, και TALL-1) επιμολυσμένα με premiR-223 ή αρνητικός μάρτυρας premiR. (H), T-ALL κυτταρική σειρά Jurkat επιμολυσμένα με

PHF6

-targeting siRNA ή αρνητικού ελέγχου siRNA. (Ι), ΟΛΑ-Τ κυτταρικές σειρές (HSB-2 και PF-382) επιμολυσμένα με

PHF6

-targeting siRNA ή αρνητικού ελέγχου siRNA. (J), NSCL κυτταρική σειρά κυττάρων (H3122) που έλαβαν θεραπεία με crizotinib. (Κ), κυτταρική γραμμή μελανώματος (WM-9) επιμολυσμένα με siRNA κατά κυκλοφιλίνης-Β. (L), AML κυτταρική γραμμή (Κ562) που έλαβαν θεραπεία με JQ1. (Μ), ο καρκίνος των κυττάρων του μαστού γραμμή (MCF-7) υποβάλλεται σε επεξεργασία με JQ1. (Ν), του καρκίνου του μαστού κυτταρική γραμμή (SKRB-3) που έλαβαν θεραπεία με JQ1. (O), κυτταρική σειρά καρκίνου του προστάτη (PC-3) που έλαβαν θεραπεία με JQ1. (P), του παχέος κυτταρική σειρά (SW-620) που έλαβαν θεραπεία με JQ1. (Q), κυτταρική γραμμή νευροβλαστώματος (SJNB-12) που έλαβαν θεραπεία με JQ1. (R), τα κύτταρα MCF-7 σε κατεργασία με 90 διαφορετικές χημικές αναστολέων. (S), του τραχήλου της μήτρας καρκίνου κυτταρική σειρά (HeLa) που έλαβαν θεραπεία με 90 διαφορετικές χημικές αναστολείς

doi:. 10.1371 /journal.pone.0071776.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

Διασπορά των Μ-αξίες

. Θηκόγραμμα δείχνει τη διασπορά των Μ-αξίες του κάθε γονιδίων αναφοράς σε όλη al σύνολα δεδομένων

doi:. 10.1371 /journal.pone.0071776.s002

(ΔΕΘ)

Πίνακα S1.

Χημική αναστολείς. Ο κατάλογος των 90 χημικών αναστολέων και τα γονίδια που στοχεύουν

doi:. 10.1371 /journal.pone.0071776.s003

(XLSX)

αρχείου S1.

Πειραματικός σχεδιασμός και η χειραγώγηση των κυτταρικών σειρών.

Παροδικές επιμολύνσεις των κυττάρων SH-EP με τα siRNA εναντίον μεταγραφεί ultraconserved περιοχές, και τη βελτιστοποίηση της συγκέντρωσης των

ΡΗΡ-6

-targetting siRNAs στο Τ όλες τις κυτταρικές σειρές

doi:. 10.1371 /journal.pone.0071776.s004

(DOCX)

αρχείου S2.

κυτταρικές σειρές και καλλιέργεια των κυττάρων

. Πληροφορίες σχετικά με την προέλευση και τις συνθήκες καλλιέργειας των κυτταρικών σειρών

doi:. 10.1371 /journal.pone.0071776.s005

(DOCX)

Ευχαριστίες

Θα θέλαμε να ευχαριστώ Νουρτέν Yigit, Aline Eggermont, και Katrien Vanderheyden για τεχνική βοήθεια τους.