Αφηρημένο

Η ρεσβερατρόλη είναι μια πολλά υποσχόμενη chemopreventive παράγοντας που μεσολαβεί πολλούς κυτταρικούς στόχους που εμπλέκονται στον καρκίνο σηματοδότηση μονοπατιών. p53 έχει προταθεί ότι παίζει ένα ρόλο στις αντικαρκινικές ιδιότητες της ρεσβερατρόλης. Ερευνήσαμε ρεσβερατρόλη επαγόμενη κυτταροτοξικότητα σε Η1299 κύτταρα, τα οποία είναι μη-μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα κύτταρα που έχουν μια μερική διαγραφή του γονιδίου που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη ρ53. Τα αποτελέσματα για Η1299 κύτταρα συγκρίθηκαν με εκείνες για τρεις κυτταρικές γραμμές που εκφράζουν ιδιοσυστατικά άγριου τύπου ρ53: καρκίνου του μαστού MCF-7, adenocarcinomic κυψελιδική βασική Α549 επιθήλια και μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα Η460. δοκιμές βιωσιμότητας των κυττάρων αποκάλυψε ότι η ρεσβερατρόλη μείωσε τη βιωσιμότητα των τεσσάρων από αυτές τις κυτταρικές γραμμές σε ένα δόση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. MCF-7, Α549 και Η460 κύτταρα ήταν περισσότερο ευαίσθητα σε ρεσβερατρόλη από ήσαν Η1299 κύτταρα όταν εκτεθούν στο φάρμακο επί 24 ώρες σε συγκεντρώσεις πάνω από 100 μΜ. Η ρεσβερατρόλη αύξησε επίσης τα επίπεδα πρωτεΐνης ρ53 σε κύτταρα MCF-7 χωρίς να μεταβάλει τα επίπεδα mRNA p53, γεγονός που υποδηλώνει μετα-μεταφραστική τροποποίηση της πρωτεΐνης. Η ρεσβερατρόλη επαγόμενη κυτταροτοξικότητα σε αυτά τα κύτταρα ήταν εν μέρει προκαλούνται από ρ53 και περιελάμβανε την ενεργοποίηση κασπασών 9 και 7 και την διάσπαση της PARP. Σε Η1299 κύτταρα, ρεσβερατρόλη επαγόμενη κυτταροτοξικότητα ήταν λιγότερο έντονη και (σε ​​αντίθεση με τα κύτταρα MCF-7) ο κυτταρικός θάνατος δεν συνοδεύτηκε από την ενεργοποίηση της κασπάσης. Αυτά τα ευρήματα είναι συνεπή με την παρατήρηση ότι τα κύτταρα MCF-7 σημάνθηκαν θετικά με TUNEL μετά από έκθεση σε 100 μΜ ρεσβερατρόλη ενώ Η1299 κυττάρων κάτω από παρόμοιες συνθήκες δεν σημάνθηκαν με TUNEL. Η παροδική επιμόλυνση ενός γονιδίου p53-GFP άγριου τύπου προκάλεσε Η1299 κύτταρα να ανταποκρίνονται περισσότερο στις προ-αποπτωτικών ιδιότητες της ρεσβερατρόλης, ομοίως με τα πορίσματα στα κύτταρα p53-θετικά MCF-7. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν μία πιθανή θεραπευτική στρατηγική που βασίζεται στη χρήση της ρεσβερατρόλης για την αγωγή όγκων που είναι συνήθως αδιάφορα στις συμβατικές θεραπείες, λόγω της απώλειας της κανονικής λειτουργίας ρ53

Παράθεση:. Ferraz da Costa DC, Casanova FA, Quarti J, Malheiros MS, Sanches D, dos Santos PS, et al. (2012) παροδική επιμόλυνση ενός γονιδίου άγριου τύπου ρ53 Εναύσματα ρεσβερατρόλη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 7 (11): e48746. doi: 10.1371 /journal.pone.0048746

Επιμέλεια: Waldemar Debinski, Πανεπιστημίου Wake Forest, Ιατρική Σχολή, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 7η Φεβρουαρίου 2012? Δεκτές: 1 Οκτ του 2012? Δημοσιεύθηκε: 12 Νοέμβρη, 2012

Copyright: © 2012 Costa et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Τεχνολογικό (CNPq)? Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nivel Superior (CAPES)? Fundação de Amparo à Pesquisa Carlos Chagas Filho κάνει Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ)? και Fundação κάνουν τον καρκίνο της Βραζιλίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος είναι μια σημαντική ανησυχία για τη δημόσια υγεία σε όλο τον κόσμο, και ο αριθμός των θανάτων που σχετίζονται με τον καρκίνο αναμένεται να διπλασιαστεί τα επόμενα 50 χρόνια [1]. Τα επιδημιολογικά στοιχεία δείχνουν ότι οι διατροφικές συνήθειες είναι σημαντικοί παράγοντες κινδύνου που σχετίζονται με την ανάπτυξη του καρκίνου και ότι φυτοχημικά που βρίσκονται φυσικά στα φρούτα και τα λαχανικά μπορεί να μεσολαβεί μια σειρά από στόχους όγκου [2], [3]. Οι κλινικές εφαρμογές έχουν προταθεί για αυτές τις διαιτητικές βιοδραστικά μόρια λόγω της μεγάλης ικανότητάς τους να αναστέλλουν, να ανακτήσετε ή να καθυστερήσει πολλαπλές καρκινογόνες βήματα [4], [5], [6].

Η ρεσβερατρόλη (3,5,4 «-trihydroxy-

trans

-stilbene), που περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1940, είναι ένα φυσικό πολυφαινόλη που βρίσκεται σε μια ευρεία ποικιλία φυτών, συμπεριλαμβανομένων σταφύλια, τα μούρα, και τα φυστίκια. Αυτό το μόριο έχει ταξινομηθεί ως phytoalexin επειδή συντίθεται από τα φυτά σε απόκριση σε μία ποικιλία συνθηκών περιβαλλοντικό στρες, όπως η μυκητιασικές λοιμώξεις και την υπεριώδη ακτινοβολία [7], [8]. Η ρεσβερατρόλη βρίσκεται σε τόσο

σις

και

συναλλαγών

στερεοϊσομερείς μορφές? η

trans-ισομερές

είναι η μορφή που σχετίζεται με τις περισσότερες από τις βιολογικές δράσεις του μορίου. Η ρεσβερατρόλη ως διαιτητικό ένωση έχει περιγραφεί ως ισχυρός παράγοντας που είναι ικανός να πρόληψη των καρδιαγγειακών, φλεγμονωδών, και νευροεκφυλιστικές ασθένειες, συμπεριλαμβανομένης της παχυσαρκίας και του διαβήτη [7], [9]. Το μόριο είναι επίσης σε θέση να διαμορφώνει ένα ευρύ φάσμα μοριακών στόχων, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που εμπλέκονται στον καρκίνο μονοπατιών σηματοδότησης [8], [10].

Η αντικαρκινική δυναμικό της ρεσβερατρόλης αναγνωρίστηκε το 1997, όταν η ικανότητά του να αναστέλλει τα τρία στάδια της καρκινογένεσης (δηλαδή, έναρξη, προώθηση και εξέλιξη) για πρώτη φορά αποδείχθηκε [10]. Μετέπειτα μελέτες έχουν δείξει ότι το μόριο εμφανίζει αντικαρκινική δραστικότητα όταν δοκιμάζεται σε διάφορα πειραματικά μοντέλα [11], [12]. Αρκετές μελέτες έχουν προτείνει ότι οι μηχανισμοί που είναι υπεύθυνοι για τις χημειοπροληπτική ιδιότητες του μορίου συνδέονται στενά με τις αντιοξειδωτικές και αντι-φλεγμονώδεις ιδιότητες [13].

Η ρεσβερατρόλη συνδέεται με τη ρύθμιση των πολλαπλών κυτταρικών οδών, συμπεριλαμβανομένης της αναστολής του καρκινογόνου ενεργοποίησης, η διέγερση των ενζύμων καρκινογόνο αποτοξίνωση, η διαμόρφωση των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην εξέλιξη του καρκίνου και την απόπτωση [14], [15], [16], και η αναστολή της αγγειογένεσης [17]. Μελέτες δείχνουν επίσης ότι η ρεσβερατρόλη μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να ευαισθητοποιήσει τους όγκους σε συγκεκριμένα καρκίνο χημειοθεραπευτικά φάρμακα [18]. Συλλογικά, τα ευρήματα αυτά παρέχονται επαρκή αποδεικτικά στοιχεία για την εκτέλεση των κλινικών δοκιμών για να διερευνήσει τις χημειοπροληπτικές και χημειοθεραπευτικών ιδιότητες αυτής της βιοδραστικών ένωσης [4], [12].

p53 είναι ένας όγκος-καταστολέα πρωτεΐνη που διαδραματίζει ουσιαστικό ρόλο στην πρόληψη την ανάπτυξη του καρκίνου με την επαγωγή διακοπή του κυτταρικού κύκλου ή απόπτωση σε απόκριση προς γενοτοξικό στρες. Αυτή η πρωτεΐνη ρυθμίζεται κυρίως από την ubiquitin λιγάση MDM2, η οποία συνδέεται με την ρ53 και στοχεύει το για αποικοδόμηση στο πρωτεασώματα. Η κανονική λειτουργία ρ53 χάνεται ή αδρανής σε περίπου 50% των ανθρώπινων καρκίνων [19], [20], [21], [22].

Η ρεσβερατρόλη είναι σε θέση να διεγείρει ρ53-εξαρτώμενη κυτταρικό θάνατο στον ποντικό JB6 επιδερμική κυτταρική γραμμή [23], και η εμπλοκή της ρ53 στην αντι-καρκινογόνες λειτουργία της ρεσβερατρόλης έχει τεκμηριωθεί σε ένα ευρύ φάσμα κυττάρων [7], [16], [23], [24], [25], [ ,,,0],26]. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η απόπτωση εμφανίζεται μόνο σε κύτταρα που εκφράζουν άγριου τύπου ρ53, αλλά όχι σε ρ53-μεταλλαγμένο ή p53-ανεπαρκή κύτταρα [23], [27]. Ο ακριβής ρόλος της ρεσβερατρόλης σε ρ53-αρνητικές κυτταρικές γραμμές όγκου, που μπορεί να είναι ανθεκτικοί σε συνηθισμένους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, ως αποτέλεσμα της απώλειας της έκφρασης ρ53 ή λειτουργίας, δεν έχει μελετηθεί εκτενώς [28], [29], [30]. Είναι πολύ σημαντικό να καθοριστεί αν η επιμόλυνση του άγριου τύπου ρ53 είναι σε θέση να αποκαταστήσει τις προ-αποπτωτικά αποτελέσματα της ρεσβερατρόλης για το σκοπό της αξιολόγησης και άλλες τεχνικές γονιδιακής θεραπείας με στόχο τον καθορισμό ενός ελαττωματικού μόριο p53. Αρκετές μελέτες της γονιδιακής θεραπείας ρ53 έχουν αποδείξει την αποτελεσματικότητα αυτής της προσέγγισης δεν είναι μόνο σε κυτταρικές σειρές όγκων αλλά επίσης και σε κλινικές δοκιμές [31].

Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε την επίδραση της ρεσβερατρόλης σε μια κυτταρική γραμμή ότι φέρει μια μερική διαγραφή του γονιδίου p53, και ελέγξαμε την υπόθεση ότι η παροδική επιμόλυνση του p53 θα μπορούσε να προκαλέσει αυτά τα κύτταρα να γίνουν ικανά να ανταποκριθούν στις προ-αποπτωτικών ιδιότητες της ρεσβερατρόλης. Για να διερευνηθεί άμεσα αυτό το ζήτημα, επιμολυσμένα Η1299 κύτταρα, τα οποία δεν εκφράζουν το γονίδιο ρ53, και συνέκριναν τα αποτελέσματα με αυτά που ελήφθησαν σε MCF-7 ανθρώπινου καρκίνου του μαστού, μια κυτταρική γραμμή που έχει μελετηθεί εκτενώς και ότι εκφράζει ιδιοσυστατικά το άγριου τύπου γονίδιο p53.

Βρήκαμε ότι η παροδική επιμόλυνση γονιδίου ρ53-GFP άγριου τύπου προκαλεί Η1299 κύτταρα να γίνει πιο ευαίσθητο σε ρεσβερατρόλη και αποκρίνεται σε προ-αποπτωτικών ιδιότητες, ομοίως με τα ευρήματα σε κύτταρα MCF-7. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η εφαρμογή της ρεσβερατρόλης, σε συνδυασμό με άλλες μεθόδους για την προώθηση της δραστηριότητας ρ53 σε κύτταρα, όπως η γονιδιακή θεραπεία με τη χρήση του γονιδίου ρ53 άγριου τύπου ή χημικά που αποκαταστήσει τη λειτουργία ρ53, είναι μια πολλά υποσχόμενη νέα θεραπευτική στρατηγική για τη θεραπεία του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

1. Αντιδραστήρια

Όλα τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν αναλυτικής ποιότητας. Annexin V /κιτ ιωδιούχου προπιδίου Προσδιορισμός απόπτωσης, βόεια ινσουλίνη, ΜΤΤ (3,4,5-dimethiazol-2,5-διφαινυλτετραζόλιο βρωμίδιο), οξείδιο της φαινύλ, pifithrin-α, PMSF (φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο), PRIMA-1, αναστολείς πρωτεάσης κοκτέιλ (# 8340), και

trans-

ρεσβερατρόλη (3,5,4′-τριϋδροξυ

trans

-stilbene) αγοράστηκαν από την Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). Οκαδαϊκό οξύ και ΒΑΧ αναστολέα πεπτίδιο (V5) ήταν από τη Roche Applied Science (Indianapolis, IN, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Z-VAD-FMK [Z-Val-Ala-Asp (OMe) -CH2F] ήταν από την Calbiochem (San Diego, CA, USA). Z-LEHD-FMK ήταν από R &? D Systems (Minneapolis, ΜΝ, USA). ΫΜΕΜ (Τροποποιημένο κατά Dulbecco Μέσο Eagle), RPMI-1640, πενικιλίνη, στρεπτομυκίνη και ήταν από την Invitrogen (Carlsbad, CA, USA).

2. Κυτταρική καλλιέργεια

Ανθρώπινο μαστού κυτταρική γραμμή καρκινώματος MCF-7 (ρ53 άγριου τύπου), ανθρώπινο μη-μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα καρκίνωμα γραμμή Η1299 (άγριου-τύπου ρ53 (ρ53 αρνητικό), adenocarcinomic ανθρώπινο κυψελιδικό Α549 βασικοκυτταρικό επιθηλιακή κυτταρική γραμμή ), και ανθρώπινο μη-μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα καρκίνωμα γραμμή Η460 (ρ53 άγριου τύπου) ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC? Manassas, VA, USA). Τα κύτταρα MCF-7 καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει 1.0 g /L γλυκόζη, συμπληρωμένο με 2,0 g /L HEPES, 3,7 g /L διττανθρακικό νάτριο, 10% ορό εμβρύου μόσχου, και 5 μg /mL βόεια ινσουλίνη. Η1299, Α549 και Η460 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 που περιέχει 2.0 g /L γλυκόζη, συμπληρωμένο με 2,0 g /L HEPES, 1,5 g /L διττανθρακικό νάτριο, και 10% εμβρυϊκό βόειο ορό. Μονοπυρηνικά κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC) απομονώθηκαν και καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32]. Πενικιλλίνη (100 U /ml) και στρεπτομυκίνη (100 μg /mL) προστέθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας πριν από τη θεραπεία με ρεσβερατρόλη. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2.

3. ΜΤΤ κύτταρο μείωση βιωσιμότητας δοκιμασία

Τα κύτταρα σε 70-80% συρροή υποκαλλιεργήθηκαν σε μια 24 φρεατίων πλάκα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με

trans-

ρεσβερατρόλη αραιώνεται σε DMSO για 5 λεπτά, 24 ώρες ή 48 ώρες . Το μέσο καλλιέργειας στη συνέχεια απομακρύνθηκε, τα κύτταρα πλύθηκαν με ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS), και προστέθηκαν 0,5 mg /mL ΜΤΤ. Μετά από 3 ώρες στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2, ΜΤΤ αναρροφήθηκε προσεκτικά και η φορμαζάνη που παρήχθη διαλύεται με 0.4 Μ οξύ-ισοπροπανόλη. Οι έλεγχοι διεξήχθησαν με προσθήκη 0.5% DMSO σε πλάκες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε ως η διαφορά μεταξύ των απορροφήσεων σε μήκη κύματος 570 nm έναντι 650 [33].

4. Western blotting ανάλυση

Για την παρασκευή ολόκληρο κυτταρικά εκχυλίσματα για την κηλίδωση Western, το μέσο καλλιέργειας απομακρύνθηκε, και τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και λύθηκαν με υγρό άζωτο σε ένα ρυθμιστικό που περιέχει 5 mM Tris-HCl ρΗ 7,4, 10 mM EDTA, 1 mM Να

3νο

4, 5 mM NaF, 1 mM οξείδιο της φαινύλ, 1 μΜ οκαδαϊκό οξύ, 1 mM PMSF, και ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται από τους Lowry

κ.ά.

. (1951) [34], χρησιμοποιώντας αλβουμίνη βόειου ορού ως πρότυπο. Τα κυτταρολύματα (100 μα) διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE (10%), και οι διαχωρισμένες πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) μεμβράνες. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν για όλη τη νύχτα στους 4 ° C σε Τρις-ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα που περιέχει 1% Tween 20 (TBS-T) και 5% άπαχο γάλα και επωάστηκαν για 2 ώρες με το πρωτογενές αντίσωμα (1:10000). Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: αντι-ρ53 (DO-1), αντι-MDM2 (D-7), και αντι-GAPDH (0411) από την Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA) και αντι-κασπάση 9 (# 9502), αντι-κασπάση 7 (# 9492), αντι-PARP (# 9542), αντι-φωσφο-Chk2 (Thr68) (# 2661), και αντι-ρ21 (# 2946) από την Cell Signaling Technology (San Diego, CA, USA). Οι μεμβράνες πλύθηκαν με TBS-Τ και επωάστηκαν με ένα δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση (1:5000) για 1 ώρα. Ανοσοαντιδραστικές ζώνες έγιναν ορατές με ένα ECL Western Blotting Σύστημα Ανίχνευσης (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. GAPDH (γλυκεραλδεΰδης αφυδρογονάση 3-φωσφορικής) επίπεδα σε κυτταρολύματα χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος. Η πυκνομετρική ποσοτικοποίηση των ζωνών διεξήχθη χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ, έκδοση 1.43r (ΝΙΗ, USA).

5. Αντίστροφη μεταγραφάση-αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR)

Για την ημι-ποσοτικό προσδιορισμό της έκφρασης mRNA p53, ολικό RNA εκχυλίζεται και καθαρίζεται από Η1299 και MCF-7 κύτταρα χρησιμοποιώντας την Illustra RNAspin Mini Kit (GE Healthcare , Buckinghamshire, UK), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι συγκεντρώσεις RNA μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Φασματοφωτόμετρο NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific, Waltham, ΜΑ, USA). Συνολικά, 4 μg ολικού RNA χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή cDNA με τους ακόλουθους εκκινητές: p53 FWD: 5′-GCT TCT TGC ΑΤΤ CTG GGA CAG-3 ‘? p53 rev: 5’-CTT CTT ΤΟΟ CTG GGG AGA GG-3 ‘(626bp)? GAPDH FWD: ATC ACC ATC TTC CAG GAG GCG? GAPDH rev: ΚΔ GCT TCA CCA CCT TCT TG (574bp). Η πυκνομετρική ποσοτικοποίηση των ζωνών προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ImageJ λογισμικό, έκδοση 1.43r.

6. διαμόλυνση Η1299 κυττάρων

Το πλήρους μήκους ρ53-EGFP πλασμιδίου ελήφθη από Genscript Corp. (Piscataway, NJ, USA). Τα πειράματα παροδικής επιμόλυνσης πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση Fugene (Roche Diagnostics, Indianapolis, ΙΝ, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για την ανάλυση του GFP-p53, τα κύτταρα επιστρώθηκαν επί γυάλινο πυθμένα πιάτα 48 ώρες πριν από την έναρξη της θεραπείας. Τα κύτταρα σημάνθηκαν με 10 μg /mL Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) για 30 λεπτά και πλύθηκαν τρεις imes με PBS [35]. Εικόνες συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο (LSM Meta 510, Carl Zeiss, Oberkochen, Γερμανία) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό πρόγραμμα περιήγησης Image Zeiss LSM, έκδοση 4,2,0121.

7. Annexin V /ιωδιούχο προπίδιο δοκιμασία απόπτωσης

Τα κύτταρα σε 70-80% συρροή απλώθηκαν πάνω σε 24-φρεατίων γυάλινο πυθμένα και οι δοκιμασίες διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το αννεξίνη V /ιωδιούχο προπίδιο Δοκιμασία Απόπτωσης κιτ σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή . Εικόνες συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο (LSM Meta 510, Carl Zeiss, Oberkochen, Γερμανία). Για να ληφθούν οι εικόνες χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα μήκη κύματος: αννεξίνη V-FITC (EX /EM ~488 nm /~540 nm) και ιωδιούχο προπίδιο (EX /EM ~495 nm /~635 nm). Εικόνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό πρόγραμμα περιήγησης Image Zeiss LSM, έκδοση 4,2,0121.

8. ΤΟΥΝΕΛ δοκιμασία

τρανσφεράσης μεσολάβηση τέλος επισήμανση dUTP nick τελική δεσοξυνουκλεοτιδιλική (ΤΟΥΝΕΛ) πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ Click-it® ΤΟΥΝΕΛ Alexa Δοκιμασία Fluor® Imaging (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι θετικοί μάρτυρες ελήφθησαν με την κατεργασία των κυττάρων με δεοξυριβονουκλεάση Ι, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα δείγματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα συνεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού (Carl Zeiss International, Oberkochen, Germany). Εικόνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα περιήγησης Εικόνα Zeiss LSM, έκδοση 4,2,0121.

9. Στατιστική ανάλυση

Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου (S.E.M.). Η ανάλυση των δεδομένων και μη γραμμικές παλινδρομήσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα λογισμικού SigmaPlot (ν. 10.0, Systat Inc., CA, USA) ενσωματωμένη με το λογισμικό SigmaStat (ν. 3.2, Systat Inc. CA, USA). Μαθητή

t-test

χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση μέσων, και

σ

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

1.. Η ρεσβερατρόλη μειώνει ανθρώπινου μαστού και η κυτταρική βιωσιμότητα καρκίνου του πνεύμονα σε ένα χρόνο- και δοσο-εξαρτώμενο τρόπο

Επειδή το ρ53 έχει προταθεί ότι παίζει ένα ρόλο στις αντικαρκινικές ιδιότητες της ρεσβερατρόλης, ελέγξαμε τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα αυτής της ένωσης σε η MCF-7 καρκίνου του μαστού, καρκίνο του πνεύμονα Α549 και κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα Η460 (που εκφράζουν άγριου τύπου ρ53) και στην ρ53 ανεπάρκεια μη-μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα γραμμή Η1299 καρκίνος. Όπως αναμενόταν, η έκφραση του mRNA p53 επιβεβαιώθηκε με RT-PCR με τον ρ53-θετικές κυτταρικές σειρές αλλά όχι σε Η1299 κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για να ελεγχθεί αν η ρεσβερατρόλη είχε κυτταροτοξική δράση, κάθε μία από τις κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκε με διάφορες συγκεντρώσεις ρεσβερατρόλης κυμαίνονται από 10 έως 500 μΜ για 5 λεπτά, 24 ώρες, και 48 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με την δοκιμασία μείωσης ΜΤΤ. Η ρεσβερατρόλη μειωμένη MCF-7, Α549, Η460 και Η1299 κυτταρική βιωσιμότητα σε ένα χρόνο- και δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 1). Η ευαισθησία των MCF-7, Α549 και Η460 κυττάρων ήταν μεγαλύτερη από εκείνη των Η1299, ιδιαίτερα όταν τα κύτταρα εκτέθηκαν για 24 ώρες σε συγκεντρώσεις ρεσβερατρόλης υψηλότερες από 100 μΜ. Η έκθεση σε 500 μΜ ρεσβερατρόλη για 24 ή 48 ώρες μείωσε την βιωσιμότητα των κυττάρων MCF-7 σε σχεδόν μηδέν (Εικ. 1Α). Πολύ παρόμοια προφίλ παρατηρήθηκαν για Α549 και Η460 κύτταρα (Σχ. 1C και 1D). Αντίθετα, περίπου 50% και 20% των κυττάρων Η1299 παρέμειναν βιώσιμα σε 24 και 48 ώρες, αντίστοιχα (Εικ. 1Β). Το όχημα DMSO (0,5%) δεν επηρεάζει τη βιωσιμότητα των κυττάρων ελέγχου (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Δοκιμάσαμε επίσης τα αποτελέσματα της ρεσβερατρόλης στην μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC), μια λιγότερο μετασχηματισμένη κυτταρική γραμμή σε σύγκριση με τις κυτταρικές γραμμές καρκίνου που μελετήθηκαν. Η ρεσβερατρόλη εμφανίζεται μια μη σημαντική επίδραση επί PBMC βιωσιμότητας (Σχ. S1), γεγονός που υποδηλώνει ότι η κυτταροτοξική δράση αυτής της ένωσης είναι ειδική για καρκινικές κυτταρικές σειρές.

MCF-7 (Α), Η1299 (Β), Α549 (C), και τα κύτταρα Η460 (D) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις

trans-ρεσβερατρόλη

(10-500 μΜ) αραιωμένη σε DMSO για 5 λεπτά, 24 ώρες και 48 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ. Η τελική συγκέντρωση του DMSO στο μέσο καλλιέργειας ήταν 0,5%. Τα αποτελέσματα (n = 4) εκφράζονται ως ποσοστό% της τιμής του μάρτυρα, και τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι μέση τιμή ± S.E.M.

Η

2. Η ρεσβερατρόλη επαγόμενη κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα MCF-7 διαμεσολαβείται από

ενεργοποιήσεως ρ53

Τα κυτταρικά επίπεδα της ρ53 διερευνήθηκε σε κύτταρα ρεσβερατρόλη επεξεργασμένα MCF-7. Τα κύτταρα εκτίθενται σε διάφορες συγκεντρώσεις της ρεσβερατρόλης για 24 ώρες, και τα επίπεδα του ρ53 και ΜΌΜ2 προσδιορίστηκαν με κηλίδωση Western ανάλυση (Σχ. 2Α). Η ρεσβερατρόλη σε συγκεντρώσεις 100 και 200 ​​μΜ προκάλεσε σημαντική (

σ

& lt? 0,05) δοσοεξαρτώμενη αύξηση του συνολικού επιπέδου των p53. Αυτή η αύξηση δεν συνοδεύτηκε από αύξηση κυτταρικό επίπεδο του MDM2. Η αναλογία ρ53 /MDM2, όπως προσδιορίζεται με πυκνομετρική ποσοτικοποίηση, αποκάλυψε ότι τα αυξημένα επίπεδα της ρ53 μετά από διέγερση με ρεσβερατρόλη δεν συνοδεύονται από αύξηση στην αποδόμηση πρωτείνης MDM2 μεσολάβηση. επίπεδα του mRNA p53 δεν άλλαξε όταν τα κύτταρα MCF-7 υπέστησαν αγωγή με ρεσβερατρόλη υπό τις ίδιες πειραματικές συνθήκες (Εικ. 2Β), γεγονός που υποδηλώνει ότι η αύξηση των κυτταρικών επιπέδων της πρωτεΐνης ρ53 δεν οφείλονταν σε μια διέγερση της έκφρασης γονιδίου ρ53.

Επιδράσεις της ρεσβερατρόλης στην ρ53 και τα επίπεδα πρωτεΐνης MDM2 (Α) και στα επίπεδα του mRNA p53 (Β) σε κύτταρα MCF-7. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις ρεσβερατρόλης ή DMSO (0,5%) για 24 ώρες. Τα επίπεδα πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν με κηλίδωση Western ανάλυση όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. έκφραση GAPDH χρησιμοποιήθηκε σαν ένας έλεγχος. Στο πάνελ Α και Β τα δεδομένα που αντιπροσωπεύουν 3-5 ανεξάρτητα πειράματα, και οι εντάσεις μπάντα έχουν παρασταθεί γραφικά με κάθε ομάδα εικόνων. (C) MCF-7 κυτταρική βιωσιμότητα σε παρουσία του ρ53-ειδικό αναστολέα pifithrin-α. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 30 μΜ pifithrin για 1 ώρα πριν από την κατεργασία με διάφορες

trans-ρεσβερατρόλη

συγκεντρώσεις (50-200 μΜ). Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ. Τα αποτελέσματα (n = 3) εκφράζονται ως% του ελέγχου, και τα δεδομένα που εμφανίζονται είναι μέσες ± S.E.M. *

σ

& lt?. 0.05 σε σύγκριση με τον αντίστοιχο έλεγχο (

t-test

Student)

Η

δεν παρατηρήθηκε Α ρεσβερατρόλη μεσολάβηση αύξηση των επιπέδων της p53 όταν η έκθεση των κυττάρων σε αυτή την ένωση για 24 ώρες ακολουθήθηκε από την απομάκρυνση της ρεσβερατρόλης από το μέσο καλλιέργειας για επιπλέον περίοδο 24 h (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η έκθεση των κυττάρων MCF-7 σε 200 μΜ ρεσβερατρόλη προώθησε τη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης σημείου ελέγχου-2 (Chk2, μία πρωτεΐνη που εμπλέκεται σε διάφορες κυτταρικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων ενεργοποίησης ρ53 σε απόκριση προς βλάβη DNA) στο Thr68 (Εικ. 3Α) και αύξησε το κυτταρικό επίπεδο του ρ21, το οποίο είναι ένα από τα σημαντικότερα ρ53-αποκριτικών γονιδίων (Σχ. 3Β).

Επιδράσεις της ρεσβερατρόλης στην φωσφο-Chk2 (Α) και στα επίπεδα της πρωτεΐνης ρ21 (Β) σε κύτταρα MCF-7. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις

trans-

ρεσβερατρόλης ή DMSO (0,5%) για 24 ώρες. Τα επίπεδα πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν με κηλίδωση Western ανάλυση όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. έκφραση GAPDH χρησιμοποιήθηκε σαν ένας έλεγχος. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητα πειράματα, και οι εντάσεις ζώνης αναπαριστώνται γραφικά με κάθε ομάδα εικόνων.

,

σ

& lt? 0,05 σε σύγκριση με τον αντίστοιχο έλεγχο (

t-test

Student)

Η

Για να προσδιορίσετε αν η ρεσβερατρόλη που προκαλείται MCF. -7 κυτταρικός θάνατος που προκαλείται από ρ53, η δοκιμασία ΜΤΤ αναγωγή διεξήχθη υπό την παρουσία pifithrin-α, ένας ειδικός αναστολέας ρ53 που μπλοκάρει την μεταγραφή του p53-γονιδίων που αποκρίνονται και επίσης αποκλείει ρ53 απόπτωση που διαμεσολαβείται [36] (Σχ. 2C ). Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε pifithrin-α 30 μΜ επί 1 ώρα και έπειτα υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις ρεσβερατρόλης για 24 ώρες. Παρατηρήσαμε ένα μεγαλύτερο αριθμό των βιώσιμων κυττάρων υπό αυτές τις συνθήκες (Σχ. 2C, γκρι ράβδοι) από ό, τι εν απουσία pifithrin-α (Σχ. 2C, μαύρες ράβδοι), γεγονός που υποδηλώνει την πιθανή εμπλοκή της ρ53 σε ρεσβερατρόλη-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο.

Ερευνήσαμε επίσης τα αποτελέσματα της PRIMA-1, ενός ενεργοποιητή ρ53 φάρμακο, για τις ρ53-θετικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών. PRIMA-1 σε μία συγκέντρωση 100 μΜ μειωμένη κυτταρική βιωσιμότητα, και ο συνδυασμός αυτού του φαρμάκου με 100 μΜ ρεσβερατρόλη ενίσχυσε την κυτταροτοξική δράση της ρεσβερατρόλης σε MCF-7, Α549 και Η460 κύτταρα (Εικ. 4).

Τα κύτταρα εκτέθηκαν για 24 ώρες σε 100 μΜ

trans-

ρεσβερατρόλη, 100 μΜ PRIMA-1, ή 100 μΜ

trans-

ρεσβερατρόλη συν 100 μΜ PRIMA-1 100 μΜ. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν 3 ανεξάρτητα πειράματα.

Η

3. Η ρεσβερατρόλη δεν επάγει απόπτωση σε Η1299 ρ53-ηυΙΙ κύτταρα

Για να δοκιμαστεί εάν ρεσβερατρόλη που επάγεται θάνατος των κυττάρων MCF-7 είναι απόπτωση με τη μεσολάβηση, εκτελέσαμε μία δοκιμασία ιωδιούχου αννεξίνης V /προπίδιο. Η ρεσβερατρόλη στα 100 μΜ επάγεται εξωτερίκευσης φωσφατιδυλοσερίνη (μια διαδικασία που δείχνει απόπτωση), όπως φαίνεται από τα αννεξίνη V-επισημασμένα κύτταρα στην εικόνα 5. Αυτό το αποτέλεσμα καταργήθηκε με την παρουσία pifithrin-α, υποδεικνύοντας ότι η ρ53-διαμεσολαβούμενη απόπτωση που συμβαίνουν στην κύτταρα. Προπίδιο κύτταρα ιωδιούχο σημασμένο δεν ανιχνεύθηκαν υπό τις ίδιες συνθήκες. Μια δοκιμασία TUNEL εκτελέστηκε επίσης MCF-7 και Η1299 κύτταρα. Η ρεσβερατρόλη που προκαλείται από αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο παρατηρήθηκε σε κύτταρα MCF-7 αλλά όχι σε Η1299 κύτταρα (Εικ. 6). Η ρεσβερατρόλη απόπτωση σε κύτταρα MCF-7 συνοδεύθηκε από σημαντική πρωτεολυτική διάσπαση της κασπάσης 9 και κασπάσης 7 (εικ. 7Α). Πολυ (ADP) πολυμεράση ριβόζη διασπάστηκε σε δύο μικρά θραύσματα από την έκθεση σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις ρεσβερατρόλης. Αριθ ενεργοποίηση κασπασών 9 και 7 ανιχνεύθηκε σε p53-αρνητικά Η1299 κύτταρα (Σχ. 7Β). Για να ελεγχθεί η πιθανότητα ότι η ρεσβερατρόλη-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο που διαμεσολαβείται από την κασπάση μονοπατιών σηματοδότησης σε MCF-7 αλλά όχι σε Η1299, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία μείωσης ΜΤΤ παρουσία του αναστολέα κασπάσης τηγάνι Z-VAD-FMK (Εικ. 4C). Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 50 μΜ Ζ-VAD-FMK για 1 ώρα και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις ρεσβερατρόλης για 24 ώρες. Ο αριθμός των κυττάρων βιώσιμων MCF-7 ήταν σημαντικά υψηλότερη στην παρουσία 100 ή 200 μΜ ρεσβερατρόλη (Σχ. 7C, γκρι ράβδοι) από ό, τι εν απουσία του αναστολέα (εικ. 7C, μαύρες ράβδοι), γεγονός που υποδηλώνει ότι οι κασπάσες εμπλέκονται σε ρεσβερατρόλη επαγόμενη από τον κυτταρικό θάνατο. Z-VAD-FMK δεν επηρέασε την βιωσιμότητα των Η1299 κυττάρων κάτω από τις ίδιες συνθήκες. Η πιθανή συμμετοχή των κασπασών διερευνήθηκε επίσης με τη χρήση της κασπάσης 9-ειδικός αναστολέας Ζ-LEDH-FMK. MCF-7 αλλά όχι Η1299 έδειξε ένα υψηλότερο ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων σε σύγκριση με τον έλεγχο με την παρουσία Ζ-LEDH-FMK (Εικ. S2).

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με

trans-

ρεσβερατρόλη (100 μΜ) ή DMSO (0,5%) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το αννεξίνη V /ιωδιούχο προπίδιο Δοκιμασία απόπτωσης κιτ (Sigma Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Σε ένα πείραμα, τα κύτταρα εξετέθησαν σε 30 μΜ pifithrin για 1 ώρα πριν από την αγωγή με

trans-ρεσβερατρόλη

. Οι εικόνες συλλέχθηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία (LSM Meta 510, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany). Αννεξίνη V-FITC φθορισμό: EX /EM ~488 nm /~540 nm? και ιωδιούχου προπιδίου φθορισμού: EX /EM ~495 nm /~635 nm. Κάθε εικόνα που παρουσιάζεται είναι αντιπροσωπεύει δύο ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με

trans-

ρεσβερατρόλη (100 μΜ) και έχει την ένδειξη χρησιμοποιώντας Δοκιμασία Click-it® ΤΟΥΝΕΛ Alexa Fluor® Imaging kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). ΤΟΥΝΕΛ φθορισμού: EX /EM ~495 nm /519 nm. Κάθε εικόνα αντιπροσωπεύει δύο ανεξάρτητα πειράματα.

Η

(Α) Ενεργοποίηση της κασπάσης 9, κασπάσης 7, και PARP με ρεσβερατρόλη σε κύτταρα MCF-7. (Β) Επίπεδα της κασπάσης 9 και κασπάσης 7 σε Η1299 κύτταρα που εκτίθενται σε ρεσβερατρόλη. Για στύπωση Western ανάλυση, τα κύτταρα εκτίθενται σε διάφορες συγκεντρώσεις της ρεσβερατρόλης. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν 3-4 ανεξάρτητα πειράματα, και οι εντάσεις μπάντα έχουν παρασταθεί γραφικά με κάθε ομάδα εικόνων. (C) MCF-7 και Η1299 κύτταρα προ-επωάστηκαν με 50 μΜ του αναστολέα κασπάσης Ζ-VAD-FMK για 1 ώρα πριν από την κατεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις

trans-ρεσβερατρόλη

. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ. Τα αποτελέσματα (n = 3) εκφράζονται ως% του ελέγχου, και τα δεδομένα που εμφανίζονται είναι μέσες ± S.E.M. *

σ

& lt? 0,05 σε σύγκριση με τον αντίστοιχο έλεγχο (Μαθητή

t-test

)

Η

Εξετάσαμε την πιθανή εμπλοκή του Bax στο resveratrol-. επαγόμενη απόπτωση κυττάρων MCF-7 με μέτρηση των κυτταρικών επιπέδων της πρωτεΐνης αυτής και με την εφαρμογή ενός συγκεκριμένου αναστολέα πεπτίδιο Βαχ (V5) μετά την επεξεργασία των κυττάρων με ρεσβερατρόλη. Παρατηρήσαμε υψηλότερα επίπεδα Bax σε κύτταρα κατεργασμένα με 100 μΜ ρεσβερατρόλη και υψηλότερους αριθμούς των βιώσιμων κυττάρων με την παρουσία V5, γεγονός που υποδηλώνει την εμπλοκή αυτού του προ-αποπτωτική πρωτεΐνη στο MCF-7 κυτταρικό θάνατο καταρράκτη (Σχ. S3).

4. κύτταρα Η1299 απαιτούν ρ53 να υποστούν απόπτωση σε απόκριση σε ρεσβερατρόλη έκθεση

Για να καθοριστεί εάν η έκφραση της ρ53 σε κύτταρα Η1299 προκαλεί τα κύτταρα να καταστούν ευαίσθητα στις επιδράσεις της ρεσβερατρόλης, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς παροδικής διαμόλυνσης του άγριου-τύπου ρ53 -ΟΡΡ πλασμίδιο. Μία δοκιμασία ΜΤΤ διεξήχθη σε p53-επιμολυσμένα Η1299 για να δοκιμαστεί η κυτταροτοξικότητα της ρεσβερατρόλης σε αυτά τα κύτταρα. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 μΜ ρεσβερατρόλη για επιπλέον 24 ώρες. Η κυτταροτοξική επίδραση της ρεσβερατρόλης στην Η1299 κύτταρα ενισχύθηκε (δηλαδή, τα κύτταρα έγιναν πιο επιρρεπή σε αυτή την ένωση) μέσω της έκφρασης p53 (Εικ. 8Α). Οι επιδράσεις της ρεσβερατρόλης στην Η1299 κύτταρα όπως επίσης και σε κύτταρα MCF-7 φαίνεται να εξαρτώνται από τη λειτουργία του ρ53 άγριου τύπου. Η παροδική επιμόλυνση των p53-GFP ενεργοποιείται ρεσβερατρόλη επαγόμενη απόπτωση σε Η1299 (Σχ. 8Β). Το ποσοστό της αποτελεσματικότητας επιμόλυνσης που ελήφθη σε αυτά τα πειράματα ήταν περίπου 60% (Εικ. 8C). Συγχωνευμένη εικόνες από μικροσκόπιο φθορισμού (Σχ. 8D) δείχνουν ότι τα περισσότερα από τα ρ53-επιμολυσμένα κύτταρα που υφίστανται απόπτωση (λευκά βέλη).

(Α) p53-επιμολυσμένα και μη επιμολυσμένα Η1299 κύτταρα επεξεργάστηκαν με ρεσβερατρόλη ( 100 μΜ). Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ. Τα αποτελέσματα (n = 4) εκφράζονται ως% του ελέγχου, και τα δεδομένα που εμφανίζονται είναι μέσες ± S.E.M. *

σ

& lt? 0,05 σε σύγκριση με τον αντίστοιχο έλεγχο (Μαθητή

t

-τεστ). (Β) Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν παροδικά με το πλήρους μήκους ρ53-EGFP πλασμιδίου και υποβάλλεται σε επεξεργασία με ρεσβερατρόλη (100 μΜ). Τα κύτταρα στη συνέχεια κάντε διπλό επισημαίνονται με Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) και με Δοκιμασία Click-it® ΤΟΥΝΕΛ Alexa Fluor® Imaging (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Hoeschst φθορισμού: EX /EM ~350 nm /461 nm. ΤΟΥΝΕΛ φθορισμού: EX /EM ~495 nm /519 nm. Στα νέα εικόνες, τα βέλη δείχνουν κυτταρικό θάνατο των κυττάρων p53-επιμολυσμένα. (Γ) Το ποσοστό της απόδοσης επιμόλυνσης για Η1299 κύτταρα. (Δ) Η ποσοτικοποίηση των αποπτωτικών και μη αποπτωτικά επιμολυσμένα Η1299 κύτταρα μετά από έκθεση σε ρεσβερατρόλη.

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε τις επιδράσεις της ρεσβερατρόλης για το p53-ανεπαρκή μη μικροκυτταρικό ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου του πνεύμονα Η1299 σε σύγκριση με τις επιδράσεις της ρεσβερατρόλης στην καρκινικών κυτταρικών γραμμών (ανθρώπινου καρκίνου του μαστού MCF-7, Α549 καρκίνου πνεύμονος και Η460) που εκφράζουν άγριου τύπου ρ53. Η υπόθεση που ελέγχθηκε ήταν ότι η επιμόλυνση p53 σε Η1299 κύτταρα, τα οποία φέρουν ένα μερικώς αφαιρεθέν γονίδιο p53, καθιστά αυτά τα κύτταρα ικανά να ανταποκρίνονται σε ρεσβερατρόλη προ-αποπτωτικών ιδιότητες. MCF-7, Α549 και Η460 κύτταρα βρέθηκαν να είναι πιο ευαίσθητα σε ρεσβερατρόλη που επάγεται από κυτταροτοξικά αποτελέσματα ήταν Η1299 κύτταρα. Η ρεσβερατρόλη που επάγεται κασπάσης με τη μεσολάβηση απόπτωση σε κύτταρα MCF-7 αλλά όχι σε Η1299 κύτταρα και παροδική επιμόλυνση του άγριου τύπου ρ53 που παρέχονται Η1299 ευαίσθητα στις προ-αποπτωτικά αποτελέσματα της ρεσβερατρόλης.

Η1299 κύτταρα ήταν περισσότερο ανθεκτικά σε ρεσβερατρόλη , ιδιαίτερα σε υψηλές συγκεντρώσεις, απο ότι ήταν τα p53-θετικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές. Η έλλειψη έκφρασης p53 σε Η1299 μπορεί να ευθύνεται για μεγαλύτερη αντοχή του σε κυτταρικό θάνατο, σε σύγκριση με τα κύτταρα p53-θετικά MCF-7. Η1299 δεν υφίστανται απόπτωση μετά από έκθεση σε ρεσβερατρόλη, σε αντίθεση με MCF-7. Άλλοι μηχανισμοί κυτταρικού θανάτου μπορεί να σχετίζονται με αυτό το αποτέλεσμα?

π.χ.

., Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι η ρεσβερατρόλη ενεργοποιεί μια αλληλεπίδραση των διεργασιών που λαμβάνουν χώρα κατά τη διάρκεια της απόπτωσης, αναστολή του κυτταρικού κύκλου, και αυτοφαγία στα καρκινικά κύτταρα [37].

Η ρεσβερατρόλη που προκαλείται κυτταροτοξικότητα και την απόπτωση είχαν διαμεσολαβείται εν μέρει από ρ53 σε κύτταρα MCF-7, όπως υποδεικνύεται από τα πειράματα κυτταρικής βιωσιμότητας πραγματοποιείται παρουσία του ρ53-ειδικό αναστολέα pifithrin-α. Τα ενδογενή επίπεδα πρωτεΐνης ρ53 ήταν σημαντικά υψηλότερη στην παρουσία της ρεσβερατρόλης, η οποία είναι σε συμφωνία με άλλες αναφορές [38], [39]. Στην παρούσα μελέτη, η αύξηση των επιπέδων ρ53 δεν ακολουθήθηκε από αύξηση των επιπέδων MDM2, υποδηλώνοντας ότι η υψηλή αναλογία ρ53 /MDM2 αντανακλούσε μια χαμηλότερη ουβικιτίνη εξαρτώμενη επίπεδο αποικοδόμησης της ρ53, πιθανότατα ως αποτέλεσμα της σταθεροποιήσεως μηχανισμούς που λειτουργούν επί της πρωτείνης .