Αφηρημένο

Υπήρχαν μελέτες που διερευνούν τις επιπτώσεις των ευρυζωνικών υπέρυθρης ακτινοβολίας (IR) για τον καρκίνο των κυττάρων, ενώ οι επιρροές της μέσης υπέρυθρης ακτινοβολίας (MIR) είναι ακόμη άγνωστες. Σε αυτή τη μελέτη, ένας εκπομπός MIR με ζώνη μήκους κύματος εκπομπής στην περιοχή 3-5 μm αναπτύχθηκε για να ακτινοβολήσει Α549 κύτταρα αδενοκαρκινώματος πνεύμονα. Διαπιστώθηκε ότι η έκθεση MIR ανέστειλαν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και μορφολογικές αλλαγές που επάγεται δια μεταβολής της κυτταρικής κατανομής των συστατικών του κυτταροσκελετού. Χρησιμοποιώντας ποσοτική PCR, βρήκαμε ότι MIR προωθούνται τα επίπεδα έκφρασης του ΑΤΜ (αταξία τηλαγγειεκτασία μεταλλαγμένη), ATR (αταξία-τηλαγγειεκτασία και Rad3-συνδεδεμένων και Rad3 σχετίζονται), ΤΡ53 (πρωτεΐνη ρ53 όγκου), ρ21 (CDKN1A, εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάση αναστολέα 1Α) και GADD45 (διακοπή αύξησης και βλάβη του DNA επαγώγιμη), αλλά μειώθηκε τα επίπεδα έκφρασης της κυκλίνης Β κωδικοποίησης γονιδίων, CCNB1 και CCNB2, καθώς και CDK1 (εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάση 1). Η μείωση των επιπέδων έκφρασης πρωτεΐνης CDC25C, κυκλίνη Β1 και την φωσφορυλίωση των CDK1 σε Thr-161 συνολικά υποδηλώνουν G

2 /M σύλληψη έγινε σε κύτταρα Α549 με MIR. σχηματισμός εστιών επιδιόρθωση του DNA του DNA δίκλωνα σπασίματα (DSB) δείκτης γ-Η2ΑΧ και αισθητήρα 53BP1 προκλήθηκε με αγωγή MIR, υπονοεί ο MIR επαγόμενη G

2 /M διακοπή του κυτταρικού κύκλου προήλθε από DSB. Αυτή η μελέτη δείχνει ένα πιθανό ρόλο για τη χρήση του MIR στη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα από την έναρξη της DSB και μπλοκάροντας την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου

Παράθεση:. Chang ΗΥ, Shih ΜΗ, Huang HC, Tsai SR, Χουάν HF, Lee SC ( 2013) Μέση υπέρυθρη ακτινοβολία Προκαλεί G

2 /M κύκλου κυττάρου σε Α549 κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα. PLoS ONE 8 (1): e54117. doi: 10.1371 /journal.pone.0054117

Επιμέλεια: Jasti Rao, University of Illinois College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9η Σεπτεμβρίου 2012? Αποδεκτές: 6 Δεκέμβρη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 15 Ιανουαρίου του 2013

Copyright: © 2013 Chang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο, την Ταϊβάν (NSC 100 έως 2120-M-002-014, NSC 99 έως 2.621-B-002-005-my3, NSC 99 έως 2.621-B-010-001-my3) και το Εθνικό Ταϊβάν Πανεπιστήμιο αιχμής Πρόγραμμα Καθοδήγησης Έρευνας (10R70602C3 και 101R4000). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

νεόπλασμα είναι η κύρια αιτία θανάτου παγκοσμίως, και ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο [1]. Δεδομένου ότι η συνήθεια του καπνίσματος μειώνεται, η συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του πνεύμονα έχει επιδεινωθεί σε πολλές χώρες αναλόγως [2]. Εκτός κάπνισμα, άλλοι παράγοντες όπως ο αμίαντος, ραδόνιο ή τα μέταλλα ανοίγματα βαριά συμβάλλουν επίσης σε καρκίνο του πνεύμονα [3]. Στατιστικά στοιχεία από το Διεθνή Οργανισμό 2008 Έρευνας για τον Καρκίνο (IARC) αξιολόγηση των κινδύνων συνάγεται ότι ο καρκίνος του πνεύμονα σκοτώνει περίπου 1,4 εκατομμύρια ανθρώπους ετησίως σε παγκόσμιο επίπεδο [4]. Λόγω της υψηλής εμφάνισης και θνησιμότητα του καρκίνου του πνεύμονα, η σχετική θεραπεία προχωρά για να λύσει αυτά τα προβλήματα.

Η ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία από την ηλιακή ακτινοβολία μπορεί να διαιρεθεί σε πολλές περιοχές, συμπεριλαμβανομένων των γ-ray, x-ray, υπεριώδη (UV), ορατό φως, υπέρυθρη (IR) ακτινοβολία, φούρνο μικροκυμάτων και ραδιοκυμάτων. Μεταξύ της ηλιακής ακτινοβολίας, IR φως με μήκη κύματος που κυμαίνονται από 0.76-1000 μm μπορεί να διαιρεθεί σε τρεις περιοχές, εγγύς υπέρυθρο (NIR, 0,76 έως 1,5 μm), μέσο υπέρυθρο (MIR, 1.5 έως 5.6 μm) και πολύ-υπέρυθρες ( FIR, 5,6 έως 1000 μm). Εφαρμογές IR έχουν ευρέως ιδρύθηκε στην καθημερινή χρήση και κλινικούς σκοπούς, συμπεριλαμβανομένης της δερματικής μικροκυκλοφορίας, την επούλωση των πληγών, αισθητήρες αερίου, και η μέτρηση εξ αποστάσεως θερμοκρασίας [5].

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η NIR το έναυσμα για μια οπισθοδρομική μιτοχονδριακή απάντηση σηματοδότησης προκύπτουν ROS μεσολάβηση μεταλλοπρωτεϊνάσης-1 (ΜΜΡ-1) παραγωγή μέσω ενεργοποιείται από μιτογόνο κινασών πρωτεΐνης (MAPKs) μονοπάτι [6]. Επίσης έδειξε ότι NIR προστατεύεται ανθρώπινων δερματικών ινοβλαστών από UV-επαγόμενη κυτταροτοξικότητα με διέγερση Hsp27 που εμποδίζει αποπτωσώματος συναρμολόγηση, ένα αρχικό συμβάν της απόπτωσης [7], [8].

In vivo

μελέτες έδειξαν ότι NIR αύξησε την αγγειογόνο επαγωγέα αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα και μείωσε την αγγειογενετική αναστολέα θρομβοσπονδίνη-2, ξεκινώντας δερματική αγγειογένεση σε ανθρώπινο δέρμα [9]. Επίσης, η έκθεση του FIR προωθούνται αγγειογένεσης σε ανθρώπινα μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα μαζί με την ενεργοποίηση των ρ38 και εξωκυτταρικό σήμα ρυθμίζεται κινάσης σηματοδότησης [10], η ενισχυμένη κυκλοφορία του αίματος στο δέρμα [11], [12] και ασκείται αντιφλεγμονώδη δραστικότητα σε αγγειακό ενδοθήλιο [13]. Ανέφερε επίσης ότι το FIR ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό μέσω της ενίσχυσης της έκφρασης του κυκλικού ΑΜΡ που εξαρτώνται από παράγοντα μεταγραφής (ATF) 3 σε καρκινικά κύτταρα των οποίων η βασική έκφραση επιπέδου της πρωτεΐνης θερμικού σοκ (HSP) 70Α ήταν χαμηλές [14], [15].

Τα αποτελέσματα της MIR σε καρκινικά κύτταρα, ωστόσο, παραμένουν άγνωστα. Αυτή η μελέτη είχε ως στόχο να διερευνήσει τις επιπτώσεις της MIR με ζώνη μήκους κύματος στα καθεστώτα 3-5 μm στις εξαιρετικά πολλαπλασιασμένο καρκινικά κύτταρα. Για το σκοπό αυτό, αναπτύξαμε ένα πομπό MIR και περιορίζεται το μήκος κύματος MIR στα 3 έως 5 μm. Δεδομένου ότι το μοριακό Ο-Η, Ν-Η και Ο-Η δεσμοί μπορούν να διεγερθούν για να δημιουργήσει τέντωμα δονήσεις κατά 3-5 μm υπέρυθρο, αναμένεται ότι το σημαντικό βιοχημική αντίδραση θα επηρεαστούν από την ακτινοβολία του υπέρυθρου με μήκος κύματος σε αυτό το εύρος [16]. Έχουμε αποκαλύψει ότι MIR μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων, προκάλεσε σημαντικές αλλαγές στη διάταξη του κυτταροσκελετού και επάγεται G

2 /M διακοπή του κυτταρικού κύκλου που θα μπορούσε να εισφέρει επαγωγή διαλείμματα διπλού-κλώνων (DSB) στο DNA κατά μήκος του ATM /ΑΤΚ-p53 -p21 άξονα.

Αποτελέσματα

το μήκος κύματος του MIR περιορίστηκε στο 3-5 μm και η θερμοκρασία του Πολιτισμού Medium ήταν συνεπής στους 37 ° C

η μεγάλη μέλανος μπάντα πηγή επινοήθηκε για να παρέχει ευρεία ζώνη MIR και στεγάζεται σε ένα μεταλλικό θάλαμο για να αποφευχθεί η διατάραξη από το περιβάλλον (Σχήμα 1). Με την αυξανόμενη της θερμοκρασίας θέρμανσης, η ισχύς εκπομπής του υποστρώματος πυριτίου ανυψώθηκε αντίστοιχα. Η ένταση της ακτινοβολίας ορίστηκε σε 3 mW /cm

2 ρυθμίζοντας την θερμοκρασία θέρμανσης και τη μέτρηση του μεγέθους του μετρητή ισχύος THORLAB PM100D. Την εξάλειψη των επιπτώσεων της θερμότητας του MIR, θέτουμε το ανακύκλωσης δοχείο ψύξης της μηχανής στους 28 ° C για την ψύξη του αέρα στο θάλαμο όπου παρέχεται έτσι η πηγή MIR διατηρεί τη θερμοκρασία του μέσου καλλιέργειας στους 37 ° C. Η διάταξη της συσκευής απεικονίζεται στο Σχήμα 1 Β.

(Α) Η πλάγια όψη της πηγής blackbody μπάντα. (Β) Σχηματικό διάγραμμα που δείχνει τη ρύθμιση για το πείραμα ακτινοβόλησης MIR. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν πάνω σε πλάκες 12 φρεατίων και καλλιεργήθηκαν σε επωαστήρα με 100% υγρασία, στους 37 ° C και με 5% CO

2.

Η

Ο κυτταρικού πολλαπλασιασμού Α549 κύτταρα παρέμειναν αμετάβλητες στο MIR Exposed Medium

για να διακρίνουμε το αν οι επιδράσεις της MIR εμφανίστηκε απευθείας πάνω καλλιεργημένα κύτταρα ή έμμεσα μέσω τροποποιήσεως του μέσου των κυττάρων, το μέσο καλλιέργειας εκτέθηκε σε MIR για 48 ώρες πριν από την προσθήκη του στην κυτταρική καλλιέργεια. Αφού τα κύτταρα Α549 (2 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο) σπάρθηκαν σε ένα 12-φρεατίων, αντικαταστήσαμε το μέσο καλλιέργειας με MIR-εκτεθειμένα ή μη εκτεθειμένα μέσο για περαιτέρω 48 ώρες και στη συνέχεια προσδιορίζεται η κυτταρική βιωσιμότητα με δοκιμασία ΜΤΤ. Παρατηρήσαμε ότι κυτταρικό πολλαπλασιασμό των κυττάρων Α549 δεν επηρεάσθηκε σημαντικά κάτω από MIR εκτεθειμένη μέσο σε σύγκριση με μη εκτεθειμένα μέσο (Σχήμα S1). Από εδώ, εφαρμόσαμε μια περίοδο 48 ωρών από την έκθεση στα κύτταρα για όλα τα πειράματα, εκτός αν ορίζεται διαφορετικά.

MIR ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και μετέβαλε την μορφολογία των κυττάρων Α549

Για να διερευνηθεί η επίδραση του MIR σε καρκινικά κύτταρα, κύτταρα αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα Α549 χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί η κυτταροτοξικότητα του MIR και τους φυσιολογικούς ινοβλάστες πνεύμονα MRC-5 δοκιμάσθηκαν για σύγκριση. Τα κύτταρα (2 χ 10

4) επιστρώθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας 12 φρεατίων όλη τη νύκτα πριν από την έκθεση MIR. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με ΜΤΤ δοκιμασία και μπλε τρυπάνης καταμέτρηση των κυττάρων με βάση μετά την έκθεση MIR. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων Α549 ήταν σημαντικά καταστέλλεται με έκθεση MIR για 48 ώρες (Εικόνα 2Α), ενώ η ανάπτυξη και η μορφολογία του MRC-5 κύτταρα δεν επηρεάστηκαν από αγωγή MIR (Σχήμα S2A, S2B). Είναι ενδιαφέρον, μπορούμε αποκάλυψε μορφολογικές αλλαγές στα κύτταρα Α549 μετά έκθεση MIR. Παρατηρήσαμε ότι MIR-εκτεθειμένα κύτταρα Α549 ήταν πιο στρογγυλεμένο σχήμα, διευρυμένη σε μέγεθος, και σχηματίζεται ένα ακτινωτό ποδιά κάτω από αντίθεσης φάσης μικροσκοπική εξέταση (Σχήμα 2Β). Τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι MIR μπορούσε ρυθμίζουν τη δυναμική του κυτταροσκελετού η οποία προσδιορίζει την κυτταρική μορφολογία.

(Α) Οι αριθμοί των κυττάρων μετρήθηκαν στα 0, 24 και 48 ώρες μετά την έκθεση MIR χρησιμοποιώντας Trypan blue και ένα αιμοκυτόμετρο. Οι μέσες αριθμούς κυττάρων ελέγχου (που δεν έχουν εκτεθεί) και θεραπείες έκθεση MIR εκφράστηκαν ως μέσο ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα. **

P

& lt? 0,01. (Β) εικόνες των κυττάρων παρατηρήθηκαν με μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης μετά από 48 ώρες έκθεσης MIR. Τα βέλη δείχνουν τις ακτινικές ποδιές της διευρυμένης κύτταρα. μπαρ κλίμακας αντιπροσωπεύει 50 μm.

Η

MIR έκθεσης Ενεργός την αναδιοργάνωση της ακτίνης νημάτων, βινκουλίνης και μικροσωληνίσκων

Η κυτταροσκελετού παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του κυτταρικού σχήματος [17], [18] , οι και οι δύο νημάτια ακτίνης και μικροσωληνίσκων είναι γνωστό ότι επηρεάζουν το σχηματισμό και την κατανομή των εστιακές συμφύσεις κυττάρων [17] που καθορίζουν τη μορφολογία των κυττάρων και κινητικότητα. Για να γίνει διάκριση μεταξύ των επιδράσεων της MIR για κυτταροσκελετού, εκτελέσαμε χρώση ανοσοφθορισμού για να εξετάσει κατά πόσον οι δύο σημαντικά συστατικά του κυτταροσκελετού, νημάτια ακτίνης και μικροσωληνίσκων, καθώς και η εστιακή βινκουλίνης μόριο προσκόλλησης που ενέχονται στην παρούσα μορφολογική αλλαγή. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι MIR προκάλεσε μια σημαντική μείωση στην F-ακτίνη που περιέχουν ίνες στρες, όπως προσδιορίζεται με χρώση με ροδαμίνη-σημασμένο phalloidin (Σχήμα 3). Περαιτέρω, τα νημάτια ακτίνης παρουσίασαν ένα πυκνό πλέγμα από unpolarized καθεστώς και ο βινκουλίνης συγκεντρώθηκε γύρω από την περιφέρεια του κυττάρου σε MIR-εκτεθειμένα κύτταρα (Σχήμα 3), υπονοώντας ότι MIR μπορεί να αναστέλλει τη μετανάστευση των κυττάρων με τη ρύθμιση της αναδιοργάνωσης των νημάτων της ακτίνης και της διανομής των βινκουλίνης [ ,,,0],19]. Από την άλλη πλευρά, οι μικροσωληνίσκοι διανεμήθηκαν στα περιπυρηνική κυτταροπλασματικές περιοχές μετά τη θεραπεία MIR (Σχήμα 4). Αυτή η ειδική κατανομή των μη κανονικών θραυσμάτων μικροσωληνίσκων προτείνει ότι θα μπορούσε να προκαλέσει MIR G

2 /M διακοπή του κυτταρικού κύκλου, όπως καταδεικνύεται προηγουμένως [20], [21].

Τα κύτταρα σπάρθηκαν επί γυάλινων καλυπτρίδων σε πλάκες 12 φρεατίων , που εκτίθενται σε MIR για 48 ώρες, σταθερό για χρώση και οπτικοποιήθηκαν με μικροσκοπία φθορισμού. νημάτια ακτίνης κολλήθηκαν με ροδαμίνη-σημασμένο phalloidin (κόκκινο), βινκουλίνης σημάνθηκε με αντι-βινκουλίνης αντίσωμα ποντικού και το αντίστοιχο FITC- συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα αντι-ποντικού IgG (πράσινο), και οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI (μπλε). μπαρ κλίμακας αντιπροσωπεύει 10 μm. Τα βέλη υποδεικνύουν τη θέση του βινκουλίνης.

Η

Τα κύτταρα σπάρθηκαν επί γυάλινων καλυπτρίδων σε πλάκες 12 φρεατίων, που εκτίθενται σε MIR για 48 ώρες, που καθορίζεται για χρώση και οπτικοποιείται με μικροσκοπία φθορισμού. Οι μικροσωληνίσκοι σημάνθηκαν με αντίσωμα α-τουμπουλίνης και του αντίστοιχου συζευγμένο με FITC δευτερογενές αντίσωμα (πράσινο), και οι πυρήνες επισημάνθηκαν με DAPI (μπλε). μπαρ κλίμακας αντιπροσωπεύει 10 μm.

Η

Ρυθμιζόμενη MIR έκθεσης το επίπεδο έκφρασης mRNA του G

2 /M ρυθμιζόμενα γονίδια σε Α549 κύτταρα

Δεδομένου ότι η κατανομή των κυτταροσκελετού συνεπάγεται πιθανό ρόλο του MIR στη ρύθμιση εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, είναι κρίσιμο να εξεταστεί η έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται σε G

μετάβαση 2-M περαιτέρω επιλέγονται για να επικυρωθεί. Το σημείο ελέγχου G

2 κυττάρων /Μ κύκλο ανταποκρίνεται στις βλάβες στο DNA και περιλαμβάνει την ενεργοποίηση της αταξίας-τηλαγγειεκτασία μεταλλαγμένα (ATM) και αταξία-τηλαγγειεκτασία και Rad3 σχετίζονται πρωτεΐνες (ATR) [22]. Τόσο ATM και ΑΤΚ ενεργοποιούν ρ53 με φωσφορυλίωση της Ser15 σε απόκριση σε βλάβη του DNA, αυξάνοντας έτσι την μεταγραφή της σύλληψης της ανάπτυξης και επαγώγιμο γονίδιο βλάβη DNA (GADD45) και ρ21, τα οποία απαιτούνται για την αναστολή της έκφρασης των βασικών ρυθμιστές του G

2 /M μετάπτωσης, εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάση 1 (CDK1) και κυκλίνης Β [23], [24], [25], [26]. Η έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στην επαγωγή G

2 /M σύλληψης αυξήθηκαν σε MIR επεξεργασμένα Α549 κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων ΑΤΜ, ATR, ρ53, GADD45A, GADD45B, και ρ21 (Σχήμα 5Α). Αντίθετα, τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της CDK1, CCNB1 και CCNB2 μειώθηκαν μετά MIR έκθεση (Σχήμα 5Α). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η έκθεση MIR ενεργοποιεί τις εκφράσεις του ΑΤΜ, ATR, ρ53, και τα γονίδια ρ21 σε απόκριση σε βλάβη του DNA και ρυθμίζει τα γονίδια για τον έλεγχο της G

2 /Μ εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου.

Τα κύτταρα εκτέθηκαν να MIR για 48 ώρες, και συλλέχθηκαν για RNA και την εξαγωγή της πρωτεΐνης. (Α) Η γονιδιακή έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στην ρύθμιση της G

2 /M μετάπτωσης (χ-άξονας). Ο γ-άξονας δείχνει τις σχετικές ποσότητες μεταγραφής υπολογίζεται χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ΔΔCt με GAPDH ως γονίδιο αναφοράς ενισχύθηκε από κάθε δείγμα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση ± δ.ϋ. (

n

= 3). *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0.001. επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης (Β) εξετάστηκαν με κηλίδα Western με ακτίνη ως εσωτερικό έλεγχο. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές. (Γ) Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του περιεχομένου DNA. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε MIR για 48 ώρες. Κύτταρα από έξι ανεξάρτητα πειράματα συλλέχθηκαν για την ανάλυση κατανομής του κυτταρικού κύκλου. (Δ) Το ποσοστό των κυττάρων σε κάθε φάση ελήφθη με ανάλυση πολλαπλών κύκλων.

Η

MIR έκθεσης Καταργήθηκε η έκφραση της Cdc25C και Κυκλίνης Β1, και Μειώθηκε η φωσφορυλίωση της CDK1

Το κύτταρο πρόοδο του κύκλου από την G

2 έως Μ φάση ρυθμίζεται από ενεργοποίηση των CDK1, των οποίων η δραστηριότητα εξαρτάται από το συντονισμό με κυκλίνη Β [27], [28]. Η ενεργοποίηση του συμπλόκου CDK1 /κυκλίνης Β διατηρείται μέσω φωσφορυλίωσης σε Thr161 και αποφωσφορυλίωση στο Thr14 και Tyr15 της CDK1 [27], [28]. Η αποφωσφορυλίωση των καταλοίπων Thr14 και Tyr15 σε CDK1 καταλύεται από Cdc25C φωσφατάση. Θεωρείται ως ένα βήμα περιορισμού του ρυθμού για G

2 έναρξη της μίτωσης [27], [29]. Λαμβάνοντας υπόψη το ρόλο του συμπλέγματος Β CDK1 /κυκλίνης και Cdc25C στη ρύθμιση G

2 έως μετάπτωσης φάσης Μ, αξιολογήσαμε εάν η έκθεση MIR μετέβαλε την πρωτεΐνη έκφραση του CDK1, κυκλίνη Β1, και Cdc25C, καθώς και η φωσφορυλίωση της CDK1. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης CDK1 στις Thr161 και τα επίπεδα της κυκλίνης Β1 και Cdc25C ήταν όλα μειώνονται σε κύτταρα κατεργασμένα με MIR (Σχήμα 5Β). Αυτό δείχνει ότι η έκθεση MIR που προκαλείται από ένα τυπικό G

2 /M του κυτταρικού κύκλου σύλληψης σε κύτταρα Α549 με τη ρύθμιση της κυκλίνης Β1 και έκφραση Cdc25C, και φωσφορυλίωση CDK1.

MIR έκθεσης Είχε ως αποτέλεσμα του κυτταρικού κύκλου σύλληψης σε G

2 /M φάση

επόμενο εξέτασε κατά πόσον η κατανομή του κυτταρικού κύκλου των Α549 επλήγησαν από MIR ακτινοβολία. Για να αποκτήσετε το περιεχόμενο DNA, εκτελέσαμε κυτταρομετρία ροής για την ανάλυση ΡΙ-επισημασμένα κύτταρα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα κύτταρα σε G

2 /M πληθυσμού αυξήθηκε στο πλαίσιο της έκθεσης MIR. Συντονισμένα, η G

2 /M ρυθμιστές και οι δύο δραστηριοποιείται στο μεταγραφικό, μεταφραστικό και μετα-μεταφραστική τους επίπεδα, οδηγώντας στη συσσώρευση των κυττάρων στο G

2 /M φάση.

Ενεργοποιήθηκε MIR έκθεσης colocalization της 53BP1 και γ-H2AX Πυρηνική εστίες σε απάντηση δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS) που προκαλείται βλάβη του DNA

από MIR ενεργοποιημένο τον άξονα /ATR-p53-p21 ΑΤΜ το οποίο είναι το μονοπάτι σημείου ελέγχου βλάβης του DNA, είναι ζωτικής σημασίας να διερευνήσει κατά πόσον η MIR προκάλεσε βλάβη του DNA στα κύτταρα Α549. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η πρόσδεση ογκοκατασταλτικό ρ53 πρωτεΐνη (53BP1) και γ-Η2ΑΧ συμμετέχουν στο ATM-εξαρτώμενη DNA μονοπάτι σηματοδότησης βλάβης και σχηματίζουν πυρηνικών εστίες σε απόκριση σε ιοντίζουσα ακτινοβολία προκαλείται βλάβη του DNA [30], [31]. Για να εξεταστεί αυτό, κύτταρα Α549 μονιμοποιήθηκαν με ακετόνη και χρωματίστηκαν για 53BP1 και γ-Η2ΑΧ μετά από έκθεση MIR. Εμείς εμφάνισε ότι 53BP1 (Σχήμα S3A) και γ-Η2ΑΧ (σχήμα S3b) έχουν dispersedly εντοπισμένη στους πυρήνες των μη εκτεθέντα κύτταρα, αλλά σχηματίζονται πολλοί διακεκριμένοι subnuclear εστίες σε απόκριση προς MIR. Δείξαμε επίσης ότι οι 53BP1 και γ-H2AX εστίες colocalized σε nucei του MIR εκτίθενται κυττάρων. Ο σχηματισμός και το συνεντόπισης του 53BP1 εστιών /γ-Η2ΑΧ είχαν μειωθεί κατά προεπεξεργασίας ή της ταυτόχρονης θεραπείας 10 mM ROS καθαριστή NAC (σχήμα 6). Μπορούμε να υποθέσουμε ότι MIR επάγεται G

2 /M του κυτταρικού κύκλου σύλληψης θα μπορούσε να προκύψει από ROS μεσολάβηση βλάβη του DNA των οποίων παρατηρήθηκαν οι δείκτες βλάβης 53BP1 και γ-Η2ΑΧ εστίες σε αυτή τη μελέτη.

Τα κύτταρα σπάρθηκαν επάνω σε η γυάλινη καλυπτρίδα σε πλάκα 12 φρεατίων, η έκθεση με MIR για 48 ώρες παρουσία ή απουσία 10 mM Ν-ακετυλο-κυστεΐνη (NAC). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με NAC για 1 ώρα πριν από την έκθεση MIR (NAC 1 h) ή συν-επεξεργάζονται σε όλη την έκθεση για 48 ώρες (NAC). Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν για χρώση και οπτικοποιήθηκαν με μικροσκοπία φθορισμού. 53BP1 σημάνθηκε με αντι-53BP1 αντίσωμα κουνελιού και αντιστοιχούσε FITC-συζευγμένο αντίσωμα αντι-κουνελιού IgG (πράσινο), γ-Η2ΑΧ σημάνθηκε με αντίσωμα αντι-γ-Η2ΑΧ ποντικού μετά αντιστοιχούσε ΡΕ-συζευγμένο αντίσωμα IgG αντι-ποντικού (κόκκινο), και οι πυρήνες επισημάνθηκαν με DAPI (μπλε). μπαρ κλίμακας αντιπροσωπεύει 10 μm.

Η

Συζήτηση

Επειδή οι μοριακές αλλαγές που εμπλέκονται στη ρύθμιση της προόδου του κυτταρικού κύκλου συνοδεύεται από μια αποτυχία να συλλάβουν τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, η αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων παρεμβαίνοντας με τον κυτταρικό κύκλο είναι μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για αντικαρκινική θεραπεία. Σε αυτή τη μελέτη, παρατηρήσαμε ότι η έκθεση MIR μπορούν να αναστείλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Α549 (Σχήμα 2Α), και επίσης να οδηγήσει σε μια διευρυμένη, ακτινικά ποδιά και η μορφολογία των κυττάρων στρογγυλεμένο σχήμα (Σχήμα 2Β) επηρεάζοντας τη διάταξη και τη διανομή των νηματίων ακτίνης (Σχήμα 3), εστιακή προσκόλληση (Σχήμα 3), και μικροσωληνίσκους (Σχήμα 4). Η περιπυρηνική κατακερματισμένη κατανομή των μικροσωληνίσκων είναι συνεπής με το κύτταρο μορφολογία που παρατηρήθηκε κατά το G

2 /M του κυτταρικού κύκλου σύλληψης, το οποίο περαιτέρω επικυρωθεί με την ανάλυση κατανομής του κυτταρικού κύκλου, την έκφραση του γονιδίου και της πρωτεΐνης ρύθμιση των ρυθμιστών της G

2 /M σημείο ελέγχου (Σχήμα 5). Σε προχωρημένο, αποδείξαμε επίσης ότι MIR θα μπορούσε να προκαλέσει σχηματισμό και colocalization 53BP1 και γ-H2AX πυρηνικό εστίες (Σχήμα 6) σε απόκριση σε βλάβη του DNA που συνήθως ενεργοποιεί οδού ATM /ATR-p53-p21 με αποτέλεσμα G

2 /M κυττάρων διακοπής κύκλου.

MIR είναι το μέρος του φωτός από την ηλιακή ακτινοβολία που μπορεί να προκαλέσει βλάβη του DNA με άμεση διέγερση του DNA ή έμμεσο μηχανισμό που περιλαμβάνει διέγερση άλλων κυτταρικών χρωμοφόρα [32]. Η διαδικασία άμεσης διέγερσης που προκαλείται από ακτινοβολία μικρού μήκους κύματος, όπως UVB (280-315 nm) και UVC (100 έως 280 nm) και ως επί το πλείστον οδηγεί να παράγουν διμερή κυκλοβουτανίου πυριμιδίνης και φωτοπροϊόντα, τα οποία παράγονται με απορρόφηση της ακτινοβολίας από το DNA [32 ]. Από την άλλη πλευρά, η έμμεση μηχανισμός εισφέρει αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS), που παράγεται από ενδογενείς φωτοευαισθητοποιητές. Η έμμεση βλάβη στο DNA που προκαλείται από μεγαλύτερο μήκος κύματος της ακτινοβολίας άνω των 320 nm, όπως UVA (315-400 nm) και πλησίον του ορατού φωτός, στην οποία το DNA απορροφά μόνο ασθενώς [33], [34]. Ακτινοβολία με μεγαλύτερο μήκος κύματος έτσι απορροφάται από φωτοευαισθητοποιητών για την παραγωγή ROS. Μετά την απορρόφηση του φωτός UVA, ενδογενή φωτοευαισθητοποιητή περάσουν σε μια κατάσταση τριπλέτας και τη μεταφορά της ενέργειας να παράγουν μονήρες οξυγόνο [35]. Αυτά UVA ακτινοβολημένα φωτοευαισθητοποιητές περιλαμβάνουν φλαβινών [36], NADH /NADPH [37], ουροκανικό οξύ [38] και μερικές στερόλες [39]. Λόγω του μικρού χρόνου ημίσειας φορά σε κύτταρα, το μονήρες οξυγόνο είναι παρόν μόνο μετά την ακτινοβολία [40]. Ωστόσο, ROS μπορεί να παρουσιαστεί για μια παρατεταμένη περίοδο μετά την έκθεση σε ακτινοβολία, διότι οι πρόσθετες ROS μπορεί να παραχθεί με αρχική είδη [41]. Η ρίζα ανιόντος υπεροξειδίου (

• O

2

-), υπεροξείδιο του υδρογόνου (H

2O

2), και ρίζα υδροξυλίου (

• ΟΗ) είναι ανήκε στην ομάδα ROS, όλα από τα οποία μπορεί να δημιουργηθούν με ενδογενή μηχανισμό ως παραπροϊόντα του φυσιολογικού μιτοχονδριακής δραστικότητας ή εξωγενές στρες [42].

Αφού το εξωγενές στρες που προκαλείται επίπεδο ROS είναι δραματικά υψηλότερα από το κύτταρο μπορεί να εξαλείψει, εμφανίζεται το οξειδωτικό στρες και οδηγεί σε οξειδωτική βλάβη του DNA από διασταυρώσεων DNA πρωτεΐνη, βάση και ζάχαρη τροποποίηση, αποπουρίνωση ή deprimidination [43], [44], [45], [46], [47]. Η οξειδωτική βλάβη του DNA που προκαλείται από ROS μπορεί να πυροδοτήσει αντιδράσεις σημείο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου συμπεριλαμβανομένης της πρόσληψης των 53BP1 και γ-H2AX που ακολουθείται από την υποβάθμιση της CDC25C για G

2 /M σύλληψη όπως παρατηρήσαμε, έτσι παρέχει πρόσθετο χρόνο για την επιδιόρθωση του DNA [48], [49]. Επιπλέον, NIR έχουν βρεθεί να παράγουν ROS παράγονται από τα μιτοχόνδρια, και κυτόχρωμα

γ

οξειδάσης έχουν προταθεί ως μια πιθανή φωτοδέκτη [6], [50]. Τα αποδεικτικά στοιχεία που δείχνουν ότι η IR θα μπορούσε να επιταχύνει την οξειδωτική αντίδραση φωσφορυλίωσης στα μιτοχόνδρια με την ακτινοβόληση φωτοϋποδοχείς, όπως oxidatse κυτοχρώματος c και NADH. Η ενισχυμένη ποσοστό στην οξειδωτική φωσφορυλίωση δημιουργεί υψηλότερες έτσι ROS συμβάλλει στην έμμεση ζημιά στο DNA.

Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι η έκθεση MIR κατέστειλε το επίπεδο των πρωτεϊνών των CDC25C και κυκλίνης Β1, και ανέστειλε την φωσφορυλίωση της CDK1. Προς τα κάτω ρύθμιση του CDC25C θα εμποδίσει την ενεργοποίηση των CDK1, με αποτέλεσμα την διάσπαση της κυκλίνης Β1 και την πρόληψη της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου από το G

2 έως Μ φάση. Επιπλέον, έχουμε εκθέσει ότι 53BP1 andγ-H2AX σχηματισμό πολυάριθμων subnuclear εστίες στην ανταπόκριση στη θεραπεία MIR. 53BP1 παίρνει μέρος στην ATM-εξαρτώμενη DNA μονοπάτι βλάβη σηματοδότησης και σχηματίζει πυρηνικών εστίες σε απόκριση σε ιοντίζουσα ακτινοβολία προκαλείται βλάβη του DNA [30], [31], ενώ γ-Η2ΑΧ διευκολύνει την πρόσληψη ενός αριθμού πρωτεϊνών απόκριση βλάβης, όπως BRCA1, MDC1 και RAD51 για το DNA επισκευαστικά [51], [52]. Είναι πιθανό ότι η έκθεση MIR επάγεται G

2 /M σύλληψης προκαλείται από βλάβη του DNA, αν και το μήκος κύματος του MIR είναι κοντά στο NIR τα οποία είναι δύσκολο να προκαλέσει άμεση ζημία στο DNA. Εδώ, έχουμε υποθέτουν ότι η έκθεση MIR μπορεί να απορροφηθεί από ενδογενείς φωτοευαισθητοποιητή ανυψώνοντας έτσι ROS και προκαλώντας την οξειδωτική βλάβη του DNA.

Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι το υπεροξείδιο του υδρογόνου που προκαλείται G

2 /M του κυτταρικού κύκλου σύλληψης και επηρέασε την οργάνωση της μικροσωληνίσκους και νημάτια ακτίνης αναμεταδίδουν την ικανότητα για τη μείωση των οξειδωμένων πρωτεϊνών του κυτταροσκελετού ή την ισορροπία της θειόλης διάσπαση [51], [52], [53]. υπεροξείδιο του υδρογόνου αυξάνεται μονομερή της τουμπουλίνης, αλλά μειώθηκε το πολυμερισμένου τουμπουλίνης που υποδηλώνει το υπεροξείδιο του υδρογόνου που προκαλείται αποπολυμερισμού των μικροσωληνίσκων. Σε αυτή τη μελέτη, η έκθεση MIR προκάλεσε την περιπυρηνική διανομή και πυκνά συσσωμάτωση των μικροσωληνίσκων μειώνοντας έτσι τα δίκτυα μικροσωληνίσκων. Η παρατήρηση αυτή είναι παρόμοια με τη στόχευση των μικροσωληνίσκων φάρμακα, όπως Vinca αλκαλοειδή [54]. Η περιπυρηνική κατανομή των μικροσωληνίσκων συνεπάγεται ότι η έκθεση MIR θα μπορούσε να προκαλέσει οξειδωτικό στρες έτσι δικτύων ενοχλητικό μικροσωληνίσκων.

Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι η έκθεση MIR προκαλούμενη απόκριση βλάβης του DNA. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η γ-Η2ΑΧ πυρηνικών εστίες βρέθηκε να colocalized με πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην επιδιόρθωση ομολογία ανασυνδυασμό και nonhomologousend-σύνδεσης (NHEJ) [55]. Άλλες πρωτεΐνες επισκευής, συμπεριλαμβανομένων MCD1 /NFBD1 και 53BP1, ήταν επίσης τεκμηριωμένες για να αλληλεπιδρούν με γ-H2AX να σχηματίσουν πυρηνικά εστίες [56]. Προηγούμενες εκθέσεις δείχνουν ότι διαμορφωτικές αλλαγές στην 53BP1 προκαλείται από φωσφορυλίωση 53BP1 από ΑΤΜ εκθέτοντας έτσι τον τομέα της χρωματίνης δέσμευσης που συμμετέχει άμεσα στην επιδιόρθωση του DNA DSBs με την ενεργοποίηση του DNA λιγάση IV /XRCC4 συγκρότημα στην οδό ΝΗΕΙ [57]. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι η έκθεση MIR σχηματίζεται πυρηνική εστίες 53BP1 και γ-H2AX (Σχήμα 6) υποδηλώνει ότι η έκθεση MIR επάγουν επιδιόρθωση του DNA σε απόκριση σε βλάβη DAN.

Εν ολίγοις, αυτή η μελέτη έκθεμα MIR του μήκος κύματος σε 3-5 μm μπορεί να αλλάξει την οργάνωση της ακτίνης, μικροσωληνίσκων και βινκουλίνης, και να προκαλέσουν αναστολή στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου μέσω της ενεργοποίησης ATM άξονας /ΑΤΚ-p53-p21 σε απόκριση σε βλάβη του DNA, και η Cdc25C ρυθμίζουν μονοπάτι παράλληλα με αποτέλεσμα σε ρύθμιση προς τα κάτω της αποφωσφορυλίωσης σε CDK1 και κυκλίνης Β ειδικότερα, η μελέτη μας δείχνει τα πρώτα στοιχεία σχετικά με την ανασταλτική δράση του MIR στον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα και παρέχει χρήσιμες πληροφορίες για την θεραπεία του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Μέση υπέρυθρη ακτινοβολία (MIR) πομπός

το μήκος κύματος του MIR που παράγεται από τη μεγάλη πηγή μέλανος συγκρότημα περιορίστηκε στην περιοχή μεταξύ 3 έως 5 μm με τη χρήση ενός 3-5 μm ζωνοπερατού ζαφείρι γκοφρέτα (SingHuang Τεχνολογία Co., Ltd., Ταϊπέι, Ταϊβάν) (Εικόνα 1Α). Το φίλτρο διέλευσης ζώνης ευρείας σχεδιάστηκε για να απομονώσει 3-5 μm ατμοσφαιρική παράθυρα με διάμετρο 25,4 mm ± 0,1%. Η περικοπή 50% στην /σημεία αποκοπής μετάδοσης ορίστηκαν σε 3,0 μm ± 4% και 5,0 μm ± 4%, αντίστοιχα. Το φίλτρο εμφάνισε μέση μετάδοση στην ζώνη διόδου μεγαλύτερη από 60% και λιγότερο από 0,1% επίπεδα μετάδοσης εκτός της ζώνης διέλευσης. Ένα 300 nm φιλμ πάχους μολυβδαίνιο κατατέθηκε με απόθεση πλάσματος στην πίσω πλευρά ενός υποστρώματος πυριτίου η-τύπου ως πηγή θέρμανσης (Σχήμα 1Α). Η ένταση της ακτινοβολίας μετρήθηκε με μετρητή ισχύος THORLAB PM100D να είναι 3 mW /cm

2. Για να διατηρηθεί η θερμοκρασία της κυτταρικής καλλιέργειας, την ανακύκλωση ψύκτη μηχανή ρυθμίστηκε να διατηρεί τη θερμοκρασία του μέσου καλλιέργειας στους 37 ° C όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 12 πλάκες και καλλιέργειας ιστού (Corning Costar, Coming, ΝΥ, USA) πριν από 24 ώρες έκθεσης IR τοποθετήθηκαν στο φίλτρο όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β.

Πολιτισμός τηλέφωνα

Ανθρώπινο πνεύμονα επιθηλιακά κύτταρα Α549 (ATCC, CCL-185) και ανθρώπινο εμβρυϊκό πνεύμονα ινοβλάστες MRC5 (ATCC, CCL-171) λήφθηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Τα κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (ϋΜΕΜ, Gibco, Grand Island, ΝΥ, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Biological Industries, Beit Haemek, Israel). Τα κύτταρα MRC5 καλλιεργήθηκαν σε Ελάχιστο Απαραίτητο Μέσο (Gibco) συμπληρωμένο με πυροσταφυλικό νάτριο 1 mM (Gibco), 0,1 mM μη-απαραίτητα αμινοξέα (Gibco), και 10% ορό εμβρύου μόσχου (Gibco). Τόσο οι κυτταρικές σειρές ήταν απαλλαγμένα από μυκόπλασμα όπως ανιχνεύεται με PCR μεθόδου που βασίζεται και καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C με 5% CO

2.

ανοσοφθορισμού χρώσης

Α549 κύτταρα σπάρθηκαν επάνω στο γυαλί καλυπτρίδα σε πλάκα καλλιέργειας 12-φρεατίων, καλλιεργήθηκαν για 1 ημέρα, και εκτίθενται από MIR ή καλλιεργούνται στο σκοτάδι για περαιτέρω 48 ώρες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και κατέστησαν διαπερατά με ακετόνη πρόψυξης για 5 λεπτά στους -20 ° C και μετά επωάστηκαν με 1% BSA (BioShop, Burlington, ΟΝ, Canada) σε PBS ως ρυθμιστικό αποκλεισμού για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολούθως, τα κύτταρα σημάνθηκαν με μονοκλωνικό ποντικού αντι-τουμπουλίνης αντίσωμα (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA? 1:1000), μονοκλωνικό ποντικού αντι-βινκουλίνης αντίσωμα (Millipore? 1:200), πολυκλωνικά κουνελιού αντι-53BP1 αντίσωμα (GeneTex, San Antonio, TX, USA? 1:500), ή αντι-γ-H2AX αντίσωμα ποντικού (Abcam, Cambridge, MA, USA? 1:500) σε 4

oC διάρκεια της νύχτας. Μετά πλύση με PBST (PBS που περιέχει 0.05% Tween-20, Sigma-Aldrich, St Louis, ΜΟ, USA) τρεις φορές, τα κύτταρα επισημάνθηκαν με αντίστοιχη δευτεροταγή αντι-ποντικού IgG-Alexa 488 (Invitrogen, Carlsbad, CA? 1:1000 ), αντι-ποντικού IgG-ΡΕ (Abcam? 1:1000), ή δευτερογενείς αντι-κουνελιού IgG FITC-(Millipore? 1:200) για 1 ώρα στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου. Κύτταρα σημάνθηκαν με αντι-βινκουλίνης είχαν μετρητής χρωματίστηκαν με TRITC-συζευγμένο Φαλλοϊδίνη (Millipore? 1:1000) για 15 λεπτά στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBST τρεις φορές και τοποθετείται με ProLong® Gold αντιδραστήριο με ϋΑΡΙ (Invitrogen). Οι εικόνες ελήφθησαν με μικροσκόπιο φθορισμού με Leica HCX FL PLAN 100 × /1,25 στόχο πετρελαίου χρησιμοποιώντας μια φωτογραφική μηχανή SPOT (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI, USA) και Advanced λογισμικού SPOT (Diagnostic Instruments).

Κυττάρου Βιωσιμότητας Δοκιμασία

2 × 10

4 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 12-φρεατίων ανά φρεάτιο και αφέθηκαν να προσκολληθούν για μία νύχτα πριν από την έκθεση MIR. Η σκόνη ΜΤΤ (3 [4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου, Sigma-Aldrich) παρασκευάστηκαν όπως απόθεμα σε PBS σε συγκέντρωση 5 mg /ml και διηθείται. Μετά εκτίθενται από MIR για 48 ώρες, 150 μΐ διαλύματος ΜΤΤ προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για 3 ώρες μέχρις ότου η κρυσταλλική παραβιάζουν σχηματίστηκε. Κρύσταλλοι φορμαζάνης διαλύθηκαν με 500 μΙ διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO, Scharlau Chemie, Βαρκελώνη, Ισπανία) και αναδεύονται αποφεύγεται από το φως για 15 λεπτά για την πλήρη διάλυση των κρυστάλλων. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 570 nm σε αναγνώστη ELISA (BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA). Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

RNA Εκχύλιση και Αντίστροφη Μεταγραφή

Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invotrogen) μετά από έκθεση 48 ωρών. Εν συντομία, 400 μL αντιδραστηρίου ΤΚΙζοΙ (Invitrogen) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο της πλάκας TC 12 φρεατίων μια φορά το μέσο απομακρύνθηκε. Τα δείγματα συλλέχθηκαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα και αποθηκεύτηκε στους -80

oC. Η εκχύλιση RNA πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το εγχειρίδιο, και η συγκέντρωση του RNA και η ποιότητα προσδιορίστηκαν με NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Montchanin, DE, USA). mRNA ήταν reverstranscripted από RevertAid ™ Η Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, Waltham, ΜΑ). 1 μg του συνολικού RNA ήταν μικτή ολιγο (dT)

18 αστάρι και το μετουσιωμένο. Στη συνέχεια, το δείγμα RNA αναμίχθηκε με 5Χ ρυθμιστικό διάλυμα αντιδράσεως, dNTP, RiboLock ™ RNase αναστολέα και RevertAid ™ Η Minus αντίστροφης μεταγραφάσης. Η αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής εκτελέστηκε σε 42

oC για 60 λεπτά και τερματίστηκε στις 70

oC για 5 λεπτά. Η αντίστροφη μεταγραφή προϊόν χρησιμοποιήθηκε απευθείας στο PCR ενίσχυση ή αποθηκεύονται στους -20

oC.

Πραγματικό PCR Ώρα

Το γονίδιο-ειδικούς εκκινητές για πραγματικού χρόνου PCR σχεδιάστηκαν από Beacon Designer 7 προγράμματος (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA) και οι αλληλουχίες παρατίθενται στον πίνακα 1. πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA) για 40 κύκλους ενίσχυσης σε ένα iQ5 iCycler ™ Real-Time Σύστημα ανίχνευσης PCR (Bio-Rad Laboratories). Σχετική ποσότητες μεταγραφής υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας την μέθοδο ΔΔCt (κύκλος κατωφλίου) με GAPDH ως γονίδιο αναφοράς ενισχύθηκε από τα δείγματα. Ολες οι αντιδράσεις έτρεξαν εις τριπλούν.

Η

Protein Extraction και κηλίδωση Western

Μετά την έκθεση MIR για 48 ώρες, η συνολική πρωτεΐνη εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η πρωτεΐνη διαλυτοποιήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (7 Μ ουρία (Boehringer, Mannheim, Germany), 2 Μ θειουρία, 4% CHAPS (JT Baker, Phillipsburg, NJ, USA) και 0.002% μπλε της βρωμοφαινόλης (Amersco, Solon, ΟΗ, USA)) και η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με τη μέθοδο BCA (Pierce Biotech Inc., Rockford, IL, USA).