Αφηρημένο

Στόχος

γονίδιο φλοτιλλίνη είναι γνωστή ως υποκινητή όγκου ή κατασταλτικά, ανάλογα με τον τύπο του όγκου ή το στάδιο του όγκου. Έχουμε ως στόχο να διερευνήσει την κλινική σημασία των flotillin2 έκφραση της πρωτεΐνης σε γαστρικό καρκίνο.

Μέθοδοι

Εξετάσαμε τα επίπεδα flotillin2 και erbB2 σε μικροσυστοιχίες ιστό των 282 δειγμάτων γαστρικού καρκίνου και ανέλυσε τη σχέση μεταξύ flotillin2 επίπεδα, κλινικοπαθολογικοί παράγοντες και την πρόγνωση. Η ρύθμιση του erbB2 με flotillin2 εξετάστηκε με flotillin2 siRNA επιμολυσμένα γαστρικών καρκινικών κυττάρων.

Αποτελέσματα

Flotillin2 μερικώς συν-εντοπίζεται με erbB2 στην πλασματική μεμβράνη όπως ανιχνεύεται με συνεστιακή μικροσκοπία, τα επίπεδα του erbB2 μειώθηκαν μετά φλοτιλλίνη knockdown σε SGC-7901 καρκινικά κύτταρα, και η έκφραση του flotillin2 συσχετίστηκε θετικά με εκείνη του erbB2. Σε μη νεοπλασματικά γαστρικό βλεννογόνο, flotillin2 δεν εκφράστηκε στο επιθηλιακό διαμέρισμα. Σε γαστρικό καρκίνο, θετική χρώση flotillin2 φάνηκε σε 129 (45,7%) από 282 περιπτώσεις, επίσης, ήταν σημαντικά σχετίζεται με βαθμό Lauren, ιστολογικός τύπος, lymphovascular εισβολή και την τοποθεσία του όγκου. Επιπλέον, η ανάλυση επιβίωσης έδειξε ότι flotillin2 έκφραση ήταν ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας κακής επιβίωσης (p & lt? 0.001).

Συμπεράσματα

Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι υπάρχει θετική συσχέτιση μεταξύ flotillin2 και τα επίπεδα έκφρασης erbB2, flotillin2 ίσως εμπλέκονται στη σταθεροποίηση του erbB2 στη μεμβράνη του πλάσματος, flotillin2 είναι συσχετίστηκε σημαντικά με την εξέλιξη του καρκίνου και κακή πρόγνωση σε γαστρικό καρκίνο

Παράθεση:. Zhu Ζ, Wang J, Sun Ζ, Sun Χ, Wang Ζ, Xu Η (2013) Flotillin2 έκφραση συσχετίζεται με τα επίπεδα HER2 και κακή πρόγνωση σε γαστρικό καρκίνο. PLoS ONE 8 (5): e62365. doi: 10.1371 /journal.pone.0062365

Επιμέλεια: Ιωσήφ Najbauer, Πανεπιστήμιο του Πετς Ιατρική Σχολή, την Ουγγαρία

Ελήφθη: 15, Φεβρουαρίου 2013? Αποδεκτές: 20 Μαρ 2013? Δημοσιεύθηκε: 2 Μαΐου 2013

Copyright: © 2013 Zhu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81272718), Ταμείο Έρευνας νέους επιστήμονες »για το Διδακτορικό Πρόγραμμα της Ανώτατης Εκπαίδευσης της Κίνας (20122104120008) και το Ταμείο Επιστημονικής Έρευνας του πρώτου Νοσοκομείου της Κίνας Ιατρικού Πανεπιστημίου (FSFH1208). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Πολλές πρωτεΐνες της πλασματικής μεμβράνης είναι γνωστό ότι εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, κυτταρικής προσκόλλησης, κυτταρική κινητικότητα και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων, που αντιπροσωπεύουν περισσότερο από τα δύο τρίτα του σήμερα γνωστά φαρμακευτικών στόχων. Η κυτταρική μεμβράνη και συναφείς πρωτεΐνες έχουν σημαντικό ενδιαφέρον σε σχέση με διάφορες πτυχές του όγκου, από καρκινογόνα και μεταστατικά μηχανισμούς μοριακής διάγνωσης και θεραπευτικής [1]. Οι Flotillins σχετίζονται με φυσαλιδώδους προεκβολές της πλασματικής μεμβράνης, και δρουν ως ρυθμιστές της μεταγωγής σήματος [2]. Μεταξύ φλοτιλλίνη μέλη της οικογένειας, υπάρχουν δύο διαφορετικά γονίδια φλοτιλλίνη (flotillin1 και 2), η έκφραση flotillin2 πρωτεΐνη έχει αναφερθεί σε ορισμένες ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές γραμμές και δείγματα όγκων [3], [4], [5], [6]. Από flotillin2 αλληλεπιδρά άμεσα με μόρια όπως υποδοχείς, κινάσες, μόρια προσκόλλησης και πρωτεΐνες G σηματοδότησης, ενεργεί ως διαμορφωτής όγκου μέσω της ρύθμισης του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της διαφοροποίησης, της απόπτωσης, προσκόλληση και εισβολή [4].

Η υπερέκφραση του erbB2 (παράγοντας υποδοχέα του ανθρώπινου επιδερμικού αυξητικού 2), επίσης γνωστή ως HER2, είναι συνδεδεμένη με μεμβράνη της κινάσης της τυροσίνης που μπορεί να οδηγήσει στην ενεργοποίηση των κυτταρικών συστημάτων μεταγωγής σήματος, με αποτέλεσμα τα γεγονότα κυτταρικό μετασχηματισμό και πολλαπλασιασμό των κυττάρων που σχετίζονται με τον καρκίνο, όπως του μαστού καρκίνο, καρκίνο των ωοθηκών και γαστρικό καρκίνο [7], [8], [9]. Υψηλό επίπεδο έκφρασης erbB2 έχει συσχετισθεί με σημαντικά αυξημένη εισβολή όγκου, μετάσταση, την αντίσταση στη χημειοθεραπεία, και κακή πρόγνωση των ασθενών [10]. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η πρωτεΐνη flotillin2, μεταξύ άλλων λειτουργιών, είχε εμπλακεί σε ενδοκυτταρικές μηχανισμούς και τις διαδικασίες κυτταρικής διακίνησης, και βρέθηκε να είναι σε ένα μοριακό σύμπλοκο με erbB2 [11]. Για να καταλάβουμε αν η σταθεροποίηση της erbB2 στην πλασματική μεμβράνη διαμεσολαβείται από flotillin2 και η κλινική σημασία τους, θα πραγματοποιηθεί συγκριτική μεμβράνη πρωτεομική ανάλυση του ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου.

Στη μελέτη αυτή, περιγράφουμε επίπεδα flotillin2 και έκφραση erbB2 είναι θετικά συσχετίζονται σε κυτταρικό επίπεδο, καθώς και σε γαστρικό καρκινικό ιστό και δείχνουμε ότι erbB2 εσωτερικοποιείται και αποικοδομείται από ένα μηχανισμό κατά flotillin2 εξάντληση. Επιπλέον, η κλινικοπαθολογική σημασία της flotillin2 αξιολογήθηκε περαιτέρω με τη χρήση αρχειακών δειγμάτων ιστού και στατιστική ανάλυση. Βρήκαμε ότι flotillin2 είναι ένα ανεξάρτητο προγνωστικό παράγοντα, και μια πιθανή νέα βιοδείκτη για μετάσταση στους λεμφαδένες. Τα δεδομένα μας θα διευκολύνει την κατανόηση της γαστρικής καρκινογένεσης του καρκίνου και των ορυχείων βιοδεικτών για τη διάγνωση και τη θεραπεία της ασθένειας αυτής.

Υλικά και Μέθοδοι

Τα δείγματα ιστών και Follow-Up

επιλέχθηκε συνολικά 282 ασθενείς οι οποίοι υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση για καρκίνο του στομάχου από τον Ιανουάριο του 2006 και Δεκεμβρίου 2009 το Πρώτο συνδεδεμένες νοσοκομείο της Κίνας Ιατρικού Πανεπιστημίου για τη μελέτη αυτή. Όλα τα δείγματα ασθενών που προέρχονται συλλέχθηκαν και αρχειοθετούνται σύμφωνα με τα πρωτόκολλα εγκεκριμένα από τις Institutional Review Boards του Πρώτου συνδεδεμένες Νοσοκομείο Κίνα Medical University. Η διάγνωση επιβεβαιώθηκε με τουλάχιστον δύο παθολόγους και σταδιοποίηση βασιζόταν σε παθολογικά ευρήματα σύμφωνα με την 7η αμερικανική μεικτής επιτροπής σχετικά με τις κατευθυντήριες γραμμές του καρκίνου. Η μέση διάρκεια της παρακολούθησης ήταν 51 (εύρος 5 έως 78) μήνες.

Οι 282 ασθενείς που υποβλήθηκαν σε gastroctomy υποβλήθηκαν σε στενή κλινική παρακολούθηση, συμπεριλαμβανομένης της στήθος και την κοιλιακή απεικόνιση CT, επίπεδο CEA, και τον έλεγχο του αίματος σε 2 έως διαστήματα 3 μηνών και ετήσια γαστροσκόπηση. Η συνολική επιβίωση (OS) ποσοστά ορίζεται ως το διάστημα από την αρχική χειρουργική επέμβαση για να κλινικά ή ακτινολογικά αποδεδειγμένη υποτροπή ή μετάσταση και του θανάτου, αντίστοιχα. Η ημερομηνία λήξης της μελέτης παρακολούθησης για τη διεξαγωγή της ανάλυσης ήταν 29 Ιουνίου 2012.

Ηθική δήλωση

Η δεοντολογική έγκριση για την έρευνα αυτή λήφθηκε από την Επιτροπή Ερευνών Δεοντολογίας της Κίνας Ιατρικού Πανεπιστημίου, Κίνα. Όλοι οι ασθενείς που παρέχει ιστό του όγκου, καθώς και δείγματα φυσιολογικού γαστρικού ιστού υπογράψει ένα έντυπο συγκατάθεσης πριν από την χειρουργική αφαίρεση του γαστρικού καρκινώματος να καταστεί δυνατή η έρευνα αυτή που πρέπει να αναληφθούν.

TMA κατασκευή και ανοσοϊστοχημεία

Hematoxylin και εωσίνη (η &? Ε) -stained πλακίδια σαρώθηκαν για βέλτιστη ιστό όγκου και noncancerous ιστός πλησίον του όγκου (τουλάχιστον 2 cm από τον όγκο) και ολισθαίνει TMA κατασκευάστηκαν με ένα χειροκίνητο όργανο συστοιχίας ιστού. Δύο πυρήνες συλλέχθηκαν από κάθε, (FFPE) δείγμα γαστρικού καρκίνου ιστού μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη εμπεδωθεί με παραφίνη και από κάθε κανονικό δείγμα γαστρικού βλεννογόνου χρησιμοποιώντας ένα όργανο διάτρησης διαμέτρου 1.0-mm. Δείγματα από τον ίδιο ασθενή κηλιδώθηκαν δίπλα στο άλλο για να εξασφαλιστεί παρόμοιες συνθήκες αντίδρασης για την φυσιολογικών και καρκινικών ιστών του εν λόγω ασθενούς. Η ανοσοϊστοχημική ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε δείγματα FFPE όπως περιγράφηκε προηγουμένως χρησιμοποιώντας ένα κιτ Envision (Dako Cytomation, Glostrup, Denmark) [12]. Χύτρα ταχύτητας ανάκτηση μεσολάβηση αντιγόνου διεξήχθη σε κιτρικό ρυθμιστικό (ρΗ 6.0) για 7 λεπτά. Οι τομές επωάστηκαν με 1 200 αραίωση αντι-flotillin2 (Santa Cruz, sc-25507) και erbB2 (sc-33684) επί μία νύκτα στους 4 ° C, και στη συνέχεια επωάστηκαν με αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού ή αντι-κουνελιού Envision System Plus-HRP ( Dako Cytomation) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από ξέπλυμα τρεις φορές σε PBS για 10 λεπτά η κάθε μία, οι τομές επωάστηκαν με DAB για 1 λεπτό, αντίθετα με αιματοξυλίνη Mayer, αφυδατωμένα, και τοποθετημένα.

Αξιολόγηση των ανοσοϊστοχημική χρώση

Η ανοσοαντιδραστικότητα αξιολογήθηκε ανεξάρτητα από δύο ερευνητές, οι οποίοι δεν γνώριζαν την έκβαση των ασθενών. Η αξιολόγηση βασίστηκε στην ένταση χρώσης και την έκταση της χρώσης. Χρώση ένταση για flotillin2 και erbB2 βαθμολογήθηκε ως 0 (αρνητική), 1 (ασθενής), 2 (μέτρια) και 3 (ισχυρή). Χρώση έκταση βαθμολογήθηκε ως 0 (0%), 1 (1-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%), και 4 (76-100%), ανάλογα με το ποσοστό των θετικών -stained κύτταρα. Το άθροισμα της έντασης χρώσης και την έκταση βαθμολογίες χρώσης χρησιμοποιήθηκε ως το τελικό σκορ χρώσης. Τα δείγματα χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες ανάλογα με τη συνολική βαθμολογία τους: 0-1, αρνητικό, 2-4, ασθενές θετικό, και 5-7, ισχυρή θετική

ανάλυση FISH για γαστρικά καρκινικά κύτταρα

ενίσχυση του γονιδίου erbB2 προσδιορίστηκε με τη μέθοδο FISH διπλού χρώματος χρησιμοποιώντας το κιτ καθετήρα Passvision HER2 DNA (Vysis Inc. Downers Grove, IL, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ο ανιχνευτής HER2-Spectrum Orange περιέχει μία αλληλουχία DNA ειδικού για το ανθρώπινο γονιδιακό τόπο erbB2 και υβριδοποιείται σε περιοχή 17q11.2-q12 του ανθρώπινου χρωμοσώματος. Η CEP 17 (χρωμόσωμα καθετήρα απαρίθμηση 17) χρησιμοποιείται ως μάρτυρας περιέχει άλφα-δορυφορικό DNA. Ο πυρήνας ήταν αντίθετα με 40, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ). Η γυμνά ποντίκια του γαστρικού μοντέλο καρκίνου (SGC-7901, MGC-803 και BGC-823) πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13], [14]. Οι διαφάνειες των όγκων παρατηρήθηκαν κάτω ΒΧ60 μικροσκόπιο φθορισμού εξοπλισμένο με ψηφιακή φωτογραφική μηχανή (DP50) (Όλυμπος, Τόκιο, Ιαπωνία), και οι εικόνες συλλήφθηκαν με το λογισμικό σκόπευτρο. Ένα κύτταρο θεωρήθηκε για να δείξει την ενίσχυση όταν βρέθηκε ένα καθορισμένο σύμπλεγμα ή περισσότερα από 10 σήματα για erbB2.

Κυτταρική καλλιέργεια και επιμολύνσεις

κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου SGC-7901 (μετρίως διαφοροποιημένων), MGC -803 και BGC-823 (κακώς διαφοροποιημένο) ήταν όλοι αγοράζονται από την κυτταρική τράπεζα της κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών. καρκινικές κυτταρικές σειρές διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 (πόλη Hyclone, Logan, USA) συμπληρωμένο με 10% FBS. Όλες οι κυτταρικές σειρές ήταν σε ένα 5% CO2 υγροποιημένη ατμόσφαιρα στους 37 ° C. Για siRNA επιμόλυνση, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων σε πυκνότητα 2 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο, 24 ώρες πριν από την επιμόλυνση, siRNAs που στοχεύουν μη-επικαλυπτόμενα τμήματα της αλληλουχίας του mRNA χρησιμοποιήθηκε για flotillin2. Για την εξάντληση του flotillin2, μια πισίνα δύο διαφορετικών siRNA με τις αλληλουχίες κατασκευής στόχευσης GAGGUUGUGCAGCGCAAUU και GGAUGAAGCUCAAGGCAGA [15], τα κύτταρα σπάρθηκαν έξω χωρίς αντιβιοτικά, αναπτύχθηκαν για 24 ώρες και επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο διαμόλυνσης Lipofectamine (Invitrogen) σύμφωνα με τον κατασκευαστή διαδικασία. Μετά από 4 ώρες από την επιμόλυνση, το μέσο αλλάχθηκε σε πλήρες μέσο ανάπτυξης που περιέχει ορό και αντιβιοτικά, και τα κύτταρα αναπτύχθηκαν για 3 ημέρες πριν ξεκίνησαν πειράματα.

Ανοσοφθορισμός, κηλίδα Western και qRT-PCR

τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό PBS και λύθηκαν επί πάγου σε ρυθμιστικό RIPA με αναστολείς πρωτεάσης και ποσοτικά με τη μέθοδο BCA. 50 μg προϊόντα λύσης πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν επί 6% πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου SDS, ηλεκτρομεταφέρθηκαν σε μεμβράνες πολυβινυλιδενο φθορίδιο (Millipore, Bedford, ΜΑ) και αποκλείστηκε σε 5% άπαχο ξηρό γάλα σε ρυθμισμένο με Tris αλατούχο διάλυμα (ρΗ = 7,5). Οι μεμβράνες ανοσοστυπώθηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με αντι flotillin2 erbB2 πολύκλωνα αντισώματα όπως IHC /περιγράφηκε παραπάνω, αντίστοιχα, στη συνέχεια ακολουθείται από αντίστοιχες δευτερεύοντα αντισώματα τους. Σήματα ανιχνεύθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (Pierce, Rockford, IL). Για ανοσοφθορισμό, η πρόσδεση του πρωτογενούς αντισώματος κατέστη ορατή με αντίσωμα TRITC /FITC-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού IgG, και οι πλάκες στη συνέχεια εξετάζονται από συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με λέιζερ.

ενισχύσεις PCR για την ποσοτικοποίηση του flotillin2, erbB2 και GAPDH mRNA σε κύτταρα έγιναν σε ένα σύστημα LightCycler (Roche Applied Science) χρησιμοποιώντας το κιτ LightCycler FastStart DNA κύριο SYBR Green Ι (Roche Diagnostics). Εν συντομία, ένας κύριος μείγμα παρασκευάζεται σε πάγο, που περιέχει 1 μΐ συμπληρωματικού DNA, 2 μΐ LC DNA κύριο SYBR Green Ι αναμειγνύεται, 50 ng των εκκινητών, και 4 mM MgCl2. Οι συνθήκες ενίσχυσης για 40 κύκλους αποτελούνταν από μετουσίωση στους 95 ° C για 10 s, ανόπτηση στους 65 ° C για 10 s, και επέκταση στους 72 ° C για 10 s. Τα προϊόντα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε μία κλίση θερμοκρασίας από 68 έως 95 ° C σε 0.1 ° C /s, με συνεχή παρακολούθηση του φθορισμού για να παραχθεί καμπύλες τήξης των προϊόντων. Τα επίπεδα έκφρασης κανονικοποιούνται με έκφραση erbB2 mRNA.

Η στατιστική ανάλυση

Ο χ

2 δοκιμή ή την ακριβή δοκιμασία του Fisher για το ποσοστό είχε χρησιμοποιηθεί, ανάλογα με την περίπτωση, για να αναλύσει τη σχέση μεταξύ flotillin2 και έκφραση erbB2 και κλινικοπαθολογοανατομικές μεταβλητές. Τα ποσοστά επιβίωσης υπολογίστηκαν με τη μέθοδο Kaplan-Meier και οι διαφορές μεταξύ των καμπυλών επιβίωσης εξετάστηκαν με τη δοκιμασία log-rank. Μονοπαραγοντική Cox αναλογικών κινδύνων παλινδρομήσεις εφαρμόστηκαν για να εκτιμηθεί η ατομική αναλογία κινδύνου (HR). Οι σημαντικές μεταβλητές στις μονομεταβλητές αναλύσεις (P & lt? 0,05) τοποθετείται στη συνέχεια σε πολυπαραγοντική ανάλυση. Το HR με 95% διάστημα εμπιστοσύνης (CI) μετρήθηκε για να εκτιμηθεί ο κίνδυνος της επικινδυνότητας των επιμέρους παραγόντων. Ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική. Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του SPSS στατιστικού λογισμικού προγράμματος έκδοση 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL).

Αποτελέσματα

Εκφράσεις της flotillin2 και erbB2 σε καρκίνο του στομάχου

τομών της μικροσυστοιχίες ιστού (ΤΜΑ) των 282 τεμαχίων των ιστών βαθμολογήθηκαν για cytoplasmatic ανοσοϊστοχημική χρώση ένταση τους κατά flotillin2 και πρωτεΐνη erbB2. Τα 282 αναγνώσιμη δείγματα περιλάμβαναν 282 γαστρικό καρκίνωμα, 181 περι-καρκίνωμα και 101 δείγματα φυσιολογικού γαστρικού επιθηλίου ιστού. Τα καρκινικά κύτταρα παρουσίασαν τυπικά διάχυτη χρώση της μεμβράνης του flotillin2 μπορεί να βρεθεί στο γαστρικό καρκίνωμα (Σχήμα 1α) με την αντίστοιχη θέση του erbB2 (Σχήμα 1β), σε μη νεοπλασματικά γαστρικό βλεννογόνο, flotillin2 και erbB2 και οι δύο δεν εκφράζεται. Θετική χρώση flotillin2 δείχθηκε σε 129 (45,7%) από 282 δείγματα, erbB2 ήταν 59 (20,9%). Ενίσχυση του γονιδίου erbB2 προσδιορίστηκε με dual-χρώμα FISH ξενομοσχευμάτων σε γυμνούς ποντικούς. γονιδιακή ενίσχυση ErbB2 σε ένα πρότυπο σύμπλεγμα (κόκκινο) παρατηρήθηκε σε MGC-803, BGC-823 και SGC-7901 κύτταρα, υπερέκφραση ErbB2 μόνο στην ανθρώπινη SGC-7901 γαστρικού καρκίνου κυττάρων (Σχήμα 2a-c).

Αντιπροσωπευτικά πρωτεΐνη έκφραση του (Α) flotillin2 και (Β) erbB2 σε έναν πυρήνα μικροσυστοιχία ιστός λαμβάνεται από ένα γαστρικό καρκίνωμα. SGC-7901 γαστρικό καρκίνο κύτταρα χρωματίστηκαν με αντι-erbB2, αντι-flotillin2 αντίσωμα αντίστοιχα, το χρωματισμένο αντίσωμα οπτικοποιήθηκε με αντίσωμα TRITC /FITC-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού IgG, και οι πλάκες στη συνέχεια εξετάζονται από συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με λέιζερ. TRITC (erbB2) εμφανίζεται ως κόκκινη (Γ), FITC (flotillin2) ως πράσινο (D), και τη συγχώνευση του πράσινου και του κόκκινου γίνεται κίτρινο (Ε).

Η

Ενίσχυση του γονιδίου HER2 καθορίστηκε με FISH. ενίσχυσης του γονιδίου HER2 σε ένα πρότυπο σύμπλεγμα (κόκκινο) παρατηρήθηκε στο (Α) MGC-803, (Β) BGC-823 και (C) SGC-7901 γαστρικών καρκινικών κυττάρων, υπερέκφραση του HER2 σε ανθρώπινο SGC-7901 κυττάρων. (Δ) ανάλυση κηλίδας Western και (Ε) Ποσοτική πραγματικού χρόνου έχουν πρόσβαση PCR για erbB2 και flotillin2 στη ΓΓΕ-7901 κυτταρική γραμμή μετά από νοκ ντάουν της φλοτιλλίνη-2. Η κατάσταση έκφρασης του flotillin2 είναι ιδιαίτερα σύμφωνη με εκείνη του erbB2, siRNA ήταν κενό φορέα, β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος.

Η

Σύνδεσης μεταξύ των εκφράσεων του flotillin2 με erbB2

Αναλύσαμε το κυτταρικό εντοπισμό του erbB2 και flotillins σε SGC-7901 γαστρικού καρκίνου των κυττάρων. Θα μπορούσαμε να δείξουμε με συνεστιακή μικροσκοπία που flotillin2 μερικώς συν-εντοπίζονται με erbB2 στην πλασματική μεμβράνη (Εικόνα 1 a-e). Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η έκφραση του flotillin2 κάνουμε έχει σημαντική συσχέτιση με εκείνη του erbB2 (ρ & lt? 0.001) στην ανοσοϊστοχημική ανάλυση συστοιχίας ιστού (Πίνακας 1). Επιπλέον, η αλληλεπίδραση μεταξύ flotillins και erbB2 μπορεί να αποδειχθεί με ανοσοστύπωμα (Σχήμα 2d) και την ποιότητα RT-PCR πειραμάτων (Σχήμα 2Ε), χτυπώντας κάτω των ενδογενών flotillin2 οδήγησε σε τράβηγμα προς τα κάτω του erbB2. Είμαστε δίπλα ανέλυσε τον αντίκτυπο της flotillins για την ενσωμάτωση και την επακόλουθη υποβάθμιση του erbB2. Όπως περιγράφεται παρακάτω, erbB2 και HER2 έχουν επίσης πολλές σχέσεις της κλινικοπαθολογοανατομικών παράγοντες στο κοινό.

Η

Σύνδεσης μεταξύ flotillin2 και κλινικοπαθολογοανατομικές παράγοντες

Σε αυτή τη μελέτη, 282 ασθενείς με γαστρικό καρκίνο με επαρκή πρωτοπαθείς όγκους υλικά και ο χρόνος παρακολούθησης ήταν διαθέσιμα, των οποίων οι ιστοί συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια των τελευταίων 6 ετών. Ο Πίνακας 2 δίνει τα περιγραφικά στατιστικά στοιχεία για τις παραμέτρους που μετρήθηκαν για αυτούς τους ασθενείς. Η μέση διάρκεια της παρακολούθησης ήταν 54 μήνες (εύρος 9 με 78 μήνες). Η (OS) ποσοστό 5-ετή συνολική επιβίωση ήταν 48,2%

Η

Βρήκαμε ότι η αυξημένη έκφραση του flotillin2 και erbB2 ήταν τόσο σημαντικά που συνδέονται με ιστολογικό τύπο (p & lt? 0.001, αντίστοιχα)., Lauren Βαθμός (ρ & lt? 0.001, αντίστοιχα) και Lymphovascular εισβολή (ρ = 0,059 και ρ & lt? 0.001, Πίνακας 2). Επιπλέον, flotillin2 συσχετίστηκε σημαντικά με το μέγεθος του όγκου (ρ = 0,006), το στάδιο Τ (p = 0,001) και λεμφαδένα μετάσταση (p = 0,033, Πίνακας 2). Ωστόσο, δεν υπάρχει σημαντική συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ flotillin2 έκφρασης και άλλες παραμέτρους όπως η ηλικία, το φύλο, την τοποθεσία, μακροσκοπικά το είδος και ηπατική μετάσταση.

Η έκφραση της flotillin2 σε σχέση με την πρόγνωση

Χρήση αναλογικού κινδύνου παλινδρόμησης του Cox μοντέλο, οι σχέσεις μεταξύ των μονοπαραγοντική χαρακτηριστικά όγκου και έκβαση των ασθενών ελήφθησαν (Πίνακας 3). Από τους 282 ασθενείς που αναλύθηκαν, στατιστικά σημαντικές διαφορές στο OS παρατηρήθηκαν, με κακή έκβαση για ασθενείς με υψηλότερο χρώση flotillin2 και erbB2. Άλλοι παράγοντες πρόβλεψης που βρέθηκαν να συσχετίζονται με το OS ήταν η ηλικία (P = 0,042), το μέγεθος (P = 0,001), μακροσκοπική τύπο (P = 0,001), PT (P & lt? 0.001) και το στάδιο ΡΝ (P & lt? 0.001) (Πίνακας 3). Χρησιμοποιώντας δοκιμασία log-rank, υπήρχαν σημαντικές διαφορές στο OS μεταξύ θετικών και αρνητικών ασθενών flotillin2 και erbB2 (P & lt? 0.001, αντίστοιχα) σε όλους τους ασθενείς που φαίνεται στο Σχήμα 3.

(Α) Οι ασθενείς με erbB2 -θετικό όγκου έδειξαν σημαντικά μικρότερη περίοδο επιβίωσης μετά την επέμβαση από εκείνους με erbB2 αρνητικά όγκου (ρ = 0,014). (Β) Οι ασθενείς με flotillin2 θετικών όγκων έδειξε το χειρότερο αποτέλεσμα. Υψηλή φλοτιλλίνη-2 και την έκφραση erbB2 συσχετίζονται σημαντικά με κακή έκβαση των ασθενών (p & lt? 0.001).

Η πολυπαραγοντικό μοντέλο παλινδρόμησης αναλογικού-κινδύνου

Cox στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό ποιοι παράγοντες ήταν από κοινού κατηγορηματικό της OS. Μεταβλητές οι οποίες πιστεύεται ότι είναι σημαντική στην μονοπαραγοντική ανάλυση συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση. Η σημασία, προσαρμοσμένο για άλλους συν-variates, δόθηκε στον Πίνακα 4. Η πολυπαραγοντική ανάλυση της κοινής επίδραση των flotillin2 και erbB2 με άλλους προγνωστικούς παράγοντες έδειξε ότι Pt (P & lt? 0.001) και το στάδιο ΡΝ (P & lt? 0.001) flotillin2 (HR = 1.485, 95% CI: 1,278 – 1,725, P & lt? 0.001) ήταν καλύτερος προγνωστικός δείκτης ανεξάρτητα από erbB2 (HR = 1,375, 95% CI: 1,133 – 1,947 P = 0.004) για το OS (Πίνακας 4)

Συζήτηση

Η αξιολόγηση των βιολογικών προγνωστικούς παράγοντες είναι κλινικής σημασίας, ειδικά για μια ασθένεια με την κακή έκβαση, όπως γαστρικό καρκίνο. Η παρούσα μελέτη επιβεβαίωσε την συστατική έκφραση της flotillin2 στο γαστρικό καρκίνο δείγματα ιστών και κυτταρικών σειρών, βρήκαμε επίσης ότι ήταν flotillin2 ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας κακής τη συνολική επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του στομάχου. Επιπλέον, η παρούσα μελέτη έδειξε, για πρώτη φορά, μια θετική σχέση μεταξύ των εκφράσεων του flotillin2 και HER2 σε καρκίνο του στομάχου. Στην προηγούμενη μελέτη, Pust et al. (2012) βρήκαν ότι οι κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού που προέρχεται από απομακρυσμένη μετάσταση έδειξε ένα υψηλότερο επίπεδο mRNA φλοτιλλίνη και εκφράσεων πρωτεΐνη από εκείνα που προέρχονται από πρωτογενή καρκίνο του στομάχου. Έτσι, εξήγησε το ρόλο του flotillin2 ως ιστών και το στάδιο-ειδικό διαμορφωτή όγκου, όπου δρα ως ένας αναστολέας ή υποκινητής του σχηματισμού όγκου και της εξέλιξης, ανάλογα με τους εταίρους της πρωτεΐνης αλληλεπίδραση όπως υποδοχείς αυξητικών παραγόντων ή μορίων κυτταρικής προσκόλλησης [11] . Τα αποτελέσματά μας συμφωνούν με αυτή την περιγραφή, διότι flotillin2 έκφρασης στην παρούσα μελέτη συσχετίστηκε θετικά με την έκφραση του HER2, η οποία συσχετίζεται θετικά με κακή πρόγνωση στον καρκίνο του στομάχου.

Τα δεδομένα από δύο πρόσφατες δημοσιεύσεις δείχνουν ότι φλοτιλλίνη έχει ένα λειτουργικό ρόλο στην υποδοχέα σηματοδότηση κινάσης τυροσίνης, ιδιαίτερα στην ενεργοποίηση της σηματοδότησης ΜΑΡ κινάσης και τη ρύθμιση της σηματοδότησης FGF σε κύτταρα HeLa [16], [17]. Στα κύτταρα καρκίνου του μαστού SKBR3, το αποτέλεσμα ότι η φωσφορυλίωση της Akt μειώνεται την εξάντληση του φλοτιλλίνη-2, αλλά όχι μετά από φλοτιλλίνη-1 knockdown, συμφώνησε με τα δεδομένα μας. Έτσι, οι κινάσες τυροσίνης υποδοχέα ή μονοπάτια σηματοδότησης κινάση τυροσίνης υποδοχέα θα μπορούσε να ρυθμίζεται από flotillins με διαφορετικούς τρόπους και /ή σε ένα κύτταρο τύπου-ειδικό τρόπο, είναι πιθανό ότι τα διαφορετικά μονοπάτια σηματοδότησης ενεργοποιούνται από erbB2 ρυθμίζονται από δύο flotillin2. Παρ ‘όλα αυτά, τα μειωμένα επίπεδα erbB2 ενεργοποιείται από flotillin2 knockdown υποστήριξη υπόθεση μας μιας flotillin2 μεσολάβηση σταθεροποίηση του erbB2.

ErbB2 είναι γνωστό ότι σχετίζεται με κακή πρόγνωση σε γαστρικό καρκίνο, έχουν flotillins περιγραφεί ότι σχετίζονται με όγκο γένεση. Έχουμε αποδείξει ότι flotillin2 συν-εντοπίζεται με erbB2 στην πλασματική μεμβράνη και παίζει ένα λειτουργικό ρόλο στην ρύθμιση της erbB2 σε γαστρικό καρκίνο. Υψηλή έκφραση του flotillin2 σχετίζεται με κακή πρόγνωση και μειωμένο χρόνο επιβίωσης, και προκύπτει ως πιθανό προγνωστικό της υποτροπής σε γαστρικό καρκίνο. Έχει αναφερθεί ότι οι υποδοχείς οιστρογόνων συμμετείχαν σε γαστρικό καρκινογένεση και flotillin2 αλληλεπιδρά με τους υποδοχείς [18], [19], υποδεικνύοντας μια σημαντική επίδραση του flotillin2 λειτουργία στην γαστρική ανάπτυξη καρκίνου. Από την άλλη πλευρά, με βάση τις μελέτες μικροσυστοιχίας ιστού μας, flotillin2 υπερέκφραση ήταν ιδιαίτερα σχετίζεται με αυξημένη κυτταρική μετανάστευση και κακοήθη μετασχηματισμό που οδηγεί στην εμπλοκή λεμφαδένων και αυξημένη διεισδυτικότητα. Στη μελέτη μας, αυξημένα flotillin2 και HER2 και οι δύο έδειξαν σημαντική συσχέτιση με ιστολογικό τύπο (P & lt? 0.001 και τα δύο), βαθμού Lauren (P & lt? 0.001 και τα δύο), ενώ flotillin2 επίσης να πάρετε μια υψηλή συνάφεια με το στάδιο T (P & lt? 0.001) και των λεμφαδένων μετάσταση (P = 0,033). Αυτή η ισχυρή συσχέτιση υποδηλώνει ότι flotillin2 μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως βιολογικός δείκτης για τον εντοπισμό υποσύνολα των ασθενών με καρκίνο του στομάχου με μια πιο επιθετική φαινότυπο. Η πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε flotillin2 χρησιμεύει ως ένα καλύτερο προγνωστικό δείκτη για να προβλέψει τον κίνδυνο μετάστασης και υποτροπής (HR = 1,485, 95% CI: 1,278 – 1,725) από ό, τι Her2 (HR = 1,375, 95% CI: 1,133 – 1,947) για το OS. Προτείνουμε ότι flotillin2 υπερ-έκφραση μπορεί να συνεισφέρει στην αυξημένη πολλαπλασιασμό και την ανάπτυξη των γαστρικών καρκίνων.

Συμπερασματικά, αυτή είναι η πρώτη απόδειξη της θετικής συσχέτισης μεταξύ των επιπέδων flotillin2 και erbB2 σε καλλιεργημένα γαστρικά καρκινικά κύτταρα, καθώς και σε ιστούς. Επιπλέον, flotillin2 επίπεδο έκφρασης συσχετίζεται με κακή πρόγνωση σε γαστρικό καρκίνο, υποδεικνύοντας ότι flotillin2 μπορούσε να είναι μια προγνωστικός βιοδείκτη για καρκίνο του στομάχου. Έχει βρεθεί ότι οι όγκοι υπερεκφράζουν ErbB2 είναι πιο πιθανό να είναι ανθεκτικά σε κατεργασία με ένα (/Herceptin trastuzumab) θεραπεία βασίζεται σε αντίσωμα, το οποίο έχει γίνει η κλινική θεραπεία πρώτης γραμμής σε ασθενείς με υπερεκφράζουν ErbB2 μεταστατικό γαστρικό καρκίνο [20] , [21]. Ωστόσο, ακόμη και σε συνδυασμό με άλλα χημειοθεραπευτικά φάρμακα, περισσότερο από το 20% των ασθενών με erbB2-υπερέκφραση δεν δείχνουν απόκριση στη θεραπεία. Έτσι, στοχεύοντας flotillin2 έκφρασης, μπορούν να αναπτυχθούν νέες στρατηγικές στη θεραπεία του καρκίνου.