Αφηρημένο

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η τρίτη πιο συχνή κακοήθεια στον κόσμο. Ο κίνδυνος θανάτου συσχετίζεται στενά με το στάδιο της CRC κατά τη στιγμή της πρωτογενούς διάγνωσης. Επομένως, υπάρχει επιτακτική ανάγκη για την ταυτοποίηση βιοδεικτών αίματος που μπορεί να καταστήσει δυνατή την έγκαιρη ανίχνευση του CRC. Χρησιμοποιήσαμε μια ποσοτική πρωτεομική προσέγγιση με ισοβαρή επισήμανση (iTRAQ) για να εξετάσει αλλαγές στο proteome 10 ασθενών με CRC σε σύγκριση με υγιείς εθελοντές του πλάσματος. Enzyme-Linked Δοκιμασία Immunosorbnent (ELISA) και στύπωμα Western χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω επικύρωση. Στην ποσοτική ανάλυση πρωτεομική μας, εντοπίσαμε 75 πρωτεΐνες του ανθρώπινου πλάσματος με περισσότερο από το 95% εμπιστοσύνης χρησιμοποιώντας επισήμανση iTRAQ σε συνδυασμό με microQ-TOF MS. 9 επάνω ρυθμισμένη και 4 ρυθμισμένα προς τα κάτω πρωτεΐνες παρατηρήθηκαν στην ομάδα CRC. Το επίπεδο στο πλάσμα ORM2 επιβεβαιώθηκε να είναι σημαντικά αυξημένα σε ασθενείς που πάσχουν από CRC σε σύγκριση με τους ελέγχους. έκφραση ORM2 σε ιστούς CRC ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με το ότι στο αντίστοιχο γειτονικό φυσιολογικό βλεννογόνους ιστούς (

P

& lt? 0.001). ITRAQ μαζί με την Q-TOF /MS είναι μια ευαίσθητη και επαναλήψιμη τεχνική της ποσοτικής πρωτεομικής. Μεταβολή στην έκφραση του ORM2 υποδηλώνει ότι ORM2 θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως μια πιθανή βιοδείκτη για τη διάγνωση της CRC

Παράθεση:. Zhang Χ, Xiao Ζ, Liu Χ, Du L, Wang L, Wang S, et al. (2012) ο πιθανός ρόλος της ORM2 στην ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 7 (2): e31868. doi: 10.1371 /journal.pone.0031868

Επιμέλεια: Αντώνης W. I. Lo, το Κινεζικό Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 7 του Νοέμβρη 2011? Αποδεκτές: 13 Γενάρη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 21 Φεβρουαρίου 2012 |

Copyright: © 2012 Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Επιχορήγηση Συμβόλαιο χορηγός: το Εθνικό Κλινική Ίδρυμα ειδικότητα-κλειδί. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το 2009, η αμερικανική Αντικαρκινική Εταιρεία εκτιμάται συνολικά 146.970 νέες καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) περιπτώσεις και το 40% των θανάτων στις Ηνωμένες Πολιτείες. CRC αναμένεται να είναι η τρίτη πιο κοινή μορφή καρκίνου στην Αμερική. Από το 1975, υπήρξε μια αξιοσημείωτη βελτίωση σε σχέση με τα ποσοστά επιβίωσης 5-ετών CRC, ως αποτέλεσμα της έγκαιρης διάγνωσης και τη βελτίωση της θεραπείας [1]. Σιγμοειδοσκόπηση βελτίωσε σημαντικά το ποσοστό ανίχνευσης της CRC. Ωστόσο, η ευρεία εφαρμογή του εξακολουθεί να είναι περιορισμένη λόγω του υψηλού κόστους και την ταλαιπωρία. Έτσι, οι ειδικοί δείκτες όγκων ορών που βασίζεται για την έγκαιρη διάγνωση και την πρόγνωση χρειάζεται.

δείκτες πλάσματος /ορού (π.χ. καρκινοεμβρυϊκό αντιγόνο, CEA) είναι το πιο ευρέως χρησιμοποιούμενο και αξιόπιστη καρκινικών δεικτών για CRC επειδή εύκολα ποσοτικά μετρώνται , να αναπαραχθούν και οικονομικά αποδοτική. Παρά το γεγονός ότι οι τρέχουσες κατευθυντήριες γραμμές από την Αμερικανική Εταιρεία Κλινικής Ογκολογίας (ASCO), προτείνουμε ότι τα επίπεδα CEA θα πρέπει να παρακολουθούνται κάθε 2-3 μήνες για τουλάχιστον 2 χρόνια μετά την διάγνωση, δεν υπάρχει σαφής συναίνεση σχετικά με την εγκυρότητα της παρακολούθησης CEA [2]. Αρκετές μελέτες [3] – [5] αμφισβήτηση την αξία της CEA ως δείκτη του CRC υποτροπής, ιδιαίτερα σε ασθενείς με φυσιολογική προεγχειρητική επίπεδα CEA. Λόγω αυτών των προβλημάτων, οι νέες βιοδείκτες που απαιτείται για τη βελτίωση της έγκαιρης ανίχνευσης και πρόβλεψης της υποτροπής για όλα τα είδη των CRC. Διαφορετικές πρωτεομική πρότυπα στην παρούσα νέες ευκαιρίες στον ορό για την ανάπτυξη νέων, ιδιαίτερα ευαίσθητα διαγνωστικά εργαλεία για την έγκαιρη ανίχνευση των καρκίνων [6].

Στη βιβλιογραφία, πρωτεομική τεχνολογίες έχουν χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη CRC βιοδεικτών του ορού. Σε αυτές τις μελέτες, οι στρατηγικές πρωτεομική όπως η δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου (2-D PAGE), δύο διαστάσεων απόκλιση φθορισμού σε ηλεκτροφόρηση πηκτής (2-D ΨΗΦΟ), επιφάνεια ενισχυμένη εκρόφησης λέιζερ /ώρα ιονισμού πτήσεως σπεκτρομετρίας μάζης (SELDI -TOF MS) την τεχνολογία και την πρωτεΐνη συστοιχίες έχουν χρησιμοποιηθεί, αλλά κανένας δεν μπορεί με ακρίβεια να αξιολογήσει το επίπεδο της άνω ή προς τα κάτω ρύθμιση των προτεινόμενων βιοδεικτών. Ως εκ τούτου, είναι δύσκολο να προσδιοριστεί ιδιαιτερότητες και την ισχύ τους σε τυφλωθεί μελέτες των δειγμάτων [7], [8]. Να αποκαλύψει νέα βιοδείκτες πλάσμα, μια νέα προσέγγιση με Ισοβαρής Ετικέτες για σχετική και απόλυτη ποσοτικοποίηση (iTRAQ) έχει εφαρμοστεί [9]. Η σταθερή ενσωμάτωση των ισοτόπων σε ένα αντιδραστήριο σήμανσης αμίνη εμπλέκεται σε αυτή τη μέθοδο χημικής σήμανσης. Με τη χρήση φασματομετρίας μάζας, οι πρωτεΐνες μπορούν να ανιχνευθούν αξιόπιστα και να επιτρέπουν τη συγκριτική ποσοτικοποίηση σε ένα multiplex τρόπο. Ο πυρήνας αυτής της μεθοδολογίας είναι ένα πολυπλεξίας σύνολο ισοβαρή αντιδραστήρια που αποφέρουν αμίνη παραγοντοποιείται πεπτίδια. Οι παραγωγοποιημένοι πεπτίδια είναι δυσδιάκριτες στο MS, αλλά παρουσιάζουν έντονη ιόντα υπογραφή χαμηλής μάζας MS /MS που υποστηρίζουν τον ποσοτικό προσδιορισμό. Αυτή η μέθοδος προσδίδει μια μάζα διαφορά ως βάση για ποσοτικοποίηση με μέτρηση σχετικών εκτάσεων κορυφής του MS και /ή φάσματα μάζας MS /MS. Σήμερα, εμπορικά διαθέσιμη 4-plex και 8-plex αντιδραστήρια μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την επισήμανση δείγματα πρωτεΐνης του ενδιαφέροντος μετά την πέψη τρυψίνης. Διαφορετικές ισοβαρή ετικέτες σε αυτή τη μέθοδο δείχνουν ότι σε μια ενιαία ανάλυση φασματομετρίας μάζας, μέχρι 4 ή 8 διαφορετικά δείγματα, ένα από τα οποία είναι μια αναφορά, μπορεί να εξεταστεί ταυτόχρονα. Δεδομένου αυτού λόγο αυτό, η προσέγγιση iTRAQ προτείνεται ως πολλά υποσχόμενη στην ανακάλυψη των βιοδεικτών σε δείγματα με ένα ευρύ φάσμα από πλάσμα, σωματικά υγρά και τους ιστούς.

Σε αυτή τη μελέτη, iTRAQ συζεύχθηκε με microQ-TOF /MS για την ανίχνευση εκφρασμένων πρωτεϊνών απόκλιση στο πλάσμα ασθενών CRC και τους ελέγχους. Μεταξύ των πρωτεϊνών που ήταν αυξημένα σε CRC πλάσμα, 9 πρωτεΐνες επάνω ρυθμισμένη, και 4 ρυθμισμένα προς τα κάτω. Συζητήσαμε πιθανές λειτουργίες τους και επαλήθευσε ORM2 που μπορεί να είναι ένας πιθανός ορολογική βιοδεικτών για το (τα) ασθενείς CRC. Η ειδική λειτουργία αυτής της πρωτεΐνης δεν έχει ακόμη καθοριστεί? Ωστόσο, ORM2 φαίνεται να λειτουργεί στη ρύθμιση της δραστηριότητας του ανοσοποιητικού συστήματος κατά την αντίδραση οξείας φάσης, η οποία ίσως παίζουν ένα δυνητικό ρόλο στην πρώιμη ανάπτυξη του CRC. Καλλιέργεια στοιχεία δείχνουν ότι σχετίζονται με όγκους φλεγμονή μπορεί να οδηγήσει την ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου, ενώ η ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου θα μπορούσε να επάγει φλεγμονή, η οποία μπορεί να παίζει έναν κεντρικό ρόλο σε όλα τα στάδια της ογκογένεσης. Τέτοια φλεγμονώδη μόρια μπορούν να ανιχνευθούν σε δείγματα αίματος από ασθενείς cancaer και μπορεί να έχει δυνητικό ρόλο στην έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου. Σε αυτή τη μελέτη, η προς τα πάνω ρύθμιση της ORM2 επιβεβαιώθηκε με ELISA σε πλάσμα ασθενών με εντερική νόσο συστήματος.

Αποτελέσματα

Αναγνώριση των υποψηφίων βιοδεικτών από microQ-TOF MS

για microQ-TOF MS πρωτεΐνη προφίλ, δείγματα πλάσματος από 10 ασθενείς CRC και 10 άτομα στην ομάδα ελέγχου συλλέχθηκαν (2 ml πλάσματος από κάθε άτομο) και στη συνέχεια αναμειγνύονται για να σχηματίσουν μια πισίνα δείγμα για περαιτέρω εξέταση. 100 μΙ συγκεντρωμένων δειγμάτων από κάθε ομάδα ανοσολογικά 12 άφθονες πρωτεΐνες του πλάσματος με την τεχνική στήλη ανοσοσυγγένειας όπως περιγράφεται στις Μεθόδους.

δείγματα πλάσματος ανοσολογικά υποβλήθηκαν σε πέψη με θρυψίνη, επισημασμένο με ένα μοναδικό ισοβαρή ετικέτα, σε συνδυασμό και ταυτόχρονα αναλύθηκαν με microQ-TOF MS. ομάδα CRC σημάνθηκε με iTRAQ-114 και η ομάδα υγιών μαρτύρων σημάνθηκε με iTRAQ-117 και στη συνέχεια διαχωρίζεται από την ισχυρή χρωματογραφία ανταλλαγής κατιόντων και C18 κλασματοποίηση. 75 πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν από microQ-TOF MS με ≥95% εμπιστοσύνη. Μεταξύ αυτής της ομάδας, 13 διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών επιλέχθηκαν με βάση την 1,5-πλάσια υπερ-έκφραση και 1,5-φορές υπο-έκφραση σε ασθενείς CRC, σε σύγκριση με τους υγιείς εθελοντές. Εννέα πρωτεΐνες από τα 13 διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών πάνω ρυθμισμένα (Πίνακας 1). Τρεις πρωτεΐνες βρέθηκαν να είναι σημαντικά αυξημένα στην ομάδα CRC (με αναλογίες από 1,3 έως 4.4). Τέσσερις πρωτεΐνες κάτω-ρυθμίζονται σε ασθενείς CRC, και τα επίπεδα έκφρασής τους φαίνονται στον Πίνακα 2. Η στατιστική διακύμανση του όγκου σε σχέση με την κανονική αναλογίες ήταν, κατά την 95η επίπεδο εμπιστοσύνης (P = 0,05).

Η

Μέτρηση ORM2 σε δείγματα πλάσματος

Όπως φαίνεται στο Σχ. 1, τα επίπεδα ORM2 πλάσμα σε λογαριθμική κλίμακα σε οικόπεδα box-και-μουστακιού, οι μέσες συγκεντρώσεις ORM2 πλάσμα ήταν σημαντικά υψηλότερα σε CRC σε σύγκριση με την κανονική παχέος εντέρου, υπερπλασίας πολύποδα, και αδένωμα (όλα σε P & lt? 0.001, αντίστοιχα). Το επίπεδο ORM2 πλάσματος ήταν στατιστικά σημαντικά υψηλότερη στους ασθενείς με IBD σε σχέση με το κανονικό παχέος εντέρου, του παχέος υπερπλασίας πολύποδα και αδένωμα (όλα σε P & lt? 0.001, αντίστοιχα) και ήταν στατιστικά σημαντικά υψηλότερη στους ασθενείς με IBD σε σχέση με το CRC (

P

& lt?. 0.05)

το αστέρι (αστέρια) στο σχήμα σημαίνει ένα σημάδι για τη στατιστική ανάλυση. Ένα αστέρι σημαίνει P & lt? 0.05 και η πινακίδα με τρία αστέρια σημαίνει P & lt? 0.001. CRC είναι στατιστικά διαφορετική από την κανονική παχέος εντέρου, πολύποδα υπερπλασίας και αδένωμα (όλα σε Ρ & lt? 0.001, αντίστοιχα)? IBD είναι στατιστικά διαφορετική από την κανονική του παχέος εντέρου υπερπλασίας πολύποδα και αδένωμα (όλα σε P & lt? 0.001, αντίστοιχα). IBD είναι στατιστικά διαφορετική από καρκίνο του παχέος εντέρου (P & lt? 0,05).

Η

αξιολογηθεί κατά πόσο ORM2 πλάσμα θα μπορούσαν δυνητικά να διακρίνει CRC από καλοήθεις παχέος ασθένειες. Ψάξαμε για τη συσχέτιση (ηλικία, φύλο, το στάδιο TNM και ιστολογικά βαθμού) μεταξύ των επιπέδων ORM2 πλάσμα και κλινικοπαθολογικών παραμέτρων CRC ασθενούς (Πίνακας 3). Καμία σημαντική συσχέτιση μεταξύ των συγκεντρώσεων ORM2 πλάσματος και την ηλικία, το φύλο, το στάδιο TNM ή ιστολογικές βαθμού.

Η

Μέτρηση ORM2 σε δείγματα ιστών

ανάλυση Western blot χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η έκφραση της ORM2 σε ιστούς. Όταν η έκφραση πρωτεΐνης μετρήθηκε με πυκνόμετρο, η μέση τιμή του πυκνομέτρου ORM2 σε CRC καρκινικούς ιστούς ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από ότι σε αντίστοιχες παρακείμενες κανονικές βλεννογόνους ιστούς (

P

& lt? 0,01). (Εικ. 2)

Συζήτηση

Τα τελευταία χρόνια, πρωτεομική βάση βιοδεικτών ανακάλυψη από τον ορό /πλάσμα έχει αποκτήσει δυναμική. Ένας αριθμός μελετών έχουν προσπαθήσει να χρησιμοποιήσουν πρωτεομική προσεγγίσεις για την ανακάλυψη νέων βιολογικών δεικτών για τους ασθενείς CRC [10] – [14]. Μελέτες από Yong-Sam Kim [10] αποκάλυψε 26 υποψήφιων βιοδεικτών για CRC με συνδυασμό 2-DE και νανο-LC-FT-ICR /LTQ MS. Ma et al [11] προσδιορίζονται 4 πρωτεϊνών με διαγνωστικές δυνατότητες από SELDI διερεύνηση της proteome των 62 ασθενών CRC και 31 άτομα μη-καρκίνου του ορού. Ωστόσο, ζητήματα σχετικά με την πολυπλοκότητα και τη δυναμική περιοχή των συστατικών πρωτεϊνών έχουν καταστήσει δύσκολο να ληφθούν ουσιώδη στοιχεία για την ερμηνεία. Τόσο ορό και πλάσμα δείχνουν τεράστια διακύμανση σε μεμονωμένες πρωτεΐνες αφθονία. LC-MS /MS προσεγγίσεις για την ανάλυση ορού /δειγμάτων πλάσματος αποδώσει πολύ καλύτερα δυναμικές ικανότητες εύρος. Επιπλέον, τα αντιδραστήρια iTRAQ έχουν αποκτήσει συμφέροντα σε αυτόν τον τομέα ως ένα χρήσιμο εργαλείο σε πρωτεΐνες ανακάλυψη βιοδεικτών. Είναι η πρώτη μελέτη για να συνδυάσει iTRAQ με την Q-TOF /MS σε δείγματα ασθενών CRC πλάσμα να ανακαλύψουν τις δυνατότητές βιοδείκτες για CRC. 13 πρωτεΐνες με διαφορετικά σχήματα έκφρασης σε CRC πλάσμα επιτυχώς εντοπίστηκαν. Μεταξύ αυτών των 13 πρωτεΐνες, υπήρξαν αρκετές πρωτεΐνες ενδιαφέροντος, όπως ORM2, Serpin αναστολέα πεπτιδάσης (κλάδος D), NADH αφυδρογονάσης υπομονάδα 5 (ND5) και ρετινόλη δεσμευτική πρωτεΐνη 4 (RBP4), οι οποίες επελέγησαν ως ευεργετική υποψηφίων και μπορεί να είναι περαιτέρω διερευνώνται. ORM2 (άλφα-1-όξινη γλυκοπρωτεΐνη), ένα μέλος της οικογένειας των πρωτεϊνών οξείας φάσης βρέθηκε να σχετίζεται με την εντερική νόσο του συστήματος [15] – [18], επιλέχθηκε για περαιτέρω έλεγχο και διερεύνηση

. είναι γνωστό ότι οι καρκίνοι συνοδεύεται από πολυάριθμες συστηματικές φυσιολογικές και βιοχημικές αλλαγές, συμπεριλαμβανομένων γλυκοζυλίωσης το οποίο είναι ένα από τα πιο σημαντικά μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις των πρωτεϊνών. Όλο και περισσότερο την προσοχή που καταβάλλεται για τη μελέτη παρεκκλίνουσα γλυκοζυλίωση κατά τη διάρκεια διάφορες παθοφυσιολογικές καταστάσεις, συμπεριλαμβανομένης της φλεγμονής [19], η αρθρίτιδα [20], [21], και τον καρκίνο [22], [23]. Κατά τη διάρκεια της οργάνωσης των δεδομένων μας βρήκαμε αρκετές ορολογικές γλυκοζυλιωμένη πρωτεΐνες όπως ORM2, EpCAM αλλαγή στα επίπεδα κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του καρκίνου. Σε αυτή την προκαταρκτική έρευνα, έχουμε αναφερθεί ORM2 ως νέο μέλος αυτών σχετίζονται με τον καρκίνο γλυκοπρωτεΐνες. Wandall [24] χρησιμοποιείται ένα μυθιστόρημα O-Γλυκοπεπτιδικά μικροσυστοιχιών στην οθόνη seromic προφίλ των ασθενών με ορθοκολικό cancer.Dai [25] μεμονωμένα απεικονίζεται η αλλαγή στο γλυκοπρωτεΐνες έμμεσα. Οι εκθέσεις αυτές ενθαρρύνουν μια άλλη οπτική γωνία για να ανακαλύψετε την κλινική βιοδεικτών για τη διάγνωση και την πρόγνωση

Υπάρχουν αρκετές αναφορές ORM2 στην εντερική νόσο συστήματος και καρκίνοι [15] -. [18], [26]. ORM2 θεωρήθηκε ότι σχετίζονται με την τριχοειδή διαπερατότητα [15]. Η λειτουργία του orosomucoid αναφέρθηκε ότι συνδέεται με τη φλεγμονή και τον καρκίνο. Η συγκέντρωση του S-orosomucoid βρέθηκε να είναι αυξημένη σε ασθενείς με νόσο του Crohn [16]. Συγκρίνοντας τους ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης με υγιείς μάρτυρες, υπήρχαν σημαντικές διαφορές, με πολύ μεγαλύτερη orosomucoid εκφράζεται στην ομάδα του καρκίνου [17]. Παρόμοια φαινόμενο θα μπορούσε να βρεθεί επίσης σε ασθενείς με βρογχικό καρκίνωμα [18]. Χρησιμοποιώντας το 2-D ΨΗΦΟ και περαιτέρω αναλύθηκαν με φασματομετρία μάζας MALDI-TOF σε ασθενείς με χρόνια φλεγμονώδη απομυελινωτική πολυνευροπάθεια, σημαντική αυξητική ρύθμιση της άλφα-1 όξινη γλυκοπρωτεΐνη 1 πρόδρομος ταυτοποιήθηκε [26]. Μελέτες έχουν δείξει ότι η CEA, παρόμοια με άλφα 1-όξινη γλυκοπρωτεΐνη (orosomucoid) στην ανοσολογία είναι αξιωματική ως βιοσυνθετική πρόδρομος της άλφα 1-όξινη γλυκοπρωτεΐνη [27].

Αυτή είναι η πρώτη αναφορά ενός up-ρύθμιση της ORM2 στο CRC πλάσμα. Επιπλέον, η αυξητική ρύθμιση του ORM2 επιβεβαιώθηκε με ELISA σε πλάσμα ασθενών με εντερική νόσο του συστήματος. Διαπιστώθηκε ότι ORM2 ήταν σημαντικά αυξημένα σε ασθενείς που πάσχουν από CRC και ΙΒϋ σε σύγκριση με φυσιολογικά άτομα και σε ασθενείς με υπερπλαστικούς πολύποδες και αδένωμα. ORM 2 είναι μια βασική πρωτεΐνη πλάσματος οξείας φάσης σε φλεγμονή, έτσι αυτή η πρωτεΐνη έχει χαρακτηριστεί ως ένα αντιδραστήριο οξείας φάσης. Η ειδική λειτουργία αυτής της πρωτεΐνης δεν έχει ακόμη καθοριστεί, ωστόσο, ORM2 φαίνεται να λειτουργεί στη ρύθμιση της δραστηριότητας του ανοσοποιητικού συστήματος κατά την αντίδραση οξείας φάσης. Αυτό μπορεί να χρησιμεύσει ως μια πιθανή μεσολαβητή του ανοσοποιητικού διαφυγής σε CRC και την ανίχνευση ORM2 μπορεί να είναι σημαντική για τη διάκριση του παχέος καρκινογένεση από IBD.

Για να προσδιοριστεί η πηγή της ORM2, ιστό του όγκου CRC και το αντίστοιχο παρακείμενο φυσιολογικό βλεννογόνους ιστούς αξιολογήθηκαν με στύπωμα Western. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το επίπεδο έκφρασης ORM2 σε CRC καρκινικούς ιστούς βρέθηκε να είναι υψηλότερο από το φυσιολογικό ιστό. Ως εκ τούτου, προτείνεται ότι ORM2 μπορεί να εμπλέκεται στην καρκινογένεση σε ασθενείς με καρκίνο CRC.

Αυτή η μελέτη παρέχει επίσης ενδείξεις ότι τα επίπεδα ORM2 σε ασθενείς CRC μπορεί να είναι χρήσιμα ως βιοδείκτη για τη διάγνωση. δοκιμασίες ορού CEA δεν συνιστώνται για τη διαλογή ασυμπτωματικούς ασθενείς για καρκίνο. Ένας λόγος είναι ότι η δοκιμασία CEA πλάσμα δεν είναι αρκετή για διαγνωστικούς να διακρίνει μεταξύ εντοπισμένου κακοήθεις όγκους και καλοήθεις διαταραχές. Στη μελέτη μας, η ανίχνευση των ORM2 χρησιμοποιώντας ELISA και Western blot είναι πολλά υποσχόμενη. Οι συγκεντρώσεις στο πλάσμα ORM2 ήταν σημαντικά υψηλότερα σε CRC σύγκριση με την κανονική παχέος εντέρου, πολύποδα υπερπλασίας, και αδένωμα (Ρ & lt? 0.001). Ως εκ τούτου, με τη χρήση ORM2 να παρακολουθεί δυνάμει ασθενείς CRC μπορεί να είναι ένας καλός τρόπος για να επικυρώσει αν ORM2 μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη διαλογή ασυμπτωματικούς ασθενείς. Ωστόσο, είναι σημαντικό να αναλυθεί περαιτέρω η διαγνωστική σημασία του ORM2 από ένα μεγάλο αριθμό ασθενών σε πολλαπλά κέντρα πριν από την τελική κλινική εφαρμογή για CRC διάγνωση.

αναστολέας Serpin πεπτιδάσης, clade D (συμπαράγοντα ηπαρίνης), το κωδικοποιημένο προϊόν συμπαράγοντα ηπαρίνης η οποία μοιράζεται ομολογία με την αντιθρομβίνη III και άλλα μέλη της άλφα 1-αντιθρυψίνης υπεροικογένεια μπορεί να αναστείλει ταχέως θρομβίνη σε παρουσία ηπαρίνης. Ελαττώματα SERPIND1 είναι η κύρια αιτία της ηπαρίνης ανεπάρκεια συμπαράγοντα II, και ηπαρίνη ανεπάρκεια συμπαράγοντα II μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένη παραγωγή θρομβίνης και ένα a-κατάσταση υπερπηκτικότητας. Αυτό είναι μειονεκτικό για την ανάπτυξη του καρκίνου. Υπάρχουν αρκετές αναφορές στην κλάδου Α και Ε σε καρκίνους [28], [29], αλλά λίγοι σε clade Δ Παρόμοια πρωτεΐνη αναγνωρίστηκε επίσης ως ένα άλφα-1-αντιχυμοθρυψίνη πρόδρομο. Άλφα-1-αντιχυμοθρυψίνη ανήκει στην οικογένεια σερπίνης, εκφράζεται έντονα σε αστροκύτταρα και έχει βρεθεί να παίζουν ρόλους στην παθογένεση της κλασικής πλακών με ασθένειες του Alzheimer. Ως παράγοντας οξείας φάσης, μπορεί να αναστείλει τη δραστηριότητα των μακροφάγων και εκτοένζυμα μεταλλοπρωτεϊνάσης-9 κατά τη διάρκεια της επούλωσης τραύματος του δέρματος [30], αλλά επάγει την παραγωγή TNF-α στη μελέτη της μικρογλοίας κυτταρικές γραμμές [31]. Αυτό το είδος της αναστολέα πρωτεάσης έχει αναφερθεί ότι σχηματίζει σύμπλοκα με την οικογένεια καλλικρεϊνη όπως hK3 (επίσης γνωστό ως ειδικό προστατικό αντιγόνο), hK2 και hK6, και θα μπορούσε να εφαρμοστεί για τη διάγνωση των καρκίνων του προστάτη [32].

Μεταξύ των κάτω ρυθμισμένα πρωτεΐνες, ND5, ένα ουσιαστικό συστατικό υπομονάδας του πλήρους μιτοχονδριακού συμπλόκου Ι [33], [34], παίζει σημαντικό ρόλο στη διαδικασία οξειδωτικής φωσφορυλίωσης καθώς και στην καρκινογένεση. Μερικοί βιβλιογραφία αναφέρεται ότι ND5 θα μπορούσε να προκαλέσει ηπατώματα [35]. Οι μιτοχονδριακού DNA (mtDNA) μεταλλάξεις έχουν αναφερθεί σε πολλά είδη καρκίνων. ελαττώματα γονίδιο μιτοχονδριακού DNA μπορούν να συμμετέχουν στους παθοφυσιολογικούς μηχανισμούς των θανατηφόρων εκδήλωση [36]. μετάλλαξης μετατόπισης πλαισίου σε γονίδια ND5 έχει αναφερθεί σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, και επίσης σε προνεοπλασματικές αλλοιώσεις της γαστρεντερικής οδού [37]. Σε αυτή τη μελέτη, εντοπίσαμε ND5 (67 kDa) ως υποψήφια χώρα, αλλά ο ακριβής ρόλος της στην καρκινογένεση εξακολουθεί να χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση, ιδιαίτερα τις μεταλλάξεις.

RBP4, μια κυτταροκίνη που εκκρίνεται από τον λιπώδη ιστό, είναι ένα μυθιστόρημα αδιποκίνης συνδέεται με την παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη διαβήτη τύπου 2. RBP4 έχει επίσης καταδειχθεί ότι εμπλέκεται, σε κάποιο βαθμό, στην ανάπτυξη της φλεγμονής και του καρκίνου. Για παράδειγμα, RBP4 μεθυλίωση διερευνήθηκε σε οισοφαγικό καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων [38]. Σε ορθοκολικό καρκίνωμα, το επίπεδο της RBP μειώνεται [39]. Στη μελέτη μας, εντοπίσαμε RBP4 ως υποψήφιος, αλλά περαιτέρω διερεύνηση της λειτουργίας του στην παθογένεια της ανάπτυξης του καρκίνου είναι απαραίτητη.

Σε αυτή την προκαταρκτική μελέτη απόδειξη της αρχής, Πίνακας 1 και Πίνακας 2 λίστα 13 υποψηφίων βιοδείκτες για CRC. Τα περισσότερα από αυτά δεν έχουν αναφερθεί ως βιοδείκτες του καρκίνου, που έχουν δείξει ότι iTRAQ μαζί με Q-TOF /MS είναι μία ευαίσθητη και αναπαραγώγιμη, ισχυρή τεχνική για τον προσδιορισμό στατιστικά σημαντικές διαφορές της έκφρασης πρωτεΐνης ασθενών betweenCRC και τα δείγματα πλάσματος υγιών ελέγχου. Από την επαλήθευση των ORM2, διαπιστώθηκε ότι ORM2 μπορεί να είναι ένας πιθανός βιολογικός δείκτης για τη διάκριση CRC από IBD. Σε μελλοντικές μελέτες, μεγαλύτερους πληθυσμούς του δείγματος θα πρέπει να επιβεβαιώσει αυτές τις πιθανές βιοδείκτες. Στην έρευνά μας, ORM2 κατ’αρχάς ταυτοποιείται ως διαφορετικά ρυθμιζόμενη πρωτεΐνη σε ασθενείς CRC συγκριτικά με φυσιολογικούς ελέγχους με διαλογή πρωτεωμικής. Ωστόσο, απαιτεί πολλή πειραμάτων πάγκο και κλινικές δοκιμές πριν ORM2 μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ένα αξιόπιστο βιοδείκτη. Εμείς θα συνεχίσουμε τη μελέτη μας για ORM2 σε δύο πτυχές. Πρώτον, έχουμε την ίδρυση μιας πλατφόρμας για τη διάκριση και να αναλύσει τις συσχετισμούς των διακριτών επιπέδων για τροποποιήσεις μοτίβο γλυκοζυλο σε διάφορες φάσεις της ανάπτυξης των ασθενειών βασίζεται στην ORM2. Ταυτόχρονα, είμαστε επίσης πολύ ενδιαφέρονται για την λειτουργία του ORM2 στην εξέλιξη του όγκου λόγω ρυθμίζει την ομοιόσταση των λιπιδίων και των πρωτεϊνών ποιοτικό έλεγχο στο μεμβράνης του ενδοπλασματικού δικτύου.

Μέθοδοι

Η προετοιμασία των δειγμάτων

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε και παρακολουθείται από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Qilu Νοσοκομείο, Πανεπιστήμιο Shangdong. Δείγματα πλάσματος για πρωτεομική από 10 Ομάδα CRC ασθενείς και 10 υγιή ομάδα ελέγχου συλλέχθηκαν (Πίνακας 4). Για κάθε άτομο, 2 ml αίματος λήφθηκε με φλεβοπαρακέντηση και συλλέγεται σε ένα σωλήνα με EDTA, και το πλάσμα παρασκευάστηκε όπως συνιστάται από τον HUPO Plasma Proteome Έργου [40]. Υπήρχαν συνολικά 419 άτομα για ELISA, οι οποίες ταξινομούνται σε πέντε κατηγορίες με πρότυπες κλινικές, ραδιολογικές ενδοσκοπική και ιστολογική κριτήρια: κανονικό έλεγχο (n = 65), υπερπλαστικό πολύποδας (n = 59), η νόσος του φλεγμονώδους εντέρου (IBD) (n = 62), αδένωμα (n = 53) και CRC (n = 180). Για στύπωμα Western, αξιολογήθηκαν συνολικά 41 διαδοχικών ασθενών που διαγνώστηκαν ως CRC. δείγματα όγκων και των αντίστοιχων γειτονικών κανονική βλεννογόνους ιστούς (& gt? 5 cm από το περιθώριο του όγκου) συλλέχθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Κανένας ασθενής σε αυτό studyreceived οποιουδήποτε τύπου θεραπεία, όπως ακτινοβολία ή χημειοθεραπεία.

Η

ανοσοεξάντληση πρωτεϊνών υψηλής αφθονίας πλάσμα

Plasma δείγματα από 10 ασθενείς CRC και 10 άτομα στον έλεγχο ομάδα συλλέχθηκαν (2 ml πλάσματος από κάθε άτομο) και στη συνέχεια αναμειγνύονται για να σχηματίσουν μια πισίνα δείγμα για περαιτέρω εξέταση. Τα συγκεντρωτικά δείγματα πλάσματος εξαντλημένο από τις κορυφαίες 12 πιο άφθονες πρωτεΐνες (αλβουμίνη, IgG, IgA, IgM, τρανσφερίνη, ινωδογόνο, α

2-μακροσφαιρίνη α

1-αντιθρυψίνης, απτοσφαιρίνης, α

1-Acid γλυκοπρωτεΐνης, της απολιποπρωτεΐνης ΑΙ, και απολιποπρωτεΐνη Α-ΙΙ) με τη χρήση ενός προ-συσκευασμένο 2-ml Seppro ™ MIXED12 στήλη LC συγγένειας (Genway Biotech, San Diego, CA) σε ένα Agilent 1100 σύστημα σειρά HPLC (Agilent, ΡβΙο Alto, CA) σύμφωνα με τη διαδικασία η συνιστώμενη κατασκευαστή.

Μετά την εξάντληση, οι κατακρημνισμένες πρωτεΐνες διαλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (6 Μ ουρία, 4% CHAPS, 1 mM PMSF, 2 mM EDTA). Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίσθηκαν με την 2D Quant Kit (GE Healthcare, USA), χρησιμοποιώντας αλβουμίνη ως πρότυπο αναφοράς (1 μg /μl-10 μg /μl). Οι συγκεντρώσεις μετρήθηκαν σε 4,83 μg /μl (η ομάδα CRC) και 2,27 μg /μl (η υγιής ομάδα).

Trypic Η πέψη και iTRAQ αντιδραστήριο σήμανσης

Μετά τη μείωση (10 mM DTT, 100 mM NH4HCO3, 56 ° C, 45 min) και αλκυλίωση (55 mM ΙΑΑ, 100 mM NH4HCO3, 45 min), το κάθε δείγμα (100 μg) χωνεύτηκε με τρυψίνη και επισημαίνονται με αντιδραστήρια iTRAQ. Αυτά τα δείγματα υποβλήθηκαν σε πέψη σε ρυθμιστικό διάστασης (trypsin:protein = 1:30) για μία νύχτα σε 37 ° C. Τα πεπτίδια σημάνθηκαν με αντιδραστήρια iTRAQ (114 για την ομάδα CRC, 117 για την υγιή ομάδα).

Strong χρωματογραφία ανταλλαγής κατιόντων και C18 στήλη κλασματοποίησης

Strong χρωματογραφία ανταλλαγής κατιόντων χρησιμοποιήθηκε για να απομακρυνθεί ο πλεονάζων αντιδραστήρια iTRAQ και παρεμβαλλόμενες ουσίες που μπορούν να επηρεάσουν την ανάλυση MS. Τα επισημασμένα δείγματα προστέθηκαν σε 10 × Ρυθμιστικό Α (10 mM ΚΗ2ΡΟ4 σε 25% ακετονιτρίλιο, ρΗ 3,0). χρωματογραφία ανταλλαγής κατιόντων υψηλής ανάλυσης στη συνέχεια διεξήχθη για να διαχωριστούν τα σημασμένα δείγματα σε 10 κλάσματα. Τα πεπτίδια εκλούστηκαν με μια γραμμική κλίση KCl mm 0~500 (25% ν /ν ACN, 10 mm ΚΗ2ΡΟ4, ρΗ 3) σε 15 λεπτά με ρυθμό ροής 1 ml /min, με κλάσματα συλλέχθηκαν σε διαστήματα 1 λεπτού. Τα δείγματα αφαλατώθηκαν και περαιτέρω κλασματώθηκε με τη χρήση μίας στήλης C18 επί nano HPLC (PROXEOME, Αμερική) ακολουθούμενη από MS ανάλυση. Η κλίση ήταν 5~40% ACN για 70 λεπτά.

Matrix βοήθεια εκρόφησης λέιζερ ιονισμού χρόνο της πτήσης (MALDI-TOF) /TOF και microQ-TOF ανάλυση

παράμετροι Machine ορίστηκαν ως , πηγή ιόντων 25 kV για θετική παραγοντοποίηση της μήτρας (PMF) και 8,0 kV για tandem MS /MS ανακλαστήρα 26,3 kV για PMF και 29,5 kV για tandem MS /MS, φακός 9.5 kV για PMF και 3,5 kV για tandem MS /MS, σηκώστε 19,0 kV και τα φάσματα αποκτήθηκαν σε λειτουργία αντανάκλαση στο MALDI TOF /TOF με το φάσμα μάζας 700~4000. Οι αιχμές με αναλογία S /N πάνω από 5 σημάνθηκαν αυτόματα από FlexAnalysis (Bruker, Germany). επιλέχθηκαν οι κορυφές PMF με μάζα ένταση άνω των 5000 για περαιτέρω MS /MS. Τα φάσματα αποκτήθηκαν με τρόπο θετικού ιόντος σε microQ-ΤΟΡ με εύρος μάζας 50~3000, και το ξηρό αέριο και το αέριο του νεφελοποιητή ορίστηκαν ως 3 L /min, και 2 L /min, αντίστοιχα. Η θερμοκρασία του θαλάμου ψεκασμού ορίστηκε ως 150 ° C, και η ισχύς του ηλεκτρικού πεδίου ορίστηκε ως 1400 V, η ενέργεια σύγκρουσης ορίστηκε ως το 35% χρονισμού για μικρή μάζα ιόντων και 65% για το χρονοδιάγραμμα μάζας υψηλής ιόντων. Άλλες παράμετροι που ως προεπιλογή.

Βάση δεδομένων αναζήτησης

Τα φάσματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με microQ-TOF ελέγχου 3.0 (Bruker, Germany) χρησιμοποιώντας τις προεπιλεγμένες ρυθμίσεις, εκτός από το ότι οι παράμετροι της χοάνης μεταφοράς RF και σύγκρουση κυττάρων RF ορίστηκαν ως 120 Vpp και 600 Vpp, αντίστοιχα. Η ανάλυση των δεδομένων επακόλουθη διεξήχθη χρησιμοποιώντας την ανάλυση των δεδομένων 4.0 Biotools 3.0 (Bruker, Germany), στημόνι-LC 2.0 (Bruker, Germany), και Mascot 2,2 (Matrix Science, Λονδίνο, Ηνωμένο Βασίλειο), αντίστοιχα. προσδιορισμός πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκε με την αναζήτηση στη βάση δεδομένων Swiss-Prot Human2009-12 με ένα πρόδρομο ιόν και το θραύσμα ανοχή μάζας τόσο οριστεί ως 0,04 Da. Carbamidomethylation κυστεϊνών ορίστηκε ως σταθερή τροποποίηση, και την οξείδωση των μεθειονίνες, iTRAQ 8 plex τροποποίηση του Ν τερματικού, Κ και Υ θεωρήθηκαν ως μεταβλητή τροποποιήσεις, αντίστοιχα. Ένα μέγιστο mis-διάσπαση έγινε δεκτή. Οι αποκοπές βαθμολογία ιόντων τέθηκαν σε 25 για τα πεπτίδια και σε 68 για τις πρωτεΐνες. ταυτοποιήσεις πεπτίδιο έγιναν δεκτές, εφόσον θα μπορούσε να δημιουργηθεί σε ποσοστό μεγαλύτερο του 90,0% πιθανότητα, όπως καθορίζεται από τον αλγόριθμο PeptideProphet. ταυτοποιήσεις πρωτεΐνης έγιναν δεκτές, εφόσον θα μπορούσε να δημιουργηθεί σε ποσοστό μεγαλύτερο του 90,0% πιθανότητα ή περιέχονται τουλάχιστον 2 προσδιορίζονται πεπτίδια. Πρωτεΐνες που περιείχαν παρόμοια πεπτίδια και δεν θα μπορούσαν να διαφοροποιηθούν με βάση την ανάλυση MS /MS μόνος ομαδοποιήθηκαν για να ικανοποιήσει τις αρχές της φειδούς. Για την κατάταξη, οι γονιδίων οντολογίας (GO) σύμβολα των ταυτοποιημένων πρωτεϊνών ήταν επιμέλεια χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων Xref, και διερωτήθηκε κατά της βάσης δεδομένων γονιδιακής οντολογίας με το εργαλείο GoMiner (https://discover.nci.nih.gov/gominer/index.jsp ). Πρόβλεψη της προέλευσης των πρωτεϊνών με άγνωστο κυτταρικό εντοπισμό πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του PSORT ΙΙ (https://www.psort.org/).

Όλα πρωτεΐνη αναλογίες iTRAQ μετατράπηκαν σε βάση 2 τιμές λογάριθμο. Στη βάση 2 χώρο λογάριθμο, ένα 2-φορές αλλαγή στα επίπεδα αναφέρθηκε ως 1 ή -1 για up-ρυθμίζονται και τα κάτω-ρυθμίζονται αλλαγές, αντίστοιχα.

Elisa για ORM2

επίπεδα

ORM2 στην πλάσματος ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα εμπορικά διαθέσιμο κιτ ELISA (Groundwork Biotechnology Diagnosticate, San Diego, CA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Western blotting για ORM2

ιστούς όγκων και η αντίστοιχη παρακείμενο φυσιολογικό βλεννώδεις ιστούς επαναιωρήθηκαν σε παγωμένο ραδιοανοσοκατακρήμνισης (RIPA) ρυθμιστικό για λύση. Ένα κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης BCA (Beyotime, Biotechnology, Κίνα) χρησιμοποιήθηκε για προσδιορισμό πρωτεΐνης. Περίπου 25 μg πρωτεΐνης των δειγμάτων φορτώθηκε, διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου Tris-γλυκίνη-SDS 9,0% και έπειτα ηλεκτρο-μεταφέρθηκαν πάνω σε μεμβράνες πολυβινυλιδενο φθορίδιο. Μετά τον αποκλεισμό με 5% άπαχο γάλα, μεμβράνες επωάστηκαν με ORM2 Ab (1:150, Yueyan Βιολογική Τεχνολογίας, Σαγκάη, Κίνα) ή μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-β-ακτίνης (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) επί μία νύκτα στους 4 ° C. Οι μεμβράνες επωάστηκαν περαιτέρω με πολυκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-κατσίκας συζευγμένο με HRP δευτερογενές αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ή αντι-ποντικού δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με HRP πολυκλωνικά κατσίκας (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Συγκροτήματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Η ένταση της κάθε ζώνης προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας ImageJ 1,32 λογισμικό (National Institutes of Health, Bethesda, MD) μετά από πυκνομετρική σάρωση των φιλμ.

Στατιστική ανάλυση

Η δοκιμή Kolmogorov-Smirnov διεξήχθη για να προσδιοριστεί η κατανομή των δειγμάτων της κάθε ομάδας. Τα δεδομένα εκφράζονται ως (ενδοτεταρτημοριακό εύρος, 1IQR) μέση. Μια μη-παραμετρικό τεστ (τεστ Kruskal-Wallis) εφαρμόστηκε για την ανάλυση των διαφορών μεταξύ CRC και άλλες ομάδες. Ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική. Η στατιστική ανάλυση έγινε με το πρόγραμμα SPSS 13.0 εκδόσεις λογισμικού για τα παράθυρα (SPSS Inc, Chicago, ΗΠΑ).

Ευχαριστίες

Χάρη στην Δρ Edward C. Mignot, πρώην του Πανεπιστημίου Shandong, για τη γλωσσική συμβουλές .