Αφηρημένο

Οι ακουαπορινών (AQP) είναι πρωτεΐνες κανάλι νερού παίζει σημαντικό ρόλο στην διακυτταρική και των επιθηλίων κίνηση του νερού. Πρόσφατα, ο ρόλος των AQPs στην ανθρώπινη καρκινογένεση έχει γίνει μια περιοχή μεγάλου ενδιαφέροντος. Εδώ, με ανοσοϊστοχημεία (IHC), έχουμε βρει μια έκφραση της AQP5 πρωτεΐνης σε 35,3% (IHC-βαθμολογία: ≥1, 144/408) των εκτομή δείγματα ιστού ΜΜΚΠ. Θήκες με AQP5-θετική κατάσταση (IHC-score: ≥2) εμφανίζεται υψηλότερο ποσοστό υποτροπής του όγκου από αρνητικές σε NSCLC (54,7% έναντι 35,1%, p = 0,005) και χειρότερα ελεύθερη νόσου επιβίωση (p = 0,033? Ή = 1,52? 95% CI: 01.04 – 02.23). Περαιτέρω

in vitro δοκιμασία

εισβολή χρησιμοποιώντας κύτταρα BEAS-2Β και ΝΙΗ3Τ3 σταθερώς επιμολυσμένα με κατασκευάσματα υπερέκφραση πλήρους μήκους άγριου τύπου AQP5 (AQP5) και δύο μεταλλάξεις του, η οποία N185D μπλοκ μεμβράνη διακίνησης και S156A οποίο εμποδίζει την φωσφορυλίωση επί Ser156 , έδειξε ότι AQP5 που προκαλείται από τις εισβολές των κυττάρων, ενώ και οι δύο μεταλλάξεις δεν το έκανε. Σε κύτταρα BEAS-2Β, η έκφραση του AQP5 προκάλεσε ατρακτοειδόμορφα και ινοβλαστικά αλλαγή και τις απώλειες του κυττάρου-κυττάρου και κυττάρου επαφές πολικότητα μορφολογικές. Μόνο τα κύτταρα με AQP5, όχι μία από τις δύο μεταλλάξεις, εμφάνισαν απώλεια δεικτών των επιθηλιακών κυττάρων και ένα κέρδος δείκτες μεσεγχυματικών κυττάρων. Σε μια συστοιχία ανθρώπινη πρωτεΐνη SH3-domains, κυτταρικά εκχυλίσματα από BEAS-2Β με AQP5 έδειξαν μια ισχυρή δραστικότητα δέσμευσης SH3-τομείς του c-Src, Lyn, και Grap2 Ο-τερματικό. Επιπλέον, στην δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης, ενεργοποιημένο c-Src, φωσφορυλιωμένη σε Tyr416, έδειξε μια ισχυρότερη δραστηριότητα δέσμευση από τα κυτταρικά εκχυλίσματα από BEAS-2B με AQP5 σε σύγκριση με N185D ή S156A μεταλλαγμένη. Φθορισμού σε in situ υβριδισμού ανάλυση (FISH) δεν παρουσιάζουν ενδείξεις γονιδιωματικής ενίσχυσης, γεγονός που υποδηλώνει την έκφραση AQP5 ως δευτερεύουσα εκδήλωση. Με βάση αυτά τα κλινικά και μοριακές παρατηρήσεις, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι AQP5, μέσω φωσφορυλίωσης του στις Ser156 και την επακόλουθη αλληλεπίδραση με c-Src, διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στον NSCLC εισβολή και, ως εκ τούτου, μπορεί να παρέχει μια μοναδική ευκαιρία για την ανάπτυξη ενός νέου θεραπευτικού στόχου, καθώς και ως προγνωστικός δείκτης σε NSCLC

Παράθεση:. Chae YK, Woo J, Kim MJ, Kang SK, Kim MS, Lee J, et al. (2008) Έκφραση του Aquaporin 5 (AQP5) Προωθεί όγκων Εισβολή στην Ανθρώπινη μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 3 (5): e2162. doi: 10.1371 /journal.pone.0002162

Επιμέλεια: Ιωσήφ Najbauer, City of Hope Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9 Γενάρη 2008? Αποδεκτές: 13 Μάρτη 2008? Δημοσιεύθηκε: May 14, 2008

Copyright: © 2008 Chae et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε εν μέρει από το P50 επιχορήγηση SPORE CA96784-01 (για CM), Cancer Research Grant από pyung-Ya Ίδρυμα (σε cm), και KOSEF επιχορήγηση για έρευνα R01-2004-000-10670-0 και Ίδρυμα Ερευνών Κορέα επιχορήγηση KFR- 2004-041-E00064 (για SJJ)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. DS είναι μια πληρωμένη σύμβουλος Cangen Βιοτεχνολογία

Εισαγωγή

Οι ακουαπορινών (AQP) αντιπροσωπεύουν μια οικογένεια. πρωτεΐνες κανάλι νερό διαμεμβρανικές κατανέμονται ευρέως σε διάφορους ιστούς σε όλο το σώμα και παίζουν σημαντικό ρόλο στην διακυτταρική και transepithelial νερό κίνηση [1], [2]. Μέχρι στιγμής, έχουν τουλάχιστον δέκα διακριτές AQPs έχουν χαρακτηριστεί σε ανθρώπους και έχει υπάρξει μια αύξηση της κατανόησης των ρόλων τους στην ανθρώπινη παθοφυσιολογία [2]. Ωστόσο, μόνο πρόσφατα έχει δεδομένα προέκυψαν σχετικά με το ρόλο της ανθρώπινης AQPs (hAQPs) ως ένα από τα βασικά στοιχεία που εμπλέκονται άμεσα στο ανθρώπινο καρκινογένεση [3]. Η έκφραση του hAQP1 συχνά σχετίζεται με τον καρκίνο του παχέος εντέρου, καρκίνο του παγκρέατος, όγκου του εγκεφάλου, καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων, και μικροαγγείων του (ΜΜ), παραλληλίζοντας την αγγειογένεση [4] – [8]. Παρομοίως, η έκφραση της AQP5 αυξήθηκε σε καρκίνο του παγκρέατος και τον καρκίνο των ωοθηκών [7], [9]. Επιπλέον, έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν την επαγωγή της έκφρασης AQP5 στο μήνυμά του κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του καρκίνου του παχέος εντέρου νωρίς [5].

Στο λειτουργικό επίπεδο, AQP1 φαίνεται να είναι ένας από τους καθυστέρησε γονιδίων πρώιμης απόκρισης και επίσης εμπλέκονται σε κυτταρική μετανάστευση, και την αγγειογένεση [10], [11], και η έκφραση του AQP1, AQP3 και AQP5 προκλήθηκαν κατά τη διάρκεια της ενεργοποίησης των λεμφοκυττάρων [12]. Προηγουμένως, έχουμε παράσχει ενδείξεις για νέα ογκογόνο ιδιότητες AQP1 και η έκφρασή του σε δείγματα ιστού από εκτομή μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα. Περαιτέρω απόδειξη του ρόλου των AQP5 στην ανθρώπινη καρκινογένεση επίσης παρέχονται από την ομάδα μας [13], [14]. Η έκτοπη έκφραση της AQP5 σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 που επάγεται πολλές φαινοτυπικές αλλαγές χαρακτηριστικές του μετασχηματισμού τόσο

in vitro

και

in vivo

προωθώντας μονοπάτια σηματοδότησης ενεργοποιούνται μέσω Ras, η οποία προκαλείται από φωσφορυλίωση του συναινετική θέση ΡΚΑ της AQP5.

στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε ο ρόλος των AQP5 στον καρκίνο του πνεύμονα. AQP5 επιλέχθηκε με βάση μια σειρά μελετών: Πρώτον, προκαταρκτική μελέτη μας έδειξε ότι, μεταξύ AQP1, 3, και 5, AQP5 έδειξε την πιο ισχυρή ογκογόνο δυναμικό σε κυτταρική γραμμή ΝΙΗ3Τ3. Δεύτερον, αν και οι δύο AQP1 και AQP5 έδειξε ογκογόνο ακίνητο με κυτταρική σειρά ΝΙΗ3Τ3, έκφραση AQP5 που προκαλείται από την ενεργοποίηση της ERK [13], ενώ η έκφραση AQP1 λένε το αντίθετο [15]. Τρίτον, η έκφραση του AQP5, δεν AQP1, ή AQP3, βρέθηκε να σχετίζεται με ERK /Rb ενεργοποίηση Ras /μονοπατιού σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου και συνδέθηκε με ηπατική μετάσταση σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου [16]. Έχουμε αποδείξει προηγουμένως την έκφραση του AQP1 σε ανθρώπινους καρκινικούς ιστούς πρωτογενούς πνεύμονα? 18 από 44 δείγματα ασθενών μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα έδειξαν θετική έκφραση πρωτεΐνης AQP1. Ωστόσο, έχει αποδειχθεί ότι AQP5 έδειξε πιο ισχυρή ογκογόνο δυναμικό από AQP1 καθώς AQP3 σε δοκιμασία μαλακού άγαρ, επικεντρώνονται δοκιμασία σχηματισμού, και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (ΜΤΤ) [13] – [15], οδηγώντας μας να επιλέξει AQP5 για του ρόλο στην καρκινογένεση του πνεύμονα όχι μόνο για κλινική μελέτη επικύρωσης, αλλά και για μελέτες σε υποκείμενη μοριακούς μηχανισμούς της.

Εδώ, παρουσιάζουμε δύο μοριακές και κλινικές ενδείξεις ότι AQP5 μπορεί να παίζει ρόλο στην εξέλιξη της μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC). Πρώτον, με βάση την ανοσοϊστοχημική ανάλυση hAQP5 με 408 ιστούς NSCLC, ερευνήσαμε αν προφίλ έκφρασης του AQP5 στον καρκίνο του πνεύμονα του ανθρώπου συσχετίζεται με την εξέλιξη της νόσου και την επιβίωση. Στη συνέχεια, έχουμε εκτελούνται δοκιμασία εισβολής και μελέτη σήμανσης μετάβαση επιθηλίου-μεσεγχύματος σε βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα ανθρώπινου υπερεκφράζουν AQP5 έναντι μεταλλακτών του εκτός από εικονικές ελέγχου, που ακολουθείται από περαιτέρω μελέτες μοριακής αλληλεπίδρασης για τη διαλεύκανση AQP5 μονοπάτι μεσολάβηση. Επιπλέον, η ανάλυση FISH έγινε για τον εντοπισμό μοριακών μηχανισμών που διέπουν την έκφραση hAQP5.

Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων

Όλες οι κυτταρικές σειρές ελήφθησαν από την Συλλογή Ιστών Αμερικανικού Τύπου (Rockville, MD ). Το μυϊκό κυτταρική γραμμή ινοβλάστης ΝΙΗ3Τ3 καλλιεργήθηκε σε DMEM με την παρουσία 10% FBS. Η κανονική πνευμονική κυτταρική σειρά BEAS-2Β αναπτύχθηκε σε LHC-9 μέσο με την παρουσία 0.5 ng /ml ανασυνδυασμένου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF), 500 ng /ml υδροκορτιζόνη, 0,005 mg /ml ινσουλίνη, 0.035 mg /ml εκχυλίσματος υποφύσεως βοοειδών , 500 ηΜ αιθανολαμίνη, 500 ηΜ φωσφοαιθανολαμίνη, 0,01 mg /ml τρανσφερίνη, 6,5 ng /ml 3,3 ‘, 5-τριϊωδοθυρονίνη, 500 ng /ml επινεφρίνης, 0,1 ng /ml ρετινοϊκού οξέος (Clonetics Corporation, Walkersville, MD). Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 5% CO

2 ισορροπημένη αέρα στους 37 ° C.

Το πλασμίδιο κατασκευάζει και παραγωγή σταθερών κυτταρικών σειρών

Ανθρώπινο cDNA από ΗΕΚ 293 ενισχύθηκε με πολυμεράση αλύσου αντίδραση (PCR) χρησιμοποιώντας εκκινητές για άγριου-τύπου AQP5 (AQP5) και στη συνέχεια εισάγεται εντός EcoR Ι και XhoI θέση του pcDNA 3.1 (+). Οι κλώνοι επιβεβαιώθηκαν με ανάλυση περιορισμού και με προσδιορισμό της αλληλουχίας του DNA και των δύο κλώνων. Σερίνη ή ασπαραγίνη 156 185 αντικαταστάθηκε με αλανίνη ή ασπαρτικό οξύ, αντίστοιχα, με βάση την PCR τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση για να παράγει το μεταλλαγμένο S156A ή N185D AQP5 με βάση την AQP5 pcDNA3.1 κατασκευάσματος όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13]. εισήχθησαν AQP5 WT και δύο μεταλλάξεις εντός των θέσεων EcoR Ι και BamH Ι του p3XFLAG-CMV-14 (Sigma) και επαληθεύεται με προσδιορισμό της αλληλουχίας του DNA και των δύο κλώνων των μεταλλακτών. οι κατασκευές έκφρασης επιμολύνθηκαν σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 και BEAS2B με FuGENE 6 σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Όλες οι επιμολύνσεις επιλέχθηκαν με 800 μg /mL G418 για 3 εβδομάδες και επιλέγονται κλώνοι υποβλήθηκαν σε διαλογή με στύπωμα Western χρησιμοποιώντας αντίσωμα AQP5 και /ή RT-PCR. Όταν φθάσει σε συρροή, τα κύτταρα υποκαλλιεργήθηκαν με επεξεργασία με θρυψίνη (0,05% θρυψίνη, 0,53 mM EDTA σε ισορροπημένο αλατούχο διάλυμα Hanks). Οι φωτογραφίες που δείχνουν τις μορφολογίες των διαφόρων σταθερών κυττάρων που εκφράζουν διαφορετικά κατασκευάσματα ελήφθησαν μέσω μικροσκοπίας αντίθεσης φάσης (ECLIPSE TE300, Nikon Co., Tokyo, Japan).

Εισβολή δοκιμασία

δοκιμασία εισβολής Matrigel ήταν με κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 και BEAS2B. BIOCOAT Matrigel (BD Biosciences, Bedford, ΜΑ) που ανασυνθέτει τη βασική μεμβράνη αγοράστηκε για την αξιολόγηση κυτταρικής εισβολής. ένθετα πλάκα καλλιέργειας ιστού των 24 φρεατίων επικαλυμμένες με Matrigel επανα-ενυδατωμένα για 2 ώρες σε 37 ° C μέσα ενημέρωσης. Media (0,6 ml) που περιέχει 5% ορό εμβρύου μόσχου προσετέθησαν σε κάθε πλακίδιο και ένα χημειοελκτικό, και προστέθηκαν σε κάθε ένθετο 0,2 ml (2 χ 10

4 κύτταρα) του κυτταρικού εναιωρήματος. Μετά από επώαση για 24 ώρες, μη εισβάλλοντα κύτταρα απομακρύνθηκαν από την άνω πλευρά της μεμβράνης με τρίψιμο. Για να ελαχιστοποιηθεί η επίδραση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων για την δοκιμασία εισβολής, έχουμε επιβεβαιώσει ότι, στις πρώτες 24 ώρες, τα κύτταρα BEAS-2Β υποβάλλονται σε διαίρεση ελάχιστη κυττάρου και δεν δείχνουν καμία αξιοσημείωτη διαφορά στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μεταξύ των κυττάρων που εκφράζουν AQP5 και κύτταρα που εκφράζουν ψευδο διάνυσμα (Εικ. S1). Εισβολή των κυττάρων στην κάτω πλευρά του Matrigel επικαλυμμένων μεμβράνη ανιχνεύθηκε με χρώση των κυττάρων με διάλυμα αιματοξυλίνης του Mayer και οπτικοποίηση των κυττάρων κάτω από ένα μικροσκόπιο. Μετά τη χρώση, τα κύτταρα μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο σε τέσσερα τυχαίως επιλεγμένα πεδία (μεγέθυνση χ 100) και τα αποτελέσματα εκφράστηκαν με τη μορφή ενός γραφήματος ράβδου. Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν με φρεάτια εις τριπλούν για κάθε κατάσταση.

Ανοσοκηλίδωση και ανοσοκαθίζηση

Τα υλικά λύσεως από καλλιεργημένα κύτταρα και ιστούς παρασκευάστηκαν σε παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης ΝΡ-40 (10 mM Tris-HCl (ρΗ 7.4), 137 mM NaCl, 10% γλυκερόλη και 0,1% Nonidet Ρ-40) που περιέχει έναν αναστολέα κοκτέιλ του 10 mM φωσφορικού β-γλυκερόλη, 1 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο, 10 mM NaF, 10 mM Na ορθοβαναδικό, 4.5 U /ml απρωτινίνη ( Sigma), και 1 μg /ml λευπεπτίνη (Sigma). λύματα Ακατέργαστη πρωτεΐνη (30 μg) διαχωρίστηκαν με 12% SDS-PAGE (BIORAD), μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (BioRad), και δεσμεύτηκαν για 1 ώρα με 5% άπαχο ξηρό γάλα σε ρυθμισμένο με Τπδ αλατούχο διάλυμα με 0,05% Tween 20. Το ακόλουθα εμπορικά αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση στυπώματος Western: anti-AQP5 (1:200, Άλφα Diagnostic), αντίσωμα αντι-α-κατενίνης (1:1000, Cell Signaling) αντίσωμα αντι-γ-κατενίνης (1:1000, Cell Signaling) , αντίσωμα αντι-φιβρονεκτίνης (1:1000, Cell Signaling), αντι-βιμεντίνη αντίσωμα (1:1000, Cell Signaling), αντίσωμα αντι-Ε-καδερίνης (1:1000, Cell Signaling), αντι-c-Src αντίσωμα (1 :1000, Cell Signaling), αντι-φωσφο Src αντίσωμα (1:1000, Cell Signaling), αντίσωμα αντι-Lyn (1:1000, Cell Signaling), αντι-grap2 αντίσωμα (1:1000, Cell Signaling) και αντι- αντίσωμα β ακτίνης (1:5000? Sigma). Φωσφο-Src αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά? κηλίδες ακολούθως απογυμνώνεται και επανα-στυπώθηκαν με αντι-src και βήτα-ακτίνη αντισώματα. Χρησιμοποιήθηκαν? δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση Κατάλληλα αντι-κουνελιού και χρένο αντι-ποντικού (Amersham 1:3000). Ανοσοαντιδραστικές ζώνες ανιχνεύθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (Pierce).

SH3 τομέα

δέσμευσης

TranSignal SH3 συστοιχία τομέα III στίγματα με πεπτίδια που εκπροσωπούν 34 διαφορετικές περιοχές ανθρώπινης SH3 συμπεριλαμβανομένων Grb2 και Src, αγοράστηκαν από Panomics και ελέγχθηκαν ως προς τη δέσμευση τους σε τμήματα AQP5 και AQP5 WT διατηρώντας τη φυσική τοπολογία σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι πρωτεΐνες που περιέχει την περιοχή SH3 στη συστοιχία είχαν εντοπισθεί εις διπλούν. Εν συντομία, φίλτρα μεμβράνης επωάστηκαν με /ml πρωτεΐνη 30 μg για όλη τη νύχτα. Μετά την πλύση, η πρωτεΐνη σύνδεση έγινε ορατή με επώαση με συζευγμένο με HRP αντίσωμα His ή αντίσωμα FLAG. Αυτή η δοκιμασία εκτελέστηκε τουλάχιστον δύο φορές με κάθε πρωτεΐνη.

Αναγνώριση των πρωτεϊνών και της αλληλεπίδρασης

Για αναλύσεις καθέλκυσης, πρωτεΐνες σύντηξης GST (πρωτεΐνες που περιέχει την περιοχή SH3) και GST αγοράστηκαν από Panomics. Τα κύτταρα λύθηκαν σε ΝΡ-40 ρυθμιστικό διάλυμα λύσης, και προϊόντα λύσης στη συνέχεια επωάστηκαν είτε με GST ή GST πρωτεΐνη σύντηξης στους 4 ° C για 2 ώρες, ακολουθούμενο από την προσθήκη 20 μΙ σφαιριδίων γλουταθειόνης-Sepharose 4Β. Μετά από 30 λεπτά ανάμιξης, τα σφαιρίδια πλύθηκαν τέσσερεις φορές. Οι πρωτεΐνες εκλούστηκαν σε ρυθμιστικό δείγματος Laemmli και αναλύθηκαν με SDS-PAGE ακολουθούμενη από ανοσοκηλίδα με υποδεικνυόμενα αντισώματα.

Καρκίνος ιστού microarray

Tissue μικροσυστοιχίες (TMAs) κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας σταθεροποιημένα με φορμαλίνη, παραφινώδη ενσωματωμένο ιστούς των 419 NSCLC που λαμβάνονται από το Τμήμα Παθολογίας του Ιατρικού Κέντρου Asan υπό την έγκριση του Διοικητικού συμβουλίου Εσωτερικής αναθεώρηση (IRB αριθμός: 2006 – 0019). Τα δείγματα πνεύμονα ελήφθησαν από το 1996 έως το 1999. Η αρχική H & amp? Ε βάφονται διαφάνειες εξετάστηκαν από παθολόγους μελέτη και αντιπροσωπευτικές περιοχές της κάθε όγκου μαζεύτηκαν με τις τριπλές μπλοκ για να ελαχιστοποιηθεί η απώλεια ιστών και να ξεπεράσουν την ετερογένεια των όγκων

.

Ανοσοϊστοχημεία

Οι διαδικασίες ανοσοχρώση διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το Benchmark συσκευή αυτόματης ανοσοχρώση (Ventana Medical System, Tucson, ΑΖ, USA) με αντίσωμα κατσίκας καθαρισμένο με συγγένεια που εγείρεται έναντι της αλληλουχίας 19-αμινοξέων (αα 251- 269) της ΟΟΟΗ-τελικό άκρο της ανθρώπινης AQP5 (Άλφα Diagnostic, San Antonio, Texas) σε αραίωση 1:50. τομές συστοιχίας ιστού (4 μm πάχους) αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο, επανυδατώθηκαν σε διαβαθμισμένες αλκοόλες, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% σε μεθανόλη σε θερμοκρασία δωματίου για τον αποκλεισμό της ενδογενούς δραστικότητας της υπεροξειδάσης. Το αντίσωμα AQP5 οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το αβιδίνης-βιοτίνης-υπεροξειδάσης τεχνική (κιτ ϋΑΚΟ LSAB? ΫΑΚΟ Cytomation, Carpinteria, CA) και ακολουθείται από ανίχνευση χρωμογόνου με διαμινοβενζιδίνη (DAB). Οι αρνητικοί έλεγχοι πραγματοποιήθηκαν από την παραλείποντας το πρωταρχικό βήμα επώασης του αντισώματος.

Η βαθμολόγηση της ανοσοϊστοχημείας

Η ανοσοχρώση για την TMAs βαθμολογήθηκε ημι-ποσοτικά λαμβάνοντας υπόψη τόσο την ένταση χρώσης και το ποσοστό των θετικών καρκινικών κυττάρων από δύο παθολόγους μελέτη (SJJ και MJK) τύφλωσε με τα κλινικοπαθολογική μεταβλητές. Η ένταση χρώσης βαθμολογήθηκε σε μια κλίμακα τεσσάρων τάξεων: 0, καμία χρώση των καρκινικών κυττάρων? 1, ασθενής χρώση? 2 μέτρια χρώση? 3, ισχυρή χρώση. Το ποσοστό των χρωματισμένων κυττάρων όγκου βαθμολογήθηκε σε μια κλίμακα από 2 τάξεων: 0, & lt? 10% και 1, & gt? 10%. έκφραση AQP5 στον καρκινικό ιστό ορίστηκε ως θετική όταν το γινόμενο της βαθμολογίας ένταση με ποσοστό βαθμολογίας είναι 1 ή περισσότερο. Τόσο ιστολογικό τύπο και το βαθμό επιβεβαιώθηκαν σε αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η & amp? Ε). Χρωματισμένο TMA διαφάνειες

φθορισμού in situ υβριδισμού ανάλυση

Εξήντα εννέα NSCLCs η οποία είχε μια έκφραση της AQP5 (βαθμολογία = 2 ή 3) ανασυγκροτήθηκαν σε δύο μπλοκ ΤΜΑ για την ανάλυση FISH, η κάθε μία. Τμήματα (πάχους 5 μm) από τις διαφάνειες TMA αποπαραφινοποιήθηκαν και προεπεξεργασία για FISH. Ο ανιχνευτής για την ανίχνευση AQP5 προήλθε από τον Homo sapiens 12 BAC RP11-469H8 περιέχει το σύνολο γονίδιο AQP5 (GenBank αρ. AC025154), και επισημαίνονται με ροδαμίνη (Macrogen, Σεούλ, Κορέα). Δύο γονιδιωματικοί κλώνοι DNA με 91 kb και 68 kb μεγέθη γραμαμτοσήμανση 12p13.31 περιοχή επισημασμένο με FITC χρησιμοποιήθηκαν ως ανιχνευτές ελέγχου (Macrogen, Σεούλ, Κορέα). FISH διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια Vysis σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή (Vysis, IL, USA). Τα πλακίδια επιχρωματίστηκαν με 4, 6-διαμιδινο-2 φαινυλινδόλιο για μικροσκοπία. Το σήμα μετρήθηκε κάτω × 1000 μεγέθυνσης.

Στατιστική Ανάλυση

Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του chi-square test με το λογισμικό SPSS (SPSS 12.0K Inc., Chicago, Illinois, USA). Η μέση ηλικία και το μέγεθος του όγκου των ασθενών εκτιμήθηκαν με t-test. Οι καμπύλες επιβίωσης παρήχθησαν χρησιμοποιώντας το μοντέλο Cox αναλογικών κινδύνων να εκτιμηθεί ο κίνδυνος θανάτου από καρκίνο. Προγνωστικοί παράγοντες εξετάστηκαν από δύο μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική ανάλυση. Στην πολυπαραγοντική ανάλυση, η ηλικία, το φύλο, η ιστολογική ποιότητα, και το στάδιο του όγκου αντιπροσώπευαν. Εμείς δεν ελέγχει για τις μεθόδους θεραπείας αφού η πλειοψηφία των ασθενών που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση και το στάδιο TNM με βάση τα οποία οι μορφές θεραπείας αποφάσισε, δεν έδειξε καμία συσχέτιση με την έκφραση AQP5. Όλες οι p-τιμές ήταν δύο όψεων, και οι διαφορές σε ρ & lt?. 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

AQP5 υπερέκφραση συνδέεται με χειρότερη πρόγνωση σε NSCLC

Ένα σημαντικό έκφραση της AQP5 πρωτεΐνης παρατηρήθηκε στο 16,9% (69/408) των δειγμάτων NSCLC ΤΜΑ (ανοσοχρώση βαθμολογία 2+? ορίζεται ως θετικός) (Πίνακας 1, Σχήμα 1Α). Όπως φαίνεται στο σχήμα 1Α, μόνο τα καρκινικά κύτταρα, τα λεμφοκύτταρα δεν διηθούν όγκο, έδειξε έκφραση AQP5. Συμπεριλαμβανομένων των περιπτώσεων με ασθενή έκφραση (immnunostaining βαθμολογία 1+), ήταν τόσο υψηλές όσο 35,3% (144/408, Πίνακας 1). Είναι ενδιαφέρον, AQP5 υπερέκφραση παρατηρήθηκε κυρίως σε αδενοκαρκινώματα πνεύμονα (ρ & lt? 0.001, Πίνακας 2). Ωστόσο, καμία άλλη στατιστικά σημαντική συσχέτιση βρέθηκε σε NSCLCs μεταξύ έκφρασης AQP5 και των δημογραφικών και παθολογικών παραγόντων, όπως η ηλικία, το φύλο, η ιστολογική διαφοροποίηση, και το στάδιο του όγκου (Πίνακας 2). Λόγω της ανεπαρκούς μέγεθος του δείγματος των μεταστατικών περιπτώσεων (n = 4), πραγματοποιήθηκε καμία περαιτέρω στατιστική μελέτη συσχέτισης για μετάσταση.

Μικροφωτογραφίες AQP5 ανοσοχρώση σε παραταγμένοι μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC) ιστούς. Παραδείγματα ασθενών (1), μέτρια (2), και ισχυρή (3) ανοσοαντιδραστικότητα σε NSCLCs (α έως γ, αντίστοιχα) Αρχική μεγέθυνση χ 200. (Β) Kaplan Meier καμπύλη σε ασθενείς με NSCLC. AQP5-θετικών περιπτώσεων εμφανίζεται ένα λιγότερο ευνοϊκό επιτόκιο ελεύθερη νόσου επιβίωση (log rank p = 0,011) από ό, τι AQP5-αρνητικών περιπτώσεων.

Η

Η

Προς έκπληξή μας, περιπτώσεις με AQP5 θετικά κατάστασης εμφανίζεται ένα υψηλότερο ποσοστό υποτροπής του όγκου από αρνητικές σε NSCLC (54,7% έναντι 35,1%, p = 0,005). Παρά το γεγονός ότι AQP5 υπερέκφραση δεν ήταν στατιστικά σημαντικά σχετίζονται με τη συνολική επιβίωση, εντυπωσιακά, τα άτομα με NSCLC έδειξαν χειρότερο ποσοστό επιβίωσης ελεύθερης νόσου (log rank test, p = 0,011) (Εικ. 1Β). Ακόμη και μετά την προσαρμογή για ιστολογική βαθμό και το στάδιο του όγκου, AQP5 υπερέκφραση σε NSCLC ήταν εξακολουθεί να συνδέεται σημαντικά με την προηγούμενη εξέλιξη της νόσου (p = 0,033? OR = 1,52? 95% CI: 01.04 έως 02.23). Ως εκ τούτου, το καθεστώς AQP5 φαίνεται να είναι ένα ανεξάρτητο μοριακό δείκτη που σχετίζεται με χειρότερα κλινικά αποτελέσματα.

Ανθρώπινο AQP5 προάγει την κυτταρική διείσδυση

Από τα κλινικά ευρήματα μας, έχουμε υποθέσει ότι AQP5 μπορεί να προκαλέσει κυτταρική εισβολή, η απαραίτητο βήμα για τη μετάσταση του όγκου. Προκειμένου να διερευνηθεί κατά πόσον AQP5 υπερέκφραση προωθεί την κυτταρική διείσδυση σε ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα και, ταυτόχρονα, να καθορίσει ποια συστατικά των πρωτεϊνών AQP5 παίζει ένα ρόλο στη διαδικασία, πρέπει πρώτα εκτελέστηκε δοκιμασία εισβολή Matrigel σε κυτταρικές γραμμές BEAS-2Β που εκφράζει σταθερά AQP5 και δύο μεταλλάξεις του, N185D το οποίο εμποδίζει μεμβράνης διακίνηση και S156A το οποίο εμποδίζει τη φωσφορυλίωση σε S156 ιστοσελίδα του μορίου AQP5 [13], [14], [17]. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα κύτταρα με AQP5 απέδειξαν τον υψηλότερο βαθμό κυτταρικής εισβολής μεταξύ τεσσάρων ομάδων (Εικ. 2Α, 2C). Αν και υψηλότερη από την ψευδο, ο βαθμός κυτταρικής εισβολής σε κύτταρα με N185D και S156A μεταλλάκτες ήταν σαφώς μικρότερη από εκείνη των κυττάρων με AQP5 (Σχ. 2Α, 2C). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι τόσο μεμβρανώδη έκφραση AQP5 και η φωσφορυλίωση της στην S156, στην περιοχή συναίνεση PKA, είναι σημαντικές για την προκαλούμενη AQP5 εισβολή των κυττάρων σε κύτταρα BEAS-2Β. Για να αποκλεισθεί η πιθανότητα ότι αυτό το φαινόμενο δεν είναι μοναδικό για ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα, εκτελέσαμε τον ίδιο προσδιορισμό χρησιμοποιώντας ινοβλαστών ποντικού κυτταρικές γραμμές ΝΙΗ3Τ3, τα οποία επιμολύνθηκαν με το ίδιο κατασκευές έκφρασης [13] και έχουν παρατηρήσει παρόμοια ευρήματα (Εικ. 2Β, 2D) .

δοκιμασία εισβολή Matrigel διεξήχθη με κάθε ένα από τα κύτταρα BEAS-2Β (A, C) και κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 (Β, D) που εκφράζουν AQP5 ή καθένα από τα δύο μεταλλακτών. AQP5 επαγόμενη μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή σε BEAS-2Β, αθανατοποιημένα ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα καθώς και κύτταρα ΝΙΗ3Τ3. Σε αντίθεση, τόσο του μεταλλαγμένου N185D (εξασθενημένη διακίνησης μεμβράνης) και το μεταλλαγμένο S156A (φωσφορυλίωση απομειωμένο κατά Ser 156 από ΡΚΑ) δεν επάγουν κυτταρική μετανάστευση και εισβολή είτε κύτταρα BEAS-2Β ή κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 συγκριτικά με Mock.

έκφραση AQP5 οδηγεί σε ινοβλάστες όπως μορφολογική αλλαγή στα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα

Εμείς, λοιπόν, αποφάσισε να αξιολογήσει τυχόν μορφολογικές μεταβολές συνοδεύονται από AQP5 υπερέκφραση. Οι μορφολογίες των επιθηλιακών κυττάρων BEAS-2B ανθρώπινα βρογχικά που φέρει είτε τον ψευδο φορέα FLAG ή FLAG /AQP5 εξετάστηκαν με μικροσκοπία αντίθεσης φάσης. Όπως ήταν αναμενόμενο, ψευδο-διαμολυσμένα κύτταρα BEAS-2Β έδειξε εξαιρετικά οργανωμένη κύτταρο-προς-κύτταρο προσκόλληση και διατηρήθηκαν κύτταρο πολικότητας, η οποία είναι η τυπική μορφολογία των κανονικών επιθηλιακών κυττάρων (Εικ. 3). Ωστόσο, η έκφραση του AQP5 προκάλεσε μία έντονη ατρακτοειδόμορφα και ινοβλαστική αλλαγή στη μορφολογία των κυττάρων και απώλεια κυττάρου-προς-κύτταρο επαφή και την κυτταρική πολικότητα (Εικ. 3). Αυτές οι μορφολογικές αλλοιώσεις μπορεί να σημαίνει ότι AQP5 παίζει ρόλο σε επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT).

Οι μορφολογίες των βρογχικών επιθηλιακών κυττάρων BEAS-2Β ανθρώπινη εκφράζοντας την παρωδία φορέα ΣΗΜΑΙΑ ή ΣΗΜΑΙΑ /AQP5 αποκαλύφθηκαν από αντίθεσης φάσης μικροσκοπία. κύτταρα BEAS-2Β διατηρείται εξαιρετικά οργανωμένη κύτταρο-προς-κύτταρο προσκόλληση και κυτταρική πολικότητα ως ένα τυπικό επιθηλιακό μορφολογία. Η έκφραση του AQP5 προκάλεσε ατρακτοειδόμορφα και ινοβλαστική μορφολογία και την απώλεια του κυττάρου-κυττάρου και κυττάρου επαφές πολικότητα. Κλίμακα μπαρ, 50 μm.

Η

έκφραση AQP5 συνδέεται με μοριακούς δείκτες της επιθηλιακής-μεσεγχυματικής μετάβασης

Για να επιβεβαιώσει εάν AQP5 προκαλεί πραγματικά EMT σε ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα, πραγματοποιήσαμε ανάλυση κηλίδος western για να ελέγξετε πρωτεϊνικών δεικτών για την EMT. Αξίζει να σημειωθεί ότι μεταξύ των κυττάρων BEAS-2Β που εκφράζει σταθερώς AQP5 (κλώνος # 1 και # 2), N185D, S156A μεταλλάκτες και εικονικές φορέα, μόνο τα κύτταρα που εκφράζουν AQP5 παρουσίασαν απώλεια δεικτών των επιθηλιακών κυττάρων, όπως Ε-καδερίνης, α κατενίνης και γ κατενίνης, καθώς και ένα κέρδος των δεικτών κυτταρικής μεσεγχυματικών συμπεριλαμβανομένων ινονεκτίνη και βιμεντίνη (Εικ. 4). Και οι δύο αλλαγές στην μορφολογία και το μοριακό προφίλ του AQP5 υπερεκφράζουν κύτταρα παρέχουν σταθερή απόδειξη ότι AQP5 διεγείρει βρογχικών επιθηλιακών κυττάρων να υποστούν EMT.

Η έκφραση των επιθηλιακών πρωτεΐνες συμπεριλαμβανομένων Ε-καδερίνης, α-κατενίνης και γ-κατενίνη, και πρωτεΐνες μεσεγχυματικά συμπεριλαμβανομένων φιμπρονεκτίνη και βιμεντίνης εξετάστηκε με ανοσοκηλίδωση στα τέσσερα χωριστά κύτταρα BEAS-2Β, καθένα από τα οποία φέρει η υπερέκφραση κατασκεύασμα για AQP5 (κλώνος # 1 και # 2), N185D, S156A και Mock. Μόνο τα κύτταρα με AQP5 παρουσίασαν απώλεια των επιθηλιακών δεικτών και ένα κέρδος δείκτες μεσεγχυματικών κυττάρων. 1, AQP5 κλώνος # 1? 2, AQP5 κλώνος # 2? 3, N185D? 4, S156A? 5, Mock βασίζεται σε κυτταρικές σειρές BEAS-2Β.

Η

AQP5 αλληλεπιδρά με το c-Src, ένα ισχυρό EMT σκανδάλη

Στη συνέχεια, μελετήσαμε την πιθανή μοριακό μηχανισμό πίσω από την EMT προώθηση ιδιοκτησία της AQP5. Ανθρώπινο AQP5 φέρει μία πεπτιδική αλληλουχία diproline (RTSPVGSP) στο βρόχο D [18], [19] το οποίο φέρει μία ομοιότητα αλληλουχίας με την δεσμευτική θέση συναίνεσης SH3. Έτσι, είναι πιθανό ότι αυτό το τμήμα της AQP5 μπορεί να συνδέονται με την περιοχή SH3 ενός μορίου προσαρμογέα [18]. Ως εκ τούτου, πραγματοποιήσαμε μια σειρά ανθρώπινων τομέων SH3 πρωτεΐνη να εξεταστεί το δυναμικό αρκετών πρωτεϊνών που περιέχουν SH3 τομέα να δεσμεύεται με ανθρώπινο AQP5. Αξίζει να σημειωθεί ότι, το καθαρισμένο AQP5 από σταθερά κύτταρα BEAS-2Β έδειξε δραστικότητα δέσμευσης με τον τομέα SH3 του c-Src, Lyn, και Grap2 Ο-τερματικό (Σχήμα 5Α). Το τμήμα AQP5 περιέχει ένα φωσφορυλιωμένο Loop D (88 αα έως 182 αα) ήταν επίσης σε θέση να δεσμεύσει τον τομέα SH3 του c-Src, Lyn, και Grap2 Ο-τερματικό (Εικ. 5Α). Το τμήμα AQP5 περιέχει μία μη φωσφορυλιωμένη Loop D, ωστόσο, δεν ήταν σε θέση να συνδέεται με οποιοδήποτε περιοχές SH3 από τρεις πρωτεΐνες (Εικ. 5Α). Η κατάσταση φωσφορυλίωσης του κάθε πρωτεΐνης επιβεβαιώθηκε περαιτέρω.

(Α) Μια συστοιχία ανθρώπινων τομέων SH3 πρωτεΐνη χρησιμοποιήθηκε για την εξέταση των πιθανών δεσμευτικών δραστηριότητες αρκετών πρωτεϊνών που περιέχει την περιοχή SH3 να AQP5. Όχι μόνο AQP5, αλλά επίσης τμήμα AQP5 που περιέχει ένα φωσφορυλιωμένο Loop D (88 αα έως 182 αα) βρέθηκαν να δεσμεύονται με την περιοχή SH3 της c-Src, της Lyn, και της πρωτεΐνης Grap2. Το τμήμα AQP5 περιέχει μία μη φωσφορυλιωμένη Loop D, ωστόσο, δεν ήταν σε θέση να συνδεθεί με την περιοχή SH3 της οποιαδήποτε από αυτές τις πρωτεΐνες. (Β) Δοκιμασία pull-down GST διεξήχθη με τρεις διαφορετικές πρωτεΐνες σύντηξης GST: έναν τομέα c-Src SH3, έναν τομέα Lyn SH3, και ένα Ο-τερματικό πεδίου πρωτεΐνη Grap2 SH3. Κύτταρα που εκφράζουν σταθερά AQP5 σε ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα, BEAS-2B, αποκάλυψε μία ισχυρή αλληλεπίδραση με την πρωτεΐνη τομέα c-Src SH3, η πρωτεΐνη τομέα Lyn SH3 και το C-τερματικό πεδίο πρωτεΐνης Grap2 SH3. (Γ) AQP5 είναι συν-ανοσοκαταβυθίστηκε με c-Src στα κύτταρα BEAS-2Β σταθερά επιμολυσμένα με το κατασκεύασμα έκφρασης AQP5. Επιπλέον, μόνο μία ενεργοποιημένη μορφή του c-Src, φωσφορυλιώθηκε σε Tyr 416, είναι συν-ανοσοκαταβυθίζεται με AQP5. 1, Mock? 2, N185D? 3, S156A? 4, AQP5? Μ, δείκτης μοριακού βάρους.

Η

Επιπλέον, πραγματοποιήσαμε ένα pull-down δοκιμασία GST να ελέγξει μια άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ AQP5 και τις οικογενειακές μόρια Src. Σε αυτή τη δοκιμασία, χρησιμοποιήσαμε τρεις διαφορετικές πρωτεΐνες σύντηξης GST: έναν τομέα c-Src SH3, έναν τομέα Lyn SH3, και ένα Ο-τερματικό πεδίου πρωτεΐνη Grap2 SH3, τα οποία προσδιορίστηκαν για να αλληλεπιδρούν με AQP5 σε SH3 συστοιχίες πρωτεΐνη τομέα. Συνεπής με το αποτέλεσμα από SH3 συστοιχίες πεδίου πρωτεΐνη, AQP5 σταθερώς εκφράζεται σε βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα BEAS-2Β ανθρώπινο επέδειξε μία ισχυρή αλληλεπίδραση με την c-Src, Lyn και C-τερματικό πεδίο πρωτεΐνες Grap2 SH3 (Εικ. 5Β).

Τέλος, για να επιβεβαιώσει το εύρημα μας

in vivo

, εκτελέσαμε μία δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης σε ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κυτταρική γραμμή, BEAS-2Β. Αυτή τη φορά, εστιάσαμε στην c-Src, ένα μόριο γνωστό για την προώθηση της ΕΜΤ δραστηριότητα της [20]. Όπως ήταν αναμενόμενο, AQP5 συν-ανοσοκαταβυθίστηκε με c-Src σε κύτταρα που εκφράζουν σταθερά AQP5 (Εικ. 5C). Περιέργως, c-Src συν-immunprecipitated με AQP5 αποδείχθηκε ότι ήταν μια ενεργοποιημένη μορφή του c-Src, η οποία φωσφορυλιώνεται στο Tyr416 (Εικ. 5C). Σημειώνουμε επίσης ότι τα κύτταρα που εκφράζουν AQP5 έχουν περισσότερο ενεργοποιημένο c-Src από τα κύτταρα που φέρουν N185D ή S156A μεταλλαγμένη (Σχ. 5C), γεγονός που υποδηλώνει ότι η αλληλεπίδραση με AQP5 μπορεί να είναι ένα σημαντικό βήμα στην ενεργοποίηση c-Src.

AQP5 υπερέκφραση δεν μπορεί να σχετίζεται με γονιδιωματική ενίσχυση

Για την διαλεύκανση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν AQP5 υπερέκφραση, ερευνήσαμε την παρουσία της γονιδιωματικής ενίσχυσης μέσω ανάλυσης FISH. Από 69 ερμηνεύσιμη περιπτώσεων NSCLC TMAs, δεν είναι μια ενιαία σαφές πρότυπο γονιδιωματικής ενίσχυσης ανιχνεύθηκε (Εικ. S2), γεγονός που υποδηλώνει ότι η έκτοπη έκφραση της AQP5 θα μπορούσε να είναι μια δευτερεύουσα μοριακή εκδήλωση.

Συζήτηση

Έχουμε αποδείξει προηγουμένως ότι η υπερέκφραση του AQP5 σε ινοβλάστες ποντικού, κύτταρα ΝΙΗ3Τ3, επάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων δευτερογενώς προς ενεργοποίηση της Ras, η οποία διαμεσολαβείται από φωσφορυλίωση της AQP5 σε site της συναινετική ΡΚΑ (S156) και αυτή η μελέτη σαφώς παρέχεται μια ένωση μεταξύ AQP5 και του Ras μονοπάτι μεταγωγής σήματος [13], [14]. Επιπλέον, έχουμε αναφερθεί πρόσφατα μια μελέτη η οποία περιγράφει μια επαγόμενη έκφραση AQP5 πρωτεΐνης κατά τη διάρκεια του παχέος καρκινογένεση και μοριακών οδών πώς η έκφραση της πρωτεΐνης AQP5 μπορεί να επηρεάσει την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου κατά την αλληλεπίδρασή του με το /ERK /Rb μονοπατιού σηματοδότησης Ras [16].

σε αντίθεση με αυτές τις προηγούμενες αναφορές, εδώ, έχουμε ασκήσει το ρόλο της AQP5 στην εξέλιξη της NSCLC. Αυτό βασίζεται εν μέρει στην προηγούμενη έκθεσή μας, η οποία όχι μόνο έδειξε το ογκογόνο ιδιότητα AQP1 στα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3, αλλά περιγράφεται επίσης το προφίλ έκφρασης των AQP1 σε NSCLC [15]. Η έκθεση αυτή, αν και προβλέπεται κάποια εικόνα σχετικά με το ρόλο των AQPs στο NSCLC, δεν απέδειξε ούτε κλινική επίπτωση της ή σχετίζονται με μοριακά μονοπάτια. Σε προκαταρκτική μελέτη μας για AQP5 στο NSCLC, έχουμε παρατηρήσει μια σειρά έκφρασης AQP5 σε διάφορες κυτταρικές σειρές NSCLC συμπεριλαμβανομένων H1975, H1838, H1650, H1437, και H838. Επιπλέον, παρόμοιες με τις παρατηρήσεις μας με κύτταρα ινοβλαστών ΝΙΗ3Τ3 ποντικού [13], [14], έχουμε εντοπίσει πρόσφατα ότι AQP5 υπερέκφραση σε κύτταρα BEAS-2Β επάγει την ενεργοποίηση του μονοπατιού ERK οδηγούν σε διέγερση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Kang et al., χειρόγραφο σε προετοιμασία)? ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με AQP5 έδειξαν σημαντικά υψηλότερο ρυθμό πολλαπλασιασμού από ότι τα κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με mock (Εικ. S1). Με βάση αυτά τα προκαταρκτικά ευρήματα και πριν από τις παρατηρήσεις που είχαμε με AQP1 σε NSCLC και AQP5 σε ορθοκολικό καρκίνο μελέτη, εξετάσαμε το προφίλ έκφρασης των AQP5 σε μια μεγάλη ομάδα των κλινικών δειγμάτων.

Αν και η έκφραση της AQP5 στο μήνυμά του επίπεδο αναφέρεται σε ορισμένα μέρη του φυσιολογικού ανθρώπινου βρογχικού και κυψελιδικά ιστούς [21], μέχρι στιγμής, προφίλ έκφρασης AQP5 σε δείγματα ιστού NSCLC, σε επίπεδο πρωτεΐνης του, δεν έχουν αναφερθεί. Για να βρείτε τις κλινικές επιπτώσεις της AQP5 υπερέκφραση σε NSCLC, έχουμε συγκεντρώσει εκτομή ανθρώπινους ιστούς NSCLC με μέσο όρο πέντε χρόνια παρακολούθησης, στην οποία θα εκτελείται ανοσοχημεία να εξετάσει το επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης του AQP5. Ενώ βρήκαμε έκφραση AQP5 στα καρκινικά κύτταρα, δεν είδαμε κανένα αποδεικτικό στοιχείο της AQP5 ανοσολογική αντίδραση μεταξύ των ογκο-διηθητικά λεμφοκύτταρα, τα οποία είναι σε αντίθεση με τα προηγούμενα ευρήματά μας δείχνουν μια επαγόμενη έκφραση των μηνυμάτων AQP5 κατά την ενεργοποίηση των λεμφοκυττάρων [12]. Αν και αυτή η διαφορά μπορεί να είναι αποτέλεσμα των πολλαπλών λόγων, είναι πιθανό ότι η έκφραση AQP5 κατά την ενεργοποίηση των λεμφοκυττάρων μπορεί να είναι μια προσωρινή εκδήλωση και ότι, μόλις τα λεμφοκύτταρα ενεργοποιούνται, μπορούν να ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση AQP5.

Έχουμε εντοπίσει τρεις ενδιαφέρουσες προφίλ έκφρασης των AQP5 πρωτεΐνης σε NSCLC με την κλινική συσχέτιση. Κατ ‘αρχάς, μια έκφραση της AQP5 πρωτεΐνης παρατηρείται στο 35,3% (144/408, Πίνακας 1) από τις εκτομή δείγματα ιστού ΜΜΚΠ. Δεύτερον, περιπτώσεις NSCLC με AQP5-θετική κατάσταση εμφανίζεται υψηλότερο ποσοστό υποτροπής του όγκου από αρνητικές (54,7% έναντι 35,1%, p = 0,005). Τρίτον, AQP5 υπερέκφραση σε NSCLC συσχετίστηκε σημαντικά με την προηγούμενη εξέλιξη της νόσου (p = 0,033? OR = 1,52? 95% CI 01.04 έως 02.23) και χειρότερα ελεύθερη νόσου επιβίωση. Πιστεύουμε ότι αυτό είναι το πρώτο κλινικά στοιχεία δείχνουν μια ισχυρή συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης AQP5 και την έκβαση των ασθενών με καρκίνο που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση και περαιτέρω προτείνουν ότι hAQP5 είναι ένας δυνητικός ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης.