Αφηρημένο

Ο καρκίνος των βλαστικών κυττάρων (CSC) θεωρία προβλέπει ότι ένα μικρό κλάσμα των καρκινικών κυττάρων έχουν μοναδική δράση αυτο-ανανέωσης και μεσολαβούν την έναρξη του όγκου και τον πολλαπλασιασμό. Ωστόσο, οι μοριακοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στη ρύθμιση της CSC παραμένει ασαφής, επηρεάζοντας την αποτελεσματική στόχευση των ΚΕΠ στη θεραπεία του καρκίνου. Εδώ έχουμε εξετάσει την υπόθεση ότι Rac1, ένα Rho ΟΤΡάσης εμπλέκεται στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και εισβολή, είναι κρίσιμη για την έναρξη του όγκου και την μετάσταση του μη-μικροκυτταρικού αδενοκαρκίνωμα ανθρώπινου πνεύμονα (NSCLA). Rac1 νοκ ντάουν από shRNA κατέστειλε τις ογκογόνο δραστηριότητες της ανθρώπινης NSCLA κυτταρικές σειρές και πρωτογενή δείγματα NSCLA ασθενών, συμπεριλαμβανομένων των επιπτώσεων στην εισβολή, διάδοση, αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη, σχηματισμό σφαίρας και των πνευμόνων αποικισμού. κύτταρα απομονωμένες πλευρά πληθυσμού (SP), που αντιπροσωπεύουν υποτιθέμενο ΚΕΠ από ανθρώπινα κύτταρα NSCLA περιείχε αυξημένα επίπεδα της Rac1-GTP, ενισχυμένη

in vitro

μετανάστευση, εισβολή, αυξημένη

in vivo

δραστηριότητες όγκου έναρξη και πνεύμονα αποικισμού σε ξενομοσχεύτηκε ποντίκια. Ωστόσο, η δραστηριότητα CSC ανιχνεύθηκε επίσης εντός του πληθυσμού μη SP, γεγονός που υποδηλώνει τη σημασία της θεραπευτικής στόχευσης όλων των κυττάρων εντός ενός όγκου. Περαιτέρω, φαρμακολογικών ή shRNA στόχευση Rac1 ανέστειλαν τις ογκογόνες δραστηριότητες αμφότερων των κυττάρων SP και μη-SP NSCLA. Αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι η Rac1 αποτελεί ένα χρήσιμο στόχο στο NSCLA, και τον αποκλεισμό της μπορεί να έχει θεραπευτική αξία στην καταστολή του πολλαπλασιασμού CSC και μετάσταση

Παράθεση:. Akunuru S, Palumbo J, Zhai QJ, Zheng Υ (2011) Rac1 Στόχευση καταστέλλει την Ανθρώπινη μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα αδενοκαρκίνωμα καρκινικά βλαστικά κυτταρική δραστηριότητα. PLoS ONE 6 (2): e16951. doi: 10.1371 /journal.pone.0016951

Επιμέλεια: Roger Chammas, Universidade de São Paulo, Βραζιλία

Ελήφθη: 13 του Αυγ 2010? Αποδεκτές: 18 Ιαν 2011? Δημοσιεύθηκε: 9 Φεβρουαρίου 2011

Copyright: © 2011 Akunuru et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από ΝΙΗ R01 CA141341 και Τ32 HL091805. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα παραμένει η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο σε όλο τον κόσμο. Η νόσος γενικά κατατάσσονται σε δύο ιστο-παθολογική ομάδες – μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (SCLC) και μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), με τη μεταγενέστερη ομάδα που αντιπροσωπεύει περίπου 80% των περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα. Αδενοκαρκινώματα συμβαίνουν σε περίπου 55% του NSCLC και το 40% όλων των καρκίνων του πνεύμονα. Παρά τη συνεχιζόμενη ανάπτυξη θεραπευτικών του καρκίνου, επί του παρόντος το συνολικό ποσοστό πενταετούς επιβίωσης για τους ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα είναι λιγότερο από 15% [1]. Συχνά, τα υπάρχοντα χημειοθεραπεία, ακτινοθεραπεία ή χειρουργική επέμβαση μπορεί να αφαιρέσει μόνο εν μέρει την επιβάρυνση του όγκου, αφήνοντας πίσω ανθεκτικοί στη θεραπεία των καρκινικών κυττάρων που μπορεί να αναγεννήσει τον όγκο στην αρχική τοποθεσία και /ή μετάσταση σε δευτερεύουσες θέσεις για την έναρξη νέων όγκων.

Πρόσφατες δημοσιεύσεις έχουν αναφέρει την αναγνώριση του καρκίνου έναρξη ή καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) από το αίμα [2], του εγκεφάλου [3], του μαστού [4], του παχέος εντέρου [5], [6], η ηπατική [7], παγκρεατικό [8] , κατάκοιτος [9], [10], καθώς και καρκίνων του πνεύμονα [11], [12], [13]. Τα ΚΕΠ ταυτοποιούνται είτε με μοναδικές ιδιότητες των κυττάρων όπως Hoechst χρωστική αποκλεισμού (Hoechst χρωστική χαμηλά πλευρικά πληθυσμού) ή με έκφραση ειδικών δεικτών επιφάνειας όπως CD133, ΑΙ_ϋΗ, ή CD24 /CD44, και είναι συχνά σχετίζεται με τη χημειοθεραπεία και την ακτινοθεραπεία αντίσταση. Τα ΚΕΠ ορίζονται από βλαστικών κυττάρων τους, όπως δυνατότητες αυτο-ανανέωση, την ικανότητά τους να διαφοροποιούνται σε τύπους κυττάρων που αποτελούν το μεγαλύτερο μέρος του όγκου, και να κινήσει τους όγκους σε σημαντικά μειωμένη δόση σε μελέτες ξενομοσχεύματος ποντικού [7], [14]. έχουν NSCLC κύτταρα κινήσεως έχουν απομονωθεί από ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα με βάση την αυξημένη δραστηριότητα χρωστική Hoechst 33342 εκροής [12]. Η Hoechst χρωστική χαμηλή πλευρά πληθυσμού κυττάρων (SP) εμπλουτισμένο για δραστικότητα έναρξη όγκου σε σύγκριση με μη-πλευρικής πληθυσμού (NSP) κύτταρα και εκφράζουν αυξημένα ABCG2 και άλλων μεταφορέων αντοχής πολυ-φαρμάκου που μπορεί να μεσολαβήσει θεραπευτική αντίσταση.

Η προαγωγή της θεωρίας του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων έχει οδηγήσει στην πρόταση ότι η στόχευση της CSC μπορεί να οδηγήσει σε εξάλειψη των ανθεκτικών υπολειμματικών θεραπεία καρκινικών κυττάρων σε ασθενείς. Πρόσφατα Gupta

κ.ά.

πρότειναν ότι επάγει διαφοροποίηση των CSC χρησιμοποιώντας σαλινομυκίνη, ένας εκλεκτικός ιονοφόρο κάλιο μπορεί να μπλοκάρει μαστικού δραστηριότητα CSC και μετάσταση [15]. Ωστόσο, αρκετές πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η ΚΕΠ και μη-ΚΕΠ μπορεί να είναι πλαστικό και μεταξύ των μετατρέψιμων στη φύση [16] – [17]. Για παράδειγμα, αρνητικά κύτταρα JARID1 δείχθηκαν να αντιπροσωπεύουν μια παροδική αργή ποδηλασία μη CSC πληθυσμό που μπορεί να οδηγήσει σε γρήγορη ποδηλασία JARID1 θετική CSCs σε μελάνωμα (13). Υπάρχουν ενδείξεις ότι η μη-ΚΕΠ μπορεί να μετατρέψει σε ΚΕΠ μέσω της αλληλεπίδρασης με εξωκυττάριας μήτρας και άλλες περιβαλλοντικές νύξεις (14). Αυτό αυξάνει την πιθανότητα που προσεγγίζει αποκλειστικά στόχευση ΚΕΠ δεν επαρκούν για την θεραπεία του καρκίνου, επειδή τα υπόλοιπα μη-ΚΕΠ μπορούν να επαναπρογραμματιστούν για να τα ΚΕΠ να ξαναρχίσει ογκογένεση.

Rac1 είναι ένα ενδοκυτταρικό μοριακό διακόπτη που μετατρέπει τα σήματα σε μια ποικιλία ογκογόνο μονοπάτια. Είναι συχνά βρεθεί να είναι αυξημένα σε έκφραση και /ή δραστικότητα σε μια ποικιλία καρκινικών κυττάρων και ρυθμίζουν σημαντικές κυτταρικές διεργασίες που σχετίζονται με τον καρκίνο των κυττάρων συμπεριφορές, συμπεριλαμβανομένης γονιδιακής έκφρασης, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, ακτίνη κυτταροσκελετό αναδιαμόρφωση και είναι απαραίτητη για κατευθυντική μετανάστευση των κυττάρων και την προσκόλληση. δραστηριότητα Rac1 μπορούν να επηρεάσουν την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και επιβίωση, και δείχθηκε να απαιτείται σε K-ras ανάπτυξης όγκου με τη μεσολάβηση του πνεύμονα σε ένα μοντέλο αυθόρμητης ποντικού καρκίνου του πνεύμονα [18]. Ωστόσο, αν Rac1 συμβάλλει στην ανάπτυξη του ανθρώπου NSCLA όγκου ή /και της μετάστασης, ιδιαίτερα εάν Rac1 παίζει ρόλο στη ρύθμιση ΚΕΠ, απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση. Στην παρούσα εργασία θα δείξουμε ότι Rac1 είναι εξαιρετικά εμπλέκονται στην NSCLA κυτταρική μετανάστευση, εισβολή και μετάσταση στους πνεύμονες των κυττάρων SP, ως εκ τούτου, χρησιμεύει ως ένα χρήσιμο θεραπευτικό στόχο αναστέλλοντας την έναρξη του όγκου και τη μετάσταση του πληθυσμού CSC της NSCLA.

υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Α549, Η23, Η1299 και τα κύτταρα Η441 καλλιεργήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες από την ATCC. Ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα (HBEC) ήταν γενναιόδωρη δωρεά από τον Δρ Jeffery Whitsett (Cincinnati Νοσοκομείο Παίδων Ιατρικό Κέντρο). Πρωτογενή δείγματα αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα ασθενών ελήφθησαν με τη γραπτή συγκατάθεση των ασθενών στο πλαίσιο εγκεκριμένου πρωτοκόλλου Ίδρυμα Review Board από το Πανεπιστήμιο του Cincinnati Επιστημονικής Επιτροπής κριτική (IRB # 01-09-27-07), και χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα σύμφωνα με το Νοσοκομείο Σινσινάτι των παιδιών Ιατρική κέντρο Επιστημονικής Επιτροπής κριτική (IRB # 07/06/57) ότι η ταυτότητα των ασθενών παραμένει ανώνυμος. Οι όγκοι κιμά και επαναιωρήθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει 0.5 mg /ml Liberase (Roche) και 1% πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη. Μετά από 45 λεπτή επώαση, πολτός των κυττάρων διέρχεται μέσω φίλτρου 100 micron και συνολική κύτταρα πλύθηκαν, τοποθετήθηκαν σε 10% εμβρυϊκό βόειο ορό που περιέχει μέσο ανάπτυξης. Τα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα εμπλουτίστηκαν με ανάπτυξη κυττάρων σε συνθήκες καλλιέργειας σφαίρα.

Α549, Η23, Η1299, Η441, HBEC ή πρωτογενή αδενοκαρκινώματος κύτταρα μολύνθηκαν με φακοϊό εκφράζουν YFP σεσημασμένων κωδικοποιημένο shRNA (SCR) ή Rac1 shRNA1 ή Rac1 shRNA2 περιγράφηκε προηγουμένως [19]. Κωδικοποιημένα κατασκεύασμα shRNA ήταν γενναιόδωρο δώρο από τον Δρ Λι Grimes (Cincinnati Νοσοκομείο Παίδων Ιατρικό Κέντρο) και Rac1 shRNA κατασκευάσματα ήταν γενναιόδωρο δώρο από τον Δρ Jim Mulloy (Cincinnati Νοσοκομείο Παίδων Ιατρικό Κέντρο). Μετά από 72 ώρες από τη μόλυνση, YFP θετικά κύτταρα ταξινομήθηκαν χρησιμοποιώντας FACS και χρησιμοποιούνται για διαφορετικά πειράματα.

Για Rac1 πειράματα μεταλλαγμένο διάσωσης, τέσσερις σημειακές μεταλλάξεις αναντιστοιχία έγιναν στο shRNA περιοχές της Rac1 cDNA δεσμευτικός ως προς τον φορέα MIEG3 χρησιμοποιώντας τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση kit (τεχνολογίες Stratagene, Agilent) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα Α549 μολύνθηκαν με μεταλλαγμένο Rac1 εκφράζουν ρετροϊό και μετά από 72 ώρες, GFP θετικά κύτταρα ταξινομήθηκαν με τη χρήση FACS. Τα κύτταρα στη συνέχεια μολύνθηκαν με φακοϊό εκφράζουν SCR shRNA ή Rac1 shRNA. Μετά από 72 ώρες, GFP

+ YFP

+ κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για να εκτελούν διάφορες λειτουργικές δοκιμασίες.

προσδιορισμούς πολλαπλασιασμού κυττάρων

Τα κύτταρα επιστρώθηκαν (2000 κύτταρα /φρεάτιο) για 96 φρεατίων πλάκα εις τριπλούν. Αριθμός των ζωντανών κυττάρων σε κάθε ημέρα προσδιορίστηκε με δοκιμασία πολλαπλασιασμού μη ραδιενεργών MTS (Promega).

Για την δοκιμασία ενσωμάτωσης BrdU, BrdU (10 μg /ml) προστέθηκε στα κύτταρα σε 60% συρροή για 2 ώρες σε 37 ° C. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, σταθερό, βάφονται και FACS ανάλυση πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Για την ανίχνευση BrdU θετικά κύτταρα σε CD133

+ και CD133

– πληθυσμοί, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με CD133 /2-APC αντίσωμα (Miltenyi Biotechnologies Inc.) μετά από χρώση BrdU. Τα θετικά κύτταρα BrdU ήταν περιφραγμένη από δύο CD133

+ και CD133

-. Κύτταρα

μαλακό άγαρ σχηματισμού αποικίας δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν (10.000 κύτταρα /φρεάτιο) σε 0,3% χαμηλού σημείου τήξης γίνονται αγαρόζη σε μέσο ανάπτυξης που περιέχει 10% εμβρυϊκό βόειο ορό και επιστρώθηκαν πάνω από 0,6% αγαρόζη σε μέσο ανάπτυξης. Αριθμός αποικιών που σχηματίστηκαν μετά είτε 2 εβδομάδες (Α549, Η1299) ή 3 εβδομάδες (Η441, Η23) μετρήθηκε υπό μικροσκόπιο φωτός.

Σφαίρα δοκιμασία σχηματισμού

Τα κύτταρα (10,000 κύτταρα /ml) ήταν τοποθετήθηκαν σε συνθήκες καλλιέργειας εναιωρήματος σε μέσο σφαίρα χωρίς ορό (DMEM: F12 που περιέχει 0.4% BSA, 10 μg /ml ινσουλίνη, 10 ng /ml EGF, 10 ng /ml FGF) σε πλάκες 6 φρεατίων προ-επικαλυμμένες με 1% αγαρόζη για την πρόληψη της προσκόλλησης των κυττάρων. Το μέσο αντικαταστάθηκε κάθε 2-3 ημέρες και ο αριθμός των σφαιρών που σχηματίζονται σε 2 εβδομάδες μετρήθηκε υπό μικροσκόπιο φωτός.

Πρόσφυση δοκιμασία

Οι πλάκες επικαλύφθηκαν με 50 μg /ml ινωδονεκτίνης διάρκεια της νύχτας στους 4 ° C και αποκλείστηκαν με 2% BSA για 2 ώρες στους 37 ° C. Μετά τον αποκλεισμό, τα κύτταρα επιστρώθηκαν (10,000 κύτταρα /φρεάτιο) και επωάστηκαν στους 37 ° C για 60 λεπτά. Τα μη προσκολλημένα κύτταρα αναρροφήθηκαν και οι πλάκες πλύθηκαν τρεις φορές με PBS. Ο αριθμός των κυττάρων που συνδέονται με τα φρεάτια μετά πλύσεις προσδιορίστηκε με χρήση μη ραδιενεργό διάδοσης δοκιμασία MTS.

Μετανάστευση και εισβολή δοκιμασίες

Για δοκιμασία μετανάστευσης trans-φρεατίων, 50.000 κύτταρα προστέθηκαν σε άνω θάλαμο σε ελεύθερα μέσα ενημέρωσης και τη μετανάστευση στους 37 ° C προς ορό 10% FBS που περιείχε μέσο ανάπτυξης προσδιορίστηκε είτε μετά από 24 ώρες (Α549, Η1299, Η23) ή 48 ώρες (Η441). Τα κύτταρα μετανάστευσαν μέσω της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν, χρωματίστηκαν με χρώση Giemsa (Sigma) και μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός.

Για την δοκιμασία εισβολής, κατώτερο θαλάμους πλακών εισβολή Matrigel επικαλυμμένα επικαλύφθηκαν με 10 μg /ml ινωδονεκτίνης διάρκεια της νύχτας στους 4 ° C και τα κύτταρα που εισβάλλουν μέσω Matrigel μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν είτε μετά από 48 ώρες (κύτταρα Α549) ή 72 ώρες (Η441 κύτταρα) είναι παρόμοια με δοκιμασία μετανάστευσης.

Immuno-χρώση

τα κύτταρα απλώθηκαν σε ινονηκτίνη επικαλυμμένα διαφάνειες και μετά από 18-20 ώρες τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας 3,7% φορμαλδεΰδη. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν για ακτίνη κυτταροσκελετό (Rhodamine-φαλλοειδίνη, Invitrogen), οι πυρήνες (ϋΑΡΙ, Invitrogen) χρησιμοποιώντας τυποποιημένες μεθόδους ανοσο-χρώσης που περιγράφηκε προηγουμένως [21]. Εναλλακτικά κύτταρα χρωματίστηκαν είτε με φωσφο-ΡΑΚ (Focal Adhesion Kinase, Millipore) ή βινκουλίνης (Sigma) ή φωσφο-παξιλλίνη (Cell Technologies σηματοδότηση).

Side-πληθυσμός, χρώση CD133 κυττάρων και απομόνωση

Cells επεξεργασία με θρυψίνη και πλύθηκαν με PBS. Τα κύτταρα βάφονται με Hoechst ρυθμιστικό χρώσης 33342 όπως περιγράφηκε προηγουμένως σε μία τελική συγκέντρωση 5 μg /ml Hoechst 33342 [22] για την πλευρά του πληθυσμού (SP), ή με αντι-CD133 αντισώματος για CD133 θετικά κύτταρα. Τα κύτταρα αναλύθηκαν ή ταξινομηθεί για SP /CD133

+ κυττάρων με κυτταρομετρία ροής.

Για να αποκτήσετε Rac1 νοκ ντάουν στον SP ή CD133

+ κύτταρα, τα κύτταρα μολύνθηκαν με φακοϊό εκφράζοντας YFP ετικέτα SCR ή Rac1 shRNA και μετά από 72 ώρες τα κύτταρα χρωματίστηκαν για την πλευρά του πληθυσμού ή CD133. YFP θετική SP ή μη-SP κύτταρα ταξινομήθηκαν είτε για ανάλυση Western ή λειτουργικές δοκιμασίες.

Rac1-GTP pull-down δοκιμασία

Για να εκτελέσετε Rac1 γκρεμίζουν δοκιμασίες, τα κύτταρα λύθηκαν με την προσθήκη λύσης ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 20 mM Tris HCl ρΗ 7.6, 100 mM NaCl, 10 mM MgCI, 1% Triton Χ-100, 0.2% SDS, πρωτεάση και αναστολείς φωσφατάσης απευθείας σε προσκολλημένα κύτταρα. Τα κυτταρολύματα που περιέχουν ίσες ποσότητες πρωτεΐνης επωάστηκαν με σφαιρίδια γλουταθειόνης συζευγμένο με GST-ΡΑΚ1 περιέχουν δραστικό πεδίο αλληλεπιδρά Rac1 και επεξεργάζονται περαιτέρω όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23].

Lung δοκιμασία αποικισμός

Χρήση των ποντικών ως οικοδεσπότες ξενομόσχευμα εγκρίθηκε από την επιτροπή IACUC στο Νοσοκομείο Ιατρικό Κέντρο Σινσινάτι των παιδιών (πρωτόκολλο # 8D06052). Καθορισμένες αριθμός κυττάρων αιωρήθηκαν σε PBS και ενέθηκαν ενδοφλεβίως σε ανοσοκατεσταλμένα NOD /SCID /γc – /- (NSG) ποντίκια με ένεση στην ουραία φλέβα. Στο τέλος της μελέτης, οι πνεύμονες μονιμοποιήθηκαν σε διάλυμα Bouin να μετρήσει τον αριθμό των όγκων

Υποδόρια ξενομοσχεύματος δοκιμασία

καθορισμένος αριθμός κυττάρων αιωρούνται σε 200 μΐ PBS:. Matrigel μίγμα (1 :1 όγκο) και ενίεται υποδορίως στα πλευρά του ανοσοκαταστολή NOD /SCID /γ – /- (NSG) ποντικούς. Μετά από 3-4 εβδομάδες το μέγεθος του όγκου έγχυσης μετρήθηκε εβδομαδιαία χρήση δαγκάνες και τον όγκο του όγκου προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο 0.52XLXW

2 cm3.

καρκινικών κυττάρων παλιννόστησης δοκιμασία

Τα κύτταρα που εκφράζουν YFP εγχύθηκαν ενδοφλεβίως σε ποντίκια NSG. Μετά από 24 ώρες, οι πνεύμονες απομονώθηκαν μετά από διαπότιση με PBS. Σύνολο πνευμονικά κύτταρα απομονώθηκαν με πέψη Liberase και ο συνολικός αριθμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με μετρητή Hemavet κύτταρο. Ποσοστό YFP θετικών κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των συνολικών κυττάρων του πνεύμονα. Παλιννόστησης δείκτης καθορίζεται από τον υπολογισμό ποσοστού YFP θετικά κύτταρα παραβρέθηκαν σε πνεύμονα κανονικοποιούνται για τον έλεγχο των κυττάρων.

Αποτελέσματα

Rac1 στόχευση βλάπτει τον πολλαπλασιασμό και το σχηματισμό αποικίας των ανθρώπινων κυττάρων NSCLA

Για να διερευνήσουν ο ρόλος του Rac1 ΟΤΡάσης σε ανάπτυξη NSCLA κυττάρων, Α549, Η441, Η1299, και τα κύτταρα Η23 μολύνθηκαν με φακοϊό κωδικοποιεί SCR ή Rac1 shRNA (shRNA1, 2). Η ανάλυση στυπώματος Western απεκάλυψε αποτελεσματική knockdown του Rac1 πρωτεΐνη τόσο με shRNA μορφώματα (50% και 90% αντίστοιχα σε σχέση με SCR) σε κύτταρα Α549 (Εικ. 1Α). έκφραση Rac1shRNA1 μειωθεί μερικώς τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα ενώ Rac1shRNA2 περισσότερο ανέστειλε ισχυρά την ανάπτυξη των κυττάρων (Εικ. 1Β) και προκάλεσε σημαντική μείωση του αριθμού των αποικιών που αναπτύσσονται σε μαλακό άγαρ δοκιμασία σχηματισμού αποικίας (Εικ. 1 C). Περαιτέρω, η ανάλυση κυτταρικού κύκλου εκτελέστηκε με χρώση BrdU και FACS ανάλυση έδειξε μία μείωση των S-φάση και μια αντίστοιχη αύξηση στην φάση G0 /G1 του κυτταρικού κύκλου κατά την Rac1 στόχευσης (Σχ. 1D). Σε κύτταρα Η441, Rac1 shRNA2 οδήγησε σε -75% μείωση στο Rac1 πρωτεΐνη (Εικ. S1 Α), και μία σχετική μικρή επίδραση επί του πολλαπλασιασμού (Σχ. S1B). Σε κύτταρα Η1299 και H23, Rac1 knockdown προκάλεσε μια σημαντική μείωση στον πολλαπλασιασμό (Εικ. S1c, S1E) και σχηματισμού αποικίας μαλακού άγαρ (Σχ. S1D, S1F). Για να προσδιοριστεί εάν οι Rac1 knockdown επιδράσεις επί του πολλαπλασιασμού και μαλακά ανάπτυξης άγαρ είναι ειδικά για Rac1, εκτελέσαμε shRNA ανθεκτικά Rac1 cDNA πειράματα μεταλλαγμένο διάσωσης στα knockdown κυττάρων. Εκφράζοντας ένα Rac1 shRNA ανθεκτικού μεταλλαγμένου cDNA θα μπορούσε κυρίως διασώσει ο πολλαπλασιασμός των Rac1 χτυπηθεί κάτω σε κύτταρα Α549 χωρίς ανιχνεύσιμη επίδραση στην SCR shRNA κατεργασμένα κύτταρα ελέγχου (Σχ. 1Ε). Ομοίως, παρατηρήσαμε μια διάσωση από μαλακό σχηματισμό άγαρ αποικίας εκφράζοντας shRNA ανθεκτικά Rac1 cDNA μεταλλαγμένο (Εικ. 1 F). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι Rac1 απαιτείται για την πολλαπλασιαστικού δυναμικού των κυττάρων NSCLA.

(Α) Κυτταρολύματα συλλέγονται από είτε ως κωδικοποιημένο shRNA (SCR) ή Rac1 shRNA (shRNA1, shRNA2) κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε Rac1 ανάλυση κηλίδας western. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) Τα μολυνθέντα κύτταρα ταξινομήθηκαν και επιστρώθηκε επί δοκιμασία πλάκας και τον πολλαπλασιασμό των 96 φρεατίων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του αντιδραστηρίου MTS. Δοκιμασία διεξήχθη εις τριπλούν και παραπάνω είναι ένας αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Γ) Τα μολυσμένα κύτταρα ταξινομήθηκαν, επιστρώθηκαν για προσδιορισμό αποικίας μαλακού άγαρ και οι αποικίες ανά πεδίο μετρήθηκαν μετά από 2 εβδομάδες. Δοκιμασία διεξήχθη εις τριπλούν και παραπάνω είναι ένας αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (D) Τα μολυσμένα κύτταρα ταξινομήθηκαν και επωάστηκαν με BrdU σε λογαριθμική φάση της κυτταρικής ανάπτυξης. Τα κύτταρα trypisinized, χρωματίστηκαν με BrdU αντίσωμα, 7ΑΑΌ και ανάλυση κυτταρικού κύκλου εκτελέσθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Δοκιμασία διεξήχθη εις τριπλούν και παραπάνω είναι ένας αντιπροσωπευτικά τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύει SD. (Ε) Κύτταρα ελέγχου ή κύτταρα που εκφράζουν ανθεκτικά shRNA μεταλλαγμένο Rac1 μολύνθηκαν με SCR ή Rac1 Τα siRNAs, ταξινομούνται και απλώθηκε σε πλάκα 96 φρεατίων. δοκιμασία πολλαπλασιασμού πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του αντιδραστηρίου MTS. Δοκιμασία διεξήχθη εις τριπλούν και παραπάνω είναι ένας εκπρόσωπος των δύο ανεξάρτητων πειραμάτων. (F) μολυσμένα κύτταρα ταξινομήθηκαν, επιστρώθηκαν για προσδιορισμό αποικίας μαλακού άγαρ και οι αποικίες μετρήθηκαν μετά από 10 ημέρες. Δοκιμασία διεξήχθη εις τριπλούν και παραπάνω είναι ένας εκπρόσωπος των δύο ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Rac1 knockdown αποτέλεσμα μειωμένη πρόσφυση, μετανάστευση και διείσδυση των κυττάρων NSCLA

Σύμφωνα με τη γνωστή ρόλος της Rac1 στη ρύθμιση κυτταρικού σκελετού, Rac1 knockdown στα δύο κύτταρα Α549 και Η441 είχε ως αποτέλεσμα αλλαγμένη ακτίνης οργάνωση του κυτταροσκελετού (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Καταστολή της Rac1 σε κύτταρα Α549 που προκαλούνται μειωμένο σχηματισμό εστιακών προσκόλληση συγκρότημα, με τα κύτταρα ελέγχου που εμφανίζουν ισχυρή σύμπλοκα εστιακής προσκόλλησης ορατές με ανοσοχρώση για τα εστιακά πρωτεΐνες προσκόλλησης p-FAK, βινκουλίνης, και ρ-παξιλλίνη ενώ ο σχηματισμός συμπλόκου τα Rac1shRNA2 μολυσμένα κύτταρα κατέδειξαν μειωμένη εστιακής προσκόλλησης (Εικ. 2Α). Επίσης παρατηρήθηκε μειωμένη ρ-FAK, ρ-παξιλλίνη και π-MLC σε κύτταρα knockdown Rac1 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου με ανάλυση κηλίδας Western (Εικ. S2A). Σε συμφωνία με τα μειωμένα σύμπλοκα προσκόλληση σε Rac1shRNA μολυσμένα κύτταρα, προσκόλληση στη φιβρονεκτίνη μειώθηκε σε αυτά τα κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχ. 2Β). Παρόμοια με την επίδραση επί του πολλαπλασιασμού, Rac1 μερικό νοκ ντάουν στα κύτταρα Η441 οδήγησε σε μια σχετικά μικρή επίδραση στην πρόσφυση σε φιμπρονεκτίνη σε σύγκριση με το Α549 κύτταρα (Εικ. S2B). Επιπλέον, Rac1 knockdown στα δύο κύτταρα Α549 και Η441 οδήγησε σε μειωμένη μετανάστευση και εισβολή δραστηριότητες trans-καλά σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχ 2C, 2D, & amp?. Σχ. S2C, Σχήμα S2D.). Ομοίως, Rac1 knockdown σε Η1299 ή Η23 κύτταρα μειώθηκαν δραστικά μετανάστευσης σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου (Σχ. S2E, Σχ. S2F). Εκφράζοντας ένα shRNA ανθεκτικό Rac1 cDNA μεταλλάγματος ήταν σε θέση να διασώσουν εντελώς το φαινότυπο μετανάστευση Rac1 knockdown σε κύτταρα Α549 (Σχ. 2Ε). Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν τη σημασία της Rac1 σε NSCLA προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων, μετανάστευση και εισβολή.

(Α) μολυσμένα κύτταρα Α549 διαλογή, απλώθηκαν σε ινονεκτίνη επικαλυμμένα πλακίδια και χρωματίστηκαν είτε με ρ-FAK (άνω πάνελ) ή βινκουλίνης (μεσαίο πάνελ) ή ρ-παξιλλίνη (κάτω τμήμα) και DAPI. Οι εικόνες συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας φθορίζον μικροσκόπιο σε 40Χ μεγέθυνση. Παραπάνω εικόνες είναι αντιπροσωπευτικές των διαφόρων εικόνων που λαμβάνονται από δύο ανεξάρτητα πειράματα. (Β) Α549 ταξινομημένα κύτταρα απλώθηκαν σε ινονηκτίνη επικαλυμμένη πλάκα 96 φρεατίων για

in vitro

δοκιμασία προσκόλλησης και τα κύτταρα που συνδέονται με την πλάκα μετά από 1 ώρα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο MTS. δοκιμασία προσκόλλησης διεξήχθη με πέντε αντίγραφα και τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Γ) Ταξινόμηση κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες μετανάστευση trans-φρεατίων και η μετανάστευση των κυττάρων προς 10% FBS μετρήθηκε όλη τη νύκτα. Δοκιμασία διεξήχθη σε επαναλήψεις και παραπάνω δεδομένα ήταν αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (D) Ταξινόμηση Α549 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία Matrigel εισβολή επικαλυμμένες και μετανάστευση κυττάρων προς 10% FBS και 10 μg /ml ινονηκτίνης μετρήθηκε μετά από 48 ώρες. Δοκιμασία διεξήχθη εις τριπλούν και τα παραπάνω είναι ένα αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύει SD. (Ε) Έλεγχος ή κύτταρα που εκφράζουν ανθεκτικά Rac1shRNA μεταλλαγμένο μολύνθηκαν με Rac1 shRNA και ταξινομημένο. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες μετανάστευση trans-φρεατίων και η μετανάστευση των κυττάρων προς 10% FBS μετρήθηκε όλη τη νύκτα. Δοκιμασία πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν και παραπάνω δεδομένα ήταν αντιπροσωπευτικά των δύο ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Rac1 νοκ ντάουν αποτρέπει πνεύμονα αποικισμό των κυττάρων NSCLA σε ποντίκια

Στη συνέχεια, εξετάσαμε την επίδραση της Rac1 νοκ ντάουν για ογκογένεση και μεταστατική συμπεριφορά των κυττάρων αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα. Rac1 knockdown ή κύτταρα ελέγχου ενέθηκαν ενδοφλεβίως σε ανοσο-ανεπαρκή ποντίκια NSG σε ένα μοντέλο πνεύμονα αποικισμού. Τόσο Α549 (Εικ. 3Α) και Η441 κύτταρα (Εικ. S3A) που εκφράζουν Scr (500.000 κύτταρα /ποντικό) προκάλεσε σχηματισμό όγκων στους πνεύμονες, ενώ Rac1 κύτταρα knockdown (500.000 κύτταρα /ποντικό) απέτυχε να σχηματίζουν όγκους στους πνεύμονες 8 εβδομάδες μετά ένεση. Όπως ήταν αναμενόμενο, Rac1shRNA1 μολυσμένα κύτταρα που έδειξαν μερική πρωτεΐνη Rac1 knockdown σχηματίστηκε μειωμένος αριθμός των όγκων. Για να καθοριστεί εάν η επίδραση επί των πνευμόνων αποικισμού σχετίζεται με μια παλιννόστησης ελάττωμα των Rac1 knockdown κυττάρων στον πνεύμονα, ελέγξαμε την ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να φιλοξενεί το πνευμονικό ιστό 48 ώρες μετά την ένεση στην φλέβα της ουράς. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι η YFP

+ Rac1 κύτταρα knockdown εμφανίζεται σημαντικά μειωμένη δραστηριότητα παλιννόστησης των πνευμόνων σε σύγκριση με το YFP

+ κύτταρα Scr (Σχ. 3Β). Επιπλέον, υποδόρια ξενομοσχεύματος των καρκινικών κυττάρων (500.000 κύτταρα /ποντικό) σε ποντικούς NSG αποδειχθεί ότι τα κύτταρα knockdown Rac1 είχε καθυστερήσει την ανάπτυξη όγκου και μείωσε τον όγκο του όγκου σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχ. 3C). Είναι ενδιαφέρον ότι, ο σχηματισμός σφαίρα των κυττάρων Η441, η οποία συσχετίζεται με όγκο δυναμικό κίνηση, επίσης σε κίνδυνο κατά την Rac1 knockdown (Εικ. S3b) ενώ δεν παρατηρήθηκε επίδραση με Rac1 knockdown στη δραστηριότητα σχηματισμού σφαίρα των μη μετασχηματισμό κυττάρων ελέγχου HBEC (Εικ. S3C ). Έτσι, είναι πιθανό ότι οι κυτταρικές επιδράσεις Rac1 knockdown όγκου πνεύμονα αποικισμού, αύξηση οφείλεται σε μια συνδυασμένη επίδραση επί των καρκινικών κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό homing στον πνεύμονα.

(Α) 5 × 10

5 κύτταρα Α549 ενέθηκαν σε φλέβα της ουράς NSG ποντικών (n = 6 ανά συνθήκη) και οι πνεύμονες αποκόπηκαν μετά από 8 εβδομάδες. Lung βάφτηκαν με διάλυμα Bouins και αποχρωματίζονται σε 70% αιθανόλη. Ποσοτικοποίηση των δεδομένων του πνεύμονα αποικισμού παρουσιάστηκε στο δεξί πλαίσιο. μπαρ σφάλμα αντιπροσωπεύει SE. Απεικονίζεται είναι ένας εκπρόσωπος από δύο ανεξάρτητα πειράματα. δοκιμασίας (Β) καρκινικών κυττάρων παλιννόστησης πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στις μεθόδους (η = 6 ανά συνθήκη σε κάθε πείραμα). δείκτης Homing μετρήθηκε ως ποσοστό των θετικών κυττάρων YFP ανιχνεύθηκε σε πνεύμονες, κανονικοποιημένη για τον έλεγχο. Απεικονίζεται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Γ) 5 × 10

5 scr ή Rac1 shRNA μολυσμένα κύτταρα εγχύθηκαν υποδόρια σε λαγόνες NOD ποντίκια /SCID και ο όγκος του όγκου μετρήθηκε εβδομαδιαίως για 7 εβδομάδες. μπαρ σφάλμα αντιπροσωπεύει SE.

Η

κύτταρα Side πληθυσμού περιέχουν αυξημένα αυξημένες δραστηριότητες μετανάστευση, εισβολή, και των πνευμόνων αποικισμού Rac1-GTP και

Η θεωρία του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων προτείνει ότι ένα κλάσμα του καρκίνου κυτταρικός πληθυσμός εμπλουτίζεται για την ικανότητα του όγκου κίνηση, απαιτώντας έτσι προνομιακή στόχευση για την επίτευξη θεραπευτικά οφέλη. Side πληθυσμός είναι ένας από τους δείκτες βλαστοκυττάρων που έχει χρησιμοποιηθεί για την απομόνωση του καρκίνου του πνεύμονα βλαστοκύτταρα [12]. Εμείς απομονωμένα κύτταρα SP με κυτταρομετρία ροής από κύτταρα Α549 (Εικ. 4Α) και επιβεβαιώθηκε με RT-PCR που εκφράζουν αυξημένη ABCG2 μεταφορέα (Εικ. S4A). Είναι ενδιαφέρον ότι, τα κύτταρα SP περιείχε αυξημένη δραστηριότητα Rac1 (Εικ. 4Β) και επέδειξαν αυξημένη μετανάστευση σε σύγκριση με κύτταρα μη-SP ή γονικά κύτταρα (Εικ. 4C). Η αναστολή της δραστηριότητας Rac1 χρησιμοποιώντας ένα μικρό μόριο αναστολέα Rac, NSC23766, οδήγησε σε μειωμένη μετανάστευση και εισβολή του SP κύτταρα (Σχ. S4B, S4C), γεγονός που υποδηλώνει αυξημένη Rac1-GTP στα κύτταρα SP συμβάλλει στις εν λόγω κύτταρο όγκου συμπεριφορές. Επιπλέον, τα κύτταρα SP έδειξαν αυξημένη ικανότητα των πνευμόνων αποικισμού

in vivo

σε σύγκριση με μη-SP ή γονικά κύτταρα (Εικ. 4D). Είναι ενδιαφέρον ότι, παρά τις διαφορετικές δραστηριότητες όγκου έναρξη

in vivo

, SP και μη-SP κύτταρα πολλαπλασιάστηκαν σε παρόμοιο ρυθμό όπως τα γονικά κύτταρα

in vitro

(Εικ. S4D). Ωστόσο, τα κύτταρα SP επέδειξαν αυξημένη δραστηριότητα σχηματισμού αποικιών όταν αναπτύσσονται σε μαλακό άγαρ σε σύγκριση με μη-SP και γονικά κύτταρα (Εικ. S4E). Η υπολειμματική ογκογόνο δραστικότητα που παρουσιάζεται από τα κύτταρα μη SP δεν οφειλόταν σε πρόσμιξη αυτών των κυττάρων, επειδή παράλληλη ανάλυση FACS που βρήκαμε 99,9% εμπλουτισμού για μη SP κύτταρα από την χρωστική Hoechst 33342 διαλογής (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ως εκ τούτου, είναι πιθανό ότι μια πλαστικότητα των κυττάρων μη-SP τους επιτρέπει να δημιουργούν καρκίνο κύτταρα έναρξης με αποτέλεσμα την παρατηρούμενη υπολειμματικό ογκογονικότητας.

(Α) κύτταρα Α549 χρωματίστηκαν με χρωστική Hoechst 33342 και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής για την πλευρά του πληθυσμού (αριστερό πάνελ). Τα κύτταρα επεξεργάστηκαν με 10 μΜ Fumitremorgen για τον έλεγχο αναστολέα (δεξί πάνελ). Απεικονίζεται είναι ένα αντιπροσωπευτικό πολλών SP αναλύσεις. λύματα (Β) Cell συλλέγονται από ταξινομημένα SP και μη SP κύτταρα υποβλήθηκαν σε GST-PAK γκρεμίζουν δοκιμασίας και επεξεργάστηκαν για ανάλυση Western Blot Rac1 για να προσδιοριστεί η δραστικότητα Rac1. Σύνολο κηλίδα Rac1 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Απεικονίζεται είναι ένα αντιπροσωπευτικό τριών ανεξάρτητων προσδιορισμών pull-down δραστηριότητα Rac1. κύτταρα (C) ταξινόμηση Α549 καλλιεργήθηκαν για δοκιμασία μετανάστευσης trans-φρεατίων και τα κύτταρα μετανάστευσαν όλη τη νύχτα προς 10% FBS χρωματίστηκαν και μετρήθηκαν. Πάνω απ ‘είναι ένα αντιπροσωπευτικό τριών ανεξάρτητων πειραμάτων και οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύει SD. (D) 5 × 10

4 ταξινομημένο SP και μη SP κύτταρα εγχύθηκαν σε φλέβα της ουράς ποντικών NSG (η = 4 ανά συνθήκη). Οι πνεύμονες αποκόπηκαν στο τέλος των 12 εβδομάδων. Δικαίωμα πλαίσιο δείχνει ποσοτικοποίηση των δεδομένων του πνεύμονα αποικισμού. μπαρ σφάλμα αντιπροσωπεύει SE. Πάνω απ ‘είναι ένα αντιπροσωπευτικό τριών ανεξάρτητων πειραμάτων

Η

κύτταρα SP ανιχνεύθηκαν επίσης σε Η441 κύτταρα σε χαμηλότερο ποσοστό από Α549 κύτταρα (Εικ S4F?. 0,5-2% έναντι 4-10%).. Παρόμοια με τα κύτταρα Α549 SP, τα κύτταρα Η441 SP επέδειξαν αυξημένη πνευμονική αποικισμού σε ανοσοκαταστολή ποντικούς σε σύγκριση με μη-SP κύτταρα (Σχ. S4G), και σχηματίζονται περισσότερες αποικίες σε μαλακό άγαρ σε σύγκριση με μη-SP και γονικά κύτταρα (Εικ. S4H).

τα αποτελέσματα αυτά μας οδηγούν στο συμπέρασμα ότι τα κύτταρα SP από NSCLA αντιπροσωπεύουν ένα υποπληθυσμό στα χύμα καρκινικά κύτταρα που περιέχουν αυξημένα δραστηριότητα Rac1, αυξημένη μετανάστευση, εισβολή, οι δραστηριότητες ανάπτυξης αγκύρωση-ανεξάρτητη, και είναι εμπλουτισμένα για κύτταρα τα οποία είναι ικανά να του αποικισμού πνεύμονα. Προτείνουν επίσης ότι τα κύτταρα μη-SP θα μπορούσαν να παραμείνουν ογκογόνα, αν και με μειωμένη δραστικότητα CSC, να προκαλέσουν όγκους.

Rac1 knockdown καταστέλλει προσκόλληση, μετανάστευση, και η εισβολή τόσο SP και μη SP κύτταρα

για να εξεταστεί περαιτέρω η επίδραση της Rac1 knockdown σε κύτταρα SP, κύτταρα Α549 μολύνθηκαν με φακοϊό είτε περιέχουν SCR ή Rac1 shRNA, και SP και μη SP κύτταρα απομονώθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Η ανάλυση στυπώματος Western επιβεβαίωσε την αποτελεσματικότητα του Rac1 knockdown σε αμφότερες SP και μη-SP κύτταρα (Σχ. S5A). Σε συμφωνία με προηγούμενα δεδομένα μας για τη γονική κύτταρα, Rac1 νοκ ντάουν αλλάξει την οργάνωση του κυτταροσκελετού των δύο SP και μη-SP κύτταρα (Εικ. S5B), και μειωμένη σύμπλοκα εστιακής προσκόλλησης όπως απεικονίζονται από p-ΡΑΚ ανοσοχρώση τόσο SP και μη-SP κύτταρα (Εικ. 5Α). Σταθερά, η δραστικότητα προσκόλλησης τόσο SP και μη SP κυττάρων σε ινονεκτίνη μειώθηκε επίσης (Σχ. 5Β). Περαιτέρω, Rac1 knockdown μειωμένη μετανάστευση και εισβολή των δύο SP και μη-SP κύτταρα (Σχ. 5C, 5D). Έτσι, Rac1 στόχευση μπορεί να καταστείλει τη μετανάστευση και την εισβολή των δύο SP και καρκινικά κύτταρα μη-SP.

(Α) Ταξινόμηση κύτταρα απλώθηκαν σε ινονεκτίνη επικαλυμμένα πλακίδια, σταθερές και υποβλήθηκαν σε ανοσοχρώση με ρ-FAK αντίσωμα. εικόνες των κυττάρων συλλέχθηκαν σε 40Χ μεγέθυνση χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού. Πάνω απεικονίζονται είναι αντιπροσωπευτικά των πολλαπλών εικόνων που συλλέγονται. (B, C, D) Α549 ταξινομημένα κύτταρα είτε τοποθετούνται σε ινονεκτίνη επικαλυμμένη πλάκα 96 φρεατίων για

in vitro

δοκιμασίας προσκόλλησης (Β), σε πλάκες trans-φρεατίων για την δοκιμασία μετανάστευσης (C) ή με Matrigel εισβολής πλάκες για δοκιμασία εισβολής (D). Όλες οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν SD. Απεικονίζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Rac1 στόχευση μειώνει τον πολλαπλασιασμό και την πνευμονική αποικισμό των δύο κυττάρων SP και μη-SP

Για να εξεταστεί αν η παρατηρούμενη αναστολή του πολλαπλασιασμού της συνολικής καρκίνου κύτταρο πληθυσμός από Rac1 knockdown οφείλεται σε μια συγκεκριμένη επίδραση στην ΚΕΠ, εμείς επόμενο δοκιμαστεί τις ιδιότητες ανάπτυξης των απομονωμένων SP και μη SP κύτταρα πριν και μετά την μεταγωγή των Rac1 ειδικών shRNA. Ο πολλαπλασιασμός των SP και NSP κύτταρα

in vitro

εμφανίστηκε παρόμοια υπό πρότυπες συνθήκες καλλιέργειας ιστού, και Rac1 knockdown μπλοκάρει

in vitro

πολλαπλασιασμό τόσο SP και μη SP κυττάρων στο παρόμοιο βαθμό (Εικ . 6Α). σήμανσης BrdU έδειξε ότι και οι δύο κύτταρα SP και μη SP ανεστάλησαν σε μεταβατικό στάδιο S-φάση με αντίστοιχη αύξηση της G0 /G1 φάση του κυτταρικού κύκλου μετά Rac1 knockdown (Εικ. 6Β). Ενώ κωδικοποιημένα RNA δεν επηρέασε την αυξημένη δραστηριότητα σχηματισμού αποικίας των κυττάρων SP σε μία δοκιμασία μαλακού άγαρ σε σύγκριση με κύτταρα μη-SP είτε μειωμένη ορό ή φυσιολογικό ορό συνθήκες (Εικ 6C?. Δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), Rac1 shRNA ήταν σε θέση να μειώσει σημαντικά σχηματισμό αποικιών τόσο SP και κύτταρα Α549 μη-SP. Στην ουρά φλεβική ένεση ποντίκια NSG, ο πνεύμονας αποικισμό των κυττάρων Rac1 shRNA SP ήταν δραστικά μειωμένη σε σχέση με τα κύτταρα SCR και τα αντίστοιχα κύτταρα μη-SP έδειξαν καμία δραστηριότητα αποικισμού όγκου (Εικ. 6D). Αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν ισχυρές ενδείξεις ότι η Rac1 στόχευση είναι αποτελεσματική στην αναστολή του πολλαπλασιασμού και της μεταστάσεως των δύο κυττάρων SP και μη-SP. Για να ελέγξετε αν είναι εφαρμόσιμες σε καρκινικά βλαστικά κύτταρα χαρακτηρίζονται από CD133 οι Rac1 νοκ ντάουν επιδράσεις στον πολλαπλασιασμό, μια δοκιμασία ενσωμάτωσης BrdU διεξήχθη στην οποία BrdU θετικά κύτταρα περιφραγμένη στο CD133

+ ή CD133

– πληθυσμός τόσο SCR και Rac1 shRNA επεξεργασμένα κύτταρα. Παρατηρήσαμε μια μείωση της BrdU

+ κύτταρα, τόσο CD133

+ και CD133

– υποπληθυσμών κατόπιν Rac1 knockdown (Εικ. 6E). Έτσι, Rac1 απαιτείται για τον πολλαπλασιασμό του πληθυσμού CSC.

(Α) Ταξινόμηση κύτταρα τοποθετήθηκαν σε ανάλυση πλάκας και τον πολλαπλασιασμό των 96 φρεατίων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του αντιδραστηρίου MTS. Δοκιμασία διεξήχθη εις τριπλούν και οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν SD. Απεικονίζεται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Β) Α549 ταξινομημένα κύτταρα επωάστηκαν με ανάλυση BrdU και του κυτταρικού κύκλου έγινε με χρώση BrdU και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Δοκιμασία διεξήχθη εις τριπλούν και οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν SD. Πάνω απ ‘είναι ένας εκπρόσωπος από δύο ανεξάρτητα πειράματα. (Γ) ταξινόμηση κυττάρων απευθείας επιστρώθηκαν για δοκιμασία μαλακού άγαρ σχηματισμού αποικίας και ο αριθμός των αποικιών που σχηματίστηκαν μετρήθηκαν μετά από 2-3 εβδομάδες. Δοκιμασία διεξήχθη εις τριπλούν και οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν SD.