Αφηρημένο

Στην εποχή της στοχευμένης θεραπείας, η μετάλλαξη των χαρακτηριστικών του καρκίνου είναι μια κρίσιμη πτυχή της λήψης θεραπευτικών αποφάσεων. Για να χαρακτηριστεί ο καρκίνος σε μοριακό επίπεδο, η χρήση των σταθεροποιημένο με φορμαλίνη εγκλεισμένο σε παραφίνη ιστό είναι σημαντική. Δοκιμάσαμε το v2 Panel Ion AmpliSeq Καρκίνος Hotspot και nCounter Αντιγραφή Δοκιμασία Αριθμός Διακύμανση 89 γαστρικό καρκίνο δείγματα παραφίνη-ενσωματωμένες φορμόλη σταθερό να διαπιστωθεί αν αυτές εφαρμόζονται στην αρχειακή κλινικά δείγματα για εξατομικευμένες στοχευμένες θεραπείες. Εμείς επικυρώνονται τα αποτελέσματα με αλληλούχιση Sanger, πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR, in situ υβριδοποίηση και ανοσοϊστοχημεία. Ανιχνεύεται συχνά σωματικές μεταλλάξεις που περιλαμβάνονται

TP53

(28.17%),

APC

(10,1%),

PIK3CA

(5,6%),

KRAS

(4,5 %),

ΠΕΑ

(3,4%),

STK11

(3,4%),

CDKN2A

(3,4%) και

Smad4

(3,4%) . Ενισχύσεις του

HER2

,

CCNE1

,

MYC

,

KRAS

και

EGFR

γονίδια παρατηρήθηκαν σε 8 (8.9%) , 4 (4,5%), 2 (2,2%), 1 (1,1%) και 1 (1,1%) περιπτώσεις, αντίστοιχα. Στις περιπτώσεις με ενίσχυση, in situ υβριδοποίηση για

HER2

επαλήθευσε ενίσχυση γονιδίου και ανοσοϊστοχημεία για HER2, EGFR και CCNE1 επαλήθευσε την υπερέκφραση των πρωτεϊνών σε κύτταρα όγκου. Εν κατακλείδι, πραγματοποιήσαμε με επιτυχία αλληλουχίας ημιαγωγών με βάση και τη διακύμανση του αριθμού αντιγράφων nCounter αναλύσεις σε δείγματα γαστρικού καρκίνου παραφίνη-ενσωματωμένες φορμόλη-σταθερές. διαλογή υψηλής απόδοσης σε αρχειακό κλινικά δείγματα επιτρέπει την ταχύτερη, πιο ακριβής και αποδοτική ανίχνευση μεταλλάξεων hotspot ή ενίσχυση των γονιδίων

Παράθεση:. Kim S, Lee J, Χονγκ ME, Do IG, Kang SY, Ha SY, et al. (2014) High-Throughput αλληλουχίας και Ανίχνευση Copy Number Παραλλαγή Χρησιμοποιώντας φορμόλη Σταθερή Embedded ιστών σε μεταστατικό καρκίνο του στομάχου. PLoS ONE 9 (11): e111693. doi: 10.1371 /journal.pone.0111693

Επιμέλεια: Hiromu Suzuki, Σαπόρο Ιατρικό Πανεπιστήμιο, την Ιαπωνία

Ελήφθη: 28 Απρίλη 2014? Αποδεκτές: 29 του Σεπτεμβρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 5 Νοέμβρη 2014

Copyright: © 2014 Kim et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη αυτή υποστηρίζεται από μια επιχορήγηση από την Κορέα Υγειονομική περίθαλψη τεχνολογίας Ε & amp? D Έργου, Υπουργείο Υγείας & amp? Πρόνοιας Υποθέσεων, Δημοκρατία της Κορέας (A101130) και επιχορήγηση Samsung Ινστιτούτο Βιοϊατρικών Ερευνών (# SBRI-SP1B20112). Η μελέτη αυτή υποστηρίζεται επίσης από τη Samsung Medical Center εντός των τειχών επιχορήγηση, 20 x 20 Έργου (# GFO1140111). Συν-συγγραφείς Seokhwi Kim, Jeeyun Lee, Min Eui Χονγκ, In-Gu Do, τόσο νέος Kang, Sang Yun Ha, Seung Tae Kim, Se Hoon Park, Won Ki Kang, Min-Gew Choi, Ιουν Ho Lee, Tae Sung Sohn , Jae Σελήνη Bae, Σουνγκ Κιμ και Kyoung-Mee Kim απασχολούνται από τη Samsung Medical Center. Συν-συγγραφέας Duk-Hwan Kim απασχολείται από τη Samsung Ινστιτούτο Βιοϊατρικών Ερευνών. Samsung Ινστιτούτο Βιοϊατρικών Ερευνών και Samsung Medical Center παρέχεται στήριξη με τη μορφή των μισθών για τους συγγραφείς Seokhwi Kim, JL, MEH, IGD, SYK, SYH, STK, SHP, WKK, MGC, JHL, TSS, JMB, Σουνγκ Κιμ, KMK και ΏΗΚ , αλλά δεν είχε καμία πρόσθετη ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Οι συγκεκριμένοι ρόλοι αυτών των συγγραφέων αρθρωτά στο τμήμα «συγγραφέας εισφορές»

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν τα εξής ενδιαφέροντα: Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από τη Samsung Ινστιτούτο Βιοϊατρικών Ερευνών και Samsung Medical Center. Συν-συγγραφείς Seokhwi Kim, Jeeyun Lee, Min Eui Χονγκ, In-Gu Do, τόσο νέος Kang, Sang Yun Ha, Seung Tae Kim, Se Hoon Park, Won Ki Kang, Min-Gew Choi, Ιουν Ho Lee, Tae Sung Sohn , Jae Σελήνη Bae, Σουνγκ Κιμ και Kyoung-Mee Kim απασχολούνται από τη Samsung Medical Center. Συν-συγγραφέας Duk-Hwan Kim απασχολείται από τη Samsung Ινστιτούτο Βιοϊατρικών Ερευνών. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Αν και καρκίνο του στομάχου είναι η τέταρτη πιο κοινή μορφή καρκίνου στον κόσμο, είναι η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου. [1] συχνότητα εμφάνισης του είναι σημαντικά υψηλότερο στις χώρες της Ασίας, συμπεριλαμβανομένης της Κορέας, όπου είναι η δεύτερη πιο κοινή μορφή καρκίνου. [2] Πρόσφατα, πολλές στοχευμένες θεραπευτικές μέθοδοι για καρκίνο του στομάχου έχουν ανακαλυφθεί, τα οποία παρέχουν πρόσθετες επιλογές για τους γιατρούς και τους ασθενείς [3] – [5]

Στην εποχή της στοχευμένης θεραπείας, η μετάλλαξη των χαρακτηριστικών του καρκίνου του αιτιολογικού. είναι ζωτικής σημασίας για τις θεραπευτικές αποφάσεις. Προσπάθειες στο προφίλ μεταλλάξεις έχουν γίνει χρήση παραδοσιακών αλληλουχίας Sanger? Ωστόσο, δεν είναι μια βέλτιστη μέθοδος σε κλινικές ρυθμίσεις λόγω του κόστους, χρόνου και εργασίας που απαιτείται. Επιπλέον, ο προσδιορισμός αλληλουχίας Sanger απαιτεί σημαντικές ποσότητες DNA? αξιολόγηση μικρές ποσότητες δείγματος για πολλά γονίδια ταυτόχρονα δεν είναι δυνατή. Εισαγωγή των μεθόδων προσδιορισμού αλληλουχίας επόμενης γενιάς (NGS) έχει επιλυθεί το πρόβλημα αυτό με αλληλούχιση multiplex, υψηλής απόδοσης πολλών δειγμάτων για πολλαπλά γονίδια ταυτόχρονα. [6], [7] Μία από τις πλατφόρμες NGS, ο Πίνακας Cancer Ion Torrent AmpliSeq, βασίζεται σε μη-οπτική ανίχνευση των ιόντων υδρογόνου σε μία συσκευή ημιαγωγού, [8] και είναι σε θέση να ανιχνεύσει 2855 ογκογόνους μεταλλάξεις σε 50 συνήθως μεταλλαγμένα γονίδια (Πίνακας S1). Είναι ανώτερη από άλλες μεθόδους προσδιορισμού αλληλουχίας φασματοσκοπία μάζας με βάση, παρέχοντας αλληλούχιση αποτελέσματα πιο γρήγορα και με χαμηλότερο κόστος. [8] Είναι εφαρμόσιμη σε σταθεροποιημένο με φορμαλίνη εμπεδωθεί με παραφίνη δείγματα (FFPE) ιστού με μικρές ποσότητες DNA. Διότι εξασφαλίζει υψηλή ευαισθησία στην ανίχνευση γνωστών ογκογόνων μεταλλάξεων, [9], [10] η ομάδα του Καρκίνου Ion Torrent AmpliSeq είναι η επιλογή των 5 μεγάλα κέντρα καρκίνου στις Ηνωμένες Πολιτείες για τη μοριακή διάγνωση σε στοχευμένη θεραπεία [11].

ενίσχυση των ογκογονιδίων είναι ένας κύριος μηχανισμός για γονιδιακή υπερέκφραση και συμβάλλει στην ανάπτυξη του όγκου. [12] Τα παραδείγματα περιλαμβάνουν την ενίσχυση της

HER2

,

ΚΟΑ

,

FGFR2

και

KRAS

γονίδια σε γαστρικών καρκίνων. [13], [14] Στην ανίχνευση των μεταβολών αριθμού αντιγράφων (CNVs) σε κλινικά δείγματα, φθορισμό in situ υβριδισμού (FISH) και /ή ανοσοϊστοχημεία (IHC) έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως. Ωστόσο, το υψηλό κόστος και μικρά μεγέθη δείγματος βιοψίας υλικών περιορίζουν την εφαρμογή αυτών των μεθόδων, και εξακολουθεί να υπάρχει ανάγκη για περαιτέρω τεχνολογία υψηλής απόδοσης με εύκολη προσβασιμότητα, υψηλή ευαισθησία και χαμηλό κόστος. CodeSets nCounter CNV (τεχνολογίες Nanostring, Life Sciences, Seattle, WA) παρέχουν ανώτερη ακρίβεια και επαναληψιμότητα για τις μελέτες όλων των μεγεθών και να παράγουν καλύτερα, πιο γρήγορα αποτελέσματα με σημαντικά λιγότερη προσπάθεια από ό, τι σε πραγματικό χρόνο αλυσίδας ποσοτική αντίδραση πολυμεράσης (qPCR) ή συστοιχίες CNV [ ,,,0],15].

Καλύτερα προσαρμοσμένη θεραπεία του καρκίνου μπορεί να βελτιώσει την έκβαση των ασθενών. δείγματα όγκων των ασθενών θα απαιτηθεί προκειμένου να χαρακτηρίσει τον καρκίνο σε μοριακό επίπεδο και να εντοπίσει τα υποομάδες ασθένεια που πρέπει να λάβουν διαφορετικές θεραπείες. Η χρήση των FFPE ιστού είναι σημαντική για την ενεργοποίηση αυτών των μελετών. [16] Εδώ έχουμε δοκιμαστεί AmpliSeq και nCounter έθιμο CNV πάνελ σε FFPE δείγματα γαστρικό καρκίνο για να καθοριστεί εάν αυτές εφαρμόζονται στην αρχειακή κλινικά δείγματα για εξατομικευμένες στοχευμένες θεραπείες.

Υλικά και Μέθοδοι

Δείγματα

ποσοστό όγκου των κυττάρων με περισσότερο από 75% αποκόπηκαν κάτω από μικροσκοπία από μη χρωσμένα τμήματα 4 mm επί σύγκριση με η &? Ε βάφονται διαφανειών, και γονιδιωματικό ϋΝΑ εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας ένα Qiagen DNA FFPE Kit Tissue (Qiagen, Hilden, Γερμανία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή από 96 ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του στομάχου. Μετά την εκχύλιση, μετρήθηκε συγκέντρωση, καθώς και αναλογία 260/280 και 260/230 nm με φασματοφωτόμετρο (ND1000, Nanodrop Technologies, ThermoFisher Scientific, ΜΑ, USA). Κάθε δείγμα στη συνέχεια ποσοτικοποιήθηκε με το qubit φθορόμετρο (Life Technologies, Carlsbad, California). Γονιδιακού DNA με & gt? 10 ng μετράται με qubit φθορισμού υποβλήθηκε σε προετοιμασία της βιβλιοθήκης και επτά δείγματα απέτυχαν να κατασκευάσουν βιβλιοθήκες και αποκλείστηκαν από τη μελέτη αυτή. Τέλος, 89 περιπτώσεις τελικά αναλύονται και περιλαμβάνονται 31 θηλυκά και 58 άνδρες ασθενείς. Ο Πίνακας 1 παραθέτει τα κλινικά και παθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών σε αυτή τη μελέτη. Υποτροπή ή μετάσταση αναπτυχθεί σε 11 ασθενείς με διάμεση παρακολούθηση διάστημα 76 μηνών (εύρος 5,5 έως 149,3). Η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας (IRB) στη Samsung Medical Center. Όλα κλινική έρευνα διεξήχθη σύμφωνα με τις αρχές που διατυπώνονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι. Η γραπτή συγκατάθεση είχε παραιτηθεί από την IRB λόγω της αναδρομικής ανάλυσης και ανώνυμα δεδομένα. Τα δείγματα συλλέχθηκαν ως μέρος ενός τακτικού ιατρικής διαδικασίας και συλλέχθηκαν από τους συγγραφείς για αυτή τη μελέτη. Δείγματα από νεκρούς ασθενείς ή ζωντανά ασθενείς όλων de-εντοπίστηκαν, καθώς και απομάκρυνση των οποιωνδήποτε και όλων των δημογραφικών στοιχείων, πριν από την ανάλυση και έντυπο συγκατάθεσης είχε παραιτηθεί από την IRB.

Η

Ion AmpliSeq πίνακα καρκίνο v2

Χρησιμοποιήσαμε το v2 Ion AmpliSeq Panel Καρκίνο (Ion Torrent) για την ανίχνευση συχνές σωματικές μεταλλάξεις που επιλέχθηκαν με βάση την ανασκόπηση της βιβλιογραφίας. Εξετάζονται 2855 μεταλλάξεις στο 50 συνήθως μεταλλαγμένα ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια (Πίνακας S1). Κατ ‘αρχάς, 10 ng DNA από καθένα από τα 89 δείγματα όγκων FFPE υποβλήθηκαν σε ενιαίο σωλήνα, ενίσχυση πολλαπλής PCR με τη χρήση του Ion AmpliSeqCancer Primer πισίνα και τα αντιδραστήρια Ion AmpliSeqKit (Life Technologies). Θεραπεία των προκυπτόντων αμπλικονίων με Αντιδραστήριο Fupa μερική πέψη τους εκκινητές και φωσφορυλιώνεται των αμπλικονίων. Οι φωσφορυλιωμένη αμπλικόνια συνδέθηκαν προς Ion Προσαρμογείς και καθαρίζεται. Για γραμμωτό κωδικό προετοιμασία της βιβλιοθήκης, θα αντικατασταθεί με barcode προσαρμογείς από τον Ion Xpress Barcode προσαρμογείς 1-96 Kit για το μίγμα προσαρμογέα μη-γραμμικό κώδικα που παρέχονται στο κιτ Ion AmpliSeq Βιβλιοθήκη. Το συνδεδεμένο DNA υποβλήθηκε nick-μετάφρασης και ενίσχυση για να ολοκληρωθεί η σύνδεση μεταξύ προσαρμογείς και αμπλικόνια και να παράγει επαρκές υλικό για τους μεταγενέστερους προετοιμασία πρότυπο. Δύο γύροι αντιδραστηρίου Agencourt AMPure XP δεσμευτική σε 0.6 και 1.2 χάντρα-to-δείγμα αναλογίες όγκου αφαιρεθεί το DNA των εισροών και χωρίς νομική προσωπικότητα εκκινητές από τα αμπλικόνια. Τα τελικά μόρια της βιβλιοθήκης ήταν 125~300 bp σε μέγεθος. Στη συνέχεια μεταφέρθηκε τις βιβλιοθήκες στην OneTouch σύστημα Ion για την αυτοματοποιημένη προετοιμασία πρότυπο. Αλληλούχιση διεξήχθη επί του sequencer Ion PGM σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Χρησιμοποιήσαμε IonTorrent λογισμικού για την αυτοματοποιημένη ανάλυση δεδομένων.

Για να μετρηθεί η ευαισθησία και η ειδικότητα του πίνακα καρκίνου Ion AmpliSeq, χρησιμοποιήθηκαν ολόκληρη αλληλουχίας exome αποτελέσματα από 4 γαστρικό καρκίνο δείγματα με γνωστή κατάσταση μετάλλαξης [17].

nCounter Copy Number Παραλλαγή CodeSets

Για την ανίχνευση της CNV, nCounter Copy Number Παραλλαγή CodeSets χρησιμοποιήθηκαν με 300 ng καθαρισμένο γονιδιακό DNA εξάγεται 2-3 τμήματα των 4-μm πάχους FFPE μπλοκ εκπρόσωπος του όγκου χρησιμοποιώντας QIAamp DNA FFPE Kit Tissue (Qiagen, Hilden, Germany). Το DNA κατακερματισμένη μέσω πέψης ΑΙυΙ και μετουσιώθηκε στους 95 ° C. Κατακερματισμένη DNA υβριδίσθηκε με τον codeset των 86 γονιδίων στο nCounter Cancer CN Assay Kit (Nanostring Technologies) για 18 ώρες στους 65 ° C και υποβάλλονται σε επεξεργασία σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η nCounter Digital Analyzer υπολογίζονται και συνοψίζονται τα σήματα των ανιχνευτών δημοσιογράφο και το μέσο αριθμό καταμέτρηση των & gt? 3 κλήθηκαν και επιβεβαιώθηκε από την IHC, FISH ή PCR πραγματικού χρόνου

IHC για HER2, EGFR (HER1) και CCNE1.

για την επικύρωση των αποτελεσμάτων CNV που λαμβάνονται από nCounter, πραγματοποιήσαμε IHC για HER2 σε όλες τις περιπτώσεις, και EGFR και CCNE1 σε επιλεγμένες περιπτώσεις. Μετά αποπαραφινώσεως και ενυδάτωσης, τα τμήματα 4 mm σε διαφάνειες σιλανίου επικαλυμμένα με ανοσοβαφή για HER2. Η HercepTest (Dako, Glostrup, Denmark) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, όπως περιγράφηκε προηγουμένως. [18] Για EGFR χρησιμοποιήσαμε αντι-NCL-L-EGFR-384 μονοκλωνικό πρωτογενές αντίσωμα ποντικού (1:100 αραίωση? Novocastra /Όραμα Biosystems, Newcastle, UK) και για CCNE1 χρησιμοποιήσαμε αντι-CCNE1 /κυκλίνης Ε1 αντίσωμα (κλώνος HE12 ? 1:200 αραίωση? Thermo Fisher Scientific, ΜΑ). Το αυτοματοποιημένο σύστημα slide επεξεργασίας Ventana BenchMark XT χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ένας παθολόγος ειδικός (KMK) αξιολόγησε τα αποτελέσματα

FISH για HER2

FISH πραγματοποιήθηκε με τη χρήση dual-χρώμα DNA-ειδικών ανιχνευτών από PathVision ™ (Abbott /Vysis:. LSI HER2 SpectrumOrange ™ και CEP 17 SpectrumGreen ™) όπως περιγράφηκε προηγουμένως σε περιπτώσεις με αμφίβολα υπερέκφραση του HER2. [19] Μετρήσαμε τα σήματα υβριδοποίησης σε 20 πυρήνες ανά δείγμα κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Zeiss Axioskop) χρησιμοποιώντας σετ φίλτρων που συνιστάται από Vysis (DAPI /Spectrum Orange διπλής διέλευσης ζώνης, ϋΑΡΙ /Spectrum Πράσινο διπλή ζωνοπερατό). Όλα τα επικαλυπτόμενα πυρήνες αποκλείστηκαν, και αξιολογήθηκαν μόνο πυρήνες με μια ξεχωριστή πυρηνική σύνορα.

HER2

γονίδιο θεωρήθηκε ενισχύεται όταν ο λόγος σήματος FISH του

HER2 /CEP17

ήταν μεγαλύτερη ή ίση με 2.0 [20].

Real-time PCR για KRAS και MET ενίσχυση

Χρησιμοποιήσαμε DNA που ελήφθησαν από FFPE ιστούς γαστρικού καρκινώματος. Το μίγμα της αντίδρασης περιείχε 2 μλ προτύπου γονιδιωματικού DNA, 10 υί του κυρίου μείγματος Taqman καθολικής PCR (Applied Biosystems Inc, Foster City, CA) και 0,2 μΜ από κάθε εκκινητή. Για την ακριβή ανίχνευση των αλλαγών ΣΟ, αναλύσαμε τρεις διαφορετικές περιοχές του

KRAS

γονίδιο: μια περιοχή εντός ιντρονίου 1 (TaqMan Copy Number Δοκιμασία Hs06943812_cn), μια περιοχή εντός ιντρονίου 2 (Hs002534878_cn), και μια περιοχή στο εξώνιο 6 (Hs02739788_cn). . Για

ΜΕΤ

γονιδίου, χρησιμοποιήσαμε τους εκκινητές όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]

Μετρήσαμε κέρδος αριθμού αντιγράφων χρησιμοποιώντας το ακόλουθο προφίλ: 2 λεπτά στους 50 ° C, μετουσίωση στους 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους των 95 ° C για 15 sec και 60 ° C για 1 λεπτό. Προσδιορίσαμε σχετική ποσοτικοποίηση με τη χρήση του 7900 ΗΤ γρήγορο σύστημα PCR σε πραγματικό χρόνο εις τετραπλούν. Ένα κιτ δοκιμασίας RNaseP (Applied Biosystems) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Μετά την ενίσχυση, θα εισαχθούν τα αποτελέσματα του πειράματος που περιέχουν τιμές κατωφλίου κύκλου για τον αριθμό αντιγράφων και δοκιμασία αναφορά στο Software CopyCaller (Applied Biosystems) για την μετα-PCR ανάλυση δεδομένων, όπως περιγράφηκε προηγουμένως. [22] Έχουμε λάβει το καθεστώς κέρδος ΣΟ και τον αριθμό των

KRAS

αντίγραφα με βάση την συμφωνία των αποτελεσμάτων σε τουλάχιστον δύο από τους τρεις ανιχνευτές.

Αναλυτικές μέθοδοι

Αποκλείσαμε όλα τα συνώνυμα αλλαγές μετά από ένα αυτοματοποιημένο αλγόριθμο μετάλλαξη-καλώντας χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση μεταλλάξεων υποτιθέμενοι. Επαναλαμβανόμενες κλήσεις σε περισσότερες από 10 από 89 δείγματα θεωρούνται ως ψευδώς θετικά και εξαιρέθηκαν. Χρησιμοποιήσαμε τιμές αποκοπής άνω του 6% παραλλαγή της συχνότητας και περισσότερο από την κάλυψη X100 για την ανίχνευση μεταλλάξεων αλήθεια αλλαγές σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες και τη δική μας εμπειρία. [9], [10] Θα φιλτράρονται πολυμορφισμών μονού νουκλεοτιδίου μετά τη χειροκίνητη αναθεώρηση κάθε πολυμορφισμού στον Κατάλογο Σωματικών Μεταλλάξεων Καρκίνου (COSMIC, https://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic) ( Φιγούρα 1). Για καλά γνωστά γονίδια μεταλλαγμένα σε γαστρικά καρκινώματα (

TP53

,

APC

,

PIK3CA

,

STK11

,

CDKN2A

,

KRAS

,

HRAS

,

BRAF

και

CTNNB1

), ένα εγχειρίδιο επανεξέταση των αυτοματοποιημένων αποτελέσματα καλώντας έγινε για να πιάσει επιβλαβείς μεταλλάξεις με ελαφρώς χαμηλή τους παραλλαγή συχνότητας.

η

Αποτελέσματα

Αποτελέσματα του Ion AmpliSeq πίνακα καρκίνο

Οι συγκεντρώσεις του DNA, φορές τη συγκέντρωσή τους, κατά μέσο όρο κάλυψης των δειγμάτων, τον συνολικό αριθμό των βάσεις, & gt? Q20 βάσεις, διαβάζει, σημαίνει να διαβάσετε το μήκος, χαρτογραφήθηκαν διαβάζει, on-στόχος για το ποσοστό (%), σημαίνει ότι το βάθος και την ομοιομορφία των αποτελεσμάτων περιγράφονται στον πίνακα S2. Συνολικά λάβαμε 8178 παραλλαγής κλήσεων από 89 δείγματα, μεταξύ των οποίων και 3554 κλήσεις ήταν μη-συνώνυμη αλλαγές. Μετά το φιλτράρισμα επαναλαμβανόμενες κλήσεις, & lt? 6% των παραλλαγή αλληλόμορφου συχνότητας, & lt? 100Χ κάλυψη και εκείνα στην περιοχή ιντρονίου, επιλέχθηκαν 65 παραλλαγή κλήσεις. Επιπλέον, εξετάσαμε τις αυτοματοποιημένες κλήσεις σε γνωστές μεταλλάξεις, όπως

BRAF

,

KRAS

και

PIK3CA

και θα μπορούσε να σώσει δύο παραλλαγή κλήσεις, οι οποίες είχαν αποκλειστεί κατά τη διάρκεια του φιλτραρίσματος διεργασίες. Τριάντα εννέα από τα 89 δείγματα (43,8%) παρουσίασαν τουλάχιστον μία μετάλλαξη (Σχήμα 1). Δύο υποθέσεις έδειξε 22 και 5 μεταλλάξεις, αντιστοίχως. Η τελευταία περίπτωση έτρεφε

MLH1

σωματική μετάλλαξη [παρερμηνεύσιμη μετάλλαξη στο εξόνιο 20: c.1147A & gt? G (p.M383 V)] και

MLH1

υπερμεθυλίωση προαγωγού με απώλειες πρωτεΐνη MLH1 από την IHC χρησιμοποιώντας την προηγουμένως περιγραφείσες μεθόδους [23], υποδηλώνοντας υπερμεταλλαχθούν όγκου. Ωστόσο, αν και οι μεταλλάξεις που βρέθηκαν στην πρώτη περίπτωση πέρασε συχνότητα παραλλαγή και την κάλυψη κομμένα οφ, οι εν λόγω μεταλλάξεις δεν επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση Sanger, προτείνοντας ψευδώς θετικά σε αυτή την περίπτωση λόγω της κακής ποιότητας του DNA. Έτσι, η υπόθεση αυτή αποκλείστηκε από την τελική ανάλυση των αποτελεσμάτων. Ανιχνεύεται συχνά σωματικές μεταλλάξεις που περιλαμβάνονται

TP53

(24 περιπτώσεις, 27,0%),

APC

(9 περιπτώσεις, 10,1%),

PIK3CA

(5 περιπτώσεις, 5,6%), %),

KRAS

(3 περιπτώσεις, 3,4%),

ΠΕΑ

(4 περιπτώσεις, 4,5%),

STK11

(3 περιπτώσεις, 3,4%),

CDKN2A

(3 περιπτώσεις, 3,4%), και

Smad4

(3 περιπτώσεις, 3,4%) όπως φαίνεται στον πίνακα 2. Πίνακας 2 συνοψίζονται επίσης τις αλλαγές αμινοξέων σε συχνά μεταλλαγμένα γονίδια. Ταυτοποιήσαμε 19 ασθενείς (21,3%) με δύο ή περισσότερες μοναδικές και ταυτόχρονη σωματικών μεταλλάξεων.

Η

Σε τέσσερις γαστρικό καρκίνο δείγματα με γνωστές συχνότητες μετάλλαξης προσδιορίζεται με αλληλούχηση ολόκληρο exome και επιβεβαιώθηκε με προσδιορισμό της αλληλουχίας του Sanger, εντοπίσαμε σωματικών μεταλλάξεις στο

TP53

,

ErbB4

και

CTNNB1

χωρίς ψευδώς θετικά κλήσεις σε άλλα γονίδια (Πίνακας S3).

ενίσχυση από nCounter και επικύρωση με IHC, FISH ή PCR πραγματικού χρόνου

Ενισχύσεις του

HER2

,

CCNE1

,

MYC

,

KRAS

και

EGFR

γονίδια παρατηρήθηκαν σε 8 (8,9%), 4 (4,5%), 2 (2,2%), 1 (1,1%) και 1 (1,1%) περιπτώσεις, αντίστοιχα (Πίνακας 3). Εμείς δεν τήρησε την ενίσχυση της

ΚΟΑ

,

FGFR2

,

CDK4

και CDK6 σε οποιαδήποτε από τις περιπτώσεις. Σε περιπτώσεις με ενίσχυση, IHC για HER2, EGFR και CCNE1 έδειξε υπερέκφραση των πρωτεϊνών στα κύτταρα του όγκου (Σχήμα 2Α, Β και C). Σε μία περίπτωση με HER2 2+ από HercepTest, FISH έδειξαν ετερογενή ενίσχυση του

HER2

γονίδια (Σχήμα 2D).

Θήκες με αριθμό αντιγράφων αυξήσεις έδειξε ισχυρή θετική για EGFR (Α), CCNE1 ( Β) και HER2 (C). Μια υπόθεση με HER2 2+ με ανοσοϊστοχημεία αποκαλύπτει την ενίσχυση των γονιδίων HER2 στα ψάρια (D).

Η

Σε πραγματικό χρόνο PCR για

KRAS

, μια περίπτωση με ενίσχυση έδειξε αριθμοί αυξήθηκαν αντιγραφής (36, 37 και 49)? στις περιπτώσεις που ήταν αρνητικά για

KRAS

ενίσχυση, δεν υπήρξε αύξηση του αριθμού αντιγράφων (0,9 έως 2,4, σημαίνει 1.4).

Για

ΚΟΑ

γονίδιο, θα βρούμε καμία θετική περίπτωση, λόγω της σπανιότητάς τους [21]. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιείται επιπλέον δέκα (πέντε κάθε ενισχυμένο και μη ενισχυμένο) δείγματα γαστρικού καρκίνου και

MET

ενισχυμένων κυτταρικών γραμμών γαστρικού καρκίνου (ΜΚΝ45 και SNU5) με γνωστούς αριθμούς αντιγράφων και ανέρχεται mRNA. CNVs ανιχνεύεται με nCounter συσχετίζονται καλά με αριθμούς αντιγράφων που εντοπίστηκε με πραγματικού χρόνου PCR (Πίνακας S4) και mRNA επίπεδα

ΜΕΤ

γονίδιο (τεστ συσχέτισης κατά Pearson? R = 0.874, p = 0,001). (Εικόνα S2)

Συζήτηση

με τη χρήση του Ion AmpliSeq v2 βρήκαμε ότι 39 από τους 89 προχωρημένου γαστρικού δείγματα αδενοκαρκινώματος περιέχονται σωματικές μεταλλάξεις, αποδεικνύοντας ότι η πλατφόρμα αυτή μπορεί να εφαρμοστεί εύκολα σε αρχειακό δείγματα ιστών FFPE.

TP53

ήταν η πιο συχνά βρέθηκε μετάλλαξη, ακολουθούμενο από

APC

,

PIK3CA

και

KRAS

. Επιπλέον, έθιμο CNV πάνελ μας ανιχνεύθηκαν με επιτυχία αυξήσεις ΣΟ του

HER2

,

CCNE1

,

MYC

,

EGFR

και

KRAS

γονίδια, τα οποία επιβεβαιώνονται από την IHC και σε πραγματικό χρόνο PCR

μεταλλάξεων συχνότητες στην κοσμική βάση δεδομένων προκύπτει ότι υπάρχουν σημαντικές ομοιότητες με τα δεδομένα που λαμβάνονται από αυτή τη μελέτη:.

TP53

(32%),

PIK3CA

(10%),

KRAS

(6%),

APC

(6%),

CTNNB1

(5%),

CDKN2A

(5%),

FBXW7

(5%),

ΠΕΑ

(4%),

ΕΚΒΒ2

(2%) και

STK11

(2%). Πρόσφατες μελέτες ολόκληρο αλληλούχιση exome για αδενοκαρκίνωμα στομάχου έδειξε κάπως υψηλότερες συχνότητες

ΤΡ53

(36% και 73%) και

PIK3CA

(14% και 20%) σε σύγκριση με μεταλλάξεις αποτελέσματά μας. [24], [25] Αν και οι συχνότητες μετάλλαξης μας ήταν χαμηλότερες σε σύγκριση με exome αποτελέσματα αλληλούχισης, υπήρξε μια σημαντική αύξηση σε σύγκριση με προηγούμενα δεδομένα μας σχετικά με φασματομετρία μάζας με βάση OncoMap V4. [26] Και οι δύο AmpliSeq και OncoMap ανίχνευση μεταλλάξεων σε περιοχές hotspot, το οποίο εξηγεί τα ευρήματα των λιγότερο συχνή μετάλλαξη σε ορισμένα ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια. Εικόνα S1 συγκρίνει AmpliSeq v2 και OncoMap v4 σε ανιχνεύσιμες προφίλ μεταλλάξεων. Προηγούμενες δοκιμές OncoMap σε 237 γαστρικά αδενοκαρκινώματα αποκάλυψε ότι

PIK3CA

μεταλλάξεις ήταν συχνές σε προχωρημένα στάδια της νόσου (5,1% κατά το τρίτο στάδιο IV? 6,4% στο στάδιο II /III? 2,4% κατά το τρίτο στάδιο ΙΒ). [26] Σε αυτήν την μελέτη παρατηρήσαμε τρία

PIK3CA

μεταλλάξεις σε ασθενείς με σταδίου III και δύο στην ασθένεια σταδίου II, υποστηρίζοντας βιολογικός ρόλος τους στην πρόοδο του όγκου. Παρατηρήσαμε επίσης

HER2

(

ΕΚΒΒ2

) c.2524G & gt? Α (V842I) μετάλλαξη σε μια περίπτωση του καρκίνου του στομάχου. Σε προκλινικές μελέτες, κυτταρικές σειρές που φέρει τη μετάλλαξη V842I ήταν ανθεκτικά στην τραστουζουμάμπη, αλλά ήταν ευαίσθητα σε μη αναστρέψιμο αναστολέα HER2, neratinib [27].

αλληλούχιση Semiconductor βασιζόμενη θεμελιώδεις διαφορές στην αίσθηση και τη μεταγωγή σήματος σε σύγκριση με φασματομετρία μάζας -με βάση αλληλουχίας. Αντί της χρησιμοποίησης οπτικών μεθόδων για την ανίχνευση μεταβολών νουκλεοτιδίου, η τεχνική ημιαγωγών με βάση το αντιλαμβάνεται τις αλλαγές του pH από την απελευθέρωση των πρωτονίων (H

+), όταν νουκλεοτίδια ενταχθούν στην αναπτυσσόμενη κλώνου DNA. [8] Ως εκ τούτου, υπάρχει μια σημαντική μείωση του κόστους και του χρόνου που απαιτείται για την επεξεργασία των δεδομένων σε σχέση με άλλες πλατφόρμες NGS. Παρέχοντας γρήγορες και ακριβείς πληροφορίες σχετικά με μεταλλάξεις σε χαμηλό κόστος είναι ζωτικής σημασίας για ασθενείς με εξαιρετικά επιθετικών καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του στομάχου.

Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε χειροκίνητα τις αυτοματοποιημένες κλήσεις σε γνωστές μεταλλάξεις μετά την εφαρμογή τιμών αποκοπής της συχνότητας και την κάλυψη, στη συνέχεια, προσθέτοντας δύο κλήσεις με χαμηλή παραλλαγή κάλυψης. Παρά το γεγονός ότι οι τιμές κάλυψή τους δεν έφτασε την αρχική μας κριτήρια, συχνότητες τους υπερέβαινε το πρώτο μας σκηνικό (6%) και η ποιότητα των δεδομένων ήταν καλή. Αυτό τονίζει τη σημασία του εγχειριδίου επανεξέταση μετά από αυτοματοποιημένο έλεγχο. Πρόσφατα δημοσιεύτηκαν τα αποτελέσματα χρησιμοποιώντας AmpliSeq ως πλατφόρμα ανάλυσης υπογραμμίζουν επίσης την αποζημίωση των δεδομένων του προσυμπτωματικού ελέγχου με αυτόματο έλεγχο [9], [10].

Εξατομικευμένη στοχευμένη θεραπεία για προχωρημένους καρκίνους βασίζεται κυρίως στην έννοια της «ογκογονιδίου εθισμό», σε τα οποία πολλαπλά γενετικές ανωμαλίες εθιστεί σε ένα ή λίγα γονίδια για τη συντήρηση και την επιβίωση των κυττάρων του όγκου. [28] Μια ανοικτή, διεθνή, φάσης 3, τυχαιοποιημένη ελεγχόμενη ToGA (τραστουζουμάμπη για τον Καρκίνο Στομάχι) δοκιμής έδειξε ότι η τραστουζουμάμπη σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία είναι μια νέα βασική επιλογή για ασθενείς με HER2-θετικό προχωρημένο γαστρικό ή γαστρο-οισοφαγική καρκίνο διασταύρωση. [29] Μια προκλινική μελέτη έδειξε ότι ένα υποσύνολο των γαστρικών καρκίνων με

EGFR

ή

ΚΟΑ

ενίσχυση και υπερέκφραση ανταποκριθεί στο cetuximab ή τυροσίνης υποδοχέα θεραπεία με αναστολέα της κινάσης της ΚΟΑ. [30] Επιπλέον, πολλαπλασιασμοί του μεσολαβητή του κυτταρικού κύκλου

CCNE1

υποδεικνύουν το δυναμικό για θεραπευτική αναστολή εξαρτώμενων από κυκλίνη κινασών σε γαστρικούς καρκίνους. [31] Η διαλογή ενισχυμένα γονίδια για στοχευμένη θεραπεία με τεχνολογία υψηλής απόδοσης είναι πολύ σημαντική. Οι παραδοσιακές μέθοδοι όπως τα ψάρια και ποικιλία συγκριτική γονιδιωματική υβριδισμού υποφέρουν από χαμηλή ανάλυση του γονιδιακού περιοχές, το υψηλό κόστος και είναι υπεβλήθησαν και χρονοβόρα. [32] Σε αυτή την πρώτη μελέτη σχετικά με nCounter CNV αναλύσεις, βρήκαμε ότι αυτή η τεχνολογία μπορεί να εφαρμοστεί σε FFPE κλινικά δείγματα και επικύρωσε τα αποτελέσματα από την IHC, FISH και PCR πραγματικού χρόνου. Παρά το γεγονός ότι δεν είχαμε επικυρώσει όλα τα γονίδια που χρησιμοποιούνται στα έθιμο εναύσματα, τα αποτελέσματα της επικύρωσης σε διάφορα επιλεγμένα γονίδια ήταν αξιοσημείωτη.

Εν ολίγοις, έχουμε επιτυχία πραγματοποιήθηκε αλληλουχίας ημιαγωγών που βασίζονται και nCounter CNV αναλύσεις σε δείγματα ιστών FFPE από 89 γαστρικό αδενοκαρκινώματα. αλληλουχίας υψηλής απόδοσης και ελέγχου CNV σε αρχειακό κλινικά δείγματα επιτρέπει την ταχύτερη, πιο ακριβής και αποδοτική ανίχνευση μεταλλάξεων hotspot και CNV στα γονίδια. Στην εποχή της εξατομικευμένης ιατρικής γονιδιωματικής, σχεδιάζουμε να χρησιμοποιήσουμε αυτά τα εργαλεία για την οθόνη για ασθενείς με γαστρικό καρκίνο οι οποίοι μπορούν να επωφεληθούν από στοχευμένες θεραπείες.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Σύγκριση της κάλυψης των ιόντων AmpliSeq v2 πίνακα καρκίνο σε σχέση με Oncomap v4

doi:. 10.1371 /journal.pone.0111693.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

Οικόπεδα συσχέτισης μεταξύ

ΚΟΑ

CNVs ανιχνεύεται από τα επίπεδα nCounter και του mRNA της

ΚΟΑ

γονιδίων με PCR πραγματικού χρόνου

doi:. 10.1371 /journal.pone.0111693.s002

(ΔΕΘ)

πίνακα S1.

Το γονίδιο Λίστα για το Ion Torrent AmpliSeq Panel Καρκίνος

doi:. 10.1371 /journal.pone.0111693.s003

(XLS)

Πίνακας S2.

Οι συγκεντρώσεις του DNA, φορές τη συγκέντρωσή τους, κατά μέσο όρο κάλυψης των δειγμάτων, το συνολικό αριθμό των βάσεων, & gt? βάσεις Ε20, διαβάζει, σημαίνει να διαβάσετε το μήκος, χαρτογραφήθηκαν διαβάζει, on-στόχος για το ποσοστό (%), σημαίνει ότι το βάθος και την ομοιομορφία.

doi: 10.1371 /journal.pone.0111693.s004

(XLS)

πίνακα S3.

Σωματικές μεταλλάξεις στο

TP53

,

ErbB4

και

CTNNB1

Η doi:. 10.1371 /journal.pone.0111693.s005

(XLS)

Πίνακας S4.

CNVs ανιχνεύεται από nCounter συσχετίζονται καλά με τους αριθμούς αντίγραφο που εντοπίστηκε με πραγματικού χρόνου PCR

doi:. 10.1371 /journal.pone.0111693.s006

(XLSX)