Αφηρημένο

Ιστορικό

Μειωμένη χημειοευαισθησία των στερεών καρκινικών κυττάρων αποτελεί καίριο εμπόδιο στην κλινική ογκολογία. Ως εκ τούτου, το μοριακό χαρακτηρισμό των οδών που ρυθμίζουν χημειοευαισθησίας είναι μια κεντρική προϋπόθεση για τη βελτίωση της θεραπείας του καρκίνου. Η υποξία παράγοντα HIF-1α έχει συνδεθεί με χημειοευαισθησία ενώ οι υποκείμενες μοριακοί μηχανισμοί παραμένουν σε μεγάλο βαθμό ασαφείς. Ως εκ τούτου, έχουμε διεξοδικά αναλύεται ο ρόλος του HIF-1α σε καθορισμό χημειοευαισθησία επικεντρώνεται στην υπεύθυνη μοριακών οδών.

Μεθοδολογία και ΚΥΡΙΟΤΕΡΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

RNA παρεμβολής εφαρμόστηκε για την αδρανοποίηση HIF-1α ή ρ53 στον ανθρώπινο καρκίνο του στομάχου κυτταρικές σειρές AGS και ΜΚΝ28. Η χημειοθεραπευτικούς παράγοντες 5-φθοριοουρακίλη και σισπλατίνη χρησιμοποιήθηκαν και χημειοευαισθησία αξιολογήθηκε με δοκιμασίες πολλαπλασιασμού κυττάρου, καθώς και τον προσδιορισμό της κατανομής του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης. Η έκφραση των πρωτεϊνών ρ53 και ρ53 στόχος αναλύθηκε με στύπωμα Western. δραστικότητα ΝΡ-κΒ χαρακτηρίστηκε μέσω ανάλυσης μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας. Η απενεργοποίηση του HIF-1α σε γαστρικό καρκινικά κύτταρα οδήγησε σε ισχυρή ανύψωση της χημειοευαισθησίας. Κατά συνέπεια, ο HIF-1α-ικανά κύτταρα παρουσίασαν σημαντική μείωση του προκαλούμενη από χημειοθεραπεία γήρανση και την απόπτωση. Αξίζει να σημειωθεί ότι, αυτή η φαινότυπος ήταν εντελώς απούσα στο

p53

μεταλλαγμένα κύτταρα, ενώ η αδρανοποίηση του p53

per se

δεν επηρέασε χημειοευαισθησίας. HIF-1α αξιοσημείωτα κατέστειλε προκαλούμενη από χημειοθεραπεία ενεργοποίηση των ρ53 και ρ21, καθώς και την πρωτεΐνη ρετινοβλαστώματος, τελικά οδηγεί σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου. Μειωμένη σχηματισμό δραστικών ειδών οξυγόνου σε HIF-1α-ικανά κύτταρα αναγνωρίστηκε ως το μοριακό μηχανισμό του HIF-1α-διαμεσολαβούμενη αναστολή της ρ53. Επιπλέον, η απώλεια του HIF-1α καταργηθεί, σε ρ53-εξαρτώμενο τρόπο, επαγόμενη από χημειοθεραπεία DNA δέσμευσης του ΝΡ-κΒ και την έκφραση των αντι-αποπτωτικών γονιδίων στόχων NF-κΒ. Κατά συνέπεια, η ανασύσταση της p65 υπομονάδας του NF-κΒ ανέτρεψε την αυξημένη χημειοευαισθησία του HIF-1α-ανεπαρκή κύτταρα.

Συμπέρασμα και τη σημασία

Εν ολίγοις, εντοπίσαμε HIF-1α ως ένας ισχυρός ρυθμιστής της ρ53 και NF-κΒ δραστηριότητα υπό συνθήκες γονοτοξικό στρες. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι

p53

μεταλλάξεις σε ανθρώπινους όγκους κατέχουν τη δυνατότητα να συγχύσει την αποτελεσματικότητα της-1-αναστολείς HIF στη θεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Rohwer Ν, Dame C, Haugstetter Α, Β Wiedenmann , Detjen Κ, Schmitt CA, et al. (2010) προκαλείται από υποξαιμία Factor 1α Καθορίζει γαστρικός καρκίνος χημειοευαισθησία μέσω Διαφοροποίηση των ρ53 και NF-κΒ. PLoS ONE 5 (8): e12038. doi: 10.1371 /journal.pone.0012038

Επιμέλεια: Deb Fox, Το Ινστιτούτο Έρευνας για τα παιδιά στο Νοσοκομείο Παίδων Νέα Ορλεάνη, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 28 Απρίλη 2010? Αποδεκτές: 19 Ιούλη του 2010? Δημοσιεύθηκε: 10 Αυγ, 2010

Copyright: © 2010 Rohwer et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από την Deutsche Forschungsgemeinschaft (https://www.dfg.de) με TC (CR 133 /2-1, 133 /2-2 και 133 /2-3), και NR (Graduiertenkolleg 276/4 – «Signalerkennung und -umsetzung»). TC επίσης υποστηρίζεται από μια επιχορήγηση από το Berliner Krebsgesellschaft e.V. (https://www.berliner-krebsgesellschaft.de, CRFF200804). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ενδογενή και επίκτητη αντίσταση του φαρμάκου είναι οι κύριες αιτίες για περιορισμένη αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας στην πλειοψηφία των γαστρεντερικών κακοηθειών, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του γαστρικού [1], [2]. Η αντοχή στα φάρμακα αντιπροσωπεύει ένα σύνθετο και πολυπαραγοντική φαινομένου που σχετίζεται με μικροπεριβάλλον του όγκου, π.χ. υποξία, οξέωση και φλεγμονή, καθώς και η ίδια η νεοπλασματικών κυττάρων [3]. Cellular αντίσταση μπορεί να είναι συμφυής με το συγκεκριμένο γενετικό υπόβαθρο του κυττάρου όγκου ή προκύπτουν από μεταλλάξεις και επιγενετικές μεταβολές μετά αντιπολλαπλασιαστική θεραπεία [4], [5].

Ο παράγοντας μεταγραφής προκαλείται από υποξαιμία παράγοντα 1 (HIF-1 ) αποτελεί περιστροφική ρυθμιστής της κυτταρικής προσαρμογής στην υποξία και έχει ενοχοποιηθεί σε αντίσταση στο φάρμακο [6] – [8]. Η πρωτεΐνη HIF-1 είναι ένα ετεροδιμερές που αποτελείται από ένα ιδιοσυστατικά εκφραζόμενο β-υπομονάδα (ARNT (αρυλ υδρογονάνθρακα υποδοχέα πυρηνικής μεταθέτη)) και ένα υποξία α-υπομονάδα [9]. Υπό ορθοξικές συνθήκες, η δραστικότητα HIF-1α μπορεί να προκληθεί από διάφορους παράγοντες ανάπτυξης, κυτοκίνες, ενεργοποιημένα ογκογονίδια ή απώλειας λειτουργίας μεταλλαγμένων γονιδίων καταστολής όγκου [10]. HIF-1α είναι κεντρικό ρόλο σε πολλές απόψεις της ογκογένεσης συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του όγκου, αγγειογένεση, μετάσταση, καθώς και την απόκριση σε χημειοθεραπεία και η ακτινοθεραπεία [11]. HIF-1α υπερεκφράζεται σε έναν τεράστιο αριθμό στερεών όγκων, και την έκφραση όγκων HIF-1α συχνά σχετίζεται με φτωχή πρόγνωση [12] – [15]. Επιπλέον, η αναστολή της HIF-1α μέσω παρεμβολής RNA ή φαρμακολογικές ενώσεις έχει αποδειχθεί αντικαρκινική αποτελεσματικότητα σε διάφορα μοντέλα καρκίνου του ποντικού [16]. Μία συνεισφορά του HIF-1α προς χημειοαντίσταση των νεοπλασματικών κυττάρων έχει παρατηρηθεί σε ένα ευρύ φάσμα συμπαγών όγκων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του γαστρικού [6] – [8], [17] – [20]. Ωστόσο, οι υποκείμενες μοριακοί μηχανισμοί, καθώς και ο ρόλος της HIF-1α για αντοχή φαρμάκου υπό νορμοξικές συνθήκες παραμένουν σε μεγάλο βαθμό ασαφείς [8], [18], [21]. Εδώ, έχουμε εντοπίσει καταστολή της ρ53 και της προώθησης των πυρηνικού παράγοντα κΒ (ΝΡ-κΒ) δραστηριότητα ως κεντρικό μηχανισμών για HIF-1α είναι η ευαισθησία-καθοριστικό ρόλο κατά του 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) και σισπλατίνη σε ανθρώπινο γαστρικό καρκινικά κύτταρα.

Αποτελέσματα

HIF-1α καθορίζει την ευαισθησία του γαστρικού καρκίνου κυττάρων έναντι των χημειοθεραπευτικών παραγόντων 5-FU και σισπλατίνη

λειτουργική απενεργοποίηση του HIF-1α επιτεύχθηκε με λεντοϊού μεταγωγή του AGS και κύτταρα ΜΚΝ28 με μικρά RNA παρεμβολής (siRNA) που στοχεύουν ειδικά HIF-1α. Αυτή η πειραματική προσέγγιση απέδωσε ένα πολύ αποδοτικό knockdown αποδεικνύεται από μια σχεδόν πλήρη αποτυχία του μετατραπέντων κυττάρων για την επαγωγή HIF-1α πρωτεΐνη σε απόκριση σε υποξία όπως δημοσιεύθηκε προηγουμένως [22]. Για να αξιολογηθεί η σημασία του HIF-1α για την ευαισθησία του ανθρώπινου γαστρικού καρκινικών κυττάρων προς εγκατεστημένος χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, συγκρίναμε τις επιδράσεις των 5-FU και σισπλατίνης σε HIF-1α-αρμοδίων (ομελέτα, «SCR») και HIF-1α με ανεπάρκεια (νοκ ντάουν, «KD») AGS κύτταρα. Λειτουργική απενεργοποίηση του HIF-1α μετατόπισε τη δόση εξάρτηση της αναστολής της ανάπτυξης προς χαμηλότερες συγκεντρώσεις του φαρμάκου (Σχήμα 1Α και το Σχήμα S1), γεγονός που υποδηλώνει ότι ο HIF-1α είναι ικανό να μειώσει τη χημειοθεραπεία επιδεκτικότητα του γαστρικού καρκίνου κυττάρων υπό νορμοξικές συνθήκες. Σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές [6] – [8], [17], [18], η έκθεση σε υποξία αυξημένη αντοχή σε 5-FU σε AGS κύτταρα, ωστόσο αδρανοποίηση του HIF-1α οδήγησε σε ισχυρή ανύψωση της χημειοευαισθησίας υπό υποξικές συνθήκες ( Εικόνα S2). Σε μία συμπληρωματική προσέγγιση, μελετήσαμε τις συνέπειες της υπερεκφράζουν HIF-1α (ροϋΝΑ HIF-1α) για την χημειοευαισθησία των κυττάρων AGS. κύτταρα που υπερεκφράζουν AGS HIF-1α ήταν σημαντικά πιο ανθεκτικά στην θεραπεία με 5-FU (Σχήμα 1Β). Η σταθερή έκφραση του HIF-1α επιβεβαιώθηκε με HRE (υποξία στοιχείο ανταποκρινόμενο) δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης (Σχήμα 1 C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα ότι HIF-1α περιορίζει την κυτταροτοξική δράση του 5-FU και σισπλατίνη σε ανθρώπινο γαστρικό καρκινικά κύτταρα και ότι η απενεργοποίηση του HIF-1α μπορεί να έχουν ευεργετικά αποτελέσματα στην χημειοευαισθησίας.

(Α) Πολλαπλασιασμός AGS KD και τα κύτταρα SCR 24 ώρες μετά την θεραπεία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις της 5-FU κάτω από νορμοξικές συνθήκες. Οι αριθμοί των κυττάρων εμφανίζονται ως ποσοστό των μη επεξεργασμένων κυττάρων (*,

P

& lt? 0,05? **,

P

& lt? 0,01). (Β) AGS κύτταρα άγριου τύπου επιμολύνθηκαν με φορέα HIF-1α έκφρασης (ροϋΝΑ HIF-1α) ή κενού φορέα (pcDNA 3.1) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 5-FU 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Οι αριθμοί των κυττάρων προσδιορίστηκαν 24 ώρες μετά την αγωγή με 5-FU, και παρουσιάζονται ως επί τοις εκατό των μη κατεργασμένων κυττάρων ελέγχου (**

P

& lt? 0,01). κύτταρα (C) άγριου τύπου AGS συν-επιμολύνθηκαν με είτε pcDNA HIF-1α ή pcDNA 3.1 συν HRE-λουσιφεράσης ανταποκριτής (pHRE-Luc) και

Renilla

ρεπόρτερ (phRL-null) ως εσωτερικού ελέγχου. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. δραστικότητα λουσιφεράσης HRE, κανονικοποιημένη για

Renilla

δραστικότητα λουσιφεράσης, εκφράστηκε σε σχέση με εκείνη των κυττάρων ελέγχου επιμολυσμένα (***

P

& lt? 0.001).

Η

όρια HIF-1α χημειοθεραπεία που προκαλείται διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης μέσω της καταστολής της p53

Ξεκινήσαμε μια χαρακτηρισμό της παρατηρούμενης αναστολής της ανάπτυξης με την ανάλυση πρότυπα κατανομής του κυτταρικού κύκλου μετά από χημειοθεραπεία. G

1-συγχρονισμένα, AGS κύτταρα στερούνται ορού απελευθερώθηκαν από το G

0 /G

1 φάση με προσθήκη προφίλ κυτταρικού κύκλου ορού και προσδιορίστηκαν μετά την προσθήκη του 5-FU. Κυκλοφόρησε καλλιέργειες χωρίς θεραπεία AGS προχώρησε άμεσα διαμέσου G

1 σε S και G

2 /M φάσεις [22], ενώ 5-FU-επεξεργασμένα κύτταρα παρέμειναν σε G

1 φάση (δεν φαίνεται). Είναι ενδιαφέρον ότι η 5-FU-εξαρτώμενη διατήρηση των κυττάρων σε G

1 φάση σημαντικά επαυξημένη σε AGS KD σύγκριση με κύτταρα AGS SCR, συνεπής με G

1 κύτταρο διακοπή κύκλου (Σχήμα 2Α). Η μη αναστρέψιμη διακοπή του κυτταρικού κύκλου έχει αναδειχθεί ως ένα σημαντικό τρόπο δράσεως των αντιπολλαπλασιαστικών παραγόντων και χαρακτηρίζεται από την κυτταρική χαρακτηριστικά του γηρασμού [7], [23]. Κατά συνέπεια, το κλάσμα των γηρασμένων κυττάρων προσδιορίστηκε. Πράγματι, η θεραπεία με 5-FU οδήγησε σε ισχυρή επαγωγή της γήρανσης σε AGS κύτταρα. Αυτή η απόκριση ήταν σημαντικά αυξημένη σε κύτταρα με ταυτόχρονη απώλεια του HIF-1α (Εικόνα 2Β). Επιπλέον, επαγωγή απόπτωσης προτάθηκε από μία αυξημένη προ G

1 κλάσμα σε ιστογράμματα DNA του 5-FU-κατεργασμένων κυττάρων AGS KD (δεν φαίνεται). Ως εκ τούτου, μια ποσοτική ανάλυση του κλάσματος αποπτωτικού κυτταρικού λήφθηκε με βάση την ανίχνευση του διασπασμένη κασπάση-3 (Σχήμα 2C). Σε συμφωνία με τα δεδομένα σχετικά με την κατανομή του κυτταρικού κύκλου, ο 5-FU επαγόμενη αποπτωτικά κλάσμα ήταν σημαντικά αυξημένη σε HIF-1α-ανεπαρκή κύτταρα AGS KD σε σύγκριση με HIF-1α-ικανά κύτταρα.

(Α) AGS KD και τα κύτταρα SCR έλαβαν θεραπεία για 24 ώρες με 10 μg /ml 5-FU, και διανομή του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με ανάλυση FACS (**

P

& lt? 0,01). (Β) Χημειοθεραπεία προκαλούμενη γήρανση προσδιορίστηκε ποσοτικά στα κύτταρα AGS KD και SCR 4 ημέρες μετά την αγωγή με 5-FU με μέτρηση της δράσης β-SA-Gal (**

P

& lt? 0,01). (Γ) AGS KD και SCR κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 48 ώρες με 10 μg /ml 5-FU και η απόπτωση ποσοστώθηκε με βάση την ανίχνευση δραστικής κασπάσης-3 με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής (**

P

& lt? 0,01 ). (D) Αντιπροσωπευτική ανάλυση ανοσοστυπώματος των ρ53, ρ21, CDK2, κυκλίνη Α και τα επίπεδα πρωτεΐνης pRb σε AGS KD και κυττάρων SCR σε επεξεργασία με 10 μg /ml 5-FU για 6 και 24 ώρες. Ακτίνης χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης. ppRb, φωσφορυλιωμένη pRb.

Η

Η χημειοθεραπεία που προκαλείται από τη γήρανση και την απόπτωση τόσο έχουν άρρηκτα συνδεδεμένη με το ογκοκατασταλτικό

p53

. Έτσι, υποθέσαμε ότι η ρ53 μπορεί να συνεισφέρει στην επαυξημένη κυτταροτοξικότητα της 5-FU κατά την απώλεια του HIF-1α. Μετά την επεξεργασία 5-FU, πρωτεΐνη ρ53 σταδιακά συσσωρεύεται στο AGS κύτταρα, ένα αποτέλεσμα που ήταν εντυπωσιακά ενισχυμένη σε AGS κύτταρα HIF-1α-ανεπαρκή (Σχήμα 2D). Αυτή η σταθεροποίηση της ρ53 σχετίζεται με αυξημένα επίπεδα της ρ21 κυκλίνη εξαρτώμενη κινάση (ΟϋΚ) αναστολέα, ένα καθιερωμένο μεταγραφικό στόχο και καθοδικός τελεστής της ρ53 με λειτουργίες σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου, επαγωγή γήρανση και την απόπτωση (Σχήμα 2D). Και πάλι, AGS κύτταρα HIF-1α με ανεπάρκεια έδειξε μία αξιοσημείωτα μεγαλύτερη αύξηση σε ρ21 από AGS κύτταρα HIF-1α-καλά. Ισχυρή επαγωγή του ρ21 αναμένεται να αναστέλλουν τη δράση του G

1 κυκλίνης /CDK συμπλοκών, με αποτέλεσμα hypophosphorylation πρωτεΐνης ρετινοβλαστώματος (pRb), και αποτυχία να επάγουν κυκλίνες φάση S, π.χ. κυκλίνη Α Πράγματι, τόσο pRb hypophosphorylation και μειωμένα επίπεδα κυκλίνης Α επιβεβαιώθηκαν σε 5-FU-κατεργασμένα κύτταρα AGS KD και – σε μικρότερο βαθμό – επίσης σε AGS κύτταρα SCR (Σχήμα 2D). Οι αλλαγές αυτές επιβεβαιώνουν την κατακράτηση G

1 φάση παρατηρήθηκε σε ιστογράμματα DNA και είναι συνεπής με την μη αναστρέψιμη G

1 σύλληψης που παρατηρείται σε προκαλούμενη από χημειοθεραπεία γήρανση. Έτσι, οι διαφορετικές βιολογικές αποτελέσματα της θεραπείας 5-FU σε HIF-1α με ανεπάρκεια και -proficient AGS κύτταρα προκύψουν από διαφορική ρύθμιση της ρ53 και ρ21 κατάντη στόχου της.

Η απενεργοποίηση του ρ53 αμβλύνει το ρόλο του HIF-1α για χημειοευαισθησία

για να αποκτήσετε πειραματικές αποδείξεις για το προτεινόμενο ρόλο της p53 σε HIF-1α-μεσολάβηση ρύθμιση των χημειοευαισθησίας στα κύτταρα AGS, έχουμε λειτουργικά αδρανοποιημένο p53 από την RNA παρεμβολής χρησιμοποιώντας παροδική επιμόλυνση των αντι-p53 siRNA (si p53) , ή μια ομελέτα ελέγχου siRNA (si SCR). P53 ήταν αποτελεσματικά χτυπήθηκε κάτω, όπως υποδεικνύεται από την αποτυχία των επιμολυσμένων κυττάρων για την επαγωγή της τελεστές ρ53 ρ21 και ΜΌΜ2 σε απόκριση σε 5-FU κατεργασία (Σχήμα 3Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, τα κύτταρα AGS KD επιμολυσμένα με si p53 ήταν σημαντικά λιγότερο ευαίσθητα στην αναστολή της ανάπτυξης από την 5-FU από κύτταρα AGS KD επιμολυσμένα με έλεγχο siRNA (Σχήμα 3Β). Σε συμφωνία με αυτά τα ευρήματα, G κατακράτηση κύκλος

1 κύτταρο και την απόπτωση του 5-FU-επεξεργασμένα κύτταρα AGS KD μειώθηκαν κατά p53 knockdown σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με έλεγχο siRNA (Σχήμα 3D και 3Ε). Σε έντονη αντίθεση, χημειοευαισθησία του AGS κυττάρων HIF-1α-καλά δεν επηρεάστηκε από απενεργοποίηση του ρ53 (Σχήμα 3C).

AGS κύτταρα επιμολύνθηκαν με έλεγχο siRNA (si SCR) ή siRNA έναντι ρ53 (ρ53 si) και 10 μg /ml 5-FU προστέθηκε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. (Α) Ανάλυση ανοσοκηλίδας για ρ53, ρ21 και ΜΌΜ2 σε ολόκληρου κυττάρου εκχυλίσματα από κύτταρα AGS KD μετά τη θεραπεία 5-FU. Ακτίνης χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β και Γ) Οι αριθμοί των κυττάρων του si SCR και si p53 επιμολυσμένα κύτταρα AGS προσδιορίστηκε 24 ώρες μετά την αγωγή με 5-FU. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως επί τοις εκατό των μη κατεργασμένων κυττάρων ελέγχου (**

P

& lt? 0,01). Τα κύτταρα στο G

1 φάση (D) και τοπεριοχής G

1 πληθυσμού (Ε) εκτιμήθηκαν από το DNA ιστογράμματα των κυττάρων AGS KD επιμολυσμένα με si ρ53 ή si SCR και θεραπεία για 24 ώρες με 5-FU ( *,

P

& lt? 0,05? **,

P

& lt?. 0.01)

Η

HIF-1α αποτυγχάνει να επηρεάσει χημειοευαισθησία στο

p53

μεταλλαγμένα κύτταρα

για την επιβεβαίωση της HIF-1α-εξαρτώμενη ρύθμιση της 5-FU ανταπόκριση και να χαρακτηρίσει περαιτέρω τη συμβολή της p53, εξετάσαμε μια δεύτερη ανθρώπινη γαστρικού καρκίνου κυτταρική σειρά (ΜΚΝ28), το οποίο μεταφέρει ένα παρερμηνεύσιμη μετάλλαξη στο

ΤΡ53

στο κωδικόνιο 251. Είναι ενδιαφέρον, διαγραφή του HIF-1α σε ΜΚΝ28 κύτταρα απέτυχαν να ενισχύσουν την αναστολή της ανάπτυξης μετά από έκθεση σε 5-FU (Σχήμα 4Α). Παρομοίως, 5-FU-επαγόμενη G

1 συσσώρευση και την απόπτωση των κυττάρων ΜΚΝ28 δεν επηρεάστηκαν από την απώλεια του HIF-1α (Σχήμα 4Β και 4C). Σύμφωνα με αυτά τα ευρήματα, τα επίπεδα πρωτεΐνης ρ53 και pRb παρέμεινε αμετάβλητη σε 5-FU-επεξεργασμένα κύτταρα ΜΚΝ28 όλη τη διάρκεια της περιόδου από 24 ώρες, και επαγωγή ρ21 απουσίαζε (Σχήμα 4D). Ωστόσο, όταν η λειτουργία ρ53 αποκαταστάθηκε με προκατεργασία με τη χημική ένωση PRIMA-1 [24] HIF-1α knockdown μεταφράζεται σε σημαντικά ενισχυμένη 5-FU κυτταροτοξικότητα (Εικόνα S3). Συνεπής με την καθιερωμένη ρόλο της ρ53 σε προκαλούμενη από χημειοθεραπεία κυτταροτοξικά /κυτταροστατικά αποτελέσματα, η θεραπεία με PRIMA-1

per se

μείωσε ελαφρώς τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ΜΚΝ28 και ενίσχυσε σημαντικά την αποτελεσματικότητα της 5-FU σε ΜΚΝ28 κύτταρα (Σχήμα S3).

(Α) Οι αριθμοί των κυττάρων του ΜΚΝ28 KD και κυττάρων SCR 24 ώρες μετά την αγωγή με 5-FU κάτω από νορμοξικές συνθήκες. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως επί τοις εκατό των μη κατεργασμένων κυττάρων. Κύτταρα σε G

1 φάση (Β) και τα αποπτωτικά κύτταρα (C) ποσοτικοποιήθηκαν από το DNA ιστογράμματα ΜΚΝ28 KD και κυττάρων SCR αγωγή για 48 ώρες με 10 μg /ml 5-FU. (Δ) Ανάλυση ανοσοστυπώματος του ρ53, ρ21 και τα επίπεδα πρωτεΐνης pRb σε ΜΚΝ28 KD και κυττάρων SCR σε επεξεργασία με 10 μg /ml 5-FU για 6 και 24 ώρες. Actin χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

ΝΡ-κΒ είναι ένας σημαντικός μεσολαβητής του ρόλου HIF-1α σε χημειοευαισθησία

Η ενεργοποίηση του NF-κΒ συνδέεται με προστασία από προκαλούμενη από χημειοθεραπεία απόπτωσης και αντίστροφα, η αναστολή της NF-κΒ μπορεί να ενισχύσει την αποτελεσματικότητα των αντι-νεοπλασματικών παραγόντων, τόσο

in vivo

και

in vitro

[25] – [27]. Ως εκ τούτου, προσδιορίστηκε δραστικότητα ΝΡ-κΒ δέσμευσης DNA σε HIF-1α με ανεπάρκεια και -proficient AGS κύτταρα μετά από θεραπεία με 5-FU με δοκιμασία μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας (EMSA). Η θεραπεία με 5-FU ισχυρά ενεργοποιημένο ΝΡ-κΒ δέσμευσης DNA σε κύτταρα AGS SCR, με επίπεδα κορυφής επιτυγχάνεται 6 ώρες μετά την έκθεση σε 5-FU (Σχήμα 5Α). Η θεραπεία με ΤΝΡα για 4 ώρες χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος για την ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ. Επιπλέον, υπερμετατόπισης προκλήθηκε από ένα αντίσωμα αντι-ρ65, επιβεβαιώνοντας ότι η 5-FU που επάγεται σύμπλοκα ΝΡ-κΒ περιείχε την υπομονάδα 65 kDa (ρ65). Απώλεια του HIF-1α ανέστειλε σημαντικά την ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ σε απόκριση σε 5-FU και TNFa (Σχήμα 5Α). Συνεπής με αυτήν την παρατήρηση, 5-FU θεραπεία απέτυχε επίσης να επάγει τα γονίδια-στόχους ΝΡ-κΒ cIAP1 και Α20 σε κύτταρα AGS KD, ενώ είχαν εύκολα επάγεται σε κύτταρα AGS SCR (Σχήμα 5Β).

(Α) Πυρηνικά εκχυλίσματα των κυττάρων AGS KD και SCR παρασκευάστηκαν στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία μετά τη θεραπεία με 10 μg /ml 5-FU ή TNFa ως θετικός έλεγχος, και η δραστικότητα δέσμευσης DNA για ΝΡ-κΒ εξετάστηκε με EMSA. Για πειράματα υπερμετατόπισης, πυρηνικά εκχυλίσματα επωάστηκαν με αντίσωμα αντι-ρ65. (Β) Έκφραση του ΝΡ-κΒ γονιδίων στόχων cIAP1 και Α20 mRNA σε ολικό RNA εκχυλίσματα από κύτταρα AGS KD και AGS SCR 48 ώρες μετά την αγωγή με 10 μg /ml 5-FU. Τα δεδομένα εκφράστηκαν σε σχέση με τα επίπεδα του mRNA σε μη επεξεργασμένα κύτταρα AGS SCR, ορίζεται σε 1,0 (*,

P

& lt? 0,05? **,

P

& lt? 0,01). κύτταρα (C) AGS KD συν-επιμολύνθηκαν με είτε pcDNA p65 ή pcDNA 3.1 και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 5-FU 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Οι αριθμοί των κυττάρων μετά άλλες 24 ώρες και παρουσιάζονται ως επί τοις εκατό των μη κατεργασμένων κυττάρων ελέγχου (***

P

& lt? 0.001). (D) δραστικότητα δέσμευσης DNA για ΝΡ-κΒ εξετάστηκε με EMSA χρησιμοποιώντας πυρηνικά εκχυλίσματα από ΜΚΝ28 KD και κυττάρων SCR σε επεξεργασία με 10 μg /ml 5-FU ή TNFa για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. αναστολή αντισωμάτων διεξήχθη με ένα αντίσωμα αντι-ρ65.

Η

Για να αντιμετωπιστεί η λειτουργική σημασία του ΝΡ-κΒ για 5-FU-επαγόμενη αναστολή της ανάπτυξης, υπερεκφράσαμε ρ65 (ροϋΝΑ ρ65) σε κύτταρα AGS KD. Η επιμόλυνση του pcDNA p65, αλλά όχι το άδειο φορέα ελέγχου, οδήγησε σε σημαντική επαγωγή πρωτεΐνης ρ65 και μεταγραφική δραστικότητα ΝΡ-κΒ σε κύτταρα AGS KD (Σχήμα S4). Αξίζει να σημειωθεί ότι, ο HIF-1α-ανεπαρκή κύτταρα AGS KD υπερεκφράζουν p65 ήταν σημαντικά πιο ανθεκτικά στην θεραπεία 5-FU σε σύγκριση με κύτταρα AGS KD επιμολυσμένα με τον φορέα ελέγχου (Σχήμα 5C), σύμφωνα με ένα ουσιαστικό ρόλο του ΝΡ-κΒ στην μεσολάβηση χημειοαντίσταση προς 5-FU σε γαστρικό καρκινικά κύτταρα. Στο σύνολό τους, μια ταυτόχρονη ενεργοποίηση της ρ53 και αναστολή του ΝΡ-κΒ σε 5-FU-θεραπεία, παρατηρήθηκε AGS κύτταρα HIF-1α-ανεπαρκή. Για να διευκρινιστεί, αν οι δύο εκδηλώσεις είναι αλληλοεξαρτώμενες, μελετήσαμε 5-FU-επαγόμενη ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ σε κύτταρα ΜΚΝ28 με μεταλλαγμένο

ρ53.

Δύο 5-FU και TNFa ενεργοποιημένων ΝΡ-κΒ δέσμευσης DNA σε ένα χρονικό εξαρτώμενο τρόπο, υποδεικνύοντας ρ53-ανεξάρτητοι μηχανισμοί της ενεργοποίησης του ΝΡ-κΒ από την 5-FU (Σχήμα 5D). Ωστόσο, διαφορετική από την διαπίστωση AGS κύτταρα, αυτή η ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ στο

p53

μεταλλαγμένη κυτταρική γραμμή δεν αμβλύνθηκε με HIF-1α αδρανοποίηση. Ετσι, ο HIF-1α μπορεί να υποστηρίξει προκαλούμενη από χημειοθεραπεία ενεργοποίηση ΝΡ-κΒ με εξουδετέρωση ανασταλτική μηχανισμούς ρ53-εξαρτώμενη.

Altered σχηματισμό ROS είναι υπεύθυνη για HIF-1α-επαγόμενη τροποποίηση της δραστηριότητας ρ53

Για αποσαφήνιση του μηχανισμού υποκείμενου υπερεπαγωγή μοριακό ρ53 σε 5-FU κατεργασία HIF-1α-ανεπαρκή κύτταρα, χαρακτηρίσαμε το ρόλο των αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS). ROS αποτελούν έναν υποψήφιο συνδέσμου ως (i) ROS είναι ισχυροί ενεργοποιητές της λειτουργίας ρ53 και θεωρούνται βασικοί παράγοντες για την επαγωγή ρ53 από διάφορους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες [28], και (ii) HIF-1α μπορεί να καταστείλει την παραγωγή ROS μειώνοντας την μιτοχονδριακή δραστηριότητα και βιογένεση [22], [29], [30]. Κατά συνέπεια, τα κύτταρα AGS KD προκατεργάστηκαν με το χλωρίδιο ROS-αναστολείς diphenyleneiodonium (DPI) ή αποκυνίνης. Και οι δύο αναστολείς που ανατίθενται σημαντική προστασία έναντι της 5-FU-επαγόμενη αναστολή της ανάπτυξης σε κύτταρα AGS KD (Σχήμα 6Α και 6Β). Επιπλέον, DPI και αποκυνίνη εμπόδισε σχεδόν πλήρως την επαγωγή ρ53 και ρ21 κατάντη στόχος της σε 5-FU-επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 6C και 6D). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν μια διασταύρωση της σηματοδότησης HIF-1α με το ρ53-διαμεσολαβούμενη απόκριση σε 5-FU στο επίπεδο της παραγωγής ROS. Προκειμένου να δημιουργηθεί μια αιτιώδη ρόλο του HIF-1α για το δυναμικό οξειδοαναγωγής της AGS κυττάρων μετά από θεραπεία 5-FU, ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS προσδιορίστηκαν σε κύτταρα AGS KD και SCR με κυτταρομετρία ροής. Βρήκαμε ότι τα ενδοκυτταρικά επίπεδα υπεροξειδίου σε 5-FU-κατεργασμένων κυττάρων AGS KD ήταν 2.5 φορές υψηλότερα από εκείνα σε 5-FU-κατεργασμένων κυττάρων AGS SCR (Σχήμα S5), υποδεικνύοντας ότι η λειτουργική απενεργοποίηση του HIF-1α σε κύτταρα AGS οδήγησε σε σημαντική και λειτουργική ανύψωση του ενδοκυτταρικού οξειδωτικού στρες ακόμη και κάτω από χημειοθεραπευτική αγωγή.

(Α-Δ) κύτταρα AGS KD προκατεργάστηκαν για 16 ώρες με διαφορετικές συγκεντρώσεις των αναστολέων της οξειδάσης του ΝΑϋΡΗ diphenyleneiodonium (DPI) ή αποκυνίνης. Ο πολλαπλασιασμός των DPI προεπεξεργασμένων (Α) ή αποκυνίνης προεπεξεργασμένων (Β) κύτταρα AGS KD 24 ώρες μετά την αγωγή με 10 μg /ml 5-FU κάτω από νορμοξικές συνθήκες (***

P

& lt? 0.001). Οι αριθμοί των κυττάρων παρουσιάζονται ως επί τοις εκατό των μη κατεργασμένων κυττάρων. (C και D) Η επίδραση της DPI (C) και αποκυνίνης (D) στα επίπεδα της πρωτεΐνης ρ53 και ρ21 προσδιορίστηκε με ανάλυση ανοσοαποτύπωσης χρησιμοποιώντας ολόκληρα κυτταρικά εκχυλίσματα των κυττάρων AGS KD θεραπεία για 24 ώρες με 10 μg /ml 5-FU. (Ε) Προτεινόμενο μοντέλο για HIF-1-εξαρτώμενη ρύθμιση της χημειοευαισθησία από ROS που προκαλείται διαμόρφωση της p53. (Αριστερό πάνελ) Χημειοθεραπεία επαγόμενη απόκριση σε HIF-1-ικανά κύτταρα. HIF-1 εξουδετερώνει γενιά των ROS στο μιτοχονδριακό επίπεδο. Μειωμένα επίπεδα ROS στην ενεργοποίηση σειρά του Abate των p53 και επιτρέπουν την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, παρά τη χημειοθεραπεία. Ως εκ τούτου, HIF-1-ικανά κύτταρα εμφανίζουν μια πιο χημειοθεραπεία φαινότυπο. Ub, ουβικιτίνης? P, φωσφορικό. (Δεξί πάνελ) Χημειοθεραπεία επαγόμενη απόκριση σε HIF-1 ελλειμματικών κυττάρων. Η αδρανοποίηση του HIF 1-οδηγεί σε επιταχυνόμενη μιτοχονδριακή παραγωγή ROS. ROS είναι ισχυροί επαγωγείς του p53 δίνοντας έτσι ώθηση στην ενεργοποίηση της p53 από χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Ρ53 με τη σειρά διαενεργοποιεί -μεταξύ άλλων – ο εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάση (ΟϋΚ) αναστολέα ρ21 και αναστέλλει τη δράση του NF-κΒ. Η συνδυασμένη ενεργοποίηση των ρ53 και αναστολή του NF-κΒ, να οδηγήσει σε απόπτωση ή /και γήρανση του HIF-1 ελλειμματικών κυττάρων, ως εκ τούτου, μια πιο χημειοευαίσθητων φαινότυπο.

Η

Συζήτηση

Η παράγοντα μεταγραφής HIF-1α έχει καθιερωθεί ως σημαντικός μεσολαβητής της υποξίας μεσολάβηση χημειοαντίσταση [6] – [8], [17], [18], [20]. Εδώ, έχουμε εντοπίσει HIF-1α ως ένα ισχυρό καθοριστικό παράγοντα της χημειοευαισθησία στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα κάτω από ορθοξικές συνθήκες. Με την εφαρμογή ενός συστήματος siRNA lentivirus που βασίζεται εμείς δείχνουν σημαντικά ενισχυμένη 5-FU και σισπλατίνη τοξικότητα σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα HIF-1α-ανεπαρκή. Τα διαθέσιμα δεδομένα σχετικά με το ρόλο του HIF-1α για την χημειοευαισθησία των καρκινικών κυττάρων υπό συνθήκες ορθοξικές αντικρουόμενες. Ενώ HIF-1α ανεπάρκεια ινοσαρκώματος κύτταρα (ΗΤ1080) εμφάνισαν σημαντικά αυξημένη ευαισθησία προς ετοποσίδη κάτω από τον ατμοσφαιρικό αέρα, καρκίνου του παχέος εντέρου (HCT116) και ηπατώματος (Hepa-1) κύτταρα απέτυχαν να το πράξουν [6]. Unruh

et al.

Αναφερθεί αυξημένη ευαισθησία του HIF-1α-ανεπαρκή εμβρυϊκών ινοβλαστών ποντικού σε καρβοπλατίνη ή ετοποσίδη υπό ορθοξικές καθώς και υποξικές συνθήκες [8]. Όσον αφορά τον καρκίνο του στομάχου, του αυξημένη αποτελεσματικότητα της 5-FU και βινκριστίνη καταδείχθηκε υπό φυσιολογική οξυγόνωση

in vitro

[18]. Λοιπόν, σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας, οι δύο μελέτες κατέληξαν στο συμπέρασμα καίριο ρόλο για την HIF-1α στη μεσολάβηση χημειοαντίσταση κάτω ορθοξικές συνθήκες. Είναι ενδιαφέρον ότι μία πρόσφατη μελέτη από την Ιαπωνία έδειξε χαμηλότερη αποτελεσματικότητα της 5-FU χημειοθεραπεία με βάση σε HIF-1α που εκφράζουν ανθρώπινο γαστρικό αδενοκαρκίνωμα, ενισχύοντας την αντίληψη του HIF-1 ως κεντρικό παράγοντα στον προσδιορισμό της γαστρικής χημειοαντίσταση του καρκίνου [31].

Έλεγχος της εξέλιξης του καρκίνου με χημειοθεραπεία στηρίζεται τουλάχιστον εν μέρει στην επαγωγή της κυτταρικής γήρανσης. Πρόσφατα, η απώλεια του HIF-1α δείχθηκε να προκαλέσει πρόωρη γήρανση του αθανατοποιημένων ινοβλαστών ποντικού εμβρυϊκών υπό νορμοξικές συνθήκες [32]. τρέχοντα δεδομένα μας δείχνουν ότι HIF-1α φυλάει παρομοίως γαστρικά καρκινικά κύτταρα έναντι της επαγόμενης από χημειοθεραπεία γηρασμό υπό νορμοξικές συνθήκες. Αυτό συνιστά την πρώτη έκθεση του αυξημένα προκαλούμενη από χημειοθεραπεία γηρασμό μέσω λειτουργική απενεργοποίηση του HIF-1α σε μια καθιερωμένη ανθρώπινη καρκινική κυτταρική σειρά. Σε HIF-1α-ανεπαρκή κύτταρα, έχουμε επίσης παρατηρήθηκε βελτιωμένη επαγωγή της απόπτωσης σε απόκριση σε 5-FU. Προηγούμενες μελέτες ανέφεραν επανενεργοποίηση της προαποπτωτικών παράγοντα Bid [6], ή μια αλλαγή στην ισορροπία των θετικών και αντιαποπτωτικών μέλη οικογένειας Bcl-2 για να αντιπροσωπεύουν αυξημένα ποσοστά απόπτωσης μετά την απενεργοποίηση του HIF-1α σε γαστρικό φάρμακα καρκινικών κυττάρων σε επεξεργασία [ ,,,0],. 18]

τρέχουσα μελέτη μας προσδιορίζει ένα νέο μηχανισμό, όπου HIF-1α εξουδετερώνει τόσο προκαλούμενη από χημειοθεραπεία γήρανση και την απόπτωση: παρουσιάζουμε αποδεικτικά στοιχεία για τη δυναμικότητα του HIF-1α για να καταστείλει την επαγωγή του όγκου καταστολέα ρ53 σε απόκριση σε 5-FU κάτω από νορμοξικές συνθήκες. Ρ53 είναι ένα κεντρικό κύτταρο μοίρα καθοριστικός λόγω του ρόλου της στην ρύθμιση της προόδου του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης σε απόκριση προς κυτταρικό στρες και αποτελεί το πιο συχνά μεταλλαγμένο γονίδιο σε ανθρώπινους καρκίνους [33]. Μια ευρεία ποικιλία χημειοθεραπευτικών παραγόντων έδειξαν να σταθεροποιηθούν ρ53 και, αντιστρόφως, η απώλεια της ρ53 συνιστά κύριος μηχανισμός αντοχής του καρκίνου προς χημειοθεραπεία [33], [34]. Η αλληλεπίδραση της ρ53 και HIF-1α έχει αποτελέσει αντικείμενο της μακροχρόνιας συζητήσεων ως έχουν τόσο θετικές όσο και αρνητικές εκθέσεις έχουν δημοσιευθεί [35]. Ωστόσο, το σύνολο του προηγουμένως δημοσιευθείσα εργασία εστιάστηκε στην ρ53-HIF-1α-αλληλεπιδράσεις υπό υποξικές (ή ακόμη και ανοξικές) συνθήκες. Για το καλύτερο της γνώσης μας, τα πειράματα μας για πρώτη φορά παρέχει αποδεικτικά στοιχεία για την καταστολή της δραστηριότητας ρ53 από HIF-1α κάτω ορθοξικές συνθήκες. Ως συνέπεια της ρ53 ρύθμιση προς τα άνω σε HIF-1α-ανεπαρκή κύτταρα, παρατηρήσαμε αλλαγές στην κατάντη επενεργητές που συνδέονται με την μη αναστρέψιμη χαρακτηριστικό διακοπή του κυτταρικού κύκλου γήρανσης, π.χ. σταθεροποίηση p21 και hypophosphorylation της pRb. Διαφορετική από την παρατήρηση μας, πρόσφατες εργασίες για χημειοαντίσταση προς ετοποσίδη σε HIF-1α ανεπάρκεια απαθανάτισε εμβρυϊκούς ινοβλάστες ποντικού δεν τήρησε την επαγωγή της p21 [36]. Επίσης, HIF-1α σταθεροποιημένο ρ21 και ρ27, καθώς οδήγησε σε hypophosphorylation του pRb κατά την υποξία προκαλούμενη αύξηση σύλληψη του αθανατοποιημένων ινοβλαστών ποντικού εμβρυϊκών και πρωτογενών σπληνικών Β-λεμφοκυττάρων [37]. Αυτά τα αντικρουόμενα αποτελέσματα πιθανότατα εξηγείται από τους κυτταρικούς τύπους ερευνήθηκαν: Ενώ Goda

κ.ά.

. χαρακτηριζόμενη μια φυσιολογική απόκριση σε υποξία σε μη-μετασχηματισμένα κυτταρικών τύπων, αναλύσαμε την απόκριση σε σοβαρή βλάβη του DNA σε καθιερωμένες κυτταρικές γραμμές καρκίνου.

Ενώ ρ53 δείξει επανειλημμένα για την εξουδετέρωση του ΝΡ-κΒ λειτουργίας [38], [39 ], τα τρέχοντα δεδομένα μας υποδεικνύουν ένα ρόλο για την ογκοκατασταλτικό στη ρύθμιση της HIF-1α-εξαρτώμενη ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ. Εκτός από ρ53, NF-κΒ έχει αναδειχθεί ως ένα δεύτερο, κεντρική καθοριστικός παράγοντας της αντίστασης προς χημειοθεραπευτικούς παράγοντες [40]. Αρκετές διαφορετικές μελέτες έχουν καθιερώσει λειτουργικές σχέσεις μεταξύ NF-κΒ και HIF-1α, αν και μεταβλητά τοποθετούν HIF-1α είτε ανάντη του ΝΡ-κΒ ή αντίστροφα. Για παράδειγμα, η υποξία-επαγόμενη σταθεροποίηση του HIF-1α σε λεία μυϊκά κύτταρα είναι υπό μεταγραφικό έλεγχο του ΝΡ-κΒ [41]. Παρομοίως, τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από υπό όρους ποντίκια knockout ΙΚΚ-β επιβεβαίωσε τον κεντρικό ρόλο του ΝΡ-κΒ στον έλεγχο βασική και έκφραση που προκαλείται από υποξία του HIF-1α

in vivo

[42]. Αντιστρόφως, η γονιδιακή έκφραση του p65 υπομονάδας ΝΡ-κΒ αποδείχθηκε ότι ελέγχεται από HIF-1α στο πλαίσιο της υποξίας-κατέστειλε την απόπτωση των ουδετεροφίλων [43]. Ως εκ τούτου, το εύρημα μας από σημαντικά μειωμένη δραστικότητα ΝΡ-κΒ σε HIF-1α-ανεπαρκή κύτταρα κατά την αγωγή με 5-FU είναι καλά ευθυγραμμίζεται με αυτήν την τελευταία έκθεση. Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε επίσης πρόσδεση του NF-κΒ υπομονάδων σε HIF-1α-ανεπαρκή κύτταρα μετά από διέγερση με TNFa, ένα καθιερωμένο επαγωγέας της δραστικότητας ΝΡ-κΒ [44] σημαντικά μειωμένη DNA. Αυτό εγείρει το ερώτημα σχετικό με την οποία φυσιολογικές και παθοφυσιολογικές καταστάσεις HIF-1α είναι σε θέση να ρυθμίζουν την ενεργοποίηση του NF-κΒ. HIF-1α και NF-κΒ μοιράζονται κρίσιμη σημασία για διάφορες διαδικασίες, όπως η φλεγμονή, η μικροβιακή θανάτωση και ογκογένεση. Η ακριβής μοριακή φύση, καθώς και η ιεραρχία της αλληλεπίδρασης τους είναι πιο πιθανό σε κύτταρα και το πλαίσιο που εξαρτάται και δεν μπορεί να γενικευθεί.

Στην παρούσα μελέτη ήμασταν σε θέση να εντοπίσουμε ROS ως σημείο τομής της HIF- 1α με το ρ53-προκαλούμενης κυτταρικής απόκρισης στρες στη χημειοθεραπεία. Η ενδοκυτταρική ROS είναι γνωστά ως ισχυροί επαγωγείς της ρ53 και να συμμετέχουν στην ενεργοποίηση της ρ53 από χημειοθεραπευτικών φαρμάκων [45]. Μιτοχόνδρια αντιπροσωπεύουν την κύρια πηγή των ενδοκυτταρικών ROS [46], και HIF-1α πιθανό εξουδετερώνει παραγωγή ROS σε μιτοχονδριακό επίπεδο μέσω πολλαπλών μηχανισμών συμπεριλαμβανομένης της αναστολής της μιτοχονδριακής βιογένεσης και του πυροσταφυλικού μετακινούνται στα μιτοχόνδρια, μείωση της μιτοχονδριακής δραστηριότητας λόγω ενισχυμένη χρησιμοποίηση της γλυκόλυσης και την ενεργοποίηση των μιτοχονδρίων αυτοφαγία [29], [30], [47], [48]. Προηγουμένως, έχουμε δημιουργήσει μια λειτουργική σύνδεση ανάμεσα HIF-1α-ελεγχόμενη μείωση των ROS και αγκύρωσης ανεξαρτησία του γαστρικού καρκίνου κυττάρων [22], ενοχοποιώντας HIF-1α στην παθογένεση του καρκίνου του στομάχου σε απουσία υποξίας. Έχουμε τώρα διαπιστώσει ότι η capacitiy του HIF-1α να περιορίσει την παραγωγή ROS γαστρικού καρκινικών κυττάρων επίσης προσδίδει αντίσταση στους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες που λειτουργούν μέσω της ενεργοποίησης της ρ53 (Σχήμα 6Ε). Είναι ενδιαφέρον ότι, η αύξηση της επιδράσεις στην αντίσταση θεραπεία μέσω διαμόρφωσης της ρ53 και ROS έχουν επίσης αναφερθεί για HIF-2α [49]. Οι ισομορφές HIF-α 1 και 2 δείχνουν ένα ευρύ επικάλυψη σε πιθανούς στόχους του HIF και δέσμευση σε υποξικές στοιχεία απόκρισης και οριστική κατανομή της υποξίας που επάγεται επιδράσεις είτε ισομορφή δεν είναι πάντα κατορθωτός [50]. Bertout

et al.

Έδειξαν ότι αναστέλλοντας HIF-2α αυξάνει προκαλούμενη από ακτινοβολία απόπτωση μέσω συσσώρευσης ROS και την επακόλουθη αύξηση της δραστηριότητας της ρ53 [49]. Επιπλέον, Roberts

et al.

Έδειξαν ότι η αντίσταση ενάντια χημειοθεραπεία είναι μερικώς διαμεσολαβείται από HIF-2α-μεσολαβούμενη καταστολή της ρ53 σε κύτταρα νεφρικού καρκινώματος [51]. Ως εκ τούτου, οι δια του παρόντος αναφερόμενη παρατηρήσεις εγγυάται έρευνες για τον πιθανό ρόλο του HIF-2α, ένα έργο που βρίσκεται σε εξέλιξη στο εργαστήριό μας.

Λόγω της κλινικής ανάγκη να προσδιοριστούν οι προγνωστικοί παράγοντες ανταπόκρισης για τις διαθέσιμες θεραπευτικές επιλογές, μας