Αφηρημένο

Στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκε η συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης RhoC και καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) σχηματισμό στο κεφάλι και ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα τραχήλου (HNSCC). Η αναστολή της λειτουργίας RhoC επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας shRNA. Η έκφραση των δεικτών επιφανείας βλαστικών κυττάρων, ALDH και CD44 ήταν σημαντικά χαμηλότερο σε δύο εξαντλημένο HNSCC κυτταρικές σειρές καρκινώματος RhoC. Επιπλέον, μια εντυπωσιακή μείωση του tumorsphere σχηματισμό επιτεύχθηκε στις γραμμές νοκ ντάουν RhoC. Η έκφραση του mRNA της RhoC σε RhoC νοκ ντάουν προσκολλημένη και tumorspheres είναι δραματικά κάτω ρυθμίζονται σε σύγκριση με το ανακατωμένο έλεγχο. Η έκφραση του mRNA των μεταγραφικών παραγόντων αρχέγονων κυττάρων? Nanog, oct3 /4 (Pouf1), και Sox2 ήταν σημαντικά φτωχό σε RhoC νοκ ντάουν κλώνους. Περαιτέρω, η φωσφορυλίωση της STAT3

ser727, και STAT3

tyr705 ήταν σημαντικά κάτω ρυθμίζονται RhoC νοκ ντάουν κλώνους. Η υπερέκφραση του STAT3 στο RhoC νοκ ντάουν δεν παρουσίασαν καμία αλλαγή στα πρότυπα έκφρασης είτε-STAT3

tyr705 ή βλαστικών παράγοντες μεταγραφής κυττάρων, που σηματοδοτεί το ρόλο του RhoC στην ενεργοποίηση STAT3 και έτσι την έκφραση του Nanog, oct3 /4 και Sox2 σε HNSCC. Η έκφραση του Inter leukin-6 (IL-6) σε RhoC κυτταρικές σειρές knockdown HNSCC ήταν δραματικά χαμηλά σε σύγκριση με το κωδικοποιημένο ελέγχου. Περαιτέρω, έχουμε δείξει μια διάσωση σε φωσφορυλίωση STAT3 από την IL-6 διέγερση σε γραμμές knockdown RhoC. Η μελέτη αυτή είναι η πρώτη του είδους της για να αποδείξει την εμπλοκή της RhoC στην φωσφορυλίωση STAT3 και ως εκ τούτου στην προώθηση της ενεργοποίησης του καρκίνου του πυρήνα βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) παράγοντες μεταγραφής. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι RhoC μπορεί να είναι ένα μυθιστόρημα στόχο για θεραπεία HNSCC

Παράθεση:. Ισλάμ M, Sharma S, Teknos TN (2014) RhoC Ρυθμίζει καρκινικά βλαστικά κύτταρα σε Κεφαλής και Τραχήλου πλακωδών κυττάρων καρκίνωμα με υπερέκφραση της IL-6 και φωσφορυλίωση STAT3. PLoS ONE 9 (2): e88527. doi: 10.1371 /journal.pone.0088527

Επιμέλεια: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 14 Οκτ του 2013? Δεκτές: 7 Γενάρη του 2014? Δημοσιεύθηκε: 12 Φεβρουαρίου, 2014

Copyright: © 2014 Islam et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Πολιτειακό Πανεπιστήμιο του Οχάιο Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου και το Ίδρυμα Slomin Οικογένειας (Florida, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής) με Ted Teknos. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

πλακώδες καρκίνωμα κεφαλής και τραχήλου (HNSCC) είναι μεταξύ των κορυφαίων δέκα θανατηφόρου καρκίνου σε όλο τον κόσμο [1], [2]. Επιπλέον, όπως αναφέρεται από την Αμερικανική Αντικαρκινική Εταιρεία, περίπου 41.380 νέες περιπτώσεις θα διαγνωστούν κατά το έτος 2013, εκ των οποίων περίπου το 19% των ασθενών που είναι πιθανό να πεθάνουν εξαιτίας της νόσου στο ίδιο έτος [3]. Οι επιζώντες αντιμετωπίζουν δευτερεύουσα εκδηλώσεις της ασθένειας με αποτέλεσμα μια παρατεταμένη και εκτεταμένη θεραπεία. Αυτό επιδεινώνεται από το γεγονός ότι η ασθένεια δείχνει μια υψηλή συχνότητα επανεμφάνισης. Ως αποτέλεσμα, οι ασθενείς HNSCC αντιμετωπίσει μια μακρά μάχη κατά της νόσου που προκαλεί μεγάλη οικονομική και συναισθηματική επιβάρυνση [4]. Κατά συνέπεια, μια έκθεση από Brown

et al

(2002) αναφέρει HNSCC μεταξύ των οκτώ πιο ακριβά καρκίνοι στο πρόγραμμα Medicare [5].

Η ασυνήθιστα υψηλή νοσηρότητα και θνησιμότητα οφείλεται η κακοήθη φύση της HNSCC και την ευρεία παρουσία της σε περισσότερες μορφές καρκίνου κεφαλής και του τραχήλου. Ως εκ τούτου, δεν είναι ασυνήθιστο να βρεθούν μετάσταση στους λεμφαδένες της περιοχής του λαιμού που οδηγεί σε τοπική-περιοχική ανεπάρκειας (πιο συχνή) ακολουθούμενη από πνευμονική και οστών μετάσταση [6], [7]. Ως αποτέλεσμα, οι ασθενείς με HNSCC δείχνουν κακή πρόγνωση και ένα ποσοστό πενταετούς επιβίωσης μόνο 50-60% [3]. Έτσι, υπάρχει μεγάλη ανάγκη να κατανοήσουμε τους γενετικούς μηχανισμούς που ρυθμίζουν την κακοήθεια των HNSCC και τους χρησιμοποιούν για να σχεδιάσουν καλύτερα τις στρατηγικές θεραπείας που μπορεί να αποτρέψει τη μετάσταση και η επανάληψη.

RhoC είναι μέλος της και χαρακτηρίζεται οικογένειας Rho του GTPases που εμπλέκονται σε ένα ευρύ φάσμα κυτταρικών δραστηριοτήτων συμπεριλαμβανομένων ενδοκυτταρικής σηματοδότησης, οργάνωση του κυτταροσκελετού, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης [8]. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα γονίδια Rho ανήκουν στους Ras υπεροικογένειας, πολλά από τα οποία έχουν ταυτοποιηθεί ως ογκογονίδια [9], [10]. Παρά το γεγονός ότι είναι πολύ λίγοι γενετικές μεταλλάξεις που παρατηρήθηκαν στο γονίδιο RhoC, αναφέρεται ότι υπερ-εκφράζεται σε πολλές μορφές διηθητικά καρκινώματα συμπεριλαμβανομένων HNSCC [11], [12]. Συγκεκριμένα, οι μελέτες σε όλους τους τύπους των καρκίνων όπου αναλύθηκε έκφραση RhoC αποκάλυψε μια πολύ ισχυρή συσχέτιση μεταξύ σημαντικά αυξημένη έκφραση και τη μετάσταση. Επιπλέον, όταν η λειτουργία RhoC αναστέλλεται

in vitro

, αυτό οδηγεί σε μια ισχυρή μείωση της κυτταρικής εισβολής και κινητικότητα [13]. Είναι ενδιαφέρον ότι,

in vivo μελέτες

της ογκογένεσης σε RhoC ποντίκια knockout δείχνουν όγκους με σημαντικά μειωμένη ικανότητα να μεταστάσεις στους πνεύμονες [10]. Συνολικά, αυτές οι μελέτες υποδεικνύουν έντονα RhoC είναι ένα ογκογονίδιο pro-μετάσταση που παίζει σημαντικό ρόλο στη μετατροπή της μη-επεμβατική τα καρκινικά κύτταρα σε μια επεμβατική φαινότυπο.

Η μελέτη της λειτουργίας RhoC επικεντρώνεται κυρίως στον ρόλο της στην αναδιοργάνωση του ο κυτταροσκελετός επάγοντας το σχηματισμό ινών στρες και εστιακή προσκόλληση, τα οποία είναι κρίσιμα βήματα προς την αλλαγή κυττάρων σε κινητικά και επεμβατικές μορφές [14]. Ωστόσο, η διαδικασία μετάστασης από καρκινικά κύτταρα είναι μία πολύπλοκη διαδικασία πολλαπλών βημάτων και η οποία συνοδεύεται με την αυξημένη έκφραση των γονιδίων που ενισχύουν την κινητικότητα και διεισδυτικότητα και την επιλεκτική ρύθμιση προς τα κάτω των γονιδίων που αναστέλλουν αυτή τη διαδικασία. Ο επιπολασμός του RhoC σε ένα ευρύ φάσμα των επεμβατικών καρκινωμάτων και τη λειτουργία του ως ΟΤΡάση σηματοδότησης δείχνει ότι μπορεί να ρυθμίσει άλλες οδούς που εμπλέκονται στο μετασχηματισμό των κυττάρων του όγκου σε ένα μεταστατικό φαινότυπο.

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) είναι ένας υποπληθυσμός αδιαφοροποίητων κυττάρων όγκου εντός μάζας του όγκου τα οποία είναι ικανά αυτο-ανανέωση. Επίσης επιδεικνύουν ισχυρή αντίσταση σε θεραπεία χημειο-ακτινοβολία. Επιπλέον, ΚΕΠ μπορεί να παραμείνουν σε όγκους ως ένα διακριτό υποπληθυσμό το οποίο μπορεί να υποτροπιάσουν και μετάσταση με σχηματισμό νέων όγκων [15], [16]. Αυτές οι μοναδικές ιδιότητες παίζουν σημαντικό ρόλο στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων που οδηγεί σε υποτροπή. Σημαντικά, μπορούν επίσης να είναι μια πηγή κυττάρων με ένα επεμβατική φαινότυπο, παίζοντας έτσι σημαντικό ρόλο στην μετάσταση.

Ένας αρκετά μεγάλος αριθμός μελετών έχουν διεξαχθεί σχετικά με την παρουσία και το ρόλο των ΚΕΠ σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου οποία έχει αναθεωρηθεί πλήρως από Minnelli και Gallo (2012) [17]. Μια μελέτη των πρωτογενών όγκων στο κεφάλι και το λαιμό καρκίνων χρησιμοποιώντας το CD44 δείκτες και ALDH εντοπιστεί ένα υποσύνολο των καρκινικών κυττάρων που μοναδικό ΚΕΠ ιδιότητες συμπεριλαμβανομένης της αυτο-ανανέωσης, ικανότητα να σχηματίσουν νέους όγκους σε ποντίκια και επέδειξαν υψηλό μεταστατικό δυναμικό (Prince

κ.ά.

2007, Davis

et al

, 2010, Πηλός

et al

2010) [16], [18], [19]. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα θετικά καρκινικά κύτταρα ALDH παρουσίασαν περισσότερο ογκογόνο δυναμικό σε σύγκριση με CD44 θετικά κύτταρα [19]. Επιπλέον, ο Τσεν

et al

(2010) [20] ανέφεραν πρωτοπαθών όγκων με υψηλότερη έκφραση του CD44 και ΑΙ_ϋΗ, η οποία αποδίδει καλά με την κακή πρόγνωση σε ασθενείς HNSCC. Με βάση αυτές τις μελέτες, μπορεί να συναχθεί το συμπέρασμα ότι τα ΚΕΠ μπορούν να διαδραματίσουν σημαντικό ρόλο στη μετάσταση του HNSCC? υποδηλώνοντας έτσι μια ανάγκη να κατανοήσουμε τους μοριακούς μηχανισμούς που τους ρυθμίζουν.

ΚΕΠ έχουν επίσης αναγνωριστεί και χαρακτηριστεί σε κυτταρικές σειρές HNSCC όπου έχει αποδειχθεί ότι παίζουν ένα σημαντικό ρόλο στην επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) [ ,,,0],21]. Στη μελέτη μας, έχουμε αναλύσει την επίδραση της αναστολής RhoC σχετικά με τα λειτουργικά χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων που παρουσιάζουν CSC-όπως χαρακτηριστικά σε κυτταρικές σειρές HNSCC. Δείχνουμε ότι αναστολή δραστικότητας RhoC στις γραμμές αποτελέσματα HNSCC κύτταρο σε σημαντική μείωση του πληθυσμού κυττάρου που εκφράζει CD44 και ΑΙ_ϋΗ, δείκτες ΚΕΠ σε όγκους κεφαλής και τραχήλου.

Επιπλέον, χαρακτηριζόμενη επίσης το μοριακό μηχανισμό με τον οποίο RhoC ρυθμίζει την ανάπτυξη και αυτο-ανανέωση των ΚΕΠ. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι RhoC μπορεί να μειώσει σημαντικά τα επίπεδα έκφρασης του πυρήνα παραγόντων μεταγραφής βλαστοκυττάρων, Nanog, Sox2 και oct3 /4. Δείχνουμε επίσης ότι αυτό επιτυγχάνεται με τη μείωση των επιπέδων της φωσφορυλιωμένης STAT3 μέσω του /JAK μονοπατιού σηματοδότησης IL-6. Η μελέτη αυτή είναι η πρώτη του είδους της, που προσπαθεί να τεμαχίσει το ρόλο του μονοπατιού σηματοδότησης RhoC ΘΤΡάσης στη ρύθμιση και ενεργοποίηση των βλαστικών κυττάρων μεταγραφικών παραγόντων. (Αυτοί οι παράγοντες προάγουν και να διατηρούν τα καρκινικά κύτταρα με τη χρήση βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με ακίνητα σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου).

Ως εκ τούτου, με βάση τα ευρήματά μας καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι RhoC είναι ένα σημαντικό ογκογονίδιο που είναι αναγκαία για τη συντήρηση και διάδοση της ΚΕΠ σε HNSCC.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρική καλλιέργεια

κυτταρικές γραμμές καρκινώματος κεφαλής και τραχήλου από πλακώδες επιθήλιο UM-SCC-1 και -47 (Πανεπιστήμιο του Michigan πλακωδών κυττάρων καρκίνωμα ) έχουν αγοραστεί από το Πανεπιστήμιο του Michigan. Αυτά είναι καλά χαρακτηρισμένος σειρές που προέρχονται από ασθενείς με T2N0 του δαπέδου του στόματος και T3N1 του βάση της γλώσσας αντίστοιχα [22], [23]. Οι κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13].

Lentivirus μεταγωγή, τη μόλυνση και την επιλογή των θετικών RhoC νοκ ντάουν κλώνους

Για να έχετε σταθερή RhoC νοκ ντάουν κλώνων από τις προαναφερθείσες κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται RhoC νοκ ντάουν και ομελέτα δομές ελέγχου ακολουθίας με GFP ετικέτα και τοποθεσίες αντίσταση πουρομυκίνης όπως περιγράφεται στο προηγουμένως δημοσιευμένο έργο μας [13]. Επιλογή των RhoC knockdown σταθερών κλώνων επετεύχθη χρησιμοποιώντας 2,0 και 1,6 μg /ml πουρομυκίνη για UM-SCC-1 και -47, αντίστοιχα. Αυτοί οι κλώνοι περαιτέρω διαλογή με κυτταρομετρία ροής για να πάρει το μέγιστο αριθμό των GFP θετικών κυττάρων, τα οποία επίσης χρησιμοποιούνται σε μεταγενέστερες μελέτες.

Η παροδική επιμόλυνση των RhoC-siRNA

Επειδή τα φάσματα εκπομπής της GFP με ετικέτα RhoC shRNA ήταν η ίδια όπως τα φάσματα εκπομπής του αντισώματος φθορισμού χρησιμοποιείται για να προσδιορίσει ALDH θετικά κύτταρα, τα επιμολυσμένα RhoC-shRNA /GFP knockdown κλώνοι που παράγονται από UM-SCC-1 κυτταρικές γραμμές και -47 δεν θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό και ταξινομήσετε τη CSC υπο-πληθυσμού. Αντ ‘αυτού, knockdown του RhoC επιτεύχθηκε παροδικά τόσο UM-SCC-1 και -47 χρησιμοποιώντας RhoC-siRNA (τεχνολογίες Ambion /Life, USA) και lipofactAMIN 2000 ως φορέα. Η επιτυχής διαμόλυνση και η αναστολή της RhoC καταδείχθηκε από την έλλειψη έκφρασης της με ανάλυση κηλίδας Western χρησιμοποιώντας αντι αντίσωμα RhoC.

Ποσοτική ανάστροφης μεταγραφάσης αλυσιδωτές αντιδράσεις πολυμεράσης (PCR qRT-)

Ολικό RNA απομονώθηκε με αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Ποσοτική αντίστροφη αλυσιδωτές αντιδράσεις μεταγραφάσης πολυμεράσης (qRT-PCR) διεξήχθησαν με το σύστημα καθετήρα Taqman από την Applied Βίο Systems (Foster City, CA) χρησιμοποιώντας την ακόλουθη προϊόντα RhoC: Hs00733980_m1, Sox2: Hs01053049_s1, Nanog: Hs02387400_g1 και Oct3 /4 (POUF1 ) Hs01895061_u1. OZ1 και G3PDH χρησιμοποιήθηκαν ως ομαλοποίηση των δεδομένων. Σχετική αλλαγές στην γονιδιακή έκφραση υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το 2

– (- Δ). C

μέθοδος T [24]

Western ανάλυση κηλίδος

αναλύσεις κηλίδος Western πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με το τυπικό πρωτόκολλο. Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν πολυκλωνικά RhoC, και π-STAT3

ser 727, σ-STAT3

tyr705 (1:1000 αραιώσεις) και αβ τουμπουλίνης (ως μάρτυρας φόρτωσης) (1:2000 αραιώσεις). Αυτά τα αντισώματα ήταν το προϊόν της κυτταρικής σηματοδότησης (Τεχνολογίες κυτταρική σηματοδότηση, Inc., Boston, USA). Μετά την επώαση με πρωτογενή αντισώματα οι μεμβράνες κηλιδώθηκαν επί μία ώρα με δευτερογενές αντίσωμα HRP-συζεύγματος αντι-κουνελιού (1:2500) (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, USA). ECL-super σύστημα σήματος (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) χρησιμοποιήθηκε για την οπτικοποίηση της πρωτεΐνης.

Προσδιορισμός των ενεργών RhoC ή [RhoC-GTP]

[RhoC- GTP] στο UM -SCC-1 και -47 κωδικοποιημένα ελέγχου και RhoC knockdown κλώνων προσδιορίστηκαν με G-LISA όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25], χρησιμοποιώντας το κιτ G-LISA (Cytoskeleton Inc., Denver, CO, USA) και ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας RhoC πρωτεύον αντίσωμα από την Cell Signaling Inc.

Ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA)

χωρίς ορό υπερκείμενα από το ανακατωμένο έλεγχο και knockdown κυτταρικές σειρές RhoC που ελήφθη μετά από 48 ώρες επώασης στάλθηκαν για ELISA για να η κυτοκίνη Πυρήνας Lab του Πανεπιστημίου του Μέριλαντ, Βαλτιμόρη, MD. Μέσες τιμές της IL-6 (μετά την ομαλοποίηση με τον αριθμό των κυττάρων από όπου συλλέχθηκαν τα υπερκείμενα) σε όρους pg /ml αποτυπώθηκαν σε ένα ραβδόγραμμα.

αναλύσεις κυτταρομετρίας ροής

Ροή ανάλυση κυτταρομετρίας για την επίλυση των GFP, ALDH και CD44 θετικών κυττάρων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση της ροής BD FACS Aria ΙΙυ κυτταρομετρητή εξοπλισμένο με 488 nm, 15 mW, αερόψυκτος Argon laser. Ένα κιτ ALDEFLOUR (Stem τεχνολογίες κυψελών, Vancouver, BC, Canada) χρησιμοποιήθηκε για χρώση ALDH. FACS ανάλυση πραγματοποιήθηκε στον πυρήνα εγκατάσταση εργαστηρίου ροή στο Πολιτειακό Πανεπιστήμιο του Οχάιο Κέντρο Comprehensive Cancer.

Tumorspheres σχηματισμό

Για tumorsphere προσδιορισμούς σχηματισμού έχουμε διευθετηθεί τα θετικά κύτταρα GFP και τα χρησιμοποίησε για όλα τα επόμενα πειράματα . Tumorspheres από το ανακατωμένο έλεγχο και γραμμές νοκ ντάουν RhoC ελήφθησαν από την αυξανόμενη ίσο αριθμό κυττάρων (1 × 10

6) σε εξαιρετικά χαμηλές πλάκες συνημμένο στο συμπλήρωμα ελεύθερα μέσα ενημέρωσης κερατινοκυττάρων ορού με EGF 20 ng /ml, bFGF 20 ng /ml , ινσουλίνη 100 ng /ml, και υδροκορτιζόνη 400 ng /ml. Για πολλαπλασιαστικό τις σφαίρες στην επόμενη γενιά, σφαίρες φιλτραρίστηκαν σε ένα σουρωτήρι κύτταρο 40 μΜ και για λίγο σε επεξεργασία με θρυψίνη σε ένα λουτρό νερού στους 37 ° C. Μετά από περιδίνηση στα 300 παλέτες κύτταρο × g επαναιωρήθηκαν σε tumorsphere μέσα ενημέρωσης και απλώθηκε σε φρέσκο ​​χαμηλή πλάκες στερεώσεως. Για να προσδιοριστεί η αποτελεσματικότητα της tumorsphere σχηματισμό, 500 κύτταρα από το ανακατωμένο έλεγχο και RhoC νοκ ντάουν απλώθηκαν σε 96 και χαμηλές πλάκες στήριξης. Οι αριθμοί των σφαιρών μετρήθηκαν μετά από δύο εβδομάδες σπορά. Οι εξαιρετικά χαμηλές πλάκες στήριξης ήταν το προϊόν της Corning Incorporated, Corning, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ.

Στατιστική Ανάλυση

Οι στατιστικές αναλύσεις (έλεγχος τ) πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση γράφημα Sigma pad πρίσμα 4 λογισμικού . Η μέση αναφέρθηκε με τυπική απόκλιση (± SD). Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές όταν

σ

τιμές ήταν μικρότερη από 0.05.

Αποτελέσματα

έκφραση RhoC μειώνεται σημαντικά στην RhoC κυτταρικές σειρές νοκ ντάουν HNSCC

Η αναστολή της έκφρασης RhoC διεξήχθη χρησιμοποιώντας μικρό RNA φουρκέτας (shRNA) και το λεντοϊού μεταγωγή και τη μόλυνση μεθοδολογία όπως περιγράφεται στο τμήμα των μεθόδων. Μετά φακοϊικών λοίμωξη, επιλέγεται RhoC knockdown κλώνοι χρησιμοποιώντας πουρομυκίνη (1,6 μg /ml) αντιβιοτικό. Ο αριθμός των κυττάρων που μολύνθηκαν με επιτυχία αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Αυτό αποκάλυψε ένα εξαιρετικά χαμηλό αριθμό των μη μολυσμένων κυττάρων (Σχ. 1Α-C επάνω πίνακα). Επιπλέον, μικροσκοπία φθορισμού των σταθερών κλώνων δείχνει μια ισχυρή πράσινο φθορισμό στην πλειονότητα των κυττάρων, που σημαίνει υψηλή απόδοση του ιού Ιβηίί μεταγωγής και μόλυνση (Σχ. 1Α-C κάτω πάνελ). Αυτά GFP θετικά κύτταρα περαιτέρω διευθετηθεί και την εκ νέου-που καλλιεργούνται για τα επόμενα πειράματα. Το σχήμα 1C είναι ο αρνητικός μάρτυρας που δείχνει τη γονική γραμμή χωρίς τη λοίμωξη οφειλόμενη σε φακοϊό. Αυτό αντιπροσωπεύει τη διαφορά μεταξύ GFP που εκφράζουν (μολυσμένα) και μη-GFP ​​εκφράζοντα κύτταρα.

Lentivirus μολυσμένα κύτταρα που δείχνει την έκφραση GFP σε UM-SCC-47. (Α) Τα ιστογράμματα των κωδικοποιημένων ελέγχου (sr ελέγχου) και (Β) RhoC knockdown (RhoC kd) που λαμβάνεται με κυτταρομετρία ροής. (Γ) Αρνητικός μάρτυρας. Αναπαράσταση της έκφρασης GFP σε φθορισμό και έντονο φως παρουσιάζονται στα φύλλα πυθμένα. Περίπου το 90% των κυττάρων ήταν GFP θετικά σηματοδοτεί την επιτυχή μεταγωγή του shRNA χρήση ανασυνδυασμένου φακοϊό.

Η

Στη συνέχεια δοκιμάστηκε η αποτελεσματικότητα των shRNA σε καταστρέφουν έκφραση RhoC mRNA από ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR) σε επιλεγμένες κυτταρικές σειρές μας. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, τα επίπεδα έκφρασης του mRNA του γονιδίου RhoC στις knockdown κλώνους ήταν σημαντικά χαμηλότερο (σχήμα 2Α & amp?. Δ), ενώ η έκφραση της πρωτεΐνης δεν ήταν ανιχνεύσιμη στο στύπωμα Western (Σχήμα 2Β & amp?. Ε). Σε αντίθεση, αρκεί η έκφραση RhoC παρατηρήθηκε σε κλώνους με το shRNA-κωδικοποιημένα αλληλουχία ελέγχου. Η σχετική έκφραση RhoC mRNA στο shRNA-κωδικοποιημένα ελέγχου και των RhoC knockdown κλώνους αξιολογήθηκε με ποσοτική RT-PCR και η C

τιμές Τ ελήφθησαν ομαλοποιήθηκαν με τη χρήση δύο γονιδίων οικοκυρική, όπως περιγράφεται στην ενότητα υλικά και μέθοδοι. Μία μείωση περίπου 80% της έκφρασης mRNA RhoC παρατηρήθηκε σε UM-SCC-1 και- 47 κλώνοι knockdown σε σύγκριση με το κωδικοποιημένο ελέγχου (σχήμα 2Α & amp?. D). Σε προηγούμενη μελέτη μας, επιβεβαιώσαμε ότι μόνο η έκφραση RhoC mRNA ανεστάλη όταν χρησιμοποιείται RhoC shRNA κατασκευές γίνονται με συγκεκριμένες αλληλουχίες του mRNA RhoC? Επιπλέον, τα επίπεδα έκφρασης άλλων πρωτεϊνών Rho δεν επηρεάστηκαν στις κυτταρικές γραμμές UM-SCC [13]. Έτσι, χρησιμοποιείται η ίδια RhoC shRNA κατασκευάζει για την τρέχουσα μελέτη μας

(Α και D) Η έκφραση του mRNA της RhoC λαμβάνονται με πραγματικού χρόνου RT-PCR.? (Β και Ε). Ανάλυση κηλίδας Western που δείχνει έκφραση RhoC στο περιπλεγμένο έλεγχο και RhoC knockdown κλώνοι (C και F). ιστόγραμμα που δείχνει την έκφραση της ενεργού RhoC [RhoC-GTP] σε περιπλεγμένο έλεγχο και RhoC knockdown UM-SCC-1 και-47, αντίστοιχα. Μια σημαντική μείωση στην RhoC mRNA, πρωτεΐνης και [RhoC-GTP] επίπεδα ελήφθησαν στα νοκ ντάουν κυτταρικές σειρές RhoC.

Η

Στη συνέχεια, αναλύσαμε την έκφραση της πρωτεΐνης RhoC χρησιμοποιώντας Western blot και παρατηρείται μια δραματική μείωση των η πρωτεΐνη RhoC σε RhoC knockdown κλώνους (Σχήμα 2Β & amp?. Ε). Περαιτέρω, η έκφραση του δραστικού RhoC [RhoC-GTP] προσδιορίστηκε με G-LISA και ένα παρομοίως χαμηλή έκφραση του δραστικού RhoC ανιχνεύθηκε στα RhoC knockdown κλώνους του UM-SCC-1 και-47 (Σχήμα 2C & amp?. F). Οι μελέτες αυτές παρέχονται σαφή εικόνα για το «σβήσιμο» της δραστηριότητας σηματοδότησης RhoC με μείωση συνολικά επίπεδα έκφρασης RhoC mRNA. Περαιτέρω λεπτομερείς μελέτες σχετικά με τους λειτουργικούς ρόλους της σε μετάσταση καρκίνου θα μπορούσε να συνεχιστεί στο μέλλον η έρευνα. Μία από τις πιο βασικές κλινικές ερωτήσεις που απευθύνονται σε αυτό το σημείο είναι το πώς η λειτουργία χτυπήσει κάτω των RhoC επηρεάζει τα καρκινικά κύτταρα με τη χρήση βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με ακίνητα σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου. Για να απαντηθεί αυτό το ερώτημα, ερευνήσαμε διάφορα βιολογικά χαρακτηριστικά των ΚΕΠ τα οποία περιλαμβάνουν ανάλυση των κυττάρων βιοδεικτών και την ικανότητα να σχηματίζουν tumorspheres στέλεχος. Στη συνέχεια, εξετάσαμε τα μόρια σηματοδότησης που διατηρούν τις ιδιότητες αυτο-ανανέωση των ΚΕΠ.

Η αναστολή της έκφρασης RhoC οδηγεί σε μείωση του πληθυσμού της ALDH και CD44 θετικών κυττάρων σε κυτταρικές σειρές HNSCC

Για να προσδιορίζουν τον πληθυσμό CSC σε κυτταρικές γραμμές UM-SCC, χρησιμοποιήσαμε την σημειωτές βλαστοκυττάρων CD44 και ALDH μαζί με ενεργοποιητή φθορισμό διαλογή κυττάρων (FACS) για να διαχωρίσει και να μετρήσει τον αριθμό των κυττάρων που εκφράζουν τους. Επιπλέον, είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι RhoC-siRNA κλώνους UM-SCC-1 και -47 χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση FACS για τον προσδιορισμό των θετικών κυτταρικών πληθυσμών ALDH αντί του λεντοϊού μολυνθεί κλώνων GFP-RhoC-shRNA. Αυτό έγινε για να αποφευχθεί η υπέρθεση των GFP φθορισμό πάνω από το επισημασμένο αντίσωμα φθορίζον ΑΙ_ϋΗ, αφού φάσματα εκπομπής επικάλυψη τους.

Συγκρίναμε τον αριθμό των ΑΙ_ϋΗ θετικών κυττάρων στο περιπλεγμένο έλεγχο και αντίστοιχες γραμμές knockdown RhoC. Στις κυτταρικές γραμμές ελέγχου, παρατηρήσαμε 18% και 10% ΑίϋΗ θετικά κύτταρα στο σύνολο του πληθυσμού του UM-SCC-1 και UM-SCC-47, αντίστοιχα. Σε αντίθεση, μόνο το 13% (UM-SCC-1) και 4% (UM-SCC-47) ΑίϋΗ θετικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν στις αντίστοιχες γραμμές knockdown RhoC (Εικ. 3Α). Ένα παρόμοιο μοτίβο παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας CD44, αλλά το ποσοστό των CD44 θετικών κυττάρων ήταν πολύ υψηλό. Είναι ενδιαφέρον, οι κλώνοι με το ανακατωμένο έλεγχο ακολουθία UM-SCC-1 και -47 έδειξε περίπου 98% CD44 θετικά κύτταρα. Στις αντίστοιχες RhoC knockdown κλώνους, υπήρχαν 60% και 41% CD44 θετικά κύτταρα αντιστοίχως (Σχήμα S1). Αξίζει να σημειωθεί ότι αυτή ήταν μια ασυνήθιστα υψηλό αριθμό CD44 θετικών κυττάρων σε αμφότερες τις UM-SCC-1 και-47 κυτταρικές γραμμές (& gt? 95%) και ως εκ τούτου CD44 δεν μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως ένας δείκτης βλαστικών κυττάρων για αυτές τις κυτταρικές σειρές. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας είναι παρόμοια με παλαιότερες δημοσιευμένες μελέτες που βρέθηκε CD44 να εκφράζεται άφθονα στα κύτταρα των όγκων του HNSCC [26].

FACS ανάλυση δείχνει την έκφραση του (Α) ALDH στο περιπλεγμένο έλεγχο και την RhoC νοκ ντάουν κλώνους. (Β) Ο σχηματισμός tumorspheres στην ομελέτα έλεγχο και το νοκ ντάουν RhoC UM-SCC-1 και -47cell γραμμές. (Γ) Η εκπροσώπηση της αποτελεσματικότητας σχηματισμού tumorspheres στην ομελέτα έλεγχο και RhoC νοκ ντάουν UM-SCC-1 που λαμβάνονται σε πλάκες 96 φρεατίων. Μια σημαντική μείωση της έκφρασης ALDH παρατηρήθηκε. σχηματισμό Tumorsphere ήταν εντυπωσιακά χαμηλή σε RhoC νοκ ντάουν UM-SCC-1 και -47 αντίστοιχα. (D) Μια σημαντική μείωση στην έκφραση mRNA RhoC ελήφθη με τον RhoC knockdown προσκολλημένων κυττάρων και στα tumorspheres. (Ε) Stem παράγοντες μεταγραφής κυττάρων, Sox2, oct3 /4, και Nanog δείχνει σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω στο mRNA τους, όπως αποκαλύφθηκε από πραγματικού χρόνου RT-PCR στην ομελέτα ελέγχου και τα νοκ ντάουν σφαίρες RhoC που λαμβάνονται από το UM-SCC-1.

τα RhoC νοκ ντάουν γραμμές HNSCC μειωθεί σημαντικά στην ικανότητά τους να σχηματίσουν tumorspheres

καρκινικών κυττάρων με ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων, όπως είναι σε θέση να σχηματίζουν κυμαινόμενο σφαίρες όταν καλλιεργούνται υπό μη ελεύθερα μέσα ενημέρωσης προσκολλημένη στον ορό. Ως εκ τούτου, για την περαιτέρω καθιέρωση του ρόλου των RhoC στην ανάπτυξη και τη συντήρηση CSC, διερευνήσαμε τις δυνατότητες tumorsphere σχηματισμό σε αυτές τις κυτταρικές σειρές. Κατ ‘αρχάς, ένας ίσος αριθμός κυττάρων (1 × 10

6) από την ομελέτα RhoC νοκ ντάουν κυτταρικές σειρές ελέγχου και σπάρθηκαν σε εξαιρετικά χαμηλές πλάκες στερέωσης για παρατήρηση. Έχουμε επιλέξει πέντε διαφορετικά πεδία για να απεικονίσει τον αριθμό των tumorspheres που είχε σχηματιστεί. Στην κωδικοποιημένα ελέγχου, υπήρχε μεγάλος αριθμός tumorspheres με λιγότερες αριθμό κυτταρικών συσσωματωμάτων. Σε αντίθεση, μία σαφής μείωση στον tumorsphere σχηματισμός ανιχνεύθηκε σε RhoC knockdown κλώνους που δημιουργούνται από τις δύο κυτταρικές σειρές UM-SCC-1 και-47. Επιπλέον, θα πρέπει να σημειωθεί ότι καλά καθορισμένα όρια, ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα της tumorspheres, είναι παρόντα μόνο σε εκείνα που προέρχονται από τα κωδικοποιημένα κύτταρα ελέγχου, αλλά προφανώς απουσιάζει όταν προέρχεται από τα RhoC knockdown κυττάρων (Σχ. 3Β). Αντίθετα, αυτό που φαίνεται είναι μικρές συστάδες κυττάρων ή συσσωματωμάτων τα οποία στερούνται σαφώς καθορισμένες εξωτερικό όριο. Επιπλέον, αυτές οι ομάδες κυττάρων δεν διαδίδονται ή να σχηματίζουν σφαίρες μετά θρυψινοποιήθηκαν και την εκ νέου επίστρωση. Σε αντίθεση, σφαίρες εύκολα δημιουργούνται από τις κυτταρικές γραμμές ελέγχου (κωδικοποιημένο αλληλουχία), ακόμη και μετά την εκ νέου επίστρωση τους μέχρι την πέμπτη γενεά. Αναλύσαμε επίσης tumorsphere αποδοτικότητα σχηματισμού σε πλάκα 96 φρεατίων χρησιμοποιώντας 500 κύτταρα ανά φρεάτιο και παρατήρησαν την πλάκα για σφαίρες μετά από δύο εβδομάδες. Μια αξιοσημείωτη μείωση στον αριθμό των σφαιρών (85%) παρατηρήθηκε για τα RhoC knockdown κυττάρων σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχ. 3C). Παρόμοια με την προηγούμενη δοκιμασία tumorsphere, κύτταρο συσσωματώματα παρατηρήθηκαν από κύτταρα που προέρχονται από τις κυτταρικές σειρές knockdown RhoC που ήταν αρκετά σε αντίθεση με τις σαφώς καθορισμένες σφαίρες που προέρχονται από τους κλώνους ελέγχου. Λάβαμε ένα παρόμοιο μοτίβο του tumorsphere αποτελεσματικότητας σχηματισμού όταν το UM-SCC-47 περιπλεγμένο έλεγχο και αντίστοιχες γραμμές του knockdown RhoC ελέγχθηκαν (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι RhoC είναι σημαντικό για την ανάπτυξη και τη συντήρηση των καρκινικών κυττάρων με βλαστικού κυττάρου-όπως χαρακτηριστικά σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου.

Ανάλυση RhoC και βλαστικών κυττάρων έκφραση παραγόντων μεταγραφής σε προσκολλητικά και tumorspheres σε HNSCC

διαφορική έκφραση mRNA σε RhoC προσκολλημένα κύτταρα και tumorspheres

: στη συνέχεια, αναλύσαμε την έκφραση RhoC mRNA στα tumorspheres παράγεται από την κυτταρική γραμμή UM-SCC-1 και συγκρίνονται με τις αντίστοιχες προσκολλημένα κύτταρα χρησιμοποιώντας πραγματικού χρόνου RT-PCR. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι τα προσκολλημένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για τα πειράματα αναφέρονται στον κωδικοποιημένο έλεγχο ή RhoC κύτταρα knockdown μονοστοιβάδας που έχουν καλλιεργηθεί σε πρότυπο υπόστρωμα κυτταρικής καλλιέργειας. Το αποτέλεσμά μας δείχνει ότι υπάρχει μια αυξημένη έκφραση του RhoC mRNA στο UM-SCC-1 κωδικοποιημένα ελέγχου σε σύγκριση με τα knockdown ομολόγους RhoC (Σχ. 3D). Είναι ενδιαφέρον ότι η έκφραση RhoC είναι πολύ υψηλότερο στα κωδικοποιημένα tumorspheres ελέγχου σε σύγκριση με προσκολλημένη ομολόγους κυττάρων τους. Αυτό θα μπορούσε να οφείλεται στην παρουσία μιας υψηλότερης συγκέντρωσης RhoC σε tumorspheres όπου υψηλότερους αριθμούς ΚΕΠ εντοπισμένη σε σύγκριση με τον έλεγχο του πληθυσμού προσκολλημένα κύτταρα, οι οποίες εμφανίζουν ένα μίγμα κυττάρων με σωλήν και μη βλαστικών κυττάρων όπως χαρακτηριστικά γνωρίσματα. Αυτό υποστηρίζει περαιτέρω την υπόθεση μας που απαιτείται RhoC για τη διατήρηση της CSC όμοια χαρακτηριστικά. Τα αποτελέσματά μας είναι σε συμφωνία με μια παρόμοια μελέτη επί της εκφράσεως RhoC σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού, όπου ΑίϋΗ θετικά κύτταρα παρουσίασαν υψηλότερη έκφραση RhoC σύγκριση με τα μη ALDH κύτταρα που εκφράζουν [27].

Stem παράγοντες μεταγραφής κυττάρων είναι κάτω ρυθμίζεται σε RhoC νοκ ντάουν tumorspheres.

Η ανάπτυξη και αυτο-ανανέωση των βλαστικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων διάδοσης εξαρτάται από τη σωστή έκφραση του πυρήνα μεταγραφής βλαστικών κυττάρων παράγοντες Nanog, oct3 /4 και Sox2. Ως εκ τούτου, αναλύσαμε τα επίπεδα έκφρασης αυτών των βλαστικών κυττάρων μεταγραφές παράγοντες στην knockdown RhoC και κωδικοποιημένα tumorspheres ελέγχου που παράγονται από την κυτταρική γραμμή UM-SCC-1 με πραγματικού χρόνου RT-PCR. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα επίπεδα έκφρασης των τριών παραγόντων πυρήνας μεταγραφής μειώνεται δραματικά στα κύτταρα knockdown RhoC όταν συγκρίνεται με τα κωδικοποιημένα tumorspheres ελέγχου (Σχ. 3Ε). Sox2 ήταν πιο έντονα εκφράζεται στα κωδικοποιημένα tumorspheres ελέγχου, ενώ Nanog και oct3 /4 ήταν και οι δύο εξέφρασαν λιγότερο έντονα, αλλά είχαν παρόμοια επίπεδα έκφρασης. Ωστόσο, στην RhoC knockdown ομολόγους, Sox2 και Nanog έδειξε τις μεγαλύτερες μειωμένα επίπεδα που ακολουθείται από oct3 /4. Επιπλέον, εξετάσαμε επίσης τα επίπεδα έκφρασης τους στα προσκολλημένα κύτταρα HNSCC γραμμές (ομελέτα ελέγχου και RhoC νοκ ντάουν) από το οποίο προέρχονται τα tumorspheres. Στην UM-SCC-1 κωδικοποιημένα ελέγχου και RhoC knockdown κυτταρικές σειρές, οι τρεις παράγοντες μεταγραφής έδειξαν παρόμοια επίπεδα έκφρασης όπως παρατηρείται στις tumorspheres που προέρχονται από αυτά (Σχ. 4Α). Στο UM-SCC-47 κωδικοποιημένα ελέγχου, oct3 /4 είχε την υψηλότερη έκφραση που ακολουθείται από Sox2 και Nanog. Παρόμοια με το νοκ ντάουν γραμμή UM-SCC-1 RhoC, Nanog έδειξε τη μεγαλύτερη μείωση, όταν η έκφραση RhoC ανεστάλη ακολούθησε Sox2 (Εικ. 4Β). Σε αμφότερες τις γραμμές UM-SCC-1 και -47 RhoC knockdown, oct3 /4 έδειξαν το λιγότερο ποσό των μειωμένων έκφρασης. Συνολικά, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι RhoC μεσολαβεί τον πολλαπλασιασμό και την αυτο-ανανέωση των ΚΕΠ με τη ρύθμιση του επιπέδου έκφρασης των παραγόντων μεταγραφής πυρήνα των βλαστικών κυττάρων.

πραγματικού χρόνου RT-PCR που δείχνει την έκφραση mRNA του Sox2, oct3 /4 και Nanog στα προσκολλημένα κύτταρα του UM-SCC-1 (Α) και-UM-SCC-47 (Β). Μια σημαντική μείωση στην έκφραση του mRNA παρατηρήθηκε σε μεταγραφικών παραγόντων βλαστικών κυττάρων στα νοκ ντάουν HNSCC κυτταρικές σειρές RhoC.

Η

Η αναστολή της έκφρασης RhoC προκαλεί ρύθμιση προς τα κάτω του μονοπατιού σηματοδότησης STAT3

Στη συνέχεια, ερευνήσαμε την πιθανή μηχανισμός με τον οποίο RhoC ρυθμίζει την έκφραση των παραγόντων μεταγραφής κύτταρο πυρήνα στελέχους. Η ενεργοποίηση των μεταγραφικών παραγόντων βλαστικών κυττάρων, Nanog, Sox2, και oct3 /4 μεσολάβηση Σήμα Ανιχνευτές και Ενεργοποιητές Transcription3 (STAT3) σηματοδότηση μονοπατιού είναι καλά εδραιωμένη [28], [29]. Ωστόσο, η συμμετοχή των RhoC στην ενεργοποίηση αυτών των μεταγραφικών παραγόντων δεν είναι γνωστή. Ως εκ τούτου, αναλύσαμε την έκφραση της ολικής και φωσφορυλιωμένης STAT3 (ρ-STAT3) στην περιπλεγμένο έλεγχο και RhoC knockdown κυτταρικές σειρές HNSCC. Παραδόξως, παρατηρήσαμε ότι ενώ τα συνολικά επίπεδα της STAT3 παρέμεινε περίπου το ίδιο με το ανακατωμένο έλεγχο και RhoC νοκ ντάουν κυτταρικές σειρές, τα επίπεδα π-STAT3 μειώθηκε σε μεγάλο βαθμό μόνο στις RhoC νοκ ντάουν κλώνους. Συγκεκριμένα, ανάλυση κηλίδας Western απεκάλυψε μειωμένη φωσφορυλίωση της STAT3 πρωτεΐνης σε ser-727 και Tyr-705 υπολείμματα (Εικ. 5Α και Β). Είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι η φωσφορυλίωση στο τελευταίο κατάλοιπο είναι απαραίτητη για STAT3 να διαχυθεί μέσα στον πυρήνα να συνδέεται με στοιχεία υποκινητή του STAT3 γονιδίων που αποκρίνονται [30], [31]. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν σθεναρά την ιδέα ότι το μονοπάτι σηματοδότησης RhoC απαιτείται για την ενεργοποίηση της STAT3 στις γραμμές HNSCC.

(Α και Β) ανάλυση κηλίδας Western που δείχνει τη φωσφορυλίωση της STAT3

ser727 και STAT3

tyr705 στα κωδικοποιημένα ελέγχων και η RhoC νοκ ντάουν UM-SCC-1 και -47 αντίστοιχα. Κανονικοποιημένη τιμή σε σχέση με το συνολικό STAT3 δίνεται ως τις αριθμητικές τιμές. Αξιοσημείωτη μείωση στην φωσφορυλίωση της STAT3 παρατηρήθηκαν στην RhoC knock-down UM-SCC-1 και -47 κυτταρικές σειρές, αντίστοιχα. Ανάλυση (Γ) Πρωτεΐνη δείχνει το p-STAT3

tyr705 στο εκτοπικά υπερεκφράζεται (Ο.Ε.) ομελέτα έλεγχο και την RhoC νοκ ντάουν UM-SCC-1. Φωσφορυλιωμένη μορφή ανιχνεύεται μόνο στο περιπλεγμένο ελέγχου όταν STAT3 ήταν πάνω εκφράζεται. Ένα παχύ μπάντα του συνολικού STAT3 μπορεί να δει κανείς στο κάτω τμήμα του, επιβεβαιώνοντας την επιτυχή επιμόλυνση STAT3 σε αυτούς τους κλώνους. (D) πραγματικού χρόνου RT-PCR που δείχνει την έκφραση των STAT3, Sox2, oct3 /4 και Nanog πριν και μετά την STAT3 πάνω έκφραση στο knockdown κλώνο RhoC. Η έκφραση του mRNA της STAT3 ήταν εντυπωσιακά υψηλό μετά είναι πάνω έκφραση, ενώ καμία σημαντική αλλαγή στην έκφραση παρατηρήθηκε σε Sox2, oct3 /4 και Nanog στα νοκ ντάουν κλώνο RhoC.

Η

Για να επιβεβαιωθεί ότι η φωσφορυλίωση της STAT3 συμβαίνει μέσω της οδού σηματοδότησης RhoC, εμείς εκτοπικά υπερεκφράζεται STAT3 σε RhoC knockdown γραμμή (UM-SCC-1). Τα συνολικά επίπεδα STAT3 στο περιπλεγμένο έλεγχο και RhoC knockdown κλώνων όταν STAT3 υπερεκφράστηκε εμφάνισαν ισχυρή συγκροτήματα, που σημαίνει επιτυχή επιμόλυνση των STAT3. Αισθητά, το p-STAT3

tyr705 μπορεί να δει μόνο σαφώς στο STAT3 υπερεκφράζουν ομελέτα κυτταρική γραμμή ελέγχου. Πιο συγκεκριμένα, στην knockdown RhoC υπερεκφράζονται STAT3 κλώνος, υπήρξε μέτριος φωσφορυλίωση της STAT3 στο Tyr-705 που θα μπορούσαν να παρατηρηθούν, και ήταν πολύ παρόμοια με τα επίπεδα έκφρασης που παρατηρούνται στις αρχικές RhoC knockdown κλώνους (Σχ. 5C).

Επίσης, αναλύσαμε τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της Nanog, Sox2, και oct3 /4 στο STAT3 πάνω εκφράζεται RhoC νοκ ντάουν κλώνος (UM-SCC-1). Όπως φαίνεται στο σχήμα 5D, μια αξιοσημείωτη αύξηση στην έκφραση της STAT3 mRNA παρατηρήθηκε σε αυτή την κυτταρική σειρά, αλλά η έκφραση των παραγόντων μεταγραφής πυρήνα βλαστοκυττάρων, Nanog, Sox2, και oct3 /4 είναι-αμετάβλητες και παρόμοια με αυτή που παρατηρήθηκε στην RhoC νοκ ντάουν γραμμές.