Αφηρημένο

Τα microRNAs (Mirs) παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης κατά τη διάρκεια των διαδικασιών της ογκογένεσης και ανάπτυξης του όγκου. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι miR-145 ρυθμίζεται προς τα κάτω στο νεόπλασμα στομάχι και σχετίζεται με τη μετανάστευση και την εισβολή του όγκου. Ωστόσο, τόσο ο μοριακός μηχανισμός και η λειτουργία των miR-145 σε γαστρικό καρκίνο παραμένουν ασαφείς. Η παρούσα μελέτη είναι η πρώτη απόδειξη της σημαντικής προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης miR-145 στην διηθητική γαστρικό καρκίνο σε σχέση με την επέκταση του καρκίνου του στομάχου. Επιπλέον, η συσχέτιση αναλύσεις αποκάλυψαν ισχυρή αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ miR-145 και τα επίπεδα έκφρασης FSCN1 σε διηθητική καρκίνο του στομάχου. Επιπλέον, αποδείξαμε ότι miR-145 στοχεύει άμεσα FSCN1 και καταστέλλει την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή σε γαστρικό καρκίνο. Να χτυπήσει κάτω την έκφραση της FSCN1 οδήγησε στην καταστολή της μετανάστευσης και της εισβολής στο γαστρικό καρκινικά κύτταρα, και την εκ νέου εκφράζουν FSCN1 στο miR-145-κύτταρα που υπερεκφράζουν αντιστραφεί η μετανάστευση και την εισβολή ελαττώματα τους. Έτσι, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι το miR-145 ρυθμίζει την κυτταρική μετανάστευση και την εισβολή στο γαστρικό καρκίνο κυρίως με την άμεση στόχευση FSCN1

Παράθεση:. Chen JJ, Cai Wy, Liu XW, Luo Qc, Chen G, Huang Wf, κ.ά. . (2015) Η αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ microRNA-145 και FSCN1 που επηρεάζουν γαστρικός καρκίνος Μετανάστευση και την εισβολή. PLoS ONE 10 (5): e0126890. doi: 10.1371 /journal.pone.0126890

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Chengfeng Yang, το Michigan State University, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 14 Ιαν. 2015? Αποδεκτές: 8 Απριλίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: May 26, 2015

Copyright: © 2015 Chen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. 1. Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Grant Νο 81172283) JCC (https://www.nsfc.gov.cn/). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. 2. Φυσικό Ίδρυμα Επιστημών της επαρχίας Fujian (Grant Νο 2012D037) JCC (https://xmgl.fjkjt.gov.cn/). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνο του στομάχου έχει ένα από τα υψηλότερα ποσοστά θανάτου για τους κακοήθεις όγκους σε όλο τον κόσμο [1]. Βελτιωμένη ιατρική τεχνολογία μπορεί να βελτιώσει το αποτέλεσμα του γαστρικού καρκίνου. Ωστόσο, γαστρικό καρκίνος παραμένει η δεύτερη πιο κοινή αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους [2], η οποία προκαλείται από την εισβολή του όγκου και τη μετάσταση. Μαζί, εισβολή και μετάσταση σχηματίζουν μια διαδικασία κατά την οποία τα κακοήθη κύτταρα του όγκου να μεταφέρει από μια πρωτογενή θέση και σε άλλους τομείς και, στη συνέχεια, σχηματίζουν όγκους σε μία απομακρυσμένη θέση μέσω του λεμφικού κανάλι, τα αιμοφόρα αγγεία ή κοιλότητα του σώματος [3]. Ως εκ τούτου, η αποσαφήνιση των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην ανάπτυξη και διηθητικότητα του γαστρικού καρκίνου είναι απαραίτητη.

Το 1977, Ming ταξινομούνται γαστρικά καρκινώματα σε επέκταση και διηθητική τύπους με βάση τα πρότυπα ανάπτυξης και διεισδυτικότητα τους [4]. Αυτοί οι τύποι είναι εύκολα αναγνωρίσιμα ιστολογικά. Επέκταση καρκινώματα αναπτύσσονται μαζικά και μέσω διαστολής με αποτέλεσμα το σχηματισμό διακριτών οζίδια όγκου, ενώ διηθητική καρκινώματα έχουν καρκινικά κύτταρα που εισβάλλουν ατομικά [5]. Από τους δύο τύπους καρκίνου του στομάχου, γαστρικό καρκίνο διηθητική είναι πιο επεμβατική από την επέκταση γαστρικού καρκίνου. Μια τέτοια ταξινόμηση παρέχει έτσι μια αναφορά για τη διάκριση γαστρικό καρκίνο δείγματα κλινικά και διευκολύνει λεπτομερείς μελέτες σχετικά με τους μοριακούς μηχανισμούς του γαστρικού καρκίνου.

Τα microRNAs (Mirs) παίζουν κρίσιμους ρόλους σε πολλές βιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένων των διεργασιών του καρκίνου, με την άμεση αναστολή της η έκφραση των mRNAs στόχου μέσω διαφόρων μοριακών μηχανισμών [6, 7]. Επιπλέον, Mirs υφίστανται παρεκκλίνουσα ρύθμιση κατά την καρκινογένεση και μπορεί να λειτουργήσει είτε ως ογκογονίδια ή καταστολείς των όγκων [7]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι πολλές Mirs επηρεάζουν πολλαπλασιασμό και εισβολή σε γαστρικό καρκίνο. miR-21 είναι επάνω ρυθμισμένο σε καρκίνο του στομάχου και προωθεί τον πολλαπλασιασμό όγκου και εισβολή σε γαστρικό καρκίνο με τη στόχευση ΡΤΕΝ [8]. Σε αντίθεση, miR-145 ρυθμίζεται προς τα κάτω σε ανθρώπινο γαστρικό καρκίνο [9]. Επιπλέον, η έρευνα έχει δείξει ότι miR-145 μπορεί να καταστείλει την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή με αναστολή της μετάφρασης πρωτεΐνης Ν-καδερίνης σε γαστρικό καρκίνο κύτταρα [10]. Ωστόσο, Kamikihara κ.ά. [11] ανιχνεύθηκαν τα επίπεδα έκφρασης του Ν-καδερίνης σε 146 ασθενείς με καρκίνο του στομάχου με ανοσοϊστοχημεία, και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι μόνο 31 ασθενείς (21%) είχαν έκφραση Ν-καντερίνης-θετικά. Ως εκ τούτου, ορισμένες άλλες μοριακών μηχανισμών miR-145 θα μπορούσε να ρυθμίζουν την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή σε γαστρικό καρκίνο.

FSCN1 είναι μία πρωτεΐνη δεσμεύσεως της ακτίνης 55-kDa που σχετίζεται με filopodia και σχηματισμός προεξοχής ακτίνης βάση, και προάγει κυτταρική κινητικότητα, μετανάστευση και εισβολή [12, 13]. έκφραση FSCN1 είναι απούσα ή χαμηλή σε κανονικές επιθήλια, αλλά FSCN1 υπερεκφράζεται σε πολλά καρκινώματα, συμπεριλαμβανομένων του παχέος αδενώματα, επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών και οισοφαγικό καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων [14-16]. Επιπλέον, μια σειρά από μελέτες έχουν δείξει ότι επιβάλλεται FSCN1 έκφραση αυξάνει τον πολλαπλασιασμό και την εισβολή των ωοθηκών και του γαστρικού καρκίνου κύτταρα [17, 18].

Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι το miR-145 λειτουργεί ως καταστολέας των όγκων και ότι miR-145 υπερέκφραση καταστέλλει τη μετανάστευση και την εισβολή του καρκίνου του προστάτη και καρκίνου της ουροδόχου κύστης με τη στόχευση FSCN1 [19, 20]. Επιπλέον, miR-145 καταστέλλει γαστρικού μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή από τη στόχευση Ν-καδερίνης. Ωστόσο, ο θετικός ρυθμός έκφραση του Ν-καδερίνης σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς είναι μόνο 21% [10, 11]. Ως εκ τούτου, τον προσδιορισμό του κλειδιού γονίδιο στόχο του miR-145 στη ρύθμιση της γαστρικής εισβολή του καρκίνου είναι απαραίτητο.

Στην παρούσα μελέτη, διαπίστωσε καταρχάς ότι το miR-145 έκφρασης αξιοσημείωτα κάτω-ρυθμίζονται σε διηθητική γαστρικού καρκίνου σε σύγκριση με εκείνη στην επέκταση γαστρικού καρκίνου. Επιπλέον, στοιχεία που αποδεικνύουν ότι το miR-145 κατέστειλε την κυτταρική μετανάστευση και την εισβολή στο γαστρικό καρκίνο κυρίως με την άμεση στόχευση FSCN1, η οποία υπογράμμισε το ρόλο του miR-145 και FSCN1 στη ρύθμιση του γαστρικού καρκίνου κακοήθη φαινότυπο.

Υλικά και μέθοδοι

κλινικά δείγματα

Όλα τα κλινικά δείγματα συλλέχθηκαν με την ενημερωμένη συγκατάθεση των ασθενών που υποβλήθηκαν σε γαστρεκτομή στο Zhongshan Νοσοκομείο του Πανεπιστημίου Xiamen στην Xiamen (επαρχία Fujian, Κίνα) από Ιούνιος 2012 – Οκτώβριος 2013 . Συνολικά, τα 160 ζευγάρια που συλλέγονται κλινικών δειγμάτων που περιλαμβάνονται 80 αταξινόμητη γαστρικό δείγματα καρκίνου, 40 διηθητική γαστρικό δείγματα καρκίνου και 40 επέκταση γαστρικό δείγματα καρκίνου. Ο όγκος παθολογική τύπος επιβεβαιώθηκε με εξέταση παθολογία, και τα συμφωνημένα φυσιολογικό γαστρικό βλεννογόνων συλλέχθηκαν από περισσότερα από 5 εκατοστά μακριά από τους όγκους.

Ηθική δήλωση

Τα πρωτόκολλα μελέτης ήταν, σύμφωνα με το ηθικές οδηγίες της Διακήρυξης του Ελσίνκι (1975) και εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Ιατρικής Δεοντολογίας (Νο 20081012) του Zhongshan Νοσοκομείο του Πανεπιστημίου Xiamen στην Xiamen (επαρχία Fujian, Κίνα). Έχουμε λάβει γραπτές δηλώσεις συγκατάθεση από όλους τους συμμετέχοντες που εμπλέκονται σε αυτή τη μελέτη.

Οι κυτταρικές σειρές

Οι MGC-803 και SGC-7901 ανθρώπινες κυτταρικές σειρές γαστρικού καρκίνου αγοράστηκαν από το Ινστιτούτο Κυτταρικής Βιολογίας (Σαγκάη , την Κίνα, https://www.cellbank.org.cn). Η ανθρώπινη εμβρυϊκή νεφρική κυτταρική γραμμή 293Τ ελήφθη από την American Type Culture Collection (ATCC, MD, USA). MGC-803 και SGC-7901 κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI-1640, ενώ τα κύτταρα 293Τ διατηρήθηκαν σε DMEM. Όλα τα μέσα περιείχαν 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).

λουσιφεράσης ανταποκριτής δοκιμασία

Τα κύτταρα επιμολυσμένα με γονίδια λουσιφεράσης, β-γαλακτοσιδάσης (β-gal) και miR-145 μιμείται ή αναστολέα miR-145 (Guangzhou RiboBio) με τη χρήση αντιδραστηρίου επιμόλυνσης Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε σε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, και η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης ομαλοποιήθηκε με την εσωτερική δραστικότητα β-gal.

εξαγωγή RNA και RT-qPCR

Το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen ) και μεταγράφηκε ανάστροφα με την M-MuLV αντίστροφη μεταγραφάση (Qiagen) για να παραχθεί cDNA σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Real-time PCR χρησιμοποιώντας ανίχνευση SYBR Green-έδρα σε Rotor-Gene 6000 μέσου (Corbett Life Science) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και χρησιμοποιώντας τα ζεύγη εκκινητών που παρατίθενται στον Πίνακα 1. miR-145 και εκκινητές U6 ελήφθησαν από Qiagen. GAPDH ή U6 ενδογενούς ελέγχου χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικό πρότυπο, και τα αποτελέσματα υπολογίστηκαν με τη χρήση του △△ CT (όπου CT είναι ο κύκλος όριο) μέθοδο.

Η

πλασμίδιο κατασκευή

Η οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή των λουσιφεράσης ρεπόρτερ και τα πλασμίδια παρατίθενται στον πίνακα 1. το ανθρώπινο FSCN1 3 ‘αμετάφραστη περιοχή (UTR) ενισχύθηκε από MGC-803 cDNA με ενίσχυση PCR με το LA Taq DNA πολυμεράσης (Takara) και κλωνοποιήθηκε κατάντι του η λουσιφεράση αλληλουχία κωδικοποίησης στον φορέα pMIR-REPORT (Ambion) στις θέσεις περιορισμού SacI και ΜΙυΙ (Promega) για την κατασκευή της ανθρώπινης FSCN1-3’UTR-λουσιφεράσης. Μεταλλάξεις εισήχθησαν στις θέσεις miR δέσμευσης χρησιμοποιώντας ένα QuikChange Mutagenesis Kit (διαγονιδιακής). Για τα πλασμίδια εκφράσεως miR-145 και FSCN1, αλληλουχίες ενισχύθηκαν με PCR και κλωνοποιήθηκε στις θέσεις SpeI /NheI και θέσεις Xbal /NdeI, αντίστοιχα, του PLV-cs.4.0-βασικό φορέα (Promega). Για το πλασμίδιο FSCN1 παρεμβολή, δύο ζεύγη ακολουθιών ανοπτήθηκαν και υποκλωνοποιήθηκαν σε PLKO.1 σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

λεντοϊών παραγωγή και την επιμόλυνση

κύτταρα ΗΕΚ293Τ σπάρθηκαν σε 6-φρεατίων ένθετο στις 24 ώρες πριν από την επιμόλυνση. Το πλασμίδιο έκφρασης miR-145, το πλασμίδιο έκφρασης ή πλασμίδιο FSCN1 FSCN1 shRNA κατόπιν συν-επιμολύνθηκαν με πλασμίδια συσκευασίας (PHR και pCMV-VSV-G) χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο διαμόλυνσης Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Viral υπερκείμενα συλλέχθηκαν στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, φυγοκεντρείται στα 3000 g για 15 λεπτά, και διηθήθηκε μέσω φίλτρων 0,45 μm (Millipore). Viral τίτλοι προσδιορίστηκαν με μεταγωγή κυττάρων HeLa σε σειριακές αραιώσεις και την ανάλυση της έκφρασης GFP μέσω κυτταρομετρίας ροής. MGC-803 κύτταρα ή 7901 κύτταρα σε 50-70% συρροή μολύνθηκαν με ιικά υπερκείμενα που περιέχουν 10 mg /ml Polybrene για 24 ώρες. Φρέσκο ​​μέσο προστέθηκε στη συνέχεια στα μολυσμένα κύτταρα, που στη συνέχεια επιλέγονται με πουρομυκίνη.

μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή δοκιμασία

Τα κύτταρα (3×10

5), απλώθηκαν σε 8.0 μm μέγεθος πόρων Boyden θαλάμων (Transwell, Corning Life Sciences, Acton, μΑ, USA) είτε επικαλυμμένων με 10 μα Matrigel (BD Bioscience, Bedford, μΑ, USA) ανά φρεάτιο (για εισβολή δοκιμασίες) ή προς τα αριστερά μη επικαλυμμένο (για δοκιμασίες μετανάστευσης) σε ελεύθερο ορού μέσο που περιέχει 10 g /L λευκωματίνης βόειου ορού. Μέσο που περιέχει 10% FBS χρησιμοποιήθηκε ως χημειοελκτικό στον κατώτερο θάλαμο. Μη εισβάλλοντας κύτταρα απομακρύνθηκαν με μπατονέτες μετά από 36 ώρες (για προσδιορισμούς εισβολής) ή 20 ώρες (για τις δοκιμασίες μετανάστευσης). Εισβολή κύτταρα βάφτηκαν με αιματοξυλίνη (ΗΕ) και μετρήθηκαν. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD από τρία ξεχωριστά πειράματα

κηλίδωση Western

Οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν με ρυθμιστικό λύσης ερυθροκυττάρων (ELB?. 50 mM Tris, 140 mM NaCl, 0,5% ΝΡ 40 και 100 mM NaF (ρΗ 7.6)) που περιέχει 1 mM φαινυλομεθανοσουλφονυλο φθοριδίου (PMSF? Sigma-Aldrich, USA). Κάθε δείγμα διαχωρίστηκε σε πήκτωμα 10% SDS-PAGE και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν πάνω σε διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) μεμβράνες. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% γάλα και επωάστηκαν με αντι-ανθρώπινο αντίσωμα FSCN1 πρωτογενούς κουνελιού (1: 3000? Cell Signaling Technology, USA) ή αντι-ανθρώπινο GAPDH ποντικού (1: 5000? Sigma-Aldrich) αντίσωμα όλη τη νύκτα στους 4 ° C . Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με το κατάλληλο υπεροξειδάση (HRP), συζευγμένης δευτερεύοντα αντισώματα (Thermo Fisher Scientific). Οι ζώνες αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας σύστημα ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL) (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK). Η πρωτεΐνη GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. Η στατιστική σημαντικότητα αναλύθηκε με t-test του Student. Η συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων miR-145 και τα επίπεδα έκφρασης του mRNA FSCN1 /πρωτεΐνης σε ανθρώπινο γαστρικό καρκίνους υπολογίστηκε με συσχέτιση Spearman του. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism λογισμικό στατιστικής (GraphPad Software).

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική (NS, δεν είναι σημαντική? *

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01? *** Em

P

& lt?. 0.001)

Αποτελέσματα

ισχυρή αντίστροφη σχέση μεταξύ της έκφρασης του miR-145 και υποθετικό στόχο της, FSCN1, στην ανθρώπινη διηθητική τύπου γαστρικού καρκίνου

Χρησιμοποιήσαμε τη βάση δεδομένων TargetScan (https://www.targetscan.org) για τον εντοπισμό των «UTRs 3 συγκεκριμένων mRNAs στόχος της miR-145, που μπορεί να ρυθμίζει τη μετανάστευση και την εισβολή των γαστρικών καρκινικών κυττάρων. Από όλες τις προβλεπόμενες mRNAs, επιλέξαμε FSCN1, το οποίο έχει προηγουμένως εμπλακεί στη μετανάστευση όγκου και εισβολή. FSCN1 επίσης έχει εξαιρετικά διατηρημένες αλληλουχίες στο 3 ‘UTR που είναι συμπληρωματικά προς την αλληλουχία σπόρο miR-145.

Αρχικά, ερευνήσαμε εάν η συσχέτιση του miR-145 και FSCN1 θα μπορούσε να είναι κλινικά σχετικές με τη μέτρηση της έκφρασης του miR-145 και FSCN1 mRNA επίπεδα /πρωτεΐνης σε κανονική /όγκου ζεύγη δειγμάτων από 80 ασθενείς με καρκίνο του στομάχου. Η στατιστική ανάλυση αποκάλυψε σημαντική αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του miR-145 και την έκφραση του mRNA FSCN1 /πρωτεΐνης στα 80 ζεύγη κλινικών δειγμάτων (Σχήμα 1Α και 1Β).

(Α) αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ miR επίπεδα -145 έκφρασης και FSCN1 mRNA σε κανονικό /όγκου σε συνδυασμό γαστρικό δείγματα καρκίνου (

P

= 1.63E-7? Spearman rank test συσχέτισης: r = -0,7646? n = 80). (Β) αντίστροφη σχέση ανάμεσα στην έκφραση του miR-145 και τα επίπεδα της πρωτεΐνης FSCN1 (

P

= 3.12E-6? R = -0,6754? N = 80).

Η

ταξινομούνται Μινγκ γαστρικό καρκινώματα σε επέκταση τύπου και διηθητική τύπου βασίζονται σε πρότυπα ανάπτυξης και της εισβολής, και υπάρχει ένας συσχετισμός μεταξύ ταξινόμησης Ming και την κλινική πρόγνωση [5]. Ως εκ τούτου, 40 διηθητική γαστρικό δείγματα καρκίνου και 40 επεκτείνεται γαστρικό καρκίνο δείγματα επιλέχθηκαν όπως υποδεικνύεται από τον εκπρόσωπο χρώση HE (Σχήμα 2Α). Σε αυτή την κατάταξη, τα κύτταρα της διευρυνόμενης καρκινώματος, λόγω της περιορισμένης διεισδυτική δύναμη τους, συνολική και παράγουν μια περιγεγραμμένη μάζα με τη μορφή πολυποειδούς και fungating βλάβες. Σε αντίθεση, τα κύτταρα του καρκινώματος διηθητικής εξαπλωθεί περιφερειακά και ευρέως, και μια μάζα όγκου δεν σχηματίζει. Ελέγξαμε την έκφραση του miR-145 και FSCN1 mRNA σε καρκίνο του στομάχου σε σύγκριση με τον παρακείμενο φυσιολογικό γαστρικό βλεννογόνο με πραγματικού χρόνου PCR. miR-145 ήταν εντυπωσιακά κάτω-ρυθμίζονται σε διηθητική γαστρικού καρκίνου σε σύγκριση με την επέκταση καρκίνο του στομάχου, ενώ η έκφραση του mRNA FSCN1 ήταν εντυπωσιακά up-ρύθμιση (Σχήμα 2Β). Έχουμε επιλέξει 10 διηθητική γαστρικό δείγματα καρκίνου και 10 επεκτείνεται γαστρικό καρκίνο δείγματα μαζί με τα γειτονικά τους φυσιολογικούς ιστούς να αναλύσουν έκφραση με qPCR και κηλίδωση Western. Τα συνολικά επίπεδα έκφρασης του miR-145 ήταν χαμηλότερα, ιδιαίτερα στις διηθητική γαστρικό καρκίνο δείγματα σε σύγκριση με τον παρακείμενο φυσιολογικό γαστρικό βλεννογόνο. Σε αντίθεση, τα συνολικά επίπεδα του mRNA /πρωτεΐνης FSCN1 ήταν υψηλότερες στην διηθητική γαστρικού καρκίνου (Σχήμα 2C). Κατά συνέπεια, η έκφραση του miR-145 και υποθετικό στόχο της FSCN1 είχε μια ισχυρή αντίστροφη σχέση με την ανθρώπινη διηθητική τύπος καρκίνου του στομάχου, γεγονός που υπονοεί ότι οι ουσιαστικό ρόλο του miR-145 και FSCN1 είναι σε γαστρικό εισβολή του καρκίνου.

( Α) Γαστρικό δείγματα καρκίνο που προέρχεται από 80 ασθενείς ταξινομήθηκαν όπως υποδεικνύεται από τον εκπρόσωπο χρώση HE. (Β) στοιχεία qPCR του miR-145 επίπεδα σε διηθητική γαστρικό καρκίνο (n = 40) σε σύγκριση με την επέκταση του γαστρικού καρκίνου (n = 40) (

P

= 8.87E-6) (αριστερά), και τα δεδομένα qPCR των επιπέδων FSCN1 mRNA σε διηθητική γαστρικό καρκίνο (n = 40) σε σύγκριση με την επέκταση του γαστρικού καρκίνου (n = 40) (

P

= 1.18E-10) (δεξιά). (C) Αντιπροσωπευτική έκφραση των επιπέδων /πρωτεΐνης miR-145 και FSCN1 mRNA σε 10 διηθητική γαστρικό δείγματα καρκίνου και 10 επεκτείνεται γαστρικό καρκίνο δείγματα μαζί με τα γειτονικά τους φυσιολογικούς ιστούς (Ν, παρακείμενο φυσιολογικό ιστό? Τ, καρκινικό ιστό). Αραβικά αριθμοί δείχνουν μεμονωμένα ζεύγη δειγμάτων. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

miR-145 στοχεύει άμεσα FSCN1 στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα

Για να προσδιορίσετε αν το miR-145 ρυθμίζει την έκφραση των FSCN1 στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα, πρέπει πρώτα να ρυθμίζεται προς τα πάνω το επίπεδο των miR-145 στο γαστρικό καρκινικά κύτταρα MGC-803 χρησιμοποιώντας έναν φορέα λεντοϊού που βασίζεται. Στη συνέχεια εκτελείται qPCR, η οποία αποκάλυψε ότι miR-145 υπερέκφραση σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται το επίπεδο του mRNA του FSCN1 (Σχήμα 3Α), και τα πειράματα στυπώματος western επιβεβαίωσε ότι το επίπεδο πρωτεΐνης του FSCN1 επίσης κατέστειλε σε miR-145-κύτταρα που υπερεκφράζουν (Σχ 3Β ). Αντίθετα, νοκ ντάουν του miR-145 επίπεδα με τη χρήση ενός αναστολέα miR-145 οδήγησε σε σημαντικά επαγόμενη έκφραση /πρωτεΐνης FSCN1 mRNA τόσο SGC-7901 και MGC-803 κύτταρα (Σχήμα 3C). Έχουμε δημιουργήσει μια πυγολαμπίδας φορέα αναφοράς λουσιφεράσης που περιέχει UTR του FSCN1 3 ‘και στη συνέχεια συν-επιμολυσμένα κύτταρα MGC-803 με miR-145 μιμείται ή έναν αναστολέα miR-145 για να διερευνήσει εάν FSCN1 είναι άμεσος στόχος του miR-145. Τα προϊόντα λύσης αναλύθηκαν για δραστικότητα λουσιφεράσης 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Η δοκιμασία λουσιφεράσης έδειξε ότι οι miR-145 μιμείται οδήγησε σε μία κατά προσέγγιση μείωση 55% της δραστηριότητας, ενώ ο αναστολέας miR-145 αύξησε την δραστικότητα λουσιφεράσης κατά 62% σε MGC-803 κυττάρων σε σύγκριση με το miR-αρνητικό μάρτυρα (Σχήμα 3D). Επιπλέον, έχουμε μεταλλαχθεί τρία σημαντικά στοιχεία υποθετική αναγνώριση miR-145 (MRes) στην FSCN1 3 ‘UTR μέσω QuikChange μεταλλαξογένεσης για χρήση στην δοκιμασία λουσιφεράσης (Σχήμα 3D). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι ρυθμιστικές επιπτώσεις των miR-145 μιμείται ή miR-145 αναστολέα ήταν κατά κύριο λόγο καταργηθεί, η οποία επιβεβαίωσε ότι οι φίμωση αποτελέσματα των miR-145 στην FSCN1 καταργήθηκαν από τη διακοπή των αλληλεπιδράσεων miR-MRE (Σχήμα 3D). Συλλογικά, οι μελέτες αυτές παρέχονται πειστικές αποδείξεις ότι FSCN1 είναι ένας άμεσος στόχος του miR-145 στο γαστρικό καρκινικά κύτταρα.

(Α) δεδομένων qPCR των επιπέδων FSCN1 mRNA σε MGC 803 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά το LV-GFP (έλεγχος ) και LV-miR-145 φορείς λεντοϊών (δεξιά), και τα αποτελέσματα qPCR δείχνει τα επίπεδα υπερέκφραση του miR-145 (αριστερά). (Β) miR-145 υπερέκφραση σημαντικά κάτω ρύθμιζε την έκφραση της πρωτεΐνης FSCN1 σε MGC-803 κύτταρα. (C) δεδομένα qPCR του miR-145 επίπεδα και τα επίπεδα mRNA σε FSCN1 SGC-7901 (αριστερά) ή κύτταρα MGC-803 (μέση) επιμολυσμένα με αναστολέα Ctrl ή αναστολέα miR-145. Ο αναστολέας miR-145 σημαντικά up-ρύθμιση της έκφρασης της πρωτεΐνης FSCN1 στη ΓΓΕ-7901 και MGC-803 κύτταρα (δεξιά). (D) Ένα λουσιφεράσης φορέα ανταποκριτή που περιέχει ‘UTR ή Mut-FSCN1 3’ ανθρώπινης WT-FSCN1 3 UTR ήταν συν-επιμολυσμένα με miR-145 μιμείται ή miR-145 αναστολέα σε MGC-803 κύτταρα. Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε σε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση και δραστικότητα κανονικοποιήθηκε ως προς β-gal. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων (**

P

& lt? 0,01? ***

P

& lt? 0.001).

Η

καταστολή FSCN1 είναι απαραίτητη για miR-145 να αναστέλλουν την μετανάστευση και την εισβολή του γαστρικού καρκίνου κυττάρων

γαστρικό καρκίνο MGC-803 και SGC-7901 κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με δύο διαφορετικά FSCN1 τα siRNAs να αναστέλλουν FSCN1 να κατανοήσουν καλύτερα ο πιθανός ρόλος της FSCN1 στο miR-145 με τη μεσολάβηση της μετανάστευσης όγκου και την εισβολή. Η αποτελεσματικότητα παρεμβολή του FSCN1 Τα siRNAs επιβεβαιώθηκε με ανάλυση κηλίδος western (Σχήμα 4Α και 4Β). Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας Transwell έδειξαν ότι η ικανότητα των κυττάρων να μεταναστεύουν και εισβάλλουν ήταν ιδιαίτερα κατεστάλη μετά από να χτυπήσει κάτω την έκφραση της FSCN1 σε MGC-803 και SGC-7901 κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα αρνητικού ελέγχου (Εικόνα 4C και 4D), υποδεικνύοντας με αυτόν τον τρόπο ουσιαστικό ρόλο από FSCN1 σε αυτές τις διαδικασίες.

(Α και Β) κηλίδωση Western χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί η σχετική έκφραση FSCN1 πρωτεΐνης σε MGC-803 (Α) και τα κύτταρα SGC-7901 (Β) που εκφράζουν σταθερά lacZ shRNA και δύο διαφορετικά FSCN1 Τα siRNAs. (Γ και Δ) ShFSCN1 MGC-803 (C) ή SGC-7901 (D) κύτταρα παρουσίασαν μειωμένη μετανάστευση και εισβολή ικανότητα σε σύγκριση με shCtrl MGC-803 ή SGC-7901 κύτταρα. Αντιπροσωπευτικές εικόνες (επάνω) και ο αριθμός των κυττάρων (κάτω μέρος) που φαίνεται. AU: αυθαίρετες μονάδα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων (***

P

& lt? 0.001).

Η

miR-145 είναι γνωστό ότι καταστέλλει τη μετανάστευση και την εισβολή του πολλούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του στομάχου [10, 19, 21]. Όπως ήταν αναμενόμενο, επιβάλλεται η έκφραση του miR-145 είχε ως αποτέλεσμα μειώθηκε σημαντικά ποσοστά μετανάστευσης και την εισβολή στην MGC-803 και SGC-7901 κύτταρα. Επιπλέον, η ταυτόχρονη επανέκφραση του FSCN1 κίνδυνο την miR-145-κατασταλεί κυτταρική μετανάστευση και εισβολή ικανότητα σχεδόν πλήρως σε αμφότερες miR-145-μορφομετατραπέντα MGC-803 και SGC-7901 κύτταρα (Σχήμα 5Α και 5Β). Αντίθετα, χρησιμοποιήσαμε FSCN1 shRNA για την αναστολή της έκφρασης FSCN1 στο miR-145 αναστολέα-επιμολυσμένα MGC-803 και SGC-7901 κύτταρα. Εξόντωση FSCN1 αντιστραφεί πλήρως το miR-145 αναστολέα διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της κυτταρικής μετανάστευσης και της εισβολής, υποδηλώνοντας έτσι τον ουσιαστικό ρόλο της FSCN1 σε αυτή τη διαδικασία (Σχήμα 5C και 5D). Συλλογικά, τα ανωτέρω αποτελέσματα κατέδειξαν ότι η καταστολή του FSCN1 είναι απαραίτητη για miR-145 να αναστέλλουν την μετανάστευση και την εισβολή του γαστρικού καρκίνου κυττάρων.

(Α και Β) επανέκφραση του FSCN1 κίνδυνο την miR-145- κατασταλεί η κυτταρική μετανάστευση και την ικανότητα εισβολής σε αμφότερες miR-145-μορφομετατραπέντα κύτταρα MGC-803 (Α) και SGC-7901 (Β). Τα επίπεδα FSCN1 πρωτεΐνη (αριστερά), αντιπροσωπευτικών εικόνων (μέση) και ο αριθμός των κυττάρων (δεξιά) δείχνονται. (Γ και Δ) εξόντωση FSCN1 σε κίνδυνο τον αναστολέα προκαλούμενη κυτταρική μετανάστευση και εισβολή ικανότητα miR-145 σε αμφότερες miR-145 κύτταρα αναστολέα-επιμολυσμένα MGC-803 (C) και SGC-7901 (D). Τα επίπεδα FSCN1 πρωτεΐνη (αριστερά), αντιπροσωπευτικών εικόνων (μέση) και ο αριθμός των κυττάρων (δεξιά) δείχνονται. AU: αυθαίρετες μονάδα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων (ns, δεν είναι σημαντική? *

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01? ***

P

& lt?. 0.001)

Η

Συζήτηση

Η απελευθέρωση της Mirs έχει εμπλακεί σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένων των ανθρωπίνων γαστρικού καρκίνου. Ωστόσο, οι μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους Mirs ρυθμίζουν τη διαδικασία της καρκινογένεσης και της συμπεριφοράς των καρκινικών κυττάρων δεν έχουν πλήρως καθορισθεί. έκφραση Διαφορική miR σε όγκους σε σύγκριση με τα γειτονικά τους φυσιολογικούς ιστούς τους ή μεταξύ ομάδων δείγματα όγκου με θετική ή κακή κλινική έκβαση έχει χρησιμοποιηθεί για να δημιουργήσει miR υπογραφές με δυνατότητες προγνωστικές ή /και προγνωστική αξία σε ορισμένους τύπους καρκίνου. Παρ ‘όλα αυτά, η συμμετοχή των εκφράζονται ανώμαλα Mirs στον ανθρώπινο καρκίνο του στομάχου παραμένει σε μεγάλο βαθμό ανεξερεύνητη. Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι miR-145 ρυθμίζεται προς τα κάτω σε διάφορες ανθρώπινων κακοηθειών, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού, καρκίνο του πνεύμονα και καρκίνο του στομάχου [9, 22, 23]. Lu et al [24] διαπίστωσε ότι το miR-145 λειτουργεί ως ογκοκατασταλτικό και απευθύνεται σε δύο ογκογονίδια, δηλαδή ANGPT2 και NEDD9, στο νεφροκυτταρικό καρκίνωμα. Μια άλλη μελέτη έδειξε ότι miR-145 καταστέλλει την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή με αναστολή της μετάφρασης πρωτεΐνης Ν-καδερίνης σε γαστρικό καρκίνο κύτταρα [10]. Ωστόσο, Kamikihara et al [11] διαπίστωσε ότι μόνο το 21% των ασθενών με γαστρικό καρκίνο έχουν έκφρασης Ν-καντερίνης-θετικά όπως αναλύθηκε με ανοσοϊστοχημεία. Ως εκ τούτου, μία εναλλακτική μοριακός μηχανισμός υποκείμενες miR-145 εμπλέκεται στη ρύθμιση της μετανάστευσης των κυττάρων και εισβολή του γαστρικού καρκίνου.

Στην παρούσα μελέτη, έχουμε επιβεβαιώσει ότι miR-145 ρυθμίζεται προς τα κάτω σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με τον παρακείμενο φυσιολογικό γαστρικό βλεννογόνο, η οποία είναι συνεπής με τα προηγούμενα ευρήματα [9]. Σε μια προσπάθεια να εντοπίσει νέες κατάντη στόχοι του miR-145, χρησιμοποιήσαμε τη βάση δεδομένων TargetScan να εκτελέσει πειράματα διαλογής. Από πολλών υποψηφίων, επιλέξαμε FSCN1 για περαιτέρω πειράματα, επειδή FSCN1 έχει βρεθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στη μετανάστευση των όγκων και την εισβολή. Αρκετές γραμμές των αποδεικτικών στοιχείων δείχνουν ότι FSCN1 είναι η άμεση κατάντη στόχος του miR-145. Πρώτον, FSCN1 περιέχει εξαιρετικά διατηρημένες αλληλουχίες στο 3 ‘UTR που είναι συμπληρωματικά προς την αλληλουχία σπόρο miR-145. Δεύτερον, ένας αντίστροφος συσχετισμός μεταξύ miR-145 και FSCN1 βρέθηκε στα ζεύγη δειγμάτων από ασθενείς με καρκίνο του στομάχου. Τέλος, κατά την ταξινόμηση των κλινικών δειγμάτων σε επέκταση τύπου και διηθητική τύπου με βάση την ταξινόμηση του Ming, βρήκαμε ότι το miR-145 είναι εξαιρετικά κάτω-ρυθμίζονται σε διηθητική γαστρικό καρκίνο σε σχέση με την επέκταση του καρκίνου του στομάχου. Εν τω μεταξύ, μια ισχυρότερη αντίστροφη συσχέτιση ανιχνεύθηκε επίσης μεταξύ των επιπέδων έκφρασης του miR-145 και FSCN1 σε διηθητική καρκίνο του στομάχου. Η παρούσα μελέτη ρίξει νέο φως στη συσχέτιση μεταξύ miR-145 και FSCN1 σε διηθητική καρκίνο του στομάχου. Σε μια προηγούμενη μελέτη, Lauren χωρίζεται γαστρικών καρκίνων στις εξής δύο τύπους: εντερικού τύπου και διάχυτη τύπου [25]. Εντερική καρκίνος τύπου περιγράφεται ως αδενικό όγκο που μοιάζει κολονικού καρκινώματος, και διάχυτη καρκίνος τύπος αποτελείται από μοναχικά ή μικρών συστάδων κυττάρων χωρίς τον σχηματισμό αδένων. Οι τύποι των όγκων ταξινόμηση Lauren και Μινγκ αντιστοιχούν στενά μεταξύ τους. Οι περισσότεροι όγκοι επέκταση έχουν χαρακτηριστικά για καρκίνο του εντέρου τύπου, και οι περισσότεροι όγκοι είναι διηθητική διάχυτες καρκίνους τύπου [5]. Ωστόσο, ένας σημαντικός αριθμός των γαστρικών καρκινωμάτων δεν μπορούν να ταξινομηθούν σε εντερικό τύπο ή διάχυτη τύπου, συμπεριλαμβανομένων και αδιαφοροποίητα καρκίνους που δεν διηθούν διάχυτα και αδενικό καρκίνους που διηθούν διάχυτα. Επιπλέον, η ανίχνευση των πρώιμων γαστρικού καρκίνου χρησιμοποιώντας ταξινόμηση Lauren είναι σχετικά δύσκολη, επειδή η πρώιμη φάση της διάχυτης καρκίνο τύπου, εξ ορισμού, δεν διαχέονται. Ωστόσο, η ταξινόμηση των Μινγκ μπορεί να λύσει αυτά τα προβλήματα [5]. Στην ταξινόμηση των Μινγκ, τα πρότυπα κατανομής των κυττάρων αναφέρει σαφώς μια θεμελιώδη διαφορά στις δυνατότητες ανάπτυξής τους, καθώς και δύναμη της διείσδυσης και της εισβολής. Όπως διηθητική καρκίνο του στομάχου είναι πιο επεμβατική από την επέκταση του γαστρικού καρκίνου, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι το miR-145 και FSCN1 δύο παίζουν κρίσιμο ρόλο στη γαστρική εισβολή του καρκίνου.

Αν και αρκετές μελέτες έχουν ενοχοποιηθεί για τη ρύθμιση της FSCN1 από Mirs σε πολλά καρκινώματα [19, 20, 26], για το καλύτερο της γνώσης μας, καμία έκθεση έχει προταθεί ότι FSCN1 είναι ένας άμεσος στόχος του miR-145 σε καρκίνο του στομάχου. Σε αυτή τη μελέτη, επιβεβαίωσε ότι το miR-145 καταστέλλει την έκφραση FSCN1 άμεσα και στοχεύει στην 3 ‘UTR της FSCN1 στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα. Επιπλέον, η ταυτόχρονη εκ νέου έκφραση FSCN1 σε κίνδυνο το miR-145-κατασταλεί μετανάστευση των κυττάρων και την ικανότητα εισβολής σχεδόν πλήρως σε miR-145-επιμολυσμένα MGC-803 και SGC-7901 κύτταρα, τα οποία έδειξαν ότι η καταστολή της FSCN1 είναι απαραίτητη για miR -145 να αναστέλλουν την μετανάστευση και την εισβολή του γαστρικού καρκίνου κύτταρα. Ως εκ τούτου, FSCN1 είναι μια σημαντική προς τα κάτω στόχος του miR-145 στη ρύθμιση της γαστρικής εισβολή του καρκίνου.

Εν κατακλείδι, η παρούσα μελέτη διαπίστωσε ότι το miR-145 είναι κυρίως τα κάτω-ρυθμίζονται σε διηθητική καρκίνο του στομάχου και ότι miR-145 έκφρασης και η έκφραση FSCN1 έχουν μια ισχυρή αντίστροφη συσχέτιση με διηθητική καρκίνο του στομάχου. Λειτουργικά, αποδείξαμε ότι miR-145 καταστέλλει την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή σε γαστρικό καρκίνο κυρίως με την άμεση στόχευση FSCN1. Ως εκ τούτου, η αποκατάσταση της έκφρασης των miR-145 μπορούν να διερευνηθούν ως εναλλακτική θεραπευτική στρατηγική κατά του καρκίνου του στομάχου.