Αφηρημένο

Έχουμε περιγράψει την επιτυχή εφαρμογή μιας νέας προσέγγισης για τη δημιουργία διμερή αναστολείς Myc τροποποιώντας και αναστρέψιμα συνδέει δύο περιγράφηκε προηγουμένως μικρά μόρια. Συνθέσαμε δύο κατευθύνεται βιβλιοθήκες μονομερών, κάθε ένα αποτελείται από ένα συνδετήρα, ένα συνδετήρα, και ένα bioorthogonal στοιχείο συνδετήρα, για τον προσδιορισμό της βέλτιστης διαμόρφωσης διμερούς απαιτείται για την αναστολή Myc. Ταυτοποιήσαμε συνδυασμούς μονομερών, που ονομάζονται αναστολείς της διμερούς αυτο-συναρμολόγηση, η οποία εμφανίζεται συνεργική αναστολή της αύξησης Myc-εξαρτώμενη των κυττάρων. Επιβεβαιώσαμε ότι αυτά τα διμερή αναστολείς συνδέονται άμεσα με Myc αναστέλλοντας την αλληλεπίδρασή του με τον Max και να επηρεάσει τη μεταγραφή του εξαρτάται από MYC γονιδίων. συνδυασμοί ελέγχου που δεν είναι σε θέση να σχηματίσουν ένα διμερές δεν παρουσιάζουν συνεργιστικές επιδράσεις σε αυτές τις δοκιμασίες. Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα επικυρώνουν νέα προσέγγιση μας για να παράγουν περισσότερο ισχυροί και εκλεκτικοί αναστολείς της Myc από την αυτο-συναρμολόγησης από μικρότερα, κατώτερο συστατικά συγγένεια. Αυτή η προσέγγιση παρέχει μια ευκαιρία για την ανάπτυξη νέων μεθόδων θεραπείας από Myc και άλλες προκλήσεις πρωτεΐνης:. Τάξεις στόχο την αλληλεπίδραση πρωτεΐνης (PPI)

Παράθεση: Wanner J, Romashko D, Werner DS, Μάιος EW, Peng Υ, Schulz R, et al. (2015) Αναστρέψιμη σύνδεση δύο αναστολείς Διακριτές μικρό μόριο της Myc Δημιουργεί μια διμερής αναστολέα με βελτιωμένη ισχύ που είναι ενεργός σε Myc υπερεκφράζουν τον καρκίνο Γραμμές κυττάρων. PLoS ONE 10 (4): e0121793. doi: 10.1371 /journal.pone.0121793

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Alessandro Datti, Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Καναδάς

Ελήφθη: 8, Δεκεμβρίου 2014? Αποδεκτές: 19 Γενάρη 2015? Δημοσιεύθηκε: 15, Απριλίου 2015

Copyright: © 2015 Wanner et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Coferon, Inc. παρέχεται υποστήριξη με τη μορφή των μισθών για τους συγγραφείς JW, DR, DSW, EWM, YP, RS, KWF, SR, βουλευτής και ST , και LDA κατά το χρόνο της μελέτης. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, η συλλογή και ανάλυση δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Οι συγκεκριμένοι ρόλοι αυτών των συγγραφέων αρθρωτά στο τμήμα «Συγγραφέας Συνεισφορές ‘

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι JW, DR, DSW, EWM, YP, RS, KWF, SR, MP, ST και LDA συνδεδεμένες με Coferon Inc κατά το χρόνο της μελέτης. LDA είναι πλέον συνδεδεμένες με Συνέλευση Biosciences, Inc. MP, FB και DEB είναι ιδρυτές και μετόχους της Coferon, Inc. JW, KWF, DSW και LDA είναι συγγραφείς σε μια αίτηση για δίπλωμα ευρεσιτεχνίας που υποβάλλονται από Coferon Inc, που καλύπτει τα μόρια που περιγράφονται σε αυτό το χειρόγραφο. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

Η χρήση μικρών μορίων, όπως τα ναρκωτικά για να αναστέλλουν στόχους καρκίνος έχει κάνει τεράστια άλματα τα τελευταία 20 χρόνια, με πολλά φάρμακα στην καθημερινή κλινική χρήση σε ένα ευρύ φάσμα διαφορετικών καρκίνων. Αυτή η προσέγγιση υπήρξε ιδιαίτερα επιτυχής για την ενζυματική στόχους, όπου η θέση σύνδεσης είναι μια καλά καθορισμένη, διακριτή τσέπη στην πρωτεΐνη που προσφέρεται για την ορθολογική σχεδίαση πολύ ισχυροί αναστολείς. Ωστόσο, οι προσπάθειες να επεκταθεί η χρήση μικρών μορίων με στόχο μεγαλύτερα ή διαταραγμένες περιοχές επιφάνειας που είναι κρίσιμες για τη ρύθμιση των αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης (PPIs) έχουν εκπληρωθεί με πιο περιορισμένη επιτυχία. αναστολείς πρωτότυπη ΠΠΑ τείνουν να είναι μεγάλα σε μέγεθος και έχουν κακή ναρκωτικών, όπως ιδιότητες και έτσι έχουν περιορισμένη χρησιμότητα στην κλινική. Είναι σαφές τότε ότι οι καινοτόμες προσεγγίσεις χρειάζονται για να μπορέσει πλήρως την ανακάλυψη φαρμάκων για τον μεγάλο αριθμό αυτών που γενικά θεωρούνται θεραπευτικά σχετικών αλλά undruggable τάξεις στόχο σε πολλούς τομείς της νόσου.

Ως μία προσέγγιση για την αντιμετώπιση των πιο προκλητική φάρμακο στόχοι αναπτύσσουμε μια νέα τεχνολογία για να επιτρέψει αυτο-συναρμολόγηση των μικρών μορίων σε μεγάλα διμερή αναστολείς, περιγράφηκε για πρώτη φορά από Barany και οι συνεργάτες του [1]. Η τεχνολογική πλατφόρμα επιτρέπει την παράδοση των διμερή μόρια με ένα μεγάλο αποτύπωμα δέσμευσης για την αναστολή της βιολογικής τους στόχους που έχουν συχνά αμφισβητηθεί παραδοσιακά φαρμακευτικά προσεγγίσεις χημείας (Εικ. 1Α). Τα διμερή που αποτελούνται από δύο μονομερή, το καθένα περιλαμβάνει ένα συνδετήρα, ένα συνδετήρα και ένα bioorthogonal στοιχείο συνδετήρα. Υπό φυσιολογικές συνθήκες, τα μονομερή μπορούν ταχέως να ισορροπήσει σχηματίσει διμερή μέσω του σχηματισμού αναστρέψιμης ομοιοπολικών δεσμών μεταξύ των στοιχείων συνδετήρα. Οι συνδετήρες σχεδιαστεί για να είναι χαρακτηριστικές ομάδες χαμηλού μοριακού βάρους που μπορεί εύκολα να προσαρτηθεί στοχεύουν ειδικά προσδέματα μέσω κατάλληλων συνδέσμων. Οι συνδετήρες, συνδετήρες και συνδετήρες μπορούν όλα να τροποποιηθούν για συντονισμό των ιδιοτήτων των μονομερών και επιτρέπει βελτιστοποίηση της καλές ιδιότητες όμοια με φάρμακο για να επιτευχθεί το επιθυμητό φαρμακοκινητικό προφίλ. Οι βελτιστοποιημένες μονομερή μπορούν να απορροφηθούν, διανέμεται στους ιστούς, και να εισχωρήσει στα κύτταρα. Μόλις στο εσωτερικό του κυττάρου, τα μονομερή μπορούν να δεσμεύουν το στόχο άμεσα, επιτρέποντας ο στόχος να οδηγεί αυτο-συναρμολόγηση του διμερούς. Εναλλακτικά, τα μονομερή μπορούν να ισορροπήσει εκ νέου μέσα στο κύτταρο για να σχηματιστεί το διμερές σε διάλυμα, και το διμερές μπορεί να δεσμεύει άμεσα και αναστέλλουν τον στόχο. Ο βαθμός στον οποίο κάθε μονοπάτι συμβάλλει στην ανασταλτική δράση εξαρτάται από τις εγγενείς συγγένειες των συνδετήρων για τις αντίστοιχες θέσεις σύνδεσης τους στο στόχο, το μήκος του συνδετήρα, και τη συνεχή διμερισμό των συνδετήρων που χρησιμοποιούνται. Είτε μονοπάτι οδηγεί στην πρωτεΐνη-στόχο που δεσμεύεται από τα διμερή με υψηλότερη συγγένεια και μεγαλύτερη επιλεκτικότητα από ό, τι τα μονομερή συστατικά. Το βασικό πλεονέκτημα αυτής της προσέγγισης είναι ότι επιτρέπει για την ενδοκυτταρική παραγωγή ενός μεγάλου αναστολέα μόριο, κατάλληλα για τη στόχευση των επιφανειών αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης, ενώ διατηρείται η ικανότητα να κεφαλαιοποιήσει επί των ναρκωτικών, όπως ιδιότητες των μικρών εξαρτημάτων μόριο.

Α) Σχηματική αναπαράσταση της αυτο-συναρμολόγηση διμερούς προσέγγισης. Τα μεμονωμένα μονομερή (Μπλε και Πράσινο) αποτελείται από συνδέτη, συνδετήρα και ένα αντιστοιχισμένο συνδετήρα bioorthoganol παραδίδονται στα κύτταρα, διασχίζουν την μεμβράνη πλάσματος και αντιδρούν για να σχηματίσουν ένα ενεργό διμερή αναστολέα στα κύτταρα. συναρμολόγηση Διμερούς μπορεί να συμβεί στο κυτταρικό περιβάλλον ή επί του στόχου που ενδιαφέρει. Β) Σχηματική αναπαράσταση του βορονικού ισορροπιών οξέος /διόλης χρησιμοποιηθούν κατά το σχηματισμό του διμερούς. Επίπεδη τριγωνική, ουδέτερα είδη είναι σε ισορροπία με τα φορτισμένα χειρόμορφη τετραεδρική είδη. Για ένα δεδομένο διόλη, στο κυτταρικό περιβάλλον σε ρΗ 7,4 οι ισορροπίες καθορίζονται από τις pKas των βορονικών οξέων που χρησιμοποιούνται και από τις pKas των εστέρων βορονικού σχηματίζονται. Ρακεμοποίηση του χειρόμορφης φορτισμένων ειδών λαμβάνει χώρα πολύ γρήγορα και το βιολογικό στόχο θα επιλέξει για την πλέον προτιμώμενη διμερές. C) Περίληψη του σχεδίου της βιβλιοθήκης: Δομές των δύο μητρικών μορίων C01 (αριστερά) και C02 (δεξιά) και τις θέσεις προσάρτησης? συνδετήρες είναι είτε αλκυλο αλυσίδες ή PEG-μονάδες? R και R ‘συνδέονται με τις υποδοχές μέσω αμιδικών ή άνθρακα ομόλογα? Τα συνθετικά στοιχεία των επιλεγμένων μελών της βιβλιοθήκης παρέχεται στον συμπληρωματικό πειραματικές διαδικασίες.

Η

Μια ποικιλία από bioorthogonal συνδετήρες είναι δεκτικά σε αυτή την τεχνολογική πλατφόρμα. Εμείς και άλλοι έχουν περιγράψει αρύλ συνδετήρες βορονικό οξύ άτομο αποδοτικών που μπορεί αντιστρεπτά διμερίζονται με διάφορες κατεχόλες και

cis

-αλκύλιο διόλης εταίρους υπό υδατικές συνθήκες [1, 2, 3, 4] (Εικ. 1Β). Τα βορονικά οξέα και οι διόλες εταίρους να καταρτίσουν ισορροπία γρήγορα, με σταθερές διμερισμού συνήθως στο μΜ σε mM εύρος [5, 6]. Είναι σημαντικό ότι, η σταθερά διμερισμού μπορεί να ρυθμιστεί μέσω υποκαταστάτες. Για παράδειγμα, η εισαγωγή στερικών επιδράσεων στις δύο συνδετικής συνιστώσας disfavors βορονικός υδρόλυση εστέρα, μετατοπίζοντας το μονομερές-διμερούς ισορροπία προς το σχηματισμό διμερούς, το οποίο οδηγεί σε βελτιωμένη σταθερές διμερισμού [7, 8] και μπορεί να μεταφραστεί σε βελτιωμένη ισχύς του προκύπτοντος διμερούς αναστολέα. Και οι δύο οξύ και διόλη συνδετήρες βορικό μπορεί να προσαρτηθεί στην επιθυμητή συνδέτες μέσα από ένα ευρύ φάσμα των τμημάτων του συνδετήρα χρησιμοποιώντας εύκολες συνθετικές μεθόδους. Αυτή η τεχνολογία μπορεί να εφαρμοστεί σε οποιοδήποτε στόχο που περιλαμβάνει δύο ή περισσότερες εγγύς θέσεις σύνδεσης που θα μπορούσε να γεφυρωθεί με συνδέτες που φέρουν κατάλληλες συνδέσεις και συνδετήρες. Τυπικά τα διμερή αποσυνδέονται από το στόχο με βραδύτερο off-τιμές, η οποία οδηγεί σε παρατεταμένη αναστολή του στόχου.

Εδώ έχουμε εφαρμόσει αυτήν την τεχνολογία για την ανάπτυξη αναστολέων έναντι του c-Myc (που αναφέρεται ως Myc κατωτέρω) μεταγραφή παράγοντας. Myc ανήκει σε μια οικογένεια μεταγραφικών παραγόντων των οποίων τα άλλα μέλη περιλαμβάνουν MycL και MycN και αυτούς τους παράγοντες μεταγραφής έχουν σημαντικούς ρόλους στον έλεγχο του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, επιβίωσης, και διαφοροποίηση [9, 10]. Myc κανονικά ρυθμίζεται αυστηρά, αλλά το επίπεδο έκφρασης του μπορεί να αυξηθεί σημαντικά στον καρκίνο, και αυτό πιστεύεται ότι είναι μια σημαντική κινητήρια δύναμη της βιολογίας των όγκων. Myc δραστηριότητα μπορεί να απελευθερωθεί μέσω της αυξημένης έκφρασης είτε με την ενίσχυση του γονιδίου [11] ή το γονίδιο μετάθεσης [12]. Σε πιο περιορισμένες περιπτώσεις, ιδιαίτερα σε λέμφωμα Burkitt, το

Myc

γονίδιο είναι μεταλλαγμένο [13, 14], το οποίο μπορεί να οδηγήσει σε μια πιο σταθερή πρωτεΐνη [15, 16]. Για να λειτουργήσει βιολογικά, Myc σχηματίζει ένα ετεροδιμερές με τον εταίρο της Max, και το προκύπτον διμερές δεσμεύεται σε ειδικούς μοτίβα υποκινητή, στρατολογεί σύμπλοκα ενεργοποίησης μεταγραφής, και τελικά ενεργοποιεί Myc-εξαρτώμενη γονίδια. Είναι σαφές ότι η απενεργοποίηση του Myc μπορεί να οδηγήσει σε σημαντικά αποτελέσματα κατά του όγκου σε μοντέλα ποντικών με καρκίνο [17, 18]. Επιπλέον, λειτουργική αδρανοποίηση των Myc στο φυσιολογικό ιστό χρησιμοποιώντας μια κυρίαρχη αρνητική μορφή (OmoMyc) είναι καλά ανεκτή [19], υποστηρίζοντας την ιδέα ότι θεραπευτικά στοχεύουν σε αυτό το μονοπάτι μπορεί να είναι ένα μέσο για τη θεραπεία του καρκίνου.

Πολλές άμεσες και οι έμμεσες μέθοδοι έχουν αναπτυχθεί για να στοχεύσετε Myc βιολογία [20]. Πρόσφατα μικρά μόρια που αναστέλλουν την οικογένεια ΒΕΤ επιγενετικών πρωτεϊνών αναγνώστη και τις επιπτώσεις

Myc

έκφραση γονιδίων έχουν δείξει εξαιρετικά προ-κλινική αποτελεσματικότητα σε μοντέλα Myc-εξαρτώμενη όγκου [21, 22, 23] και είναι επί του παρόντος σε κλινικές δοκιμές. Αρκετές ομάδες έχουν επίσης αναφέρει μικρού μορίου αναστολείς που προσδένονται άμεσα με Myc και αναστέλλουν την αλληλεπίδρασή του με τον Max [24, 25]. Αυτοί οι αναστολείς, αρχικά εισαχθεί από Prochownik κ.ά., δεσμεύονται με micromolar συγγένεια και να διαταράξει το Myc: Max αλληλεπίδραση, καθώς και τον πολλαπλασιασμό των αναστέλλουν Myc-κυτταρικές σειρές που εκφράζουν όγκου. Δύο τέτοια μικρά μόρια, 10058-F5 και 10074-G5, έχουν δειχθεί ότι δεσμεύουν ανεξάρτητα και ταυτόχρονα στο διαταραγμένο διαμόρφωση του τομέως βασικού έλικας-βρόχου-έλικας λευκίνης φερμουάρ (bHLHZip) του Myc, αναστέλλοντας έτσι την αλληλεπίδρασή του με Max [26 , 27, 28]. Επιπλέον, κοντά ανάλογα 10058-F4 και 10074-G5 με παρόμοια και βελτιωμένη δυναμικότητες έχουν περιγραφεί [29, 30, 31, 32, 33].

Έχουμε χρησιμοποιηθεί τεχνολογική πλατφόρμα μας για την ανάπτυξη αυτο-συναρμολόγηση διμερή αναστολείς της Myc χρησιμοποιώντας αυτές που περιγράφηκαν προηγουμένως μικρά μόρια όπως μας ξεκινώντας ατομικές συνδέτες. Αυτά τα μόρια είναι επιπλέον τροποποιούνται με Επισυναπτόμενων συνδετήρες και συνδετήρες σχεδιαστεί για να διευκολύνει το σχηματισμό αναστρέψιμη διμερούς. Έχουμε αποδείξει ότι η νέα μας αναστολείς δεσμεύονται άμεσα με Myc με βελτιωμένη συγγένεια έναντι των υπαρχόντων μικρών μορίων αναστολέων, να διαταράξει το Myc: Μέγιστη αλληλεπίδραση

in vitro

, και να επηρεάσει την έκφραση MYC ρυθμισμένων γονιδίων σε κύτταρα με αποτέλεσμα την αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα σε Myc-κυτταρικές σειρές που εκφράζουν όγκου.

Υλικά και Μέθοδοι

Σύνθεση Ένωση

Μια πλήρης περιγραφή των συνθετικών οδών για τα μόρια που περιγράφονται στο παρόν έγγραφο μπορεί να βρεθεί στο S1 αρχείου .

Cell Culture, πολλαπλασιασμό και Synergy ανάλυση

Κ562 (CCL-243), Daudi κύτταρα (CCL-213), Raji (CCL-86) και MV 4-11 (CCL-9591) αγοράστηκαν απευθείας από την American Type Culture Collection (Manassas, VA) και συνήθως καλλιεργούνται υπό τις συνιστώμενες συνθήκες. Ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό προσδιορίστηκε με χρήση κυττάρων Titer 96 Aqueous One Solution (Promega, Madison, WI). Όλα τα κύτταρα απλώθηκαν σε 10000 κύτταρα ανά φρεάτιο σε μέσο ανάπτυξης με σαφή πλάκα 96 φρεατίων. Μετά από 3 ημέρες αντιδραστηρίου ένωσης θεραπείας προστέθηκε, και η απορρόφηση στα 490 nm αναγνώστηκε μετά από επώαση για 4 ώρες στους 37 ° C. Μια πλάκα ελέγχου της ένωσης αραιωμένα σε μέσα στις ίδιες συγκεντρώσεις υποβλήθηκε σε επεξεργασία με παρόμοιο τρόπο και αυτές οι τιμές αφαιρούνται από τα δεδομένα πλάκα κελί για τον έλεγχο για οποιαδήποτε ένωση παρεμβολή στον προσδιορισμό. Συνέργεια προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το μοντέλο Bliss της ανεξαρτησίας.

Η λύση των κυττάρων και κηλίδωση Western

κύτταρα επεξεργασμένα Drug πλύθηκαν σε PBS και λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA (συμπληρωμένο με πρωτεάση και αναστολείς φωσφατάσης) (Sigma, St. Louis, ΜΟ) επί πάγου επί 30 λεπτά. Οι ολικές συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL). Κηλίδες Western διεξήχθησαν με διαχωρισμό των πρωτεϊνών με SDS-PAGE και μεταφορά σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με αντισώματα προς: c-Myc (9Ε10) (sc-40)? Συζευγμένο με HRP GAPDH (FL-335) (sc-25778 HRP) (όλα από την Santa Cruz Biotechnology)? Max (AF4304) (R & amp? D Systems)? Διασπασμένη PARP (Asp214) (D64E10) XP (5625? Cell Signaling). Οι πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας συζευγμένη με υπεροξειδάση χρόνου δευτεροβάθμιας ποντίκι ή κουνέλι (1: 5000) (GE Healthcare) ή αίγα (1: 1000) (R &? D Systems) αντισώματα και το σετ SuperSignal ELISA Femto μέγιστη ευαισθησία υποστρώματος χρησιμοποιήθηκε για ανίχνευση (Thermo Scientific).

συντονισμού επιφανειακών πλασμονίων

Όλα SPR πειράματα διεξήχθησαν σε ένα όργανο Bio-Rad XPR36 στους 25 ° C. Επισύναψη His τομέα bHLH-LZ ανθρώπινης πρωτεΐνης Myc (aa353-439, Cayman Chemicals, Αηη Arbor, ΜΙ) ακινητοποιήθηκε σε ρέον ρυθμιστικό διάλυμα (20 mM φωσφορικό νάτριο, ρΗ 7,5, 300 mM NaCl, 4 mM KCl ,. 05% Tween20) σε απουσία DMSO σε 25μL /λεπτό για 400 δευτερόλεπτα σε Bio-Rad HTE (Νί-ΝΤΑ) chips με αποτέλεσμα τιμή RU περίπου 4500 μετά την ακινητοποίηση. Ένωση σύνδεσης αναλύθηκε στο ίδιο τρέξιμο ρυθμιστικού διαλύματος με τελική συγκέντρωση DMSO 2%. Οι ενώσεις εγχύθηκαν σε 30 μL /λεπτό για 180 δευτερόλεπτα με χρόνο διάσπασης των 300 δευτερολέπτων. Ενέσεις αποτελούνταν από 5 συγκεντρώσεις των ενώσεων συν ένα κενό κανάλι για την αναφορά που έρεε πάνω από όλα τα ακινητοποιημένα συνδεσμικά σε μορφή μήτρας. βήματα αναγέννηση δεν απαιτείται λόγω της ταχείας διάσπασης των ενώσεων. ταιριάζει ισορροπία πραγματοποιήθηκαν με το λογισμικό Proteon μετά από ενδο-spot και το κανάλι αναφοράς αφαιρέσεις

ελεύθερα κυττάρων Myc: Μεγ. ELISA

Υψηλή δεσμευτικές πλάκες 96 φρεατίων καλύφθηκαν με GST-συζευγμένο πλήρους μήκος Max πρωτεΐνη (σινο Biologicals) σε 1 ng /μL σε 100 μΐ PBS όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Η πλάκα πλύθηκε 4Χ 200 μΐ /φρεάτιο με PBS και αποκλείστηκε σε 200 μΙ /φρεάτιο 5% άπαχο ξηρό γάλα σε PBS για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Πλήρους μήκους Myc πρωτείνης (ΟηΟεηε) αραιώθηκε σε 1 ng /μL σε ρυθμιστικό Α (50 mM Tris-HCl, ρΗ 7,4, 0,1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,002% ΝΡ-40). Οι ενώσεις αραιώθηκαν διαδοχικά σε 100% DMSO και στη συνέχεια διαδοχικά αραιωμένο 1: 100 μέσα στο διάλυμα Myc πριν από την επώαση για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Για την εσωτερική συνοχή, οι τελικές συγκεντρώσεις DMSO διατηρήθηκαν σε 2%. Η αποκλεισμένη πλάκα πλύθηκε 4Χ 200 μΐ /φρεάτιο με Ρυθμιστικό Α, πριν από την προσθήκη 100 μΙ του μίγματος των ενώσεων Myc. Οι πλάκες επωάστηκαν για τέσσερις ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, και πλύθηκαν 4Χ 200 μl ρυθμιστικού διαλύματος Α /φρεάτιο. Αντι-Μγο αντίσωμα (Cell Signaling) αραιώθηκε 1: 1000 σε 5% άπαχο ξηρό γάλα σε ρυθμιστικό Α 100 μL /φρεάτιο αραιωμένου πρωτογενούς αντισώματος προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκε για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι πλάκες πλύθηκαν 4 φορές 200 μΙ /εκβάθυνση ρυθμιστικό Α HRP-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού (GE Healthcare) αραιώθηκε 1: 5000 σε 5% άπαχο ξηρό γάλα σε ρυθμιστικό Α 100 μL /φρεάτιο αραιωμένο δευτερεύον αντίσωμα προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για τριάντα λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι πλάκες πλύθηκαν 4 φορές 200 μί /φρέαρ προσετέθη ρυθμιστικό Α 50 μL /φρεάτιο Femto αντιδραστηρίου χημειοφωταύγειας (Thermo Scientific), και η φωταύγεια διαβάζεται αμέσως σε αναγνώστη πλακός Victor X5 (PerkinElmer) με χρόνο ολοκλήρωσης 0,1 sec. IC

50s δημιουργήθηκαν από τη μη γραμμική προσαρμογή των δεδομένων με πρίσματος (GraphPad).

δοκιμασία μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας (EMSA)

Ανθρώπινο c-Myc (NP_002458.2) που περιέχει το bHLH-LZ τομέα κλωνοποιήθηκε σε ένα τροποποιημένο φορέα ρΕΤ21α και στη συνέχεια μετατράπηκε σε σύστημα έκφρασης BL21StarDE3, που εκφράζεται και καθαρίζεται στο Cayman Chemical. Το κατασκεύασμα αποτελείται από ένα Ν-τερματικό tag 6xHis με μία θέση διάσπασης TEV, υπολείμματα c-Myc Asn352 να Ala439, και GGCD Ο-τερματική επέκταση (μοριακό βάρος 12.9 kDa). Οι ενώσεις προστέθηκαν σε 200 ng c-Myc σε ρυθμιστικό αντίδρασης (100 mM ΚΟΙ, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 50 mM Tris ρΗ7.4, 5mM ΜαΟΙ

2, 0,002% ΝΡ40) και επωάστηκε για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου θερμοκρασία. 350 ng His-tagged και GST-tagged πλήρους μήκους ανθρώπινου Max πρωτεΐνη (σινο Biologicals, # 12885-H20b) προστέθηκε, και η αντίδραση επωάστηκε για επιπλέον 60 λεπτά. Τέλος, ανόπτηση δίκλωνο E-box που περιέχει DNA ολιγονουκλεοτίδιο με αλληλουχία 5′-GATCAGTTGACCACGTGGTCTGGG-3 ‘προστέθηκε σε τελική συγκέντρωση 100 ηΜ για είκοσι λεπτά επώασης σε θερμοκρασία δωματίου. Η τελική συγκέντρωση του DMSO διατηρήθηκε σταθερή στο 2%. Τα σύμπλοκα πρωτεΐνης-ΟΝΑ (τελικός όγκος 10 μΐ) αναλύθηκαν σε Νονβχ NativePAGE 4-16% γέλες Bis-Tris Protein (τεχνολογίες Life, # BN1002BOX) στους 4 ° C με προ-ψύξη ΤΒΕ (89 mM Tris-βορικό, 1 mM EDTA) στα 125 V για 90 λεπτά. λεκές SYBR Green EMSA νουκλεοτιδίων Acid γέλη (Molecular Probes, # E33075) χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση dsDNA και DNA-πρωτεΐνης σύμπλοκα. Εικόνες συλλήφθηκαν με ένα σύστημα απεικόνισης της Alpha Innotech FluorChem Q εγκαθίσταται με το λογισμικό AlphaView.

Απομόνωση RNA και Real Time-PCR

RNeasy μίνι κιτ (Qiagen) χρησιμοποιήθηκε για τον καθαρισμό RNA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή . Πρώτου κλώνου συμπληρωματικού DNA συντέθηκε και γονιδιακή έκφραση αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ένα ανθρώπινο Myc-στόχους συστοιχία PCR (SABiosciences, # ΠΑΥ-177Z) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Αποτελέσματα

Ο σχεδιασμός και η διαλογή μιας συνδυαστικής βιβλιοθήκης βασίζεται σε δύο διακριτές συνδέτες για τον εντοπισμό αυτοσυνθέσιμα διμερής αναστολείς της Myc

Έχουμε αναπτύξει μια νέα τεχνολογική πλατφόρμα που στοχεύει στην ανάπτυξη αναστολέων έναντι φιλόδοξων στόχων για τα ναρκωτικά μέσω της χρήσης αναστρέψιμη bioorthogonal χημεία συνδετήρα. Εδώ έχουμε εφαρμόσει αυτήν την τεχνολογία για την ανάπτυξη αναστολέων του παράγοντα μεταγραφής Myc. Το μικρό μόριο αναστολείς 10058-F4 και 10074-G5 και τα ανάλογά τους συνδέονται με myc και να μπλοκάρει την αλληλεπίδρασή της με τον Max. Επιπλέον έχει αποδειχθεί για την οδήγηση ενός αντι-πολλαπλασιαστικού αποτελέσματος σ ‘Myc οδηγείται γραμμές κυττάρων σε υψηλές συγκεντρώσεις [26]. Πρόσφατα, δισθενή ανιχνευτές όπως LinkN1 που συνδέουν τα βασικά ικριώματα αυτών των μορίων έχουν περιγραφεί και είναι πιο ισχυροί αναστολείς Myc σε σχέση με μία από τις επιμέρους ικριωμάτων σε βιοχημικές και κυτταρικές δοκιμασίες [30] (S1 Εικ.). Αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι η σύνδεση των δύο αυτών βασικών ικριωμάτων (αναφέρεται εδώ ως C01 και C02?. S1 Σχήμα) χρησιμοποιώντας προσέγγιση μας θα μπορούσε να οδηγήσει σε μια πιο ισχυρός και εκλεκτικός αναστολέας του παράγοντα μεταγραφής Myc, με δυνατότητες για βελτιωμένη μονομερές φαρμακοκινητικά προφίλ σε σχέση με το μεγαλύτερο bivalents. Ως εκ τούτου, σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν δύο μικρές βιβλιοθήκες μονομερή προσαρτώντας επιλεγμένα κατεχίνης /αλκυλο διόλης και συνδετήρες βορικού οξέος μέσω κατάλληλων συνδέσμων προς τους συνδετήρες C01 και C02, αντίστοιχα (Εικ. 1Γ). Έχουμε ορίσει μονομερή που φέρουν συνδετικά βορονικό οξύ ως «Ε» (ηλεκτρονιόφιλη) μονομερή και αυτών που φέρουν κατεχόλη ή αλκύλιο συνδέτες διόλης ως «Ν» (πυρηνόφιλη) μονομερή. Οι βιβλιοθήκες περιείχαν 10 «E» και 12 μονομερή «Ν», αντίστοιχα, τα οποία μπορούν να διασυνδεθούν για να σχηματίσουν 120 διμερή, που μας επιτρέπει να εντοπίσει αποτελεσματικά «E + N» ζεύγη που οι περισσότεροι συνεργικά αναστέλλουν Myc. Αυτά τα διμερή έχουν μέγιστη απόσταση που εκτείνονται μεταξύ τους συνδέτες τους περίπου 7-25Å και τοποϊσομερών χαρακτηριστικό συνδετήρα για κάθε συγκεκριμένη απόσταση spanning.

διαλογή κατά ζεύγη συνδυασμοί των μονομερών από βιβλιοθήκες μας σε μια δοκιμασία κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Αυξανόμενες συγκεντρώσεις κάθε ένωσης δοσολογήθηκαν σε ένα σχήμα μήτρα 8×6 και τα αποτελέσματά τους στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων παρακολουθείται. Ο στόχος μας ήταν να προσδιοριστούν οι συνδυασμοί που έδειξε μια συνεργιστική αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Η θεωρητική αθροιστική επίδραση επί του πολλαπλασιασμού για κάθε συνδυασμό, με βάση την δραστηριότητα του κάθε μονομερούς, υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας Bliss ανάλυση [34], και συνδυασμούς που έδειξε δραστικότητα μεγαλύτερη από αυτήν την προβλεπόμενη τιμή θεωρήθηκαν ότι είναι συνεργιστική (S2 Εικ.). Η πλειοψηφία των συνδυασμών ήταν προσθετικό χαρακτήρα, ένα αποτέλεσμα συνεπές με το συνδυασμό των δύο μητρικών προσδεμάτων C01 και C02 (S1 Εικ.). Εντοπίσαμε μια σειρά από συνδυασμούς που ήταν συνεργιστική, και αντιπροσωπευτικές γραφικές παραστάσεις που δείχνουν δοσοεξαρτώμενη αναστολή του πολλαπλασιασμού με 2 διαφορετικούς συνδυασμούς (E07 + N12 και E08 + Ν11) εμφανίζονται (Εικ. 2 Α και Β). Οι δομές αυτών των μορίων φαίνεται στο Σχ. 2C. Δεν υπήρξε καμία δραστηριότητα των μεμονωμένων ενώσεων E07, E08, N12, N11 ή στη δοκιμασία πολλαπλασιασμού σε συγκεντρώσεις έως και 30 μΜ. Πάντως, η δραστικότητα του E07 (Εικ. 2Α) ή E08 (Εικ. 2Β), είχε βελτιωθεί δραματικά με την παρουσία 10 μΜ Ν12 ή 30 μΜ N11 αντίστοιχα. Επιπλέον, η δραστηριότητα των + Ν12 και E08 + Ν11 συνδυασμούς E07 ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από την προβλεπόμενη πρόσθετη επίδραση (Bliss γραμμή), υποδεικνύοντας συνέργια μεταξύ αυτών των ενώσεων.

καμπύλες δόσης-απόκρισης (Α και Β) για δύο διαφορετικούς συνδυασμούς, E07 + Ν12 (Α) και E08 + Ν11 (Β) δοκιμάζονται στην οθόνη του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Σε κάθε περίπτωση η καμπύλη δόσης-απόκρισης για κάθε επιμέρους μονομερές σχεδιάζεται. Οι καμπύλες δόσης-απόκρισης για την προβλεπόμενη προσθέτου απόκρισης (Bliss) και ο συνδυασμός πειραματικά δεδομένα απεικονίζονται με αυξανόμενη συγκέντρωση του E07 orE08 παρουσία N11 ή N12 (30 μΜ). Τα δεδομένα παρίστανται γραφικώς ως μέση ± SEM από 3 ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Αυτά τα αρχικά αποτελέσματα διαλογής έδειξαν ότι μόνο επιλεγμένα συνδυασμοί ήταν σε θέση να οδηγήσει ένα συνεργικό αποτέλεσμα στη δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Δεδομένου ότι η βιβλιοθήκη σχεδιάστηκε αρχικά για να εμπεριέχει ένα εύρος μηκών συνδετήρα, προσανατολισμούς και τάσεις διμερισμό, τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι ορισμένα μήκη, προσανατολισμοί και συνδυασμούς συνδέτη προτίμησε να οδηγήσει την συνεργιστική απόκριση σε ένα κυψελοειδές ανάγνωσης. Μια πιο εκτεταμένη συζήτηση γύρω από τις σχέσεις δομής-δραστικότητας και δομής-ιδιοτήτων μεταξύ αυτών των διαφορετικών μορίων θα παρουσιαστεί και αλλού, και έτσι για τους σκοπούς της παρούσας έκθεσης, έχουμε επικεντρωθεί στις συνδυασμούς που έδειξε την πιο σημαντική συνέργεια για περαιτέρω επικύρωση.

myc κατευθύνεται αυτοσυνθέσιμα διμερή δεσμεύονται με myc και να μπλοκάρει την αλληλεπίδραση του με Max

Έχοντας εντοπίσει ειδικούς συνδυασμούς μονομερών που ήταν σε θέση να οδηγεί ένα αντι-πολλαπλασιαστική απόκριση σε κύτταρα Daudi, έχουμε επιβεβαιώσει την επόμενη την ικανότητα του Αυτά τα μονομερή για να σχηματίσουν διμερή στην περιοχή συγκεντρώσεων που χρησιμοποιείται στις δοκιμασίες πολλαπλασιασμού. Συνδυάσαμε τις μονομερείς αναστολείς Myc E07 και E08 N11 ή και Ν12 σε ένα μίγμα 1: 1 με τη χρησιμοποίηση 10μΜ κάθε ένωσης και αναλύθηκαν για την παρουσία του διμερούς χρησιμοποιώντας LC-MS. Σε αυτές τις συγκεντρώσεις παρατηρήσαμε 67% και 24% αντίστοιχα διμερές (S3 και S4 Σχ.), Επιβεβαιώνοντας ότι αυτά τα μονομερή ήταν σε θέση να σχηματίσει σημαντικές ποσότητες διμερούς στις συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτά τα πειράματα.

επόμενο ανέλυσε εάν Αυτά τα διμερή οι αναστολείς θα μπορούσαν να συνδέονται άμεσα με Myc. Για να γίνει αυτό αναπτύξαμε ένα ποσοτικό προσδιορισμό Surface Plasma Συντονισμού (SPR) για να συγκρίνουν τις συγγένειες δέσμευσης των μονομερών με εκείνη των διμερών αναστολέων. Εμείς ακινητοποιημένο τον τομέα bHLHZip του Myc στην επιφάνεια ενός τσιπ Νί-ΝΤΑ μέσω ενός His-tag και μετρήθηκαν δεσμευτικές συγγένειες για τα μονομερή ή διμερή. Παρατηρήσαμε ασθενής σύνδεση του κάθε μονομερούς (μέση Kd τιμές E07 = 42 μΜ και Ν12 & gt?.. 50 μΜ σχήμα 3Α και στον Πίνακα 1) σύμφωνο με την πρόσφατη έκθεση χρησιμοποιώντας τις γονικές συνδετήρες 10058-F4 και 10078-G5, η οποία έδειξε συγγένειες 39,7 μΜ και 31,7 μΜ αντίστοιχα για Myc με παρόμοιο SPR δοκιμασία [35]. Σε αντίθεση, ο συνδυασμός E07 + Ν12 συνδέεται με Kd 8.6 μΜ, μια αξιοσημείωτη βελτίωση σε σχέση με τα μεμονωμένα μονομερή. Παρατηρήσαμε παρόμοια δεδομένα με το διμερές E08 + N11. Αξίζει να σημειωθεί ότι, παρατηρήσαμε δέσμευσης κορεσμού των συνδυασμών με στοιχειομετρία της διμερούς δέσμευσης λιγότερο από ένα, αποκλείοντας το ενδεχόμενο η ένωση συσσωμάτωση που προκαλείται από διμερισμό ήταν υπεύθυνη για την αυξημένη δέσμευση που παρατηρείται.

Α) Αναστολείς δείχνουν κορεσμό δέσμευσης της Myc σε SPR πειράματα. Ανταπόκριση Μονάδες ισορροπίας (RU), έχει κανονικοποιηθεί σε μεγίστη κορεσμένο τιμές σε μεμονωμένα πειράματα, απεικονίζονται (μέση ± SEM) ως συνάρτηση της συγκέντρωσης αναστολέα. Β) Δόση καμπύλες απόκρισης για την αναστολή του Myc: Max αλληλεπίδραση όπως προσδιορίζεται με ELISA. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύονται ως κλάσμα της δραστικότητας σε σύγκριση με ένα δείγμα ελέγχου έλαβαν DMSO και χαράσσονται ως μέσο 2-5 πειραμάτων ± SD. Ο άξονας Χ αναφέρεται στη συγκέντρωση του κάθε μονομερούς που χρησιμοποιείται.

Η

Για να επιβεβαιωθεί ότι η διμερής αναστολέας οδηγούσε η βελτιωμένη σύνδεση προς Myc, συνθέσαμε ένα ανάλογο Ν12 η οποία ήταν παρόμοια σε κάθε πτυχή εκτός του ότι στερείται της ομάδας διόλης που απαιτείται για την αντίδραση με τον ομόλογό του βορονικό οξύ (C12, Σχ. 2C). C12 μόνη ή σε συνδυασμό με E07 είχαν τιμές Kd & gt? 50 μΜ (Εικ. 3Α και Πίνακας 1), υποστηρίζοντας το συμπέρασμα ότι η ικανότητα να σχηματίζει διμερές ήταν σημαντική για την ενισχυμένη σύνδεση αυτών των μονομερών

επόμενο. το ερώτημα αν η σύνδεση αυτών των διμερών να Myc θα μπορούσε να διαταράξει την αλληλεπίδραση με μεταγραφικές εταίρο της Max. Έχουμε αναπτύξει μια ELISA χρησιμοποιώντας καθαρισμένη Myc και Max πρωτεΐνη που μας επέτρεψε να μετρηθούν οι επιπτώσεις στην Myc: δεσμευτικές Max. Η πλάκα ELISA αρχικά επικαλυμμένο με Max πρωτεΐνη και οι ενώσεις προ-επωάστηκαν με Myc πρωτεΐνης πριν από την προσθήκη στο Max-επικαλυμμένη πλάκα. Μετά από εκτεταμένη πλύση, Myc σύνδεση προς Max ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-Μγο. Αρχικά εξετάστηκαν τα μόρια μητρικής συνδέτη, C01 και C02, και παρατηρήθηκε μικρή αναστολή είτε των μονομερών (IC

50 & gt? 30 μΜ) ή ο συνδυασμός (IC

50 23 μΜ) στις Myc: Max αλληλεπίδραση (S1 πίνακα). Είμαστε δίπλα επικεντρώνεται σε έναν από προσδιορίζονται διμερή αναστολείς μας, E07 + Ν12 και παρομοίως παρατηρηθεί ότι οι επιμέρους μονομερή E07 και Ν12 έδειξε μικρή αναστολή της Myc: αλληλεπίδραση Max (IC

50 24 μΜ και & gt? 30 μΜ, αντίστοιχα? Εικ. 3Β και Πίνακας 1). Σε αντίθεση, ο συνδυασμός E07 + Ν12, δοσολογείται σε μία αναλογία 1: 1, ανέστειλε Myc δέσμευση σε Max με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (IC

50 3,3 μΜ) (Σχ 3Β και Πίνακας 1)., Ένα εξάρτημα 8 φορές πάνω από το πιο ενεργό άτομο μονομερές. Παρατηρούμε παρόμοιες επιπτώσεις για τη διμερή αναστολέα E08 + Ν11 (Πίνακας 1)

Ο συνδυασμός ελέγχου των C12 με E07 απέτυχε να δείξει δραστηριότητα στα Myc: Μεγ. ELISA πέρα ​​από τη δραστηριότητα του E07 μόνο (Εικ. 3Β) , γεγονός που υποδηλώνει ότι η ικανότητα των E07 + Ν12 να διμερίζεται οδηγούσε το βελτιωμένο ανασταλτικό αποτέλεσμα. Περιορισμένα αποτελέσματα παρατηρήθηκαν με την πρόσθετη μη dimerizable συνδυασμό ελέγχου E08 + C11 (Πίνακας 1)

διμερή Αυτο-συναρμολόγηση αναστέλλουν εκλεκτικά Myc: Μεγ. Δέσμευσης στο DNA

Αφού επιβεβαίωσε ότι τα διμερή δεσμεύουν να myc και να μπλοκάρει τη δέσμευση του σε Max εμείς δίπλα θέλαμε να επιβεβαιώσουμε ότι αυτοί οι αναστολείς μπλοκάρει επιλεκτικά τη βιολογική δράση της myc σε μία δοκιμασία άνευ κυττάρου. Ο σχηματισμός του Myc: Max ετεροδιμερές απαιτείται για την ικανότητά του να δεσμεύεται με αλληλουχίες DNA και ενεργοποιούν τη μεταγραφική ενεργοποίηση του Myc-εξαρτώμενων γονιδίων. Max έχει την πρόσθετη ικανότητα να σχηματίζουν ομοδιμερή που μπορούν να προσδένονται στους ίδιους αλληλουχίες DNA αλλά γενικά καταστέλλουν τη γονιδιακή έκφραση [9, 10]. Ως εκ τούτου, εκτελείται μία δοκιμασία μετατόπισης κινητικότητας σε πήκτωμα ηλεκτροφόρησης για να καθοριστεί εάν οι αναστολείς μας είχε εκλεκτικότητα για την αναστολή της πρόσδεσης του Myc: Max ετεροδιμερή με το DNA πάνω Max: Μεγ. Ομοδιμερή

Η επώαση του Max πρωτεΐνης με το ολιγονουκλεοτίδιο E-box προέκυψε σε μια μετατόπιση ζώνης DNA ενδεικτικό του Max: Μέγιστη ομοδιμερή (Εικ. 4Α). Η προσθήκη Myc είχε ως αποτέλεσμα μείωση της ποσότητας του Max: Max ομοδιμερή και την εμφάνιση του Myc: Max ετεροδιμερή σε σύμπλεγμα με το DNA. Κανένα από τα δύο μονομερή, E07 ή Ν12, είχε καμία αισθητή επίδραση στις Myc: Max ή Max: Max συγκροτήματα, ωστόσο E07 + Ν12 προκάλεσε μια δοσοεξαρτώμενη μείωση στα επίπεδα των Myc: Max συγκρότημα. Αξίζει να σημειωθεί ότι η μείωση στην Myc: Max συγκρότημα συσχετίζεται αντίστροφα με την αύξηση των επιπέδων του Max: συγκρότημα Max, γεγονός που υποδηλώνει το διμερές είναι ειδικά το κλείδωμα των Myc: Max αλληλεπίδραση, απελευθερώνοντας Max να homodimerize και δεσμεύονται στο DNA

δοκιμασία μετατόπισης κινητικότητας πηκτής που δείχνει τις επιπτώσεις στην Myc: σχηματισμός Max DNA συμπλόκου από το διμερικό αναστολέα E07 + Ν12 (Α) και τη μη dimerizable συνδυασμός ελέγχου E07 + C12 (Β). Τα συγκροτήματα που αντιπροσωπεύουν σύμπλεγμα πρωτεΐνης-ϋΝΑ ή γυμνό DNA που φαίνεται στη δεξιά πλευρά εκάστου πίνακα. Οι συγκεντρώσεις που αναφέρονται είναι σε μΜ.

Η

Ως περαιτέρω απόδειξη ότι ο σχηματισμός του διμερούς αναστολέα ήταν κρίσιμη για την ανασταλτική δραστικότητα, πραγματοποιήσαμε παρόμοια πειράματα με το μη-dimerizable μονομερές ελέγχου C12 (Εικ. 4Β) . Σε αντίθεση με E07 + Ν12, το συνδυασμό των E07 + C12 δεν είχε καμία επίδραση επί της συνδέσεως του Myc: Max ή Max: Μέγιστη συμπλοκών DNA. Αυτά τα δεδομένα είναι συνεπή με τα αποτελέσματα αυτών των ενώσεων στη δοκιμασία SPR και ELISA.

σύνολό τους, αυτά τα δεδομένα προσδιορισμού ελεύθερο κυττάρων αποδεικνύουν ότι οι αυτοσυναρμολογούμενες διμερούς αναστολείς προσδιορίζονται στις δοκιμασίες κυττάρου μπορεί να συνδέονται απευθείας προς Myc και αναστέλλουν αλληλεπίδρασή της με τον Max, υποστηρίζοντας έναν μηχανισμό για στόχο της δράσης για αυτούς τους αναστολείς. Περαιτέρω, η χρήση των μη-dimerizable μονομερή μονάδα επιβεβαιώνει ότι η ικανότητα να σχηματίζουν ένα μεγάλο μοριακό βάρος διμερούς αναστολέας είναι το κλειδί για την ικανότητα να στοχεύουν την πρωτεΐνη Myc.

Αυτοσυναρμολόγηση διμερούς είναι κρίσιμη για την κυτταρική δραστηριότητα του myc αναστολείς

ελεύθερο κυττάρων τα πειράματά μας έδειξαν ξεκάθαρα ότι η ικανότητα για αυτο-συναρμολόγηση του διμερούς ήταν σημαντικό στην οδήγηση τη βελτιωμένη ανασταλτική δράση έναντι της πρωτεΐνης myc. Για να δοκιμάσετε αυτό σε ένα κυψελοειδές πλαίσιο συγκρίναμε την επίδραση στην κυτταρική βιωσιμότητα της διμερούς E08 + N11 έναντι μη dimerizable συνδυασμό έλεγχο της E08 + C11. Η επεξεργασία των κυττάρων Daudi με E08 + Ν11 προκάλεσε μια σημαντική μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων μετά από 72 ώρες θεραπείας, ενώ ο συνδυασμός E08 + C11 δεν είχε καμία επίδραση στη βιωσιμότητα του κυττάρου (Εικ. 5Α, αριστερό πλαίσιο). Προηγούμενες αναφορές έχουν δείξει ότι η θεραπεία των κυττάρων με σχετικά υψηλές συγκεντρώσεις (& gt? 50 μΜ) του μικρού μορίου Myc αναστολείς 10058-F4 και 10078-G5 να προκαλέσει μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης Myc [31, 35] και έτσι χρησιμοποιήσαμε αυτό σαν μία τη μέτρηση του αντίκτυπου των διμερών επί της οδού Myc.