Αφηρημένο

Ένας αυξανόμενος αριθμός των κακοηθειών έχει αποδειχθεί να ξεκινήσει και κινούνται με μικρές υποπληθυσμών των καρκινικών βλαστικών κυττάρων (CSC). Ωστόσο, αν η επιθετικότητα του όγκου οδηγείται από CSC και με ποιο βαθμό αυτή η ιδιότητα μπορεί να είναι σχετικό εντός της μάζας του όγκου είναι ακόμα εκκρεμή. Για την αντιμετώπιση αυτού του ζητήματος, απομονώσαμε ένα σπάνιο πληθυσμό των κυττάρων του όγκου βάσει του CD44

+ CD24

του – φαινότυπο από το ανδρογόνο-ανεξάρτητων ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου του προστάτη DU145 και καθιέρωσε CSC ιδιότητές του. Η συμπεριφορά των επιλεγμένων CSC διερευνήθηκε σε σχέση με τα μαζικά κύτταρα DU145. Η ένεση του CSC σε γυμνούς ποντικούς που δημιουργούνται ιδιαίτερα vascularized όγκοι διηθούν τους γειτονικούς ιστούς, που δείχνει υψηλή πυκνότητα νευροενδοκρινών κυττάρων και εκφράζουν χαμηλά επίπεδα της Ε-καδερίνης και β-κατενίνης, καθώς και υψηλά επίπεδα βιμεντίνης. Αντιθέτως, όταν εγχύθηκαν ένα συγκρίσιμο αριθμό των μη ταξινομημένα κύτταρα DU145 τα προκύπτοντα όγκοι ήταν λιγότερο επιθετική. Για να διερευνήσουν τα διάφορα χαρακτηριστικά των όγκων

in vivo

, εξετάστηκε η επίδραση των διαφοροποιημένων κυττάρων όγκου επί CSC

in vitro από

αυξανόμενη CSC εν απουσία ή παρουσία ρυθμισμένου μέσου από κύτταρα DU145. CSC αναπτύχθηκαν σε επιτρεπτές συνθήκες διαφοροποιηθεί σε κυτταρικούς πληθυσμούς με χαρακτηριστικά παρόμοια με εκείνα των κυττάρων πραγματοποιήθηκε σε επιθετικούς όγκους που δημιουργούνται από την έγχυση CSC. Διαφορετικά, ρυθμισμένο μέσο που επάγεται CSC να διαφοροποιηθούν σε ένα κυτταρικό φαινότυπο συγκρίσιμη με κύτταρα ελάχιστα επιθετικών όγκων προήλθε από χύδην ένεση DU145 κυττάρων. Αυτά τα ευρήματα δείχνουν για πρώτη φορά ότι η CSC είναι σε θέση να παράγουν διαφοροποιημένα κύτταρα που εκφράζουν είτε υψηλά ή ελάχιστα επιθετική φαινότυπο, επηρεάζοντας έτσι την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη. Η μοίρα του CSC προσδιορίστηκε με σήματα που απελευθερώνονται από το περιβάλλον του όγκου. Επιπλέον, χρησιμοποιώντας την ανάλυση μικροσυστοιχιών έχουμε επιλέξει μερικά μόρια που θα μπορούσαν να συμμετέχουν σε αυτή την κυτταρική σηματοδότηση-to-κυττάρων, υποθέτοντας δυνητική αξία τους για την πρόγνωση ή θεραπευτικές εφαρμογές

Παράθεση:. Salvatori L, Caporuscio F, Verdina Α, Starace G, Κρίσπι S, Nicotra MR, et al. (2012) Cell-to-Cell Signaling επηρεάζει την μοίρα του καρκίνου του προστάτη Βλαστικά κύτταρα και το δυναμικό τους για να παράγουν περισσότερα επιθετικούς όγκους. PLoS ONE 7 (2): e31467. doi: 10.1371 /journal.pone.0031467

Επιμέλεια: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), Ιταλία

Ελήφθη: 8 Ιουνίου, 2011? Αποδεκτές: 9, Γενάρη 2012? Δημοσιεύθηκε: 6 του Φλεβάρη 2012

Copyright: © 2012 Salvatori et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε εν μέρει από το ιταλικό Υπουργείο Υγείας (ΠΡΙΝ 2006062242). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση ελήφθη για τη μελέτη αυτή

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

αδενοκαρκίνωμα του προστάτη (PCA) είναι ο κορυφαίος. αιτία θανάτου μεταξύ των ανδρών στις Ηνωμένες Πολιτείες και τη Δυτική Ευρώπη [1]. Λόγω της εξαρτώμενων από ανδρογόνα ανάπτυξης, την ορμονοθεραπεία παραμένει η κύρια θεραπεία της μεταστατικής νόσου. Ενώ αρχικά αποτελεσματική, αυτή η θεραπεία ακολουθείται μέσα σε λίγα χρόνια από την υποτροπή του όγκου [2] στην οποία ένα ανδρογόνο ανεξάρτητος νευροενδοκρινών (ΝΕ) υποπληθυσμό κυττάρων πιστεύεται ότι παίζει ένα σημαντικό ρόλο [3], [4]. κύτταρα ΝΕ είναι ήρεμα, τελικά διαφοροποιημένα κύτταρα που χαρακτηρίζονται από δενδρίτη-όπως διεργασίες που εκτείνονται μεταξύ γειτονικών κυττάρων και η έκφραση των νευρωνικών πρωτεϊνών που ομοιάζουν όπως CD56 και χρωμογρανίνης Α (CGA) που περιέχεται μέσα σε πυκνά κυτταροπλασματικά κοκκία [5]. Μέσω της έκκρισης των νευροπεπτιδίων κυττάρων ΝΕ ρυθμίζουν τη δραστικότητα του φυσιολογικού επιθηλίου του προστάτη αλλά είναι επίσης ικανές να επηρεάσουν γειτονικά μετασχηματισμένα επιθηλιακά κύτταρα μέσω παρακρινούς σήματα, διεγείροντας έτσι την ανάπτυξη του όγκου και τη μεταστατική ικανότητα [5] – [7]. Στην πραγματικότητα, ένας αυξημένος πληθυσμός ΝΕ κύτταρο στο PCA είναι πιστεύεται ότι συνδέονται με μια πιο επιθετική ασθένεια, ενώ ένας μικρός αριθμός κυττάρων ΝΕ στον ιστό του όγκου δεν έχουν συγκεκριμένη προγνωστική σημασία [6], [8], [9]. Είναι ενδιαφέρον ότι, και τα δύο ΝΕ και εκκριτικά επιθηλιακά γράμμωσης προέρχονται από ένα κοινό πολυδύναμο βλαστικό κύτταρο του προστάτη [10].

Ένα περαιτέρω βασικό μηχανισμό εμπλέκονται στην εξέλιξη του PCA είναι μειωμένη έκφραση της Ε-καδερίνης, ο κύριος διαμεμβρανικό μόριο προσκόλλησης υπεύθυνη για κυττάρου-προς-κύτταρο αλληλεπιδράσεων και οργάνωση ιστού σε επιθηλιακά κύτταρα [11], [12]. Μέσω της κυτταροπλασματικής περιοχής, συνδέεται β-κατενίνης, η οποία επηρεάζει κυτταροσκελετική διάταξη [13]. Κατά συνέπεια, απώλεια της λειτουργίας Ε-καδερίνης ή έκφραση θεωρείται ζωτικής σημασίας συμβάν στην διατάραξη της προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου και αρχιτεκτονική κυτταροσκελετικές και στην απόκτηση μιας επεμβατικής φαινοτύπου σε καρκινικά κύτταρα [14]. Ειδικότερα, στην PCa, χαμηλότερη έκφραση Ε-καδερίνης συσχετίστηκε με περισσότερο προηγμένα στάδια του όγκου και ποιότητας [15], [16]. Τα κακώς διαφοροποιημένους όγκους του προστάτη έδειξε επίσης υψηλότερη έκφραση του βιμεντίνης, μία κυτταροσκελετική συστατικό υπεύθυνο για τη διατήρηση της ακεραιότητας των κυττάρων, και τα υψηλά επίπεδα βιμεντίνης συσχετίζεται με την επεμβατική ικανότητα των καρκινικών κυτταρικών σειρών προστάτη, συμπεριλαμβανομένων DU145 [17].

Παραδοσιακά, οι όγκοι θεωρήθηκαν ότι αποτελείται από ετερογενείς κυττάρων με συγκρίσιμη απεριόριστη πολλαπλασιαστική και ογκογόνο δυναμικό. Ωστόσο, έχει πρόσφατα γίνει η υπόθεση ότι μόνο σπάνια κύτταρα εντός του όγκου, που ονομάζεται καρκινικά βλαστικά κύτταρα (CSC), είναι σε θέση να πολλαπλασιάζονται εκτενώς και είναι ογκογόνα, λαμβάνοντας υπόψη ότι η πλειονότητα των κυττάρων στη μάζα του όγκου δείχνουν ποικίλου βαθμού διαφοροποίησης και να υποβάλλονται σε περιορισμένο αριθμό διαιρέσεων. Η συμβολή τους στην ανάπτυξη του όγκου και metastatization θεωρείται μάλλον περιορισμένη. Είναι σημαντικό ότι, το μοντέλο αυτό συνεπάγεται την ανάγκη για μια νέα θεραπευτική προσέγγιση που στοχεύουν ειδικά προς το CSC στην προσπάθεια για την εξάλειψη του όγκου οριστικά [18]. Ωστόσο, αν η επιθετικότητα του όγκου οδηγείται από CSC και με ποιο βαθμό αυτή η ιδιότητα μπορεί να είναι βιολογικά σχετικές εντός του φυσικά μάζας του όγκου είναι ακόμα άστατος.

Καθώς η παρουσία της CSC σε προστάτη [19] και κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη [20] αποδείχθηκε πρόσφατα με βάση το προφίλ της επιφάνειας αντιγονική CD44

+ /α

2β

1

hi /CD133

+ και CD44

+ CD24

– , αντίστοιχα, στην παρούσα μελέτη με στόχο την αξιολόγηση της συμβολής των CSC εξέλιξης του όγκου. Απομονώσαμε CD44

+ CD24

– στέλεχος που μοιάζει με τα καρκινικά κύτταρα από τον καρκίνο του προστάτη κυτταρική γραμμή ανεξάρτητου από ανδρογόνο DU145 προέρχονται από μια μετάσταση εγκεφάλου του ανθρώπινου προστάτη, έδειξε ιδιότητες τους CSC, και διερευνήθηκαν φαινότυπο και τη συμπεριφορά τους σε σχέση με τα κύτταρα χύμα DU145. Είναι σημαντικό ότι, σε αυτό το μοντέλο του καρκίνου του προστάτη παρατηρήσαμε ότι CSC ήταν σε θέση να παράγει εξαιρετικά επιθετική όγκους σε ποντίκια NOD /SCID και ότι αυτό το δυναμικό περιορίζεται από την παρουσία των διαφοροποιημένων κυττάρων DU145 με την επακόλουθη ανάπτυξη λιγότερο επιθετικών όγκων. Σταθερά, με ανάπτυξη CSC σε ρυθμισμένο μέσο από κύτταρα DU145

in vitro

, παρουσιάσαμε ότι διαχεόμενο παράγοντες απελευθερώνονται από διαφοροποιημένα κύτταρα όγκου ήταν σε θέση να συγκρατήσει CSC από διαφοροποιηθούν σε κυτταρικούς πληθυσμούς που δείχνουν μια επιθετική φαινότυπο και με χαρακτηριστικά παρόμοια με εκείνα των κυττάρων πραγματοποιήθηκε σε όγκους που παράγονται σε ποντίκια από την ένεση του CSC. Τέλος, λειτουργική ανάλυση των γονιδίων που βρέθηκαν διαφορικά εκφραζόμενων σε κύτταρα CSC και DU145 με ανάλυση μικροσυστοιχιών επιβεβαίωσε τον ουσιαστικό ρόλο του κυττάρου-προς-κύτταρο μόρια σηματοδότησης για να προσδιοριστεί η συμπεριφορά του CSC. Περαιτέρω έρευνες πραγματοποιούνται και σε άλλα μοντέλα του καρκίνου του προστάτη μπορεί να εκχωρήσει προγνωστική ή θεραπευτική αξία σε αυτή την υπογραφή.

Αποτελέσματα

Απομόνωση και χαρακτηρισμός της CSC από DU145 κύτταρα καρκίνου του προστάτη

DU145 κύτταρα εμπλουτίστηκαν με ενεργοποιημένων με φθορισμό κυττάρων (FACS) για τον πληθυσμό που εκφράζει CD44

+ CD24

– [20], που αντιπροσώπευε περίπου το 10% των χύμα κυττάρων DU145 (Σχήμα 1Α). Δοκιμάσαμε τα βλαστικά-όπως ιδιότητες των επιλεγμένων κελιών για να τους περιγράψει αναμφισβήτητα ως προστάτη CSC. Ένα πολύ μικρό ποσοστό των CD44

+ CD24

– απομονωμένα κύτταρα ήταν σε θέση να παράγουν τα μη προσκολλημένα σφαιρικά σμήνη, που ονομάζεται σφαιροειδή ή prostaspheres, σε μέσο ελεύθερο ορού συμπληρωμένο με EGF, FGF και της ινσουλίνης (Ορός Αντικατάσταση Medium, SRM ). Τα σφαιροειδή μεγάλωσε πολύ αργά, φθάνοντας το μέγεθος των περίπου 300 μm εντός 6-8 εβδομάδων (Εικόνα 1Β). Όπως ήταν αναμενόμενο, τα σφαιροειδή εμπλουτίστηκαν για CD44

+ CD24

– κύτταρα, όπως προσδιορίστηκε με ανοσοφθορισμό (IF) χρώση (τα δεδομένα δεν φαίνονται) και ποσοτική ανάλυση πραγματικού χρόνου PCR (Q-PCR), με συγκρίσιμα αποτελέσματα. Στην πραγματικότητα, σε σφαιροειδή CD44 mRNA εκφράστηκε σε επίπεδα παρόμοια με τα κύτταρα DU145, ενώ η έκφραση του CD24 ήταν σημαντικά χαμηλότερη (Σχήμα 1 C).

(Α) FACS ανάλυση των CD44 και CD24 έκφραση σε κύτταρα DU145. (Β) Πολιτισμός απομονωμένων CD44

+ CD24

– κύτταρα που αναπτύσσονται στο ΕΥΚ ως μη προσκολλημένα prostaspheres (5 × στόχος). (C) Q-PCR των CD44 και CD24 έκφρασης σε σφαιροειδές και DU145 κύτταρα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM από 3 πειράματα. *,

σ

& lt? 0,05

vs

DU145 κύτταρα. (D) ικανότητα αυτο-ανανέωσης των σφαιροειδή. συμπλήρωση ορού και την απόσυρση των αυξητικών παραγόντων επάγουν την ανάπτυξη των κυττάρων σφαιροειδούς ως προσκολλητικά κύτταρα με μορφολογία (Ε), του ρυθμού πολλαπλασιασμού (F) και η έκφραση της βιμεντίνης (G) συγκρίσιμη με κύτταρα DU145. Φωτογραφίες του σφαιροειδούς κύτταρα ελήφθησαν κάτω από ένα μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης μετά από 10 και 20 ημέρες ανάπτυξης σε μέσο που περιείχε FBS (20 ×). Οι αντιπροσωπευτικές κηλίδες Western δείχνουν την έκφραση του βιμεντίνη και β-ακτίνης σε σφαιροειδές κύτταρα που αναπτύσσονται σε μέσο συμπληρωμένο με FBS σε σχέση με τον έλεγχο σφαιροειδή και τα κύτταρα DU145. Το ιστόγραμμα δείχνει την πυκνομετρική ποσοτικοποίηση των βιμεντίνης ομαλοποιήθηκε σε β-ακτίνη επίπεδα. Οι τιμές εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM από 3 ανεξάρτητα πειράματα. (H) συχνότητα εμφάνισης όγκων και την καθυστέρηση μετά την ένεση 1 σφαιροειδές, 5.000 ή 3 × 10

6 DU145 κυττάρων σε NOD /SCID ποντίκια.

Η

σφαιροειδή περιλαμβάνονται μακροχρόνια αυτο-ανανέωση των κυττάρων, όπως καταδεικνύεται από την ικανότητα ενός κλάσματος των κυττάρων από διαχωρισθεί σφαιροειδή να δημιουργηθούν νέα prostaspheres διήρκεσε πάνω από 5 περάσματα (Σχήμα 1 D).

Παρατηρήσαμε ότι σφαιροειδές κύτταρα εμφάνισαν ικανότητα διαφοροποίησης. Στην πραγματικότητα, όταν απομακρύνονται από αυξητικούς παράγοντες και εκτέθηκαν σε 10% FBS μέσου που περιέχει ένα σημαντικό κλάσμα του σφαιροειδούς κύτταρα κατέστησαν προσκολλητικά, μεγάλωσε ως μια επίπεδη μονοστοιβάδα και έδειξε ένα ετερογενές μορφολογία πολύ παρόμοια με τα κύτταρα DU145 μετά από 20 ημέρες (Σχήμα 1 Ε). Κατά τις πρώτες ημέρες της ανάπτυξης σε αυτές τις επιτρεπτές συνθήκες, τα κύτταρα σφαιροειδές έδειξε ένα χρόνο διπλασιασμού περίπου 50 ώρες που σταδιακά μειώθηκε μέχρι το ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων DU145, δηλαδή 30 ώρες, αρχής γενομένης από τις 15 ημέρες καλλιέργειας (Σχήμα 1 F). Επιπλέον, για να επιβεβαιωθεί η εμφάνιση του φαινοτύπου των DU145 διαφοροποιημένων κυττάρων καρκίνου αναλύσαμε την έκφραση της πρωτεΐνης ενδιάμεσων νηματίων βιμεντίνης. Στην πραγματικότητα, η έκφραση βιμεντίνη έχει αναφερθεί να διαμορφώνεται κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης των κυττάρων, ανάλογα με το κύτταρο γενεαλογίας [21] και βρέθηκε εντόνως εκφρασμένο στην κυτταρική σειρά DU145 [17]. Στην πραγματικότητα, μετά από 20 ημέρες σε μέσο συμπληρωμένο με FBS, βιμεντίνη-αρνητικά κύτταρα που προέρχονται από σφαιροειδή που εκφράζονται βιμεντίνη σε επίπεδα συγκρίσιμα με κύτταρα DU145 (Σχήμα 1 G).

Τέλος, προσδιορίσαμε την ικανότητα του όγκου παραγωγής των κυττάρων με σφαιροειδές σχέση με μη ταξινομημένα κύτταρα DU145 σε ποντίκια με ανοσοανεπάρκεια. Η ένεση 1 σφαιροειδές 300 μm σε διάμετρο, που περιέχει περίπου 5000 κύτταρα, κατέληξε σε όγκους στο 80% των ποντικών, ενώ η έγχυση του 5000 χύμα κυττάρων DU145 δημιουργούνται όγκοι στο 40% των ζώων (Σχήμα 1). Επιπλέον, η λανθάνουσα κατάσταση του όγκου ήταν επίσης μικρότερη στα σφαιροειδή ενέθηκαν ποντικοί ό, τι στο ποντικούς που έχουν εγχυθεί με μη ταξινομημένα κύτταρα (37 και 54 ημέρες, αντίστοιχα). Η ένεση του 3 × 10

6 DU145 κύτταρα, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι, που δημιουργούνται όγκων με τη χαμηλότερη λανθάνουσα κατάσταση σε όλα τα ποντίκια. Συνεπής με την προηγούμενη έκθεση [20], όλοι μαζί τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η CD44

+ CD24

– σφαιροειδές κύτταρα που υπάρχουν βασικές βιολογικές ιδιότητες της CSC, δεδομένου ότι έδειξε ικανότητα για αυτο-ανανέωση, ήταν σε θέση να διαφοροποιηθούν σε πρόδρομα κύτταρα DU145 και ήταν πιο ογκογόνα από χύμα κύτταρα DU145 όταν ο ίδιος αριθμός κυττάρων εγχύθηκε σε ποντικούς.

ετερογενούς σύνθεσης του σφαιροειδή

τα σφαιροειδή έως 300-400 μm σε διάμετρο εμφάνισαν συμπαγής αρχιτεκτονική (Εικόνα 2Α) λόγω της παρουσίας του πολύ στενό επαφές κυττάρου-προς-κύτταρο, όπως φαίνεται στην Ηλεκτρονική Μικροσκοπία (ΤΕΜ). μεγέθυνση υψηλής ισχύος έδειξε πολλαπλές συνδετική σύμπλοκα που σχηματίζονται από δεσμοσωμάτων και προσκολλημένα κόμβους (Σχήμα 2Β). Σφαιροειδές κύτταρα παρουσιάζονται επίσης συγκροτήματα πυρηνικού πόρου οργανώνονται σε δακτυλιοειδείς ελάσματα (Σχήμα 2C), τα οποία θεωρούνται πρόδρομοι για τη συναρμολόγηση του πυρηνικού περιβάλλουν. Είναι συνήθως υπάρχουν σε εμβρυϊκά και ανώριμα κύτταρα και εξαφανίζονται κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης [22]. Ωστόσο, σφαιροειδή κατέχουν επίσης διαφοροποιημένα κύτταρα που, σε αυτές τις συνθήκες καλλιέργειας εκλεκτικό για βλαστικά κύτταρα, έδειξε αρκετές επίπεδα αποικοδόμησης των κυττάρων. Ειδικότερα, χαρακτηριστικό κυτταροπλασματική κύστες ήταν εμφανής (Εικόνα 2D), υποδεικνύοντας ότι η υποβάθμιση φάση πλησίασε νέκρωση κυττάρων (Σχήμα 2F), ενώ οι πυρήνες εμφανίστηκε κυρίως άθικτα (Σχήμα 2Ε). Αυτές οι βλάβες δείχνουν το τερματικό μοίρα των διαφοροποιημένων κυττάρων. Αξιολόγησης

(Α) αντίθεση φάσης του σφαιροειδούς δομής (10 ×). (Β) Ανάλυση ΤΕΜ που δείχνουν δεσμοσωμάτων και προσκολλημένα κόμβους (πάνω και κάτω, αντίστοιχα), καθώς και τα ελάσματα δακτυλιοειδείς (C) στο σφαιροειδές κύτταρα. (D) Φάση αντίθεσης (20 Χ) ενός θραύσματος του σφαιροειδούς που περιβάλλεται από τα κύτταρα που χαρακτηρίζονται από προεξέχοντα κύστες των κενών κυτταροπλάσματος, οι οποίες παρουσιάζουν ανέπαφη πυρήνες όπως δείχνεται με χρώση ϋΑΡΙ (40 ×, E). (F) χρώση με trypan blue δείχνει την παρουσία των νεκρών κυττάρων σε σφαιροειδή (10 Χ). χρώση ανοσοφθορισμού ενός τμήματος του σφαιροειδή και κυττάρων DU145 (αρχική μεγέθυνση χ 200) που δείχνει την έκφραση της Ε-καδερίνης (G), β-κατενίνης (H) και βιμεντίνης (Ι).

Η

Τα σφαιροειδή και κύτταρα DU145 αξιολογήθηκαν επίσης για την έκφραση των δεικτών του στελέχους (Ε-καδερίνης και β-κατενίνης [23] – [25]) και διαφοροποιημένα κύτταρα (βιμεντίνη). χρώση ανοσοφθορισμού προσδιορίζονται Ε-καδερίνης και της έκφρασης β-κατενίνης στα δύο κυτταρικούς πληθυσμούς, αλλά σε υψηλότερα επίπεδα σε σφαιροειδή (Σχήματα 2G και 2Η, αντίστοιχα). Αξίζει να σημειωθεί ότι, σε σφαιροειδή κύτταρα Ε-καδερίνης και χρώση β-κατενίνης ήταν εντοπισμένη στην μεμβράνη του πλάσματος, ενώ στα κύτταρα DU145 ήταν κυρίως κυτταροπλασματική, υποδεικνύοντας ότι διαφοροποιημένα κύτταρα όγκου ήταν αρκετά ανεξάρτητη από κύτταρο-προς-κύτταρο αλληλεπιδράσεων. Το ώριμο φαινότυπο των κυττάρων DU145 συνοδεύτηκε από μια υψηλή έκφραση του βιμεντίνης, που, αντιθέτως, εκφράστηκε μόνο από σπάνιες κύτταρα σε σφαιροειδή (σχήμα 2I). Ως εκ τούτου, μπορούμε να συμπεράνουμε ότι τα σφαιροειδή εμπλουτισμένα για CSC, αλλά έκρινε επίσης ορισμένα κατεστραμμένα διαφοροποιημένα κύτταρα που προορίζονται για τη νέκρωση.

Ανάλυση των όγκων που αναπτύσσονται σε ποντίκια

Συγκρίνοντας όγκοι που δημιουργούνται σε NOD /SCID ποντίκια μετά την ένεση 1 σφαιροειδούς (που περιέχει περίπου 5000 συνολικά κύτταρα, λαμβάνοντας υπόψη τόσο CSC και κατεστραμμένα διαφοροποιημένων κυττάρων) 5000 μη ταξινομημένα κύτταρα DU145 (που περιέχουν κυρίως διαφοροποιημένα κύτταρα και ένα πολύ μικρό ποσοστό του CSC) ή, αρκετές μακροσκοπικές διαφορές ήταν εμφανείς κατά τη στιγμή της εκτομής του όγκου. Όγκοι από σφαιροειδή αυξήθηκαν βαθιά στο σημείο της ένεσης, εισέβαλαν γειτονικούς ιστούς και έδειξε αξιοσημείωτη αγγείωση. Διαφορετικά, οι όγκοι που προέρχονται από την έγχυση των κυττάρων DU145 μεγάλωσε επιφανειακά και εμφανίστηκε καλά οριοθετημένη και κινητά σε σχέση με τους περιβάλλοντες ιστούς. Ορατά αιμοφόρα ήταν σπάνια ή απούσα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Αυτές οι διαφορές επιβεβαιώθηκαν με ιστολογική ανάλυση. Σφαιροειδές προερχόμενα όγκοι αποτελούνται από μονομορφικού κύτταρα με υψηλή αναλογία πυρήνα /κυτταροπλάσματος και παρουσίασε μία έντονη διηθητική ανάπτυξη χαρακτηρίζεται από μπάντες εισβολή των γύρω μυϊκός και ο λιπώδης ιστούς (Σχήμα 3Α, αριστερός πίνακας). Αντιθέτως, οι όγκοι που δημιουργούνται από μη ταξινομημένα κύτταρα DU145 αποτελούνταν από μορφολογικά ετερογενείς υποπληθυσμών των κυττάρων και έδειξε μια επεκτατική ανάπτυξη, συμπιέζοντας παρά διηθούν τους γειτονικούς ιστούς του ξενιστή (Σχήμα 3Α, δεξιό πλαίσιο). Είναι ενδιαφέρον, ιδιαίτερα επιθετικοί όγκοι έδειξαν χαμηλότερη έκφραση Ε-καδερίνης και β-κατενίνης και υψηλότερη έκφραση του βιμεντίνης όταν συγκρίνεται με σχεδόν επιθετικοί όγκοι (Σχήμα 3Β). Αξίζει να σημειωθεί ότι, σε κάθε όγκο το μοτίβο έκφρασης αυτών των δεικτών ήταν 3 αντίθετη με εκείνη των κυττάρων τα οποία προέρχονταν ίδιο τον όγκο, δηλαδή CSC ή DU145 κυττάρων (Σχήματα 2G-2Η).

(Α) ιστολογική χρώση με η &? Ε των όγκων καλλιεργούνται μετά την ένεση 1 σφαιροειδές ή 5000 DU145 κύτταρα που παρουσιάζουν ιδιαίτερα επεμβατική (αριστερό πάνελ) και scantly επεμβατική (δεξιά) φαινότυπο (5 ×). Οι αστερίσκοι δείχνουν τα σύνορα μεταξύ των όγκων και των περιβαλλόντων ιστών. (Β) Αντιπροσωπευτική στυπώματα Western που δείχνει την έκφραση της Ε-καδερίνης, β-κατενίνης και βιμεντίνη σε όγκους. (Γ) χρώση IHC με αντι-ποντικού CD31 αντίσωμα τονίζοντας υψηλότερη πυκνότητα σκάφος σε σφαιροειδή προερχόμενα όγκους (υποδεικνύονται με αστερίσκους, αριστερό πάνελ) σε σύγκριση με τους όγκους από κύτταρα DU145 (δεξιά). (D) Q-PCR που δείχνουν έκφραση CD31 ποντικού σε όγκους. Ποντίκι Β2Μ χρησιμοποιήθηκε σαν ενδογενής έλεγχος. Οι τιμές είναι μέση τιμή ± SEM από 3 πειράματα. *,

σ

& lt? 0,05 σε σχέση με τους όγκους που δημιουργούνται από σφαιροειδές. (Ε) IHC με αντι-CD56 αντίσωμα παρουσιάζει υψηλότερη πυκνότητα των κυττάρων ΝΕ σε όγκους που παράγονται από σφαιροειδές ό, τι από τα κύτταρα DU145 (20 ×). (F) Q-PCR εμφάνιση επίπεδο CGA mRNA στους όγκους. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως αναλογίες μεταξύ του γονιδίου-στόχου και του ενδογενούς GAPDH ελέγχου και αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM από 3 ανεξάρτητα πειράματα. *,

σ

& lt? 0,05 σε σχέση με τους όγκους που δημιουργούνται από σφαιροειδές. (G) Ένας εκπρόσωπος ανάλυση FACS δείχνει την παρουσία του CD44

+ CD24

– κυττάρων σε όγκους που παράγονται από την ένεση του 1 σφαιροειδές σε ποντίκια. Οι όγκοι που προέρχονται από την έγχυση του 5000 DU145 κυττάρων έδειξε ένα συγκρίσιμο CD44

+ CD24

– κυτταρικός πληθυσμός (τα δεδομένα δεν φαίνονται)

Η

Οι όγκοι που δημιουργούνται από σφαιροειδή έδειξε επίσης μια σημαντική αύξηση του αριθμού των. αιμοφόρων αγγείων (

ρ

& lt? 0,0001), όπως παρακολουθείται με χρώση με το CD31 ενδοθηλιακού δείκτη κυττάρων (Σχήμα 3C, αριστερά), σε σύγκριση με τους όγκους προήλθε από DU145 κύτταρα (Σχήμα 3C, δεξιά). Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώθηκαν από την ανάλυση του επιπέδου έκφρασης CD31 mRNA (Σχήμα 3D) και δείχνουν ενεργό νεοαγγειογένεσης σε όγκους που προέρχονται από σφαιροειδή. Επιπλέον, η ανάλυση ανοσοϊστοχημική (IHC) έδειξε μεγαλύτερο αριθμό κυττάρων θετικών για CD56, έναν δείκτη των κυττάρων ΝΕ, σε περισσότερες επιθετικοί όγκοι σε σχέση με λιγότερο επεμβατικές όγκους (Σχήμα 3Ε). Η παρατήρηση αυτή επιβεβαιώθηκε με PCR πραγματικού χρόνου ανάλυση της ΑΧΕ, περαιτέρω δείκτη των κυττάρων ΝΕ (Σχήμα 3F). Επιπλέον, η ανάλυση FACS των όγκων που αποκόπτονται και πέψη αποκάλυψε ότι και οι δύο τύποι νεοπλασίας περιείχε ένα συγκρίσιμο CD44

+ CD24

– κυτταρικού πληθυσμού (Σχήμα 3G). Αυτά τα ευρήματα παρέχουν απόδειξη ότι CSC ήταν σε θέση να παράγει εξαιρετικά επιθετικοί όγκοι σε γυμνούς ποντικούς. Ωστόσο, η έγχυση CSC με DU145 διαφοροποιημένα κύτταρα όγκου (δηλαδή έγχυση μη ταξινομημένα κύτταρα DU145) είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση των όγκων του χαμηλού βαθμού επιθετικότητας.

Επίδραση του ρυθμισμένου μέσου από κύτταρα DU145 επί της διαφοροποίησης CSC

με βάση τις ανωτέρω διαπιστώσεις, διερευνήθηκε η επίδραση των DU145 διαφοροποιημένων κυττάρων σε επιλεγμένα CD44

+ CD24

– προστάτη CSC

in vitro

. Ανατμηθέντες σφαιροειδή αναπτύχθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με FBS (για την προσομοίωση της έγχυσης σφαιροειδή σε ποντικούς) ή σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με FBS στην οποία τα κύτταρα DU145 προηγουμένως αναπτύχθηκαν για 3 ημέρες (ρυθμισμένο μέσο (CM), για την προσομοίωση της ένεσης των κυττάρων χύδην DU145 σε ποντικούς). Σε αμφότερες τις συνθήκες καλλιέργειας, CSC περιέχονται σε σφαιροειδή αυξήθηκε το μονοστιβάδας, αλλά ο πολλαπλασιασμός τους μειώθηκε σημαντικά όταν καλλιεργήθηκαν για 20 ημέρες σε CM (-47%? Σχήμα 4Α). Η αναστολή του πολλαπλασιασμού σφαιροειδούς ενισχύθηκε περαιτέρω με αύξηση της συγκέντρωσης του CM (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, φάνηκε πολύ εμφανές ότι τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο που περιείχε FBS ήταν αρκετά ανεξάρτητη από κύτταρο προς κύτταρο αλληλεπιδράσεις καθώς αυξήθηκαν κυρίως μεμονωμένα ή σε μικρές ομάδες με ακανόνιστο σχήμα, και η μορφολογία και το μοτίβο της ανάπτυξης τους ήταν παρόμοια με αυτά του DU145 κύτταρα (Σχήμα 4Β, αριστερό πάνελ). Αντιθέτως, τα κύτταρα σε CM ήταν σφιχτό αλλήλων και μεγάλωσε κυρίως ως σφαιροειδές νησιά (Σχήμα 4Β, δεξιό πλαίσιο). Είναι ενδιαφέρον ότι, μετά από 20 ημέρες και μόνο στις πλάκες που περιέχουν μέσο συμπληρωμένο με FBS, παρατηρήσαμε την εμφάνιση των κυττάρων που εμφανίζουν την δενδρίτη-όπως μορφολογία χαρακτηριστική των κυττάρων ΝΕ (Σχήμα 4Β, αριστερό πάνελ και το Σχήμα 4C). Η ταυτότητα αυτών των κυττάρων επιβεβαιώθηκε με την αξιολόγηση της έκφρασης CD56 στα κυτταροπλασματικά κοκκία των κυττάρων ΝΕ (Σχήμα 4C, δεξιά πάνελ). Η ανάλυση της έκφρασης των δεικτών των βλαστικών και διαφοροποιημένων κυττάρων επισημαίνεται ότι μετά από 20 ημέρες σε FBS που περιέχει μέσον, τα κύτταρα εμφανίζονται επίπεδα Ε-καδερίνης, β-κατενίνης και βιμεντίνης συγκρίσιμες με εκείνες που παρουσιάζονται από τα κύτταρα DU145 (Σχήμα 4D). Αντιθέτως, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν για 20 ημέρες σε CM εμφάνισαν επίπεδα έκφρασης ενδιάμεση μεταξύ αυτών που παρουσιάζονται από τον έλεγχο CSC και τα κύτταρα DU145 αλλά πιο κοντά στα επίπεδα του CSC. Συγκεκριμένα, μία μείωση στην έκφραση της Ε-καδερίνης και β-κατενίνης και μία ελαφρά αύξηση στο επίπεδο της βιμεντίνης σε σχέση με τον έλεγχο σφαιροειδή ήταν εμφανής (Εικόνα 4D). Είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι τόσο η υψηλή έκφραση των μορίων προσκόλλησης και η χαμηλή έκφραση του βιμεντίνης έδειξε ισχυρή κύτταρο-προς-κύτταρο αλληλεπιδράσεις και μειωμένη κυτταρική κινητικότητα, αντίστοιχα, το οποίο συμφώνησε καλά με την ιδιόμορφη κυτταρική ανάπτυξη, όπως νησιά. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η CSC καλλιεργήθηκαν σε επιτρεπτές συνθήκες ήταν σε θέση να παράγει τελικά διαφοροποιημένα κύτταρα, δηλαδή DU145 και ΝΕ κύτταρα. Ωστόσο, διαχεόμενο παράγοντες που απελευθερώνονται από τα κύτταρα DU145 εμπόδισε τη διαφοροποίηση της CSC.

(Α) Ο πολλαπλασιασμός του CSC που περιέχονται σε σφαιροειδή αναπτύσσονται σε FBS που περιέχει μέσο ή στο CM από κύτταρα DU145 αξιολογήθηκε σε διαφορετικές χρονικές στιγμές του πολιτισμού. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± SEM από 3 πειράματα. Οι αστερίσκοι δείχνουν μια σημαντική ανασταλτική δράση των CM σε σχέση με FBS-μέσο (*,

σ

& lt? 0,05). (Β) αντίθεση φάσης (10 χ) των κυττάρων μετά από 20 ημέρες σε FBS που περιέχει μέσο ή σε CM δείχνει το διαφορετικό πρότυπο της κυτταρικής ανάπτυξης. Στο αριστερό πλαίσιο, το ορθογώνιο αναδεικνύει την παρουσία των κυττάρων ΝΕ. (C) αντίθεσης φάσης (αριστερά, 20 ×) και IF χρώση (δεξιά, 40 ×) της διακλαδισμένης κύτταρα ΝΕ παράγεται από CSC καλλιεργούνται σε FBS-μέσο. Ειδικότερα, το δεξιός πίνακας δείχνει την έκφραση του CD56 στο κυτταρόπλασμα και σε μακροπρόθεσμη κυτταρικές διεργασίες. (D) Αντιπροσωπευτική κηλίδες Western που δείχνει τις αλλαγές στην έκφραση της Ε-καδερίνης, β-κατενίνης, και βιμεντίνη σε σφαιροειδείς CSC καλλιεργούνται στις διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας σε σχέση με τον έλεγχο σφαιροειδή και τα κύτταρα DU145. Τα επίπεδα έκφρασης των 3 πρωτεϊνών προσδιορίστηκαν με πυκνομετρική ανάλυση των αντίστοιχων ζωνών και κανονικοποιημένα επίπεδα σε β-ακτίνη. Οι τιμές που αναφέρονται στα ιστογράμματα είναι μέσες ± SEM από 3 ανεξάρτητα πειράματα.

Η κατατομή

Η γονιδιακή έκφραση της CSC και κυττάρων DU145

Για τη διερεύνηση της κυτταρικής απόκρισης που εμπλέκονται στην ογκογένεση τόσο στο επίπεδο της γονιδιακή έκφραση και στο επίπεδο συναρμογής προ-mRNA, πραγματοποιήσαμε μια ολόκληρο το γονιδίωμα, μάτισμα ευαίσθητη ανάλυση μικροσυστοιχιών κυττάρων DU145 και επιλεγμένων CSC τους. Δείγματα RNA που παρασκευάζεται από κάθε πληθυσμό κυττάρου υβριδοποιήθηκαν Ανθρώπινα εξόνιο 1,0 ST Πίνακες, οι οποίες επιτρέπουν τον ορισμό των δύο μοτίβα μεταγραφής (γονιδιακή ανάλυση επιπέδου) και εναλλακτικές εκδηλώσεις ωρίμανση προ-mRNA (ανάλυση εξόνιο-επίπεδο). Gene-επίπεδο προφίλ έκφρασης ανιχνεύθηκε με γραμμική στατιστικές μοντέλο χρησιμοποιώντας μια εμπειρική μέθοδο Bayes έως μέτρια τα τυπικά σφάλματα. Για την αξιολόγηση της μεταγραφικής τροποποιήσεις, αναλύσαμε τις αλλαγές της γονιδιακής έκφρασης σε σφαιροειδές CSC

vs κύτταρα

DU145. Για τον προσδιορισμό των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων, εφαρμόσαμε μια απόλυτη ημερολόγιο

2 φορές αλλαγή ≥ +/- 1 και Ρ-value≤0.05 ως αποκοπές. Η πολυπλοκότητα του συνόλου δεδομένων μειώθηκε με την αφαίρεση των μη σημαντικών συνόλων ανιχνευτών (αυτά που δεν εκφράζεται και εκείνων που δεν αλλάζει). Με αυτόν τον τρόπο, περισσότερα από 400 γονίδια των οποίων τα επίπεδα ήταν σημαντικά διαφορετική σε CSC και επιλέχθηκαν κύτταρα DU145. Ένας πλήρης κατάλογος των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων που βρέθηκαν στον πίνακα S1.

Ανάλυση επιλεγμένων γονιδίων

Τα διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια αναλύθηκαν για μοριακές και κυτταρικές λειτουργίες τους και τις συναφείς οδούς χρησιμοποιώντας την Ανάλυση Ingenuity Pathways λογισμικό (IPA 7.0, Ingenuity Systems). Η ανάλυση IPA εντοπίζονται περισσότερα από 70 λειτουργικές κατηγορίες, και μεταξύ αυτών, έχουμε επιλέξει τα 8 πιο συνεπείς τάξεις βρέθηκε εμπλουτισμένο εντός του συνόλου των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων (δηλαδή, τον καρκίνο, την κυτταρική κίνηση, κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό, τη μορφολογία των κυττάρων, του κυτταρικού θανάτου, κυτταρικής ανάπτυξη, τον κυτταρικό κύκλο, κύτταρο προς κύτταρο σηματοδότηση και την αλληλεπίδραση? Σχήμα 5Α) που ήταν κατάλληλα για τον χαρακτηρισμό των κυττάρων CSC και DU145. Συνδυάσαμε τα γονίδια από τις 8 επιλεγμένες λειτουργικές κατηγορίες, τον εντοπισμό 22 κοινά γονίδια εξακολουθούν να δείχνουν τις λειτουργικές συνδέσεις. Αυτά στη συνέχεια διαχωρίζονται ανάλογα με τον κυτταρικό εντοπισμό τους. Είναι ενδιαφέρον ότι, περαιτέρω ανάλυση των επιμέρους επιλεγμένα γονίδια έδειξε ότι 17 από τα 22 γονιδιακά προϊόντα εντοπίστηκαν στη μεμβράνη του πλάσματος ή εκκρίνονται στον εξωκυττάριο χώρο (Σχήμα 5Β), την ενίσχυση πάνω από τα ευρήματά μας δείχνουν τη σημασία των αλληλεπιδράσεων μεταξύ CSC και η μικροπεριβάλλον. Παρά το γεγονός ότι τα επιλεγμένα γονίδια που κωδικοποιούνται πρωτεΐνες με μια ευρεία ποικιλία λειτουργιών, 4 κύριες ομάδες θα μπορούσαν να προσδιοριστούν: 1) Pro-αγγειογόνους παράγοντες αγγειοποιητίνη 2 (ANGPT2), αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα C (VEGFC) και πλούσια σε κυστεΐνη αγγειογενετική επαγωγέα 61 (CYR61) βρέθηκαν κάτω-ρυθμίζονται σε CSC σε σχέση με τα κύτταρα DU145? 2) Τα γονίδια που κωδικοποιούν μόρια προσκόλλησης Ε-καδερίνης (Cdh1), ιντεγκρίνης βήτα 6 (ITGB6) και διασταύρωση πλακοσφαιρίνη (JUP) εκφράστηκαν περισσότερο CSC σε συμφωνία με την παράλληλη προς τα κάτω ρύθμιση των μικροσπηλαίων πρωτεΐνης (CAV1)? 3) ογκοκατασταλτικά γονίδια λιποκαλίνη 2 (LCN2), διπεπτιδυλικής πεπτιδάσης-4 (DPP4), πρωτεΐνη δέσμευσης παράγοντα ανάπτυξης που μοιάζει με ινσουλίνη 3 (IGFBP3), θειορεδοξίνη αλληλεπιδρώντας πρωτεΐνη (TXNIP) και Kruppel-σαν παράγοντας 4 (KLF4) ρυθμίζονταν up- στην CSC? 4) Διάχυτο παράγοντες που σχετίζονται με τη συντήρηση κόγχη βλαστικών κυττάρων όπως του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF), μορφογενετική πρωτεΐνη οστών 4 (ΒΜΡ4) και μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας βήτα 2 (TGFB2) επίσης διαφορετικά εκφράζονται σε CSC και τα κύτταρα DU145. Αξιοσημείωτα, 19 από τα 22 γονίδια που προσδιορίσαμε δεν είχαν περιγραφεί προηγουμένως να εκφράζονται ανώμαλα σε προστάτη CSC. Αυτά τα δεδομένα επιβεβαιώνουν ότι οι αλληλεπιδράσεις με το μικροπεριβάλλον έχουν ένα κρίσιμο ρόλο στον έλεγχο του φαινοτύπου των CSC και προτείνουν έναν περιορισμένο αριθμό γονιδίων των οποίων παρουσιάζει ενδιαφέρον σε CSC σηματοδότηση θα πρέπει να διερευνηθεί. Επιπλέον, τα περισσότερα από τα 22 επιλεγμένα γονίδια θα μπορούσαν να είναι μυθιστόρημα δείκτες του προστάτη CSC.

(Α) Επιλεγμένα 8 top βιολογικές λειτουργίες βρίσκονται εμπλουτίζεται μέσα στο σύνολο των μεταγραφών διαμορφώνονται σε CSC σε σχέση με το συνολικό κύτταρα DU145 με ανάλυση μικροσυστοιχιών. (Β) Τα 22 απορυθμισμένη γονίδια, όπως προσδιορίζεται με ΙΡΑ, είναι τοποθετημένα σε υποκυτταρική σχεδιαγράμματα, και οι σχέσεις, σημειωμένες με βέλη: συμπληρώθηκε και διακεκομμένα βέλη γραμμή σηματοδοτήσει άμεσες και έμμεσες αλληλεπιδράσεις, αντίστοιχα. Γονίδια στο κόκκινο έδειξαν αυξημένη έκφραση σε CSC, ενώ τα γονίδια στο πράσινο ήταν κάτω-ρυθμίζονται. (Γ) Οι διαφορές στην έκφραση των γονιδίων που προσδιορίζεται με ανάλυση μικροσυστοιχιών επιβεβαιώθηκε με Q-PCR, η επιλογή 7 εκπρόσωπος των γονιδίων μεταξύ των επιλεγμένων 22. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως αναλογία μεταξύ κάθε γονιδίου στόχου και του ενδογενούς GAPDH ελέγχου. Έκφραση σε CSC συγκρίθηκε με αυτό που παρατηρήθηκε σε κύτταρα DU145 στην οποία αποδίδεται αυθαίρετα μια τιμή ίση με 1. Οι τιμές είναι μέση τιμή ± SEM από 3 πειράματα. *,

σ

& lt? 0,05 σε σχέση με κύτταρα DU145

Η

Επικύρωση της γονιδιακής έκφρασης

Για να επιβεβαιώσετε τις διαφορές στην έκφραση των γονιδίων που βρέθηκαν με ανάλυση μικροσυστοιχιών, Q-. PCR διεξήχθη για 7 διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων (Cdh1, CYR61, DPP4, IGFBP3, ITGB6, LCN2, TGFB2). Σε όλες τις περιπτώσεις, οι διαφορές στα επίπεδα mRNA επιβεβαιώθηκαν (Σχήμα 5C).

Ο ρόλος της οδού του Ε-καδερίνης στην διαφοροποίηση της CSC

ανάλυση Q-PCR έδειξε ότι η έκφραση του mRNA της λιποκαλίνη 2 και Ε-cadherin ακολούθησε μια ανάλογη τάση στην CSC, τα κύτταρα DU145 και CSC καλλιεργούνται για 20 ημέρες σε FBS που περιέχει μέσο ή σε CM. Ειδικότερα, τα επίπεδα mRNA των δύο γονίδια ήταν πολύ υψηλά σε CSC περιέχονται σε σφαιροειδή, μειώθηκαν το CSC αναπτύχθηκαν σε CM και ήταν σημαντικά χαμηλότερα και συγκρίσιμα CSC αναπτύχθηκαν σε FBS θρεπτικό μέσο και σε κύτταρα DU145 (Σχήμα 6). Η τάση αυτή ήταν σε συμφωνία με την διαμόρφωση της έκφρασης β-κατενίνης παρατηρήθηκε προηγουμένως στις ίδιες συνθήκες καλλιέργειας (Εικόνα 4D). Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η οδός του Ε-καδερίνης ήταν διαμορφωμένο κατά τη διάρκεια της CSC διαφοροποίησης.

Q-PCR που δείχνουν τις μεταβολές στα επίπεδα mRNA για λιποκαλίνη-2 και Ε-καδερίνης σε κύτταρα DU145, CSC περιέχονται σε σφαιροειδή ελέγχου, και CSC καλλιεργούνται για 20 ημέρες σε FBS-μέσο ή CM από κύτταρα DU145. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM από 3 μεμονωμένα πειράματα. Οι αστερίσκοι δείχνουν μία σημαντική διαφορά (*,

σ

& lt? 0,05).

Η

Συζήτηση

Ογκογονικότητα προστάτη CSC

CD44

+ CD24

– κύτταρα που απομονώνονται από την κυτταρική σειρά DU145 καρκίνου του προστάτη χρησιμοποιώντας δείκτες κυτταρικής επιφάνειας ήταν σε θέση να αναπτυχθούν ως μη προσκολλημένα σφαιροειδή σε μέσο ελεύθερο ορού συμπληρωμένο με ειδικούς παράγοντες αναπτύξεως. Ως αποτέλεσμα των ασύμμετρων σφαιροειδή διαίρεσης αρχέγονων κυττάρων εμπλουτίστηκαν σε καρκινικά βλαστικά κύτταρα (CSC), αλλά είχε επίσης ένα ποσοστό των διαφοροποιημένων κυττάρων πλησιάζει νέκρωση. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η CSC ήταν σε θέση να υποβληθούν σε ασύμμετρη διαίρεση επίσης

in vivo

επειδή μετά την ένεση σε ποντικούς, και οι δύο παράγονται διαφοροποιημένα κύτταρα που αποτελούσαν το μεγαλύτερο μέρος του όγκου και αυτο-ανανεώνονται οι ίδιοι όπως αποδεικνύεται από την παρουσία του CD44

+ CD24

– κύτταρα σε όλες τις εκτομή όγκων

Μια εντυπωσιακή διαφορά στην ογκογόνο ικανότητα φάνηκε από τη διαφορετική συχνότητα και την καθυστέρηση των όγκων που προέρχονται από σφαιροειδές CSC ή έγχυση κυττάρων DU145, με την πρώην. κυτταρικός πληθυσμός είναι πιο ογκογόνο. Προτείνουμε ότι η καθυστέρηση στο σχηματισμό όγκων μετά την ένεση του 5000 DU145 κύτταρα θα μπορούσαν να αποδοθεί στην αμελητέο αριθμό CSC πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα DU145 εγχέεται σε σύγκριση με την ποσότητα του εμπλουτισμένου CSC που περιέχεται σε κάθε σφαιροειδές. Αυτές οι διαπιστώσεις και η πρόταση αυτή επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω από την ένεση του 3 × 10

6 DU145 κυττάρων, η οποία πραγματοποιήθηκε ένα μεγαλύτερο ποσό της CSC από 1 σφαιροειδές και δημιουργούνται οι όγκοι σε μόλις μία εβδομάδα.

Είναι σημαντικό, η περαιτέρω