Αφηρημένο

Μη διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης (NMIBC) είναι ένα από τα πιο οι κοινές κακοήθεις όγκοι στο ουρολογικό σύστημα με υψηλό κίνδυνο υποτροπής, και αποτελεσματική μη επεμβατική βιοδεικτών για NMIBC υποτροπή εξακολουθούν να χρειάζονται. Η ανθρώπινη ουρική πρωτεώματος μπορεί να αντανακλά την κατάσταση του μικροπεριβάλλοντος του ουροποιητικού συστήματος και αποτελεί την ιδανική πηγή για την κλινική διάγνωση των παθήσεων του ουροποιητικού συστήματος. προηγούμενες εργασίες μας χρησιμοποιούνται πρωτεϊνωματική να προσδιορίσουν 1643 υψηλής εμπιστοσύνης των ούρων πρωτεΐνες στα ούρα από έναν υγιή πληθυσμό. Εδώ, χρησιμοποιήσαμε βιοπληροφορικής για την κατασκευή ενός δικτύου αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης που σχετίζεται με καρκίνο (ΡΡΙ) που περιλαμβάνει 16 υψηλής αφθονίας πρωτεΐνες ούρων με βάση την ουρική βάση δεδομένων πρωτεώματος. Ως αποτέλεσμα, επιλέχτηκε βήτα υποδοχέα αυξητικού παράγοντα που προέρχεται από αιμοπετάλια (PDGFRB) για περαιτέρω επικύρωση ως υποψήφιο βιοδείκτη για τη διάγνωση και την πρόγνωση NMIBC. Αν και τα επίπεδα ουρικής PDGFRB δεν έδειξε σημαντική διαφορά μεταξύ των ασθενών πριν και μετά την χειρουργική επέμβαση (n = 185, Ρ & gt? 0,05), πάνω από 3 έτη παρακολούθησης, ουρική PDGFRB δείχθηκε να είναι σημαντικά υψηλότερη σε υποτροπή ασθενείς (n = 68) από ό, τι σε ασθενείς ελεύθεροι υποτροπών (n = 117, Ρ & lt? 0.001). Τα επίπεδα ουρικής PDGFRB συσχετίζονταν σημαντικά με τον κίνδυνο της 3-χρόνια υποτροπή της NMIBC, και αυτά τα επίπεδα βελτίωσε την ακρίβεια ενός μοντέλου πρόβλεψης NMIBC κίνδυνος υποτροπής που περιλάμβανε την ηλικία, το μέγεθος του όγκου, και ο αριθμός των όγκων (περιοχή κάτω από την καμπύλη, 0.862? 95% CI, 0,809 έως 0,914) σε σύγκριση με PDGFR μόνο. Ως εκ τούτου, μπορούμε να υποθέσουμε ότι η ακράτεια PDGFRB θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως μια μη επεμβατική βιοδείκτη για την πρόβλεψη NMIBC επανάληψης

Παράθεση:. Feng J, Ο W, Τραγούδι Υ, Wang Υ, Simpson RJ, Zhang Χ, et al. (2014) αιμοπετάλια αυξητικός παράγοντας βήτα υποδοχέα: Ένα μυθιστόρημα του ουροποιητικού βιοδεικτών για υποτροπή της μη διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης. PLoS ONE 9 (5): e96671. doi: 10.1371 /journal.pone.0096671

Επιμέλεια: Hari Κ Κοαΐ, Louisiana State University Κέντρο Επιστημών Υγείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 16, Οκτώβρη του 2013? Αποδεκτές: 10 Απριλίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: May 6, 2014

Copyright: © 2014 Feng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εργαστήριο Κλειδί Chongqing για την ασθένεια Πρωτεϊνωματική έργου. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνου της ουροδόχου κύστης είναι η έβδομη συχνότερος καρκίνος παγκοσμίως και περίπου το 80% των περιπτώσεων είναι μη-διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης (NMIBC), ενώ το υπόλοιπο 20% είναι διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης (MIBC) [1 ] – [3]. Όλων των νέων διαγνωσμένων κρουσμάτων της μεταβατικής καρκινώματα, περίπου το 80% του παρόντος ως μη διηθητικό όγκων (Ta-T1) [3]. Για NMIBC, 50-70% των ασθενών θα αναπτύξουν την υποτροπή της νόσου εντός δύο ετών από την αρχική τους διάγνωση [4]. Τρέχουσες κλινικές και ιστοπαθολογικές συμβατικές παραμέτρους, όπως το στάδιο του όγκου, τον βαθμό και το μέγεθος των όγκων, είναι καλά μελετηθεί όσον αφορά την παροχή προγνωστικών πληροφοριών σχετικά με την εξέλιξη των μυών εισβολή και επανάληψης. Ωστόσο, κανένας από αυτούς τους παράγοντες έχουν αποδειχθεί ότι είναι επαρκής για την πρόβλεψη της συμπεριφοράς των ποικίλων NMIBC. Έτσι, βιοδείκτες για NMIBC επανάληψη, οι οποίες είναι μη επεμβατική, απαιτούνται επειγόντως για κλινική θεραπεία.

ανθρώπινα ούρα είναι ένα από τα σημαντικότερα σωματικά υγρά και είναι μια ιδανική πηγή για την κλινική διάγνωση, ειδικά για τις ασθένειες του ουροποιητικού συστήματος, καθώς τα ούρα μπορούν να ληφθούν μη διεισδυτικά σε μεγάλες ποσότητες [5]. Πρωτεϊνών ούρων θα πρέπει να θεωρούνται ως πιθανές πηγές βιοδεικτών για αρκετές ασθένειες. Κατά τη διάρκεια των τελευταίων ετών, μεγάλες τεχνολογικές πρόοδοι σημειώθηκαν στην πρωτεομική, και ένας μεγάλος αριθμός των πρωτεϊνών στο ουροποιητικό πρωτεώματος των υγιών ανθρώπων έχουν εντοπιστεί [6] – [10]. Ωστόσο, η εφαρμογή των εν λόγω βάσεων δεδομένων σε πρωτεΐνη στα ούρα για να διευκολύνει την αναγνώριση των βιοδεικτών για ασθένειες γνώρισε περιορισμένη πρόοδο. Μέχρι στιγμής, η αλληλεπίδραση πρωτεΐνης-πρωτεΐνης (ΡΡΙ) τα δεδομένα έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για την ταυτοποίηση των βιοδεικτών με την υπόθεση ότι οι πρωτεΐνες αλληλεπίδραση απεικονίζουν σημαντικά την κατάσταση της ασθένειας, επειδή οι πρωτεΐνες δεν λειτουργούν μεμονωμένα, αλλά μάλλον αλληλεπιδρούν μεταξύ τους. Επιπλέον, μπορούν να παρέχουν υποθέσεις όπως μονοπάτια σηματοδότησης και άλλους μηχανισμούς που επηρεάζουν την έκβαση της νόσου. Κατασκευή δικτύου ΠΠΑ θα μπορούσε να αναδείξει τις ασθένειες που σχετίζονται πρωτεΐνες που έχουν βιολογική λειτουργία. Σε αυτή τη μελέτη, επιδιώξαμε να ελέγξουν πιθανούς βιοδείκτες για τη διάγνωση και την πρόγνωση NMIBC με την κατασκευή ενός δικτύου ΠΠΑ σχετίζονται με τον καρκίνο βασίζεται στην υγιή ανθρώπινη ουρική proteome, και αποκάλυψε ότι PDGFRB θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως προγνωστικό βιοδείκτη για NMIBC υποτροπής.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Xinqiao Νοσοκομείο, Chongqing και τήρησε τις αρχές της Διακήρυξης του Ελσίνκι. Επιπλέον, γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από τους ασθενείς σε αυτή τη μελέτη.

Υψηλή πληθώρα πρωτεϊνών ούρων σύνολο δεδομένων

προηγούμενη μελέτη μας εντοπίζονται 1641 υψηλής εμπιστοσύνης πρωτεϊνών ούρων στον υγιή πληθυσμό [11]. Ο ορισμός μιας πρωτεΐνης υψηλής αφθονίας αυθαίρετα οριστεί ως ένα με & gt? 4 μοναδικά πεπτίδια και έναν αριθμό φάσματα στη βάση δεδομένων του & gt? 10. Ένα σύνολο 592 πρωτεϊνών ούρων υψηλής αφθονίας ελήφθησαν για περαιτέρω ανάλυση βιοπληροφορική (S2 File).

Εξωκυττάρια και το πλάσμα πρωτεϊνών της μεμβράνης ελήφθησαν με ανάλυση GO

Χρησιμοποιήσαμε το Bingo plug-in για να βρείτε στατιστικά υπερεκπροσωπούνται κατηγορίες GO στα βιολογικά δεδομένα ως εργαλείο για τον εμπλουτισμό ανάλυση της υψηλής αφθονίας σύνολο δεδομένων πρωτεΐνης στα ούρα. Για τον εμπλουτισμό ανάλυση, χρειαζόμασταν ένα τεστ σύνολο δεδομένων (η οποία περιείχε πρωτεϊνών ούρων 592 υψηλής αφθονίας) και ένα σύνολο αναφοράς GO σχολιασμούς για την πλήρη ανθρώπινη proteome. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα «τεστ υπερ-γεωμετρική», και όλα GO όρους που ήταν σημαντική με την P & lt? 0,0001 (μετά από διόρθωση για πολλαπλές δοκιμές χρησιμοποιώντας τις διορθώσεις ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη Benjamini και Hochberg) επιλέχθηκαν ως υπερ-εκπροσωπούνται. Στη συνέχεια, επιλέχθηκαν οι πρωτεΐνες που περιγράφονται ως «εξωκυττάρια» και «μεμβράνη πλάσματος» για την κατασκευή του δικτύου ΠΠΑ.

δίκτυο ΠΠΑ κατασκευή

αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης είχαν προβλεφθεί χρησιμοποιώντας το εργαλείο αναζήτησης για την ανάκτηση των Αλληλεπίδραση γονιδίων /Πρωτεΐνες v9.0 (STRING) βάση δεδομένων (https://www.string-db.org/). Οι πρωτεΐνες που συνδέονται με βάση τα ακόλουθα έξι κριτήρια? γειτονιά, γονίδιο σύντηξης, συν-περιστατικό, συν-έκφραση, πειραματικές αποδείξεις και τις υπάρχουσες βάσεις δεδομένων [12].

Καρκίνος πρωτεΐνες που συνδέονται στο δίκτυο ΠΠΑ αναλύθηκαν με KEGG μονοπάτι εμπλουτισμού

Χρησιμοποιήσαμε ClueGO, ένα εύκολο στη χρήση Cytoscape plug-in [13], για την ενσωμάτωση γονιδίων οντολογίας (GO) όρους, καθώς και την εγκυκλοπαίδεια του Κιότο γονιδίων και γονιδιωμάτων (KEGG) /μονοπάτια BioCarta να δημιουργήσει μια λειτουργικά οργανωμένη όρος δίκτυο GO /μονοπάτι για το δίκτυο πρωτεΐνη στα ούρα. Οι δοκιμές εμπλουτισμού για τους όρους και τις ομάδες ήταν δύο όψεων (/εξάντληση εμπλουτισμού) δοκιμές με βάση την υπερ-γεωμετρική κατανομή, και όλοι οι όροι σχετίζονται με τον καρκίνο που ήταν σημαντική με την P & lt? 0,05 (μετά από διόρθωση για πολλαπλές δοκιμές με τη χρήση του Benjamini και Hochberg ψευδείς αποκοπή διορθώσεις ανακάλυψη) επιλέχθηκαν για περαιτέρω ανάλυση. Η ελάχιστη βαθμολογία Κάπα είχε οριστεί σε 0,5. ClueGO οπτικοποιεί τα επιλεγμένα όρους σε λειτουργικά ομαδοποιούνται δίκτυο σχολιασμού που αντικατοπτρίζει τις σχέσεις μεταξύ των όρων με βάση την ομοιότητα των συνδεδεμένων πρωτεϊνών τους.

Οι συμμετέχοντες στη μελέτη

Ένα σύνολο 185 ιστολογικά αποδεικνύεται NMIBC περιπτώσεις ήταν επιλέγεται από τον Ιανουάριο του 2007 έως τον Ιανουάριο του 2010. Τα κριτήρια για την εγγραφή της μελέτης είχαν ως εξής: ιστοπαθολογική διάγνωση του μεταβατικού κυτταρικού καρκινώματος της ουροδόχου κύστης που ήταν πρόσφατα διαγνωστεί και αντιμετωπιστεί, καμία ιστορία των άλλων όγκων, και την ικανότητα να διεξάγει παρακολούθηση. Οι ασθενείς που συμπεριλήφθηκαν 160 άνδρες και 25 γυναίκες 32-83 ετών (μέση ηλικία 62,1 έτη). Όλοι οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε διουρηθρική εκτομή του όγκου της κύστης (TURBT). Όλοι οι ασθενείς με NMIBC έλαβαν ενδοκυστική μιτομυκίνη C (MMC) ή πιραρουβικίνη (ΤΗΡ) ενσταλάξεις μία φορά την εβδομάδα για τις πρώτες 8 εβδομάδες και στη συνέχεια μηνιαίως έως 1 έτος. Ορίσαμε υποτροπή ως επανάληψη της πρωτοβάθμιας NMIBC με ίσο ή χαμηλότερο παθολογικό στάδιο. Τα άλλα κλινικά και παθολογικά χαρακτηριστικά των εγγεγραμμένων ασθενών συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Ο βαθμός και το στάδιο των ασθενών είχαν καθοριστεί σύμφωνα με τα κριτήρια του ΠΟΥ του 1973 για το βαθμό και το σύστημα ταξινόμησης 2002 TNM.

Η

δείγμα ούρων παρασκεύασμα

Morning δείγματα ούρων συλλέχθηκαν καθημερινά κατά τη διάρκεια των 3 ημέρες πριν τη χειρουργική επέμβαση πρωτογενών και κατά τη διάρκεια των 3 ημερών μετά το χειρουργείο. Τα δείγματα ούρων αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρις ότου συλλέχθηκαν όλα τα δείγματα. Δέκα χιλιοστόλιτρα ούρων ελήφθη από κάθε δείγμα πριν από την επέμβαση και μετά από χειρουργική επέμβαση και ομαδοποιήθηκαν μαζί. Τα δείγματα ούρων εφυγοκεντρήθησαν εις 10.000 χ g για 30 λεπτά στους 4 ° C για την απομάκρυνση τυχόν κυτταρικών θραυσμάτων και το υπερκείμενο συμπυκνώθηκε και αφαλατώθηκε χρησιμοποιώντας μία μεμβράνη με αποκοπή 10 kDa. Η ποσότητα πρωτεΐνης στα ούρα συμπυκνώματα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ Coomassie Protein Assay (Pierce, Rockford, IL, USA). Λίγο μετά, τα συμπυκνώματα ούρων πάγωσαν στους -80 ° C.

ανάλυση της έκφρασης PDGFRB στους ιστούς NMIBC

επιλέχθηκαν Οι ιστοί NMIBC από υποτροπή και ελεύθερη υποτροπής ασθενών για ανοσοϊστοχημική επικύρωση. Όλοι οι ιστοί σταθεροποιήθηκαν με 10% φορμαλδεΰδη και εγκλεισμένα σε παραφίνη. Οι ιστοί κόπηκαν σε 4 μm σε πάχος. Το αντίσωμα για PDGFRB αγοράστηκε από Abcam. Μια δύο σταδίων ανοσοϊστοχημική τεχνική χρησιμοποιήθηκε. Εν συντομία, οι τομές αποκηρωμένα και ενυδατωμένο, και στη συνέχεια έβρασε σε 10 mM κιτρικό ρυθμιστικό, ρΗ 6.0 για 10 λεπτά. Ο αποκλεισμός πραγματοποιήθηκε με μη ειδική σύνδεση με 5% (ν /ν) αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) για 10 λεπτά. Οι τομές επωάστηκαν με PDGFRB Ab (1:200 αραίωση εργασίας) στους 4 ° C για 12 ώρες σε ένα υγρό θάλαμο. Μετά από πλύσιμο με 0,02Μ φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS) ρΗ 7.4 τρεις φορές, οι τομές επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με HRP-σημασμένο πολυμερές (Abcam) στους 37 ° C για 30 λεπτά. Οι τομές στη συνέχεια επωάστηκαν με υγρό DAB υπόστρωμα-χρωμογόνου επί 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, ξεπλύθηκαν σε απεσταγμένο νερό, και με αιματοξυλίνη.

Validation με Western Blot

Περίπου 20 μg πρωτεΐνης στα ούρα ήταν διαχωρίστηκαν με 12% SDS-PAGE, στη συνέχεια μεταφέρονται σε μεμβράνη PVDF (Millipore, USA), και ανιχνεύθηκαν με αντι-ανθρώπινες πρωτεΐνες PDGFRB πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (1:2000, Abcam, USA), αντίστοιχα. Οι κηλίδες σημάνθηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση αρμορακίας (1:10000), και οπτικοποιήθηκε με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (ECL) σύστημα ανίχνευσης (Pierce Biotech Inc., Rockford, IL).

ELISA

Η ποσότητα πρωτεΐνης στα ούρα συμπυκνώματα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ Coomassie Protein Assay (Pierce, Rockford, IL, USA). Ανθρώπινη πρωτεΐνη PDGFRB ποσοτικοποιήθηκε με κιτ ELISA από Uscn Life Science Inc. (Wuhan, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Στατιστική ανάλυση

χρησιμοποιήθηκαν μη ζευγαρωμένο t-test και μονόδρομη ANOVA για την ανάλυση της συσχέτισης μεταξύ των ομάδων. Μια σταδιακή διαδικασία επιλογής μοντέλο χρησιμοποιήθηκε για να καταλήξουμε σε μια φειδωλή μοντέλο. Η υλικοτεχνική μοντελοποίηση παλινδρόμησης χρησιμοποιήθηκε για να περιγράψει τη σχέση μεταξύ των επιπέδων της ουρικής PDGFRB και τον κίνδυνο υποτροπής του καρκίνου του μαστού και άλλων κλινικών παρατηρήσεων. χαρακτηριστικό λειτουργίας (ROC) καμπύλη Receiver απεικονίσθηκαν για την αξιολόγηση της ευαισθησίας και της ειδικότητας των μετρήσεων βιοδείκτη στην πρόβλεψη της επανεμφάνισης NMIBC. Δύο-ουρά τιμές Ρ μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές. Συνεχείς μεταβλητές εκφράζονται ως μέσος όρος ± την τυπική απόκλιση, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά.

Αποτελέσματα

Κατασκευή δικτύου ουρικής ΡΡΙ καρκινο-συναφές με βάση την προηγούμενη μας ουροποιητικού πρωτεώματος βάση δεδομένων

Αναφέραμε προηγουμένως ότι 1.641 υψηλής αξιοπιστίας ουροποιητικού πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν σε ένα υγιές ανθρώπινο πληθυσμό από τέσσερις τεχνικές κλασματοποίησης (in-gel, 2DLC, OFFGEL και MRP) συζευγμένο με HPLC-CHIP-MS /MS [11]. Στο παρόν, επιδιώξαμε να βρούμε μη επεμβατική υποψήφιοι προγνωστικό βιοδείκτη για NMIBC υποτροπής μέσω βιοπληροφορικής ανάλυσης του υγιούς πληθυσμού ουροποιητικού proteome. Για να βρείτε ουροποιητικού βιοδείκτες πρωτεΐνη που είναι κατάλληλα για μεθόδους ρουτίνας κλινική εξέταση, πρώτα σε διαλογή ως προς πρωτεΐνες ούρων υψηλού αφθονία στο ουροποιητικό βάση δεδομένων πρωτέωμα, τα οποία εξ ορισμού μας είχε & gt? 4 μοναδικά πεπτίδια και είχε μια σειρά φασμάτων & gt? 10. Ένα σύνολο 592 πρωτεϊνών ούρων υψηλής αφθονίας ελήφθησαν από την ουροδόχο βάση δεδομένων πρωτεώματος για περαιτέρω ανάλυση (S2 File).

Για να αποφευχθεί η μόλυνση με κυτταρικά θραύσματα, οι πρωτεΐνες που περιγράφονται ως «εξωκυττάρια» και «πλασματική μεμβράνη «μεταξύ των συνολικών πρωτεϊνών ούρων επελέγησαν από την ανάλυση μπίνγκο. Συνολικά, 544 πρωτεΐνες που συνδέονται με τουλάχιστον έναν όρο σχολιασμό εντός του κυτταρικού συστατικού GO. Συνολικά, 37 όρους παρουσίασαν σημαντική (P & lt? 0,0001) ως υπερ-εκπροσωπούνται και υποεκπροσωπούνται όρους σε σύγκριση με το σύνολο του καταλόγου της Διεθνούς Πρωτεΐνη Δείκτη (IPI) καταχωρήσεις. Αναλυτικότερες πληροφορίες σχετικά με την ανάλυση GO είναι διαθέσιμο ως S2 αρχείου. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, στην κατηγορία κυτταρικό συστατικό, GO όρων που σχετίζονται με εξωκυτταρικές πρωτεΐνες όπως η εξωκυτταρική περιοχή (269 πρωτεΐνες βρέθηκε), στον εξωκυτταρικό χώρο (140), της εξωκυττάριας ουσίας (68), και της μεμβράνης του πλάσματος (197) ήταν υπερεκπροσωπούνται, όπως ήταν αναμενόμενο. Ένα σύνολο 373 πρωτεϊνών ούρων που περιγράφονται ως «εξωκυτταρική περιοχή» και «μεμβράνη πλάσματος» ελήφθησαν για περαιτέρω κατασκευή του δικτύου ΡΡΙ (S2 File). Επειδή το δίκτυο ΠΠΑ είναι σημαντικό να αντανακλά την κατάσταση της νόσου σε σύγκριση με το ενιαίο πρωτεΐνες, οι πρωτεΐνες 373 χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή ενός δικτύου ΠΠΑ μέσω ανάλυσης STRING. Ενιαία κόμβων και μικρές συνιστώσες του δικτύου ΠΠΑ που αρχικά είχαν συναρμολογηθεί αφαιρέθηκαν, και μόνο η μεγαλύτερη συνιστώσα αποθηκεύτηκε ως ένα νέο δίκτυο ΠΠΑ, το οποίο αποτελείται από 312 κόμβους και 1779 αλληλεπιδράσεις (Εικόνα 1Β). Οι πληροφορίες του δικτύου PPI περιγράφεται λεπτομερώς ως S2 αρχείου. Για την περαιτέρω διερεύνηση του καρκίνου που σχετίζονται με πρωτεΐνες σε αυτή την υπο-δίκτυο, τα 312 κωδικοποιημένες πρωτεΐνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Cytoscape plug-in ClueGO + CluePedia. Ένα δίκτυο σχολιασμό με βάση τις οδούς KEGG δημιουργήθηκε ως μια ομάδα λειτουργικά οργανωμένη όρων GO /μονοπάτι του δικτύου (Σχήμα S1 στο αρχείο S1). Οι πληροφορίες όρος δίκτυο περιγράφεται λεπτομερώς ως S2 αρχείου. Μεταξύ αυτών όρος δίκτυα, λειτουργικά ομαδοποιούνται δίκτυο που σχετίζεται με καρκίνο παρουσιάζεται στο σχήμα 1C. Αποτελείται από 6 ειδικές σημαντικά υπεραντιπροσωπεύονται όρων όπως «πορείες στον καρκίνο», «καρκίνος του ενδομητρίου», «καρκίνος του προστάτη», «γλοίωμα», «μελάνωμα», «καρκίνος της ουροδόχου κύστης» και «μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα». Οι πληροφορίες σχετικά με τους όρους του καρκίνου στη σχετίζεται δίκτυο KEGG περιγράφεται λεπτομερώς στον Πίνακα 2. Επιπλέον, συνολικά 15 πρωτεϊνών, οι οποίες συσχετίστηκαν με όλους τους όρους 6 καρκίνου (Πίνακας 3), χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή ενός καρκινο-συναφές ΡΡΙ ουροποιητικού δίκτυο (Σχήμα 1 D). Παρατηρήθηκε περαιτέρω ότι ο EGF και Cdh1 στο δίκτυο ΠΠΑ σχολιάστηκαν ως σχετιζόμενες με καρκίνο πρωτεΐνες της ουροδόχου κύστης, και οι δύο υποδοχέα FGFR2 και PDGFRB θα μπορούσαν να αλληλεπιδράσουν με EGF (Πίνακας 3). Επειδή ετεροδιμερή PDGFRB /EGFR αναφέρθηκαν να εκφράσουν για καρκίνο της ουροδόχου κύστης κύτταρα [14], και η EGF /EGFR οδός διαδραμάτισε σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου της ουροδόχου κύστης [15], [16], επιλέχθηκε PDGFRB για περαιτέρω επικύρωση ως υποψήφιο βιοδείκτη της καρκίνο της ουροδόχου κύστης

(α) ένα σύνολο 592 υψηλής αφθονίας πρωτεΐνες ούρων στην ουρική βάση δεδομένων πρωτεώματος μας επιλέχθηκαν σύμφωνα με τα κριτήρια της ύπαρξης & gt?. 4 μοναδικά πεπτίδια και ένας αριθμός φάσματα & gt? 10. Αυτές οι πρωτεΐνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το μπίνγκο plug-in λογισμικό Cytoscape, και 373 πρωτεΐνες σχολιάστηκαν ως «εξωκυτταρική περιοχή» και «μεμβράνη του πλάσματος.» Ένας χάρτης του κυτταρικού συστατικού εμφανίζεται. (ΣΙ). Τα δίκτυα αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης των πρωτεϊνών 373 κατασκευάστηκαν με STRING. Ένα δίκτυο ΡΡΙ, το οποίο αποτελούνταν από 312 κόμβους και 1779 αλληλεπιδράσεις με αφαίρεση του ενιαίου κόμβων, ελήφθη. (Γ) Το δίκτυο PPI αναλύθηκε με λογισμικό Cytoscape με την ClueGO + Cluepedia plug-in. Έξι καρκινο-συναφές εμπλουτισμένο όροι KEGG ελήφθησαν και απεικονίζεται. (D) Ένα ουροποιητικού δίκτυο ΡΡΙ σχετίζονται με τον καρκίνο που αποτελείται από 15 πρωτεϊνών ούρων που σχετίζεται με τις 6 σχετίζονται με τον καρκίνο όρους κατασκευάστηκαν με STRING.

Η

Η

Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές του ουροποιητικού PDGFRB μεταξύ των ασθενών πριν και μετά τη χειρουργική επέμβαση

για να επιβεβαιώσετε τα προκαταρκτικά πληροφορικής αποτέλεσμα, δείγματα ούρων από 185 άτομα που επιβεβαιώθηκαν για να έχουν NMIBC (Πίνακας 1) συλλέχθηκαν πριν και μετά την επέμβαση. Τα ουρικά επίπεδα PDGFRB εξετάστηκαν με ELISA. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα επίπεδα της ουρικής PDGFRB μειώθηκε (300,1 ng /mg πριν την επέμβαση εναντίον 287.23 ng /mg μετά την επέμβαση), αλλά η διαφορά δεν ήταν σημαντική (Ρ = 0.0607) (Σχήμα 2). Αυτό έδειξε ότι η ακράτεια PDGFRB δεν θα μπορούσαν να προκύψουν από majorly NMIBC ιστό και δεν θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως μια καλή νωρίς βιοδείκτη διάγνωση για NMIBC.

Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των επιπέδων της ουρικής PDGFRB σε ασθενείς NMIBC προ-χειρουργική και μετά τη χειρουργική επέμβαση (n = 185) (P = 0,067).

η

Συσχέτιση των επιπέδων της ουρικής PDGFRB και της επανάληψης της NMIBC

Για να ξέρω αν ουροποιητικού PDGFRB θα μπορούσε να συνδέεται με μια υποτροπή της NMIBC, μια μελέτη παρακολούθησης 3 ετών για τα 185 NMIBC ασθενείς διεξήχθη. Τα δεδομένα παρακολούθησης έδειξε ότι μεταξύ των 185 ασθενών NMIBC, 68 (36.8%) βρέθηκαν αργότερα να έχουν υποτροπή μετά την πρωτογενή χειρουργική επέμβαση (Πίνακας 1). Στην υποτροπιάζουσα ομάδα, το μέσο επίπεδο του ουροποιητικού PDGFRB ήταν 395.3 ng /mg (διατεταρτημοριακό εύρος 306,65 – 440,01 ng /mg ολικής πρωτεΐνης στα ούρα), ενώ ήταν 245 ng /mg (διατεταρτημοριακό εύρος 175,12 – 307,16 ng /mg ολικής πρωτεΐνης στα ούρα) για την ελεύθερη υποτροπής ομάδα (Σχήμα 3Α, P & lt? 0,0001) .Indeed, η έκφραση PDGFRB στα ούρα των ασθενών με υποτροπή επιβεβαιώθηκε να αυξηθεί σημαντικά από ότι χωρίς υποτροπή σε 3 χρόνια παρακολούθησης με Western Blot (Σχήμα S2A στο Αρχείο S1). Ωστόσο, δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στην έκφραση PDGFRB σε καρκινικό ιστό μεταξύ των ασθενών με υποτροπή και ελεύθεροι υποτροπών σε 3 χρόνια παρακολούθησης από την IHC (Σχήμα S2B και S2C στο S1 αρχείου).

(Α) Σύγκριση του επιπέδου της ουρικής PDGFRB σε υποτροπή (n = 68) και ελεύθερη υποτροπής (n = 117) ασθενείς με NMIBC. Το επίπεδο της ουρικής PDGFRB ήταν σημαντικά χαμηλότερη στους ασθενείς με υποτροπή από εκείνους χωρίς υποτροπή (Ρ & lt? 0.001). (Β) Ο δέκτης λειτουργεί χαρακτηριστικά (ROC) καμπύλη του ουροποιητικού PDGFRB. Η AUC ήταν 0,826 (95% CI, 0,768 – 0,884). (Γ) Η AUC της ηλικίας, το μέγεθος του όγκου, και τον αριθμό των όγκων σε συνδυασμό ήταν 0.636 (95% CI, 0,552 – 0,721). (Δ) Ένταξη της PDGFRB σε αυτό το μοντέλο αύξησε την AUC σε 0,862 (95% CI, 0,809 – 0,914).

Η

Ένα μοντέλο λογιστικής παλινδρόμησης χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η σχέση μεταξύ του ουροποιητικού PDGFRB και άλλες κλινικές παρατηρήσεις . Σημαντικές θετικές συσχετίσεις παρατηρήθηκαν μεταξύ των ουροφόρων επιπέδων PDGFRB και το μέγεθος του όγκου (Ρ = 0,03) και την ηλικία (Ρ = 0,019) (Πίνακας 4). Ωστόσο, δεν υπήρξαν σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ των ούρων PDGFRB και των δύο φύλων, παθολογικές στάδιο, ή βαθμού (Πίνακας 4). Η σχέση μεταξύ του ουροποιητικού PDGFRB και τον κίνδυνο υποτροπής του καρκίνου του μαστού περαιτέρω εκτιμηθεί. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι η συσχέτιση μεταξύ των ούρων επίπεδα PDGFRB και τον κίνδυνο υποτροπής του καρκίνου του μαστού ήταν στατιστικά σημαντική (Πίνακας 5, παράγοντας συντελεστής ήταν -1.274, P & lt? 0.001). Το μέγεθος του όγκου (συντελεστής, -1.193? Ρ = 0.009) και τον αριθμό των όγκων (συντελεστής, -0.986? Ρ = 0.022) επίσης σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο υποτροπής NMIBC (Πίνακας 5). Ωστόσο, άλλες κλινικές παρατηρήσεις, όπως η ηλικία, το φύλο, παθολογικές στάδιο, και ο βαθμός δεν συσχετίστηκαν σημαντικά με τον κίνδυνο υποτροπής NMIBC (Πίνακας 5).

Η

καμπύλες ROC κατασκευάστηκαν για την κλινική παράγοντες και PDGFRB. Η περιοχή κάτω από την καμπύλη (AUC) της καμπύλης ROC για μόνος PDGFRB ήταν 0.826 (95% CI, 0,768 να 0.884) (Σχήμα 3Β). Η AUC της ηλικίας, το μέγεθος του όγκου, και τον αριθμό των όγκων σε συνδυασμό ήταν 0.636 (95% CI, 0,552 – 0,721) (Εικόνα 3C). Ένταξη της PDGFRB σε αυτό το μοντέλο αύξησε την AUC σε 0,862 (95% CI, 0,809 – 0,914) (Εικόνα 3D). Χρησιμοποιώντας ένα κατώφλι του 324.12 ng /mg, η ευαισθησία ήταν 70.6%, ενώ η ειδικότητα ήταν 81.2%. Όταν PDGFRB, την ηλικία, το μέγεθος του όγκου, και ο αριθμός των όγκων συνδυάστηκαν, η ευαισθησία αυξήθηκε σε 82,7%, και η εξειδίκευση αυξήθηκε σε 88,5%.

Συζήτηση

Το ουροποιητικό proteome θα μπορούσε να αντικατοπτρίζει το ουροποιητικό σύστημα μικροπεριβάλλον, το οποίο θα μπορούσε να διαδραματίσει ένα πολύ σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του ουροποιητικού συστήματος του όγκου και της εξέλιξης. Screening τα ούρα για μη επεμβατική βιοδείκτες για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης είναι πολλά υποσχόμενη. Εδώ, κατασκευάσαμε ένα δίκτυο ΡΡΙ σχετίζονται με τον καρκίνο που αποτελείται από πρωτεϊνών ούρων 15 υψηλής αφθονίας χρησιμοποιώντας προσέγγιση πληροφορικής για την ανάλυση της ουρικής πρωτεώματος ενός υγιούς πληθυσμού (11). Είναι ενδιαφέρον ότι, από τις 15 πρωτεΐνες, 9 (CTNNA3, COL4A6, KLK3, APC, APC2, FGFR2, PDGFRB, EGF, και COL4A2) ταυτοποιήθηκαν ως πρωτεΐνες υψηλής αφθονία στο ουροποιητικό proteome, αλλά αυτές δεν είχαν ανιχνευθεί ή αναγνωρίστηκαν ως πρωτεΐνες χαμηλής αφθονίας στην proteome πλάσμα [17]. Αυτό δείχνει ότι αυτές οι πρωτεΐνες majorly προέρχονται από την έκκριση του ουροποιητικού συστήματος κύτταρο και όχι από το πλάσμα και θα μπορούσε να αντανακλά το χαρακτηριστικό μικροπεριβάλλον του ουροποιητικού συστήματος, το οποίο με τη σειρά του θα μπορούσε να παρέχει πολύτιμες πληροφορίες για την πρόγνωση του ουροποιητικού συστήματος των όγκων. Μεταξύ των 9 πρωτεΐνες, EGF, FGFR2, KLK3, και PDGFRB συνδέθηκαν με καρκίνο ουροποιητικού συστήματος σύμφωνα με την ανάλυση μονοπάτι KEGG. Πράγματι, EGF /EGFR [18], FGFR2 [4], [19], KLK3 [20] – [23], και PDGFRB [14] έχουν αναφερθεί να παίζουν σημαντικούς ρόλους στην ανάπτυξη του καρκίνου του ουροποιητικού συστήματος και την εξέλιξη. Είναι γνωστό ότι η οδός EGF /EGFR διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου της ουροδόχου κύστης, της εξέλιξης και υποτροπής. Αν και ουρική EGFR θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως μια πολλά υποσχόμενη προγνωστικός υποψήφιο βιοδείκτη για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης, ταυτίστηκε ως ουρική πρωτεΐνη χαμηλής αφθονίας (1 μοναδικό πεπτίδιο και & lt? 10 φάσματα) και, στην πράξη, ήταν δύσκολο να μετρηθεί με ELISA (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Παρόμοια με EGFR, FGFR2 και PDGFRB θα μπορούσαν να έχουν την ικανότητα να δεσμεύουν EGF (Πίνακας 3, βάση δεδομένων STRING) και μεταγωγή των οδών σήματος ΡΙ3Κ και ΜΑΡΚ [24], [25]. Επιπλέον, PDGFRB αντί FGFR2 θα μπορούσε να σχηματίσει ένα ετεροδιμερές με EGFR σε καρκινικά κύτταρα κύστης, και αυτό θα μπορούσε να επάγει αντίσταση σε αντι-EGFR θεραπεία για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης [14]. Μαζί, είναι λογικό να υποθέσουμε ότι PDGFRB αποτελεί σημαντικό υποδοχέας για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης βιολογική εξέλιξη, και θα πρέπει να χρησιμεύσει ως μια πιθανή βιοδείκτη για τη διάγνωση ή /και πρόγνωση NMIBC.

Τα ούρα προέρχεται από το πλάσμα που είναι Υπερδιηθήθηκαν από τους νεφρούς για την εξάλειψη των αποβλήτων. Σε αντίθεση με τις πρωτεΐνες του ορού, η συγκέντρωση των πρωτεϊνών στα ούρα ποικίλλει ανάλογα με την αραίωση των ούρων. Επιπλέον, η ουρική πρωτεΐνη από το ίδιο άτομο ποικίλλει σε διαφορετικούς χρόνους λόγω της επίδρασης της άσκησης, τη διατροφή, τον τρόπο ζωής και άλλους παράγοντες [10], [26] – [28]. Σε αυτή τη μελέτη, η διακύμανση από αραίωση των ούρων απαλείφθηκε με κανονικοποίηση προς συνολική πρωτεΐνη, καθώς και η μεταβολή συναρτήσει του χρόνου ήταν επαρκώς ελεγχόμενη από τη χρήση συγκεντρωμένων δειγμάτων πρωινών ούρων από έναν μεμονωμένο ασθενή για 3 ημέρες πριν και 3 ημέρες μετά τον αρχικό χειρουργείο (δείγματα συλλέχθηκαν μία φορά την ημέρα). Είναι γνωστό ότι η ουρική πρωτείνη διαφέρει ανάλογα με το φύλο και την ηλικία [26]. Ακράτεια PDGFRB παρατηρήθηκε να σχετίζεται σημαντικά με την ηλικία και όχι το φύλο σε αυτή τη μελέτη (Πίνακας 4). Επιπλέον, ακράτεια PDGFRB ήταν σημαντικά θετική συσχέτιση με το μέγεθος του όγκου (Πίνακας 4). Σε 183 NMIBC ασθενείς, το επίπεδο της ουρικής PDGFRB ήταν αυξημένη σε ασθενείς με μεγάλο μέγεθος του όγκου (& gt? 3 cm? 329.6 ± 22.10 ng /mL, η = 46) σε σύγκριση με εκείνους με μικρό μέγεθος του όγκου (≤3 cm? 290.4 ± 11.08 ng /mL, η = 139) (Σχήμα S3 σε File S1, Ρ = 0,0907). Αυτό υποδηλώνει ότι τα επίπεδα της ουρικής PDGFRB αυξάνει με το μέγεθος του όγκου. Επιπλέον, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ NMIBC ασθενείς πριν και μετά τη χειρουργική επέμβαση (Εικόνα 2, Ρ = 0,0607), γεγονός που δείχνει ότι η ακράτεια PDGFRB δεν θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως ένα αποτελεσματικό έγκαιρες διαγνωστικές βιοδείκτη για NMIBC. Σε μία επιπλέον μελέτη παρακολούθησης, παρατηρήθηκε ότι τα επίπεδα της ουρικής PDGFRB σε υποκείμενα με υποτροπή ήταν σημαντικά υψηλότερες από εκείνες χωρίς υποτροπή (Σχήμα 3Α), και αυτά επίσης συσχετίζεται με τον κίνδυνο του 3-χρόνια υποτροπή του καρκίνου. Η αντίστοιχη τιμή AUC ήταν 0.826 (Εικόνα 3Β? 95% CI, 0,768 – 0,884). Επιπλέον, μαζί με τα κλινικά χαρακτηριστικά όπως η ηλικία, το μέγεθος του όγκου, και τον αριθμό των όγκων, η AUC αυξήθηκε σε 0,862 (Σχήμα 3D? 95% CI, 0,809 έως 0,914), γεγονός που υποδηλώνει ότι η ουρική PDGFRB είναι ένας παράγοντας κινδύνου για NMIBC υποτροπής και θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν ως εν δυνάμει μη επεμβατική βιοδείκτη για την πρόβλεψη της επανεμφάνισης της NMIBC.

Συμπέρασμα

Εν ολίγοις, έχουμε για πρώτη φορά, έδειξε ότι η ακράτεια PDGFRB θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως μια μη επεμβατική βιοδείκτη για την πρόβλεψη της NMIBC επανάληψη. Επικύρωση από πολλαπλές κλινικές κέντρα είναι απαραίτητη για την περαιτέρω εφαρμογή στην κλινική πράξη.

Υποστήριξη Πληροφορίες

αρχείου S1.

περιλαμβάνονται τα Στοιχεία. Σχήμα S1 Παράδειγμα δικτύου. Εικόνα S2 Επικύρωση της υποτροπής. Εικόνα S3 Προσδιορισμός του ουροποιητικού PDGFRB. Εικόνα S1. Το δίκτυο PPI αναλύθηκε με λογισμικό Cytoscape με την ClueGO + Cluepedia plug-in. Τα εμπλουτισμένα όροι KEGG έδειξαν. Εικόνα S2. Επικύρωση της έκφρασης PDGFRB στα ούρα και σε ιστούς όγκων των ασθενών NMIBC με υποτροπή και ελεύθερη υποτροπής. Η έκφραση του PDGFRB στα ούρα των ασθενών με υποτροπή NMIBC και ελεύθεροι υποτροπών αναλύθηκε με Western Blotting (Α). Η έκφραση του PDGFRB για ιστό όγκου των ασθενών NMIBC με υποτροπή (Β) και ελεύθερη υποτροπής (C) αναλύθηκε με IHC. Ένα σύνολο από 50 καρκινικούς ιστούς από 27 υποτροπιάζον και 23 ασθενείς ελεύθεροι υποτροπών αξιολογήθηκαν μέσω ανοσοϊστοχημείας. Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές έκφρασης PDGFR σε καρκινικούς ιστούς μεταξύ υποτροπιάσει και ελεύθερη υποτροπής ομάδες. Τα αντιπροσωπευτικά 6 δείγματα από ασθενείς υποτροπίασαν και ελεύθεροι υποτροπών ήταν έδειξε 3Α και 3Β, αντιστοίχως. Εικόνα S3. Προσδιορισμός του ουροποιητικού συγκεντρώσεων PDGFRB σε ασθενείς NMIBC με μεγάλο και το μικρό μέγεθος του όγκου με ELISA. Σε 183 NMIBC ασθενείς, το επίπεδο της ουρικής PDGFRB ήταν αυξημένη σε ασθενείς με μεγάλο μέγεθος του όγκου (& gt? 3 cm) σε σύγκριση με εκείνους με ένα μικρό μέγεθος του όγκου (≤3 cm) (P = 0.0906)

DOI: 10.1371. /journal.pone.0096671.s001

(PDF)

αρχείου S2.

συμπληρωματικά στοιχεία

doi:. 10.1371 /journal.pone.0096671.s002

(XLS)