Abstract

IL-2 είναι ο πρωταρχικός παράγοντας ανάπτυξης για την προώθηση επιβίωση και πολλαπλασιασμό των ενεργοποιημένων Τ κυττάρων που συμβαίνει μετά την εμπλοκή του Janus Kinase (JAK) 1-3 και /Signal Transducer και ενεργοποιητής της μεταγραφής ( STAT) οδός 5 σηματοδότησης. STAT5 έχει δύο ισομορφές: STAT5A και STAT5b (που συνήθως αναφέρονται ως STAT5), η οποία, σε κύτταρα Τ, παίζουν ρόλους περιττή τη μεταγραφή γονιδίων του κυτταρικού κύκλου και την επιβίωση. Ως τέτοια, η αναστολή της STAT5 με μια ποικιλία μηχανισμών μπορεί να επάγει ταχέως απόπτωση σε ορισμένα λεμφοειδή κύτταρα όγκου, γεγονός που υποδηλώνει ότι και τα γονίδια-στόχους της αντιπροσωπεύουν θεραπευτικοί στόχοι για τον έλεγχο ορισμένων ασθενειών λεμφοειδή. Για την αναζήτηση αυτών των μορίων που ευθυγραμμίζονται με τον IL-2 ρυθμιζόμενα γονίδια ανιχνεύονται με μικροσυστοιχίες γονιδιακή έκφραση Affymetrix με την cistrome STAT5 προσδιορίζονται από τσιπ-on-chip ανάλυση σε ένα IL-2-εξαρτώμενη κυτταρική σειρά ανθρώπινου λευχαιμίας, ΚΙΤ225. Επιλέξτε επικαλυπτόμενα γονίδια στη συνέχεια επικυρώνονται χρησιμοποιώντας qRT

2PCR συστοιχίες μεσαίου απόδοσης σε ανθρώπινους ΡΗΑ-ενεργοποιημένα PBMCs. Από 19 υποθετικών γονιδίων, ένας ρυθμιστής κλειδί της σηματοδότησης υποδοχέα Τ κυττάρων, PDE4B, ταυτοποιήθηκε ως νέο στόχο, το οποίο ήταν άμεσα up-ρυθμίζονται σε επίπεδο πρωτεΐνης (3 ώρες) σε IL-2 διεγείρεται, ενεργοποιημένα ανθρώπινα PBMCs. Παραδόξως, μόνο καθαρίστηκε CD8 + πρωτογενή Τ-κύτταρα εξέφρασαν PDE4B, αλλά όχι τα κύτταρα CD4 +. Επιπλέον, PDE4B βρέθηκε ότι εκφράζεται υψηλά σε CD4 + λεμφοειδή κύτταρα καρκίνου, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα φυσιολογικό ρόλο μοναδική για την CD8 + και λεμφοειδή καρκινικά κύτταρα και έτσι θα μπορούσαν να αποτελούν στόχο για φαρμακευτική παρέμβαση για ορισμένες λεμφοειδείς ασθένειες.

Παράθεση: Nagy ZS, Ross JA, Rodriguez G, Balint, BL, Szeles L, Nagy L, et al. (2013) Genome Wide Χαρτογράφηση Αποκαλύπτει PDE4B ως IL-2 Induced STAT5 γονιδίου στόχου σε ενεργοποιημένα ανθρώπινα PBMCs και καρκινικά κύτταρα λεμφοειδούς. PLoS ONE 8 (2): e57326. doi: 10.1371 /journal.pone.0057326

Επιμέλεια: Ramin Homayouni, Πανεπιστήμιο του Μέμφις, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6 Σεπτέμβρη, 2012? Αποδεκτές: 21 Ιαν 2013? Δημοσιεύθηκε: 25 Φλεβάρη, 2013

Copyright: © 2013 Nagy et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (NIH) αριθμός επιχορήγηση AI053566 σε RAK και επιχορήγηση πιλοτικό πρόγραμμα για την ZSN (πρόγραμμα SCORE NIGMS, χορηγεί S06 GM008012-37), και κατέστη δυνατή από Grant αριθμός 5G12RR008124 από το Εθνικό Κέντρο Έρευνας Πόρων, ένα συστατικό του ΝΙΗ. ZSN είναι ο αποδέκτης της János Bolyai Έρευνας Felowship από την Ουγγρική Ακαδημία Επιστημών και υποστηρίζεται από την NKTH-OTKA-ΕΕ 7KP (Δράσεις Marie Curie) Επανένταξης Grant (OTKA MB08C 84.630). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η Signal Transducer θηλαστικών και ενεργοποιητής της μεταγραφής (STAT) οικογένεια αποτελείται από 7 μέλη (1-4, 5α, 5β και 6). STAT μόρια ασκούν κρίσιμους ρόλους στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τη διαφοροποίηση και την επιβίωση (που επισκοπείται στο [1]). Αρχικά, τα στατιστικά ήταν πιστεύεται ότι είναι λανθάνουσα παράγοντες που κατοικούν στο κυτταρόπλασμα και ενεργοποιείται μόνο όταν κυτοκίνες προσδένονται σε συγγενή υποδοχέα τους μετά την ενεργοποίηση των κινασών τυροσίνης Janus (JAK). Πράγματι, ο κεντρικός μοντέλο προτείνει ότι JAKs φωσφορυλιώνει υπολείμματα τυροσίνης στον υποδοχέα χρησιμεύουν ως θέσεις σύνδεσης για μόρια σηματοδότησης που περιέχει την περιοχή SH2, όπως στατιστικά. Μετά σύνδεσης μέσω φωσφοτυροσίνης-SH2 αλληλεπιδράσεις, στατιστικά να γίνουν οι ίδιοι φωσφορυλιωμένη τυροσίνη από JAKs, απεμπλακούν από τα διμερή υποδοχέα και η μορφή μέσω αμοιβαίων αλληλεπιδράσεων τομέα φωσφοτυροσίνης-SH2. Το διμερές STAT ακολούθως μετατοπίζεται προς τον πυρήνα για την έναρξη της μεταγραφής του γονιδίου [2] – [3]. Ωστόσο, γνωρίζουμε πλέον ότι ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΑ μπορεί να διμερίζονται και τετραμερή μορφή με την απουσία της φωσφορυλίωσης της τυροσίνης και να πυρηνικά εντοπισμένη για τον έλεγχο της γονιδιακής ρύθμισης σε πολλούς μοναδικούς τρόπους που είναι λιγότερο κατανοητές [4] – [5].

Αυτό που είναι σαφές είναι ότι STATs 1, 3, 5Α και 5Β είναι ευρέως χρησιμοποιούνται από διάφορες κυτοκίνες και είναι σημαντικά για τη ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης, πολλαπλασιασμού και θανάτου, ενώ STATs 2, 4 και 6 προάγουν ιική άμυνα και Th1 έναντι Th2 διαφοροποίησης, αντίστοιχα. Επιπλέον, STAT3 και STAT5 έχουν βρεθεί να είναι στενά συνδεδεμένες και τις σχετικές με ογκογένεση (αναθεωρηθούν [1]). Πράγματι, οι ιδιοσυστατικά φωσφορυλιωμένη τυροσίνη μορφές STAT5 παρατηρούνται εύκολα σε μια ποικιλία καρκινικών κυττάρων και ιστών διακριτών προελεύσεων, ως αποτέλεσμα της χρωμοσωμικής μετάθεσης, απορυθμισμένη κινασών τυροσίνης και την ιογενή μεταμόρφωση (που επισκοπείται στο [1]).

Η φυσιολογικός ρόλος της STAT5A και Β είναι σε μεγάλο βαθμό προέρχεται από

in vivo

μελέτες STAT5A και Β νοκ-άουτ ζώα. Από τις μελέτες αυτές φαίνεται σαφές ότι STAT5A ασχολείται κυρίως με την ανάπτυξη του μαστικού αδένα [6] και STAT5b είναι υπεύθυνη για τη ρύθμιση της ανάπτυξης μέσω της αυξητικής ορμόνης σηματοδότησης [7]. Σε Τ-λεμφοκύτταρα, ωστόσο, έχουν αντισταθμιστικά λειτουργίες: μελέτες από STAT5A /B διπλό ανεπαρκή ποντίκια έδειξαν ότι έχουν περιττές ρόλους στη διαμεσολάβηση της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου των ενεργοποιημένων Τ κυττάρων [8], [9]. Επιπλέον, μελέτες που χρησιμοποιούν STAT5A /B null ποντίκια δείχνουν ότι αυτά τα μόρια είναι σημαντικά για την ανάπτυξη λεμφοειδών οργάνων ως μια ανεπάρκεια σε αυτές τις πρωτεΐνες μπορεί να οδηγήσει σε σοβαρό φαινότυπο συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια [10]. Επιπλέον, STAT5 φαίνεται να δρα ως ένα κρίσιμος παράγοντας επιβίωσης για τα κύτταρα Τ, αφού ουσιαστικά δραστική (δηλαδή φωσφορυλιωμένη τυροσίνη) STAT5 είναι συχνά παρόν σε λεμφοειδή και λευχαιμικά κύτταρα καρκίνου μεταξύ των άλλων τύπων όγκων, σε σύγκριση με τα φυσιολογικά, μη μετασχηματισμένα κύτταρα (ανασκόπηση στο [1]). Επιπλέον, το κλείδωμα έκφραση STAT5 σε ανθρώπινα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος, καθώς και λεμφοειδών και λευχαιμικά κύτταρα καρκίνου σοβαρά σε κίνδυνο τη βιωσιμότητα των κυττάρων και να επάγουν αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο [11]. Τα στοιχεία από πολλές ομάδες υποδεικνύει ότι STAT3 παίζει ένα παρόμοιο ογκογόνο ρόλο STAT5 και εξαρτάται από τον τύπο του κυττάρου, μπορεί κανείς να είναι πιο κυρίαρχο [12]. Νέα ευρήματα για αυτή την οικογένεια πρωτεϊνών δείχνουν επίσης ότι η επιβίωση των κυττάρων τους, την προώθηση της χαρακτηριστικά, ενώ un-φωσφορυλιωμένη μπορεί να διαδραματίσει ρυθμιστικό ρόλο του γονιδίου, καθώς και [4]. Αυτά τα δεδομένα παρέχουν βοήθεια ενδιαφέρουσα νέα μοντέλα που δείχνουν ότι η φαρμακολογική αποσύνδεση των ενεργοποιημένων καθώς και un-ενεργοποιημένα STAT5 μπορεί να απαιτείται να διαταράξει γονιδίων-στόχων τους να προκαλούν καρκίνο κυτταρικό θάνατο. Ετσι, προσδιορίζοντας την επιβίωση των κυττάρων και του όγκου σχετικών γονιδίων-στόχων STAT5 είναι ένας σημαντικός στόχος για την ανάπτυξη νέων αντικαρκινικών θεραπειών.

Μια μέθοδος που έχει αποδειχθεί επιτυχής στον προσδιορισμό νέων γονιδίων-στόχος είναι χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση που μπορούν να αποκαλύψουν την άμεση μεταγραφή παράγοντα αλληλεπιδράσεις DNA [13] και επιτρέπει την ταυτοποίηση των θέσεων πρόσδεσης άγνωστος παράγοντας μεταγραφής σε νέα γονίδια-στόχους με τη δημιουργία μιας γονιδίωμα ολόκληρη βιβλιοθήκη που μπορεί να είναι (i) την αλληλουχία και βρίσκονται στο ανθρώπινο γονιδίωμα, ή (ii) υβριδοποιούνται προς μικροσυστοιχίες εκπροσωπούν μη κωδικεύουσες περιοχές του γονιδιώματος. χαρτογράφηση του γονιδιώματος σε επίπεδο των επαγόμενων κυτοκινών γονιδίων στόχων STAT5 έχουν διεξαχθεί και δημοσιευθεί σε διάφορους τύπους κυττάρων (Τ-, προ-Β-, ανθρώπινο ΝΚ-όπως καρκινικά κύτταρα και τον καρκίνο του μαστού) χρησιμοποιώντας τσιπ κλώνο ή τσιπ Seq τεχνολογίες [4] [14] – [18]. Ειδικότερα, χαρτογράφηση IL-2 επαγώγιμο STAT5 γεγονότα και μεταγραφικές αλλαγές στην πρωτογενή Τ κύτταρα χρησιμοποιώντας τσιπ Seq, μικροσυστοιχίες γονιδιακή έκφραση, ή RNA-Seq τεχνολογία δέσμευσης έχουν διεξαχθεί και δημοσιευθεί τόσο για ποντίκι [5], [16], [19 ], [20] και την ανθρώπινη [16], [19] μοντέλα. Αυτές οι σημαντικές μελέτες επικεντρώθηκαν κυρίως στο ρόλο των STAT5 στη διαφοροποίηση Τ βοηθητικών κυττάρων και φυσιολογικές ανοσολογικές αποκρίσεις.

Η παρούσα εργασία προσπάθησε να εντοπίσει το κλειδί της επιβίωσης των κυττάρων και του όγκου σχετικών γονιδίων-στόχων STAT5 στην IL-2 εξαρτώμενη από ανθρώπινα κύτταρα λευχαιμίας με τη χρήση γονιδιακής έκφρασης και μελέτες μικροσυστοιχίας υποκινητή. Τα αποτελέσματα της οποίας ήταν ευθυγραμμισμένες και μια επίλεκτη ομάδα των υποψήφιων στόχων στη συνέχεια επικυρώνονται σε φυσιολογικό ανθρώπινο ενεργοποιηθεί PBMCs. Φωσφοδιεστεράσης (PDE) 4Β, ένας ρυθμιστής της κυκλικής ΑΜΡ σηματοδότηση σε Τ κύτταρα δείχθηκε ότι είναι IL-2 ρυθμίζεται κατά γεμάτοι ανθρώπινα PBMCs και CD8 + Τ κύτταρα καθαρίστηκαν. Είναι ενδιαφέρον ότι το μόριο αυτό ήταν έντονα υπερ-εκφράζεται στο λεμφικό όγκου αλλά όχι γεμάτοι πρωτογενή CD4 + Τ κύτταρα.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

ένα γονιδίωμα-ευρεία προσέγγιση για τον εντοπισμό STAT5 Ειδικές IL-2 με τη μεσολάβηση Γονίδια

STAT5 είναι ένας ισχυρός ρυθμιστής της επιβίωσης των κυττάρων Τ ως εξάντληση αποτελέσματά της σε μαζικές κυτταρικό θάνατο των ενεργοποιημένων Τ και λεμφοειδή κύτταρα όγκου [11] – [12]. Μέχρι σήμερα, οι μελέτες γονιδιώματος σε επίπεδο έχουν χρησιμοποιηθεί για την αναγνώριση και τον εντοπισμό της IL-2 ρυθμίζεται δέσμευσης STAT5 εκδηλώσεις και γονιδίων-στόχων σε κανονικό ποντικό [5], [16], [19], [20] και ανθρώπινα Τ κύτταρα [16], [19] αναθεωρηθούν [21]. Ωστόσο, στην παρούσα μελέτη επιδιώξαμε να εντοπίσει γονιδίωμα στόχους σε επίπεδο μεσολάβηση γονίδιο STAT5 IL-2 από λεμφοειδή κύτταρα όγκου (Σχήμα S1). Για να χαρτογραφηθούν συστηματικά θέσεις πρόσδεσης STAT5 στην γενωμική κλίμακα που ορίζεται από το STAT5 cistrome [22] και της IL-2 με τη μεσολάβηση μεταβολών γονιδιακή έκφραση χρησιμοποιήσαμε μικροσυστοιχίες. Για τις μελέτες αυτές καθορίσαμε πρώτα την cistrome STAT5 χρησιμοποιώντας τσιπ-on-chip σε κύτταρα IL-2 εξαρτώμενη ΚΙΤ225 που ήταν είτε αριστερά un-διεγερμένα ή διεγερμένα με IL-2 για 30 λεπτά, που ακολουθείται από μετέπειτα ανάλυση έκφρασης γονιδίου για την ανίχνευση IL-2 μεσολάβηση mRNA αλλάζει σε 3 ώρες. Οι προκύπτουσες πισίνες δεδομένα στη συνέχεια αναλύονται στατιστικά και ευθυγραμμισμένα και μια επίλεκτη ομάδα γονιδίων που έτρεφε περιοχές εντός των περιοχών υποκινητή τους δεσμευτική STAT5 επικυρώνονταν με μέσο throughput qRT

συστοιχίες 2PCR.

Δημιουργία ενός Βιβλιοθήκη της IL-2 οι ρυθμιζόμενες τοποθεσίες Δεσμευτική STAT5

Αρχικά, τρεις βιολογικούς επαναλήψεις ChIP διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ένα μίγμα αντισωμάτων που κατευθύνονται προς το Ο-τερματικό του STAT5A και STAT5b σε κύτταρα ΚΙΤ225 διεγερμένα με IL-2 για 30 λεπτά. Η δοκιμασία ελέγχθηκε με μέτρηση της IL-2 που προκαλείται εμπλουτισμός του ενισχυτή IL2RA [23] στοιχείο που ονομάζεται θετική ρυθμιστική περιοχή (PRR) III (Σχήμα 1Α) μέσω αντισωμάτων STAT5 σε σύγκριση με τον ορό ελέγχου. Στη συνέχεια, το κατέλαβε DNA ενισχύθηκε όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι χρησιμοποιώντας ένα πρωτόκολλο τυχαία ενίσχυση. Για να επιβεβαιωθεί ότι οι βιβλιοθήκες παρέμειναν εμπλουτισμένο για το θετικό μάρτυρα PRR στοιχείο III μετά την ενίσχυση, PRR III μετρήθηκε χρησιμοποιώντας qPCR (Εικόνα 1Β) από όλα τα πειράματα επανάληψη. Στη συνέχεια, η ανάλυση μικροσυστοιχιών χρησιμοποιώντας συστοιχίες 1.0R Affymetrix GeneChip ανθρώπινο προαγωγέα διεξήχθη χρησιμοποιούν οθόνες εισόδου γονιδιωματικό DNA (ως μάρτυρας) και η IL-2 που διεγείρεται δείγματα σε τρεις βιολογικούς επαναλήψεις όπως περιγράφεται παραπάνω. Οι προκύπτουσες «.cel αρχεία» ήταν συνέχεια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ΜΑΤ (Model-based Ανάλυση του πίνακα Πλακάκια, [24]) που απέδωσε «.bed αρχεία» με τις χρωμοσωμικές συντεταγμένες όλων των τσιπ περιοχές, συμπεριλαμβανομένης της p-τιμές, βαθμολογίες MAT (σε επιτρέπουν τον εμπλουτισμό σε διάφορες περιοχές διαφορετικού μήκους που πρέπει να συγκριθούν άμεσα), FDR (ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη) υπολογισμούς και επαναλάβετε σημαίες. Επαναλαμβανόμενες και τμηματική στοιχεία επικάλυψη απομακρύνθηκαν και οι υπόλοιπες 1581 hits χαρτογραφήθηκαν με ΚΕΣΑ (cis-ρυθμιστικών στοιχείων σύστημα σχολιασμού) [25] σε απόσταση 300 kb του σχολιασμένη περιοχές του γονιδιώματος. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α μόνο περίπου το 17% των υποψήφιων γονιδίων βρίσκονται εντός κοντινό υποκινητές, ενώ περίπου το 25% και το 42% βρίσκεται σε ενισχυτές και εσώνια, αντίστοιχα. Αυτά τα ευρήματα είναι σε καλή συμφωνία με τα δεδομένα των άλλων υποδεικνύοντας ότι η πλειονότητα των θέσεων πρόσδεσης TF βρίσκονται σε ιντρονικές και διαγονιδιακές περιοχές [26]. Για να συγκρίνουμε τα αποτελέσματά μας με προηγουμένως δημοσιευθέντα σύνολα δεδομένων τσιπ Seq, θέσεις δέσμευσης STAT5A και STAT5b που προέρχονται από πρωτογενή ανθρώπινα CD4 + Τ-κύτταρα επανα-αναλύθηκαν (GSE27158, [16] χρησιμοποιώντας ένα αγωγό ανάλυση τσιπ Seq από Barta et al, [27 ]) και το προκύπτον κορυφές υποβλήθηκαν σε ανάλυση ΚΕΣΑ. Τα προκύπτοντα αποτελέσματα για STAT5A και STAT5b διανομή θέσεις είχαν ως εξής: προαγωγός δεσμευμένη 21% και 19%, ιντρονικές 34% και 35%, ενισχυτή συνδεδεμένο 38% και 39%, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας ότι η γονιδιωματική STAT5 δεσμευτικό μοτίβο από την τρέχουσα chip-on-chip σύνολα δεδομένων ταιριάζουν με το τσιπ-Seq αποτελέσματα από Liao και οι συνεργάτες του [16]. Είναι ενδιαφέρον ότι μόνο περίπου το 20% των θέσεων δέσμευσης STAT5 περιορίστηκαν στους υποψηφίους. Στη συνέχεια, ο εμπλουτισμός των κινήτρων δεσμευτική TF επίσης αναλύθηκαν με βάση το ΚΕΣΑ ανατεθεί φορές την αξία της αλλαγής που αντιπροσωπεύει σημαντικά εμπλουτισμένη κίνητρα με & gt? 2 φορές αλλαγή στο εσωτερικό των περιφερειών ChIP σε όλο το γονιδίωμα. Σχήμα 2Β άνω πίνακα και του πίνακα δείχνει ότι τα κίνητρα TF με τα υψηλότερα φορές αλλαγές περιλαμβάνουν τα κίνητρα πρόσδεσης κλασικής STAT TTCNNNGAA σε διάφορες μορφές. Η Ιντερφερόνη Sensitive Response Element (ISRE) επίσης εμπλουτίστηκε σημαντικά γεγονός που υποδηλώνει ότι σε ορισμένα κύτταρα STAT5 μπορεί επίσης ενδεχομένως να συνδεθεί με αυτά τα μοτίβα: είτε απευθείας είτε με τη βοήθεια ενός άλλου TF που προσδένεται ISRE. Σχήμα 2Β κάτω πίνακα και του πίνακα αντιπροσωπεύουν τον πιο σημαντικά εμπλουτισμένη θέσεις πρόσδεσης TF. Περιέργως αυτά είναι TTC STAT μισό-sites. Ίσως σε αυτούς τους τύπους των κυττάρων STAT5 μπορεί να δεσμεύσει ένα δεύτερο-sites, άμεσα ή έμμεσα, γεγονός που υποδηλώνει μια ανώμαλη ρύθμιση καθώς αυτός ο τύπος σύνδεσης DNA δεν έχει παρατηρηθεί

in vitro

[28].

(Α ) ΚΙΤ225 IL-2-εξαρτώμενη ανθρώπινα κύτταρα λευχαιμίας έγιναν εν ηρεμία και στη συνέχεια διεγέρθηκαν με μέσο (-) ή IL-2 (+) για 30 λεπτά στους 37 ° C, σταθεροποιήθηκαν με 1% φορμαλδεΰδη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια χρωματίνης ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντισώματα προς C-τερματικό STAT5A mix /Β ή IgG ελέγχου. Το εκλουσμένο DNA ενισχύθηκε με εναρκτήρες που αντιστοιχούν στο ανθρώπινο IL2RA PRR III. Αντιπροσωπευτικά δεδομένα από τρία ανεξάρτητα πειράματα που δείχνονται. υλικό εισροής αντιπροσωπεύει το 5% του ανοσοκατακρημνίστηκαν χρωματίνης. ελέγχου χάντρες αντιπροσωπεύει δείγματα στα οποία έγινε ανοσοκατακρήμνιση χωρίς αντισώματα αλλά κατά τα άλλα ήταν ο χειρισμός με τον ίδιο τρόπο. (Β) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται παραπάνω και, στη συνέχεια, για τα πειράματα μικροσυστοιχιών το DNA τσιπ ed τυχαία ενισχύθηκαν μετά την απολίνωση συνδετήρων όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Το ενισχυμένο DNA χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια ως πρότυπο στις αντιδράσεις qPCR να μετρήσει τον εμπλουτισμό του IL2RA PRR ΙΙΙ.

Η

(Α) Γονιδιώματος-ευρεία διανομή των STAT5 θέσεις πρόσδεσης (τοις εκατό του συνολικού αριθμού των θέσεων). Το τσιπ-on-chip εντοπίστηκαν στοιχεία που έπεσε μέσα σε 300 kb από περιοχές κωδικοποίησης αναλύθηκαν με βάση την απόστασή τους από το πλησιέστερο γονιδίων χρησιμοποιώντας ΚΕΣΑ. Το γράφημα πίτας αντιπροσωπεύει το «%» διανομή. (Β) Εμπλουτισμένο μεταγραφικός παράγοντας μοτίβα με τα υψηλότερα φορές αλλαγή (άνω τμήμα) και το υψηλότερο σημασία (κάτω πίνακας) δεσμευτικές. sites και πίνακες τους μέσα το τσιπ-on-chip εντοπίστηκαν, ΚΕΣΑ αναλύονται τα ρυθμιστικά στοιχεία δέσμευσης εμπλουτίζεται TF φαίνονται.

Η

Αναγνώριση IL-2 ρυθμιζόμενα γονίδια στα κύτταρα ΚΙΤ225 χρήση ανάλυσης γονιδιακής έκφρασης

για τον εντοπισμό της IL-2 με τη μεσολάβηση γονιδίων σε κύτταρα ΚΙΤ225, κύτταρα εξαντλούνται από IL-2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με IL-2 ή ελέγχου του οχήματος για 3 ώρες και υποβλήθηκε σε γονιδιακή ανάλυση μικροσυστοιχιών έκφραση σε δύο βιολογικές επαναλήψεις. Από αυτήν την ανάλυση, 469 γονίδια αλλάξει περισσότερο από 2 φορές, με 129 και 340 κατάντη γονίδια ρυθμισμένα προς τα πάνω μεταξύ των οποίων αρκετά μεσολάβηση στόχων IL-2 όπως CISH, SOCS1, OSM, PIM-1, BCL6 και BCL2. Αυτή η λίστα γονιδίου αναλύθηκε με την web-based λογισμικό Ingenuity Διαδρομή ανάλυση η οποία επιβεβαίωσε περαιτέρω STAT5A και την κατάσταση ενεργοποίησης STAT5b μετά από θεραπεία με IL-2 (Σχήμα S2) και προσδιορίζονται τα δίκτυα κινητής τηλεφωνίας που σχετίζονται με τη λειτουργία του ανοσοποιητικού, συμπεριλαμβανομένων Κυτταρικής Ανάπτυξης & amp? Του κυτταρικού κύκλου, Αιματολογικές Σύστημα Ανάπτυξης & amp? Λειτουργία, το αναπαραγωγικό σύστημα Ανάπτυξης & amp? Λειτουργίας, καθώς και Κυτταρικής Κίνημα, Ανάπτυξης & amp? Πολλαπλασιασμό σημαντικά υπερεκπροσωπούνται (Σχήμα S3).

Αναγνώριση IL-2 ρυθμιζόμενα γονίδια του STAT5 Cistrome

Ο στόχος μας ήταν να ανακαλύψει μια πισίνα της IL-2 ανταποκρίνεται γονίδια που περιέχουν ρυθμιστικές περιοχές STAT5. Ως εκ τούτου, δημιουργήσαμε τέμνονται της cistrome STAT5 και των IL-2 γονιδίων που αποκρίνονται με τη χρήση του UCSC Πίνακας Browser. Πρώτον, η Affymetrix αναγνωριστικά της πισίνας γονιδιακής έκφρασης μετατράπηκαν σε γονιδιωματική θέσεις (.bed αρχεία) τα οποία στη συνέχεια ευθυγραμμίζονται με τα αποτελέσματα chip-on-chip. Αυτές οι πισίνες έγιναν ορατά στην γενωμική κλίμακα χρησιμοποιώντας τα «.bed αρχεία» και την Ολοκληρωμένη Genomics Viewer (IGV, Σχήμα 3). Από την πισίνα τέμνονται αποτελείται από 106 γονίδια, μια λίστα 57 γονιδίων τα οποία περιείχαν τα ρυθμιστικές θέσεις STAT5 εντός εγγύς υποκινητή τους (30 γονίδια), αμέσως μεταγενέστερο τμήματα του γονιδίου (7 γονίδια), ενισχυτής (14 γονίδια) ή πρώτο εξώνιο (6 γονίδια) επιλέχθηκαν για την επικύρωση στο ανθρώπινο ασταρωμένο PBMCs (Σχήμα 3 και Πίνακας S1) στο επίπεδο του mRNA χρησιμοποιώντας μέσο throughput qRT

συστοιχίες γονιδιακής έκφρασης 2PCR (που περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι και στατιστικώς σημαντικά αποτελέσματα (p-value & lt.? 0.05) που φαίνονται στον πίνακα 1). Τα γνωστά IL-2 γονιδίων στόχων (που υποδεικνύεται με αστερίσκους στον Πίνακα 1) BCL2, BCL6, CDK6 και IL2RA ταυτοποιήθηκαν ως IL-2 επαγώγιμων γονιδίων με θέσεις πρόσδεσης STAT5. Άλλα γνωστά IL-2 γονιδίων στόχων, όπως CISH, ΙΡΝγ και FoxP3 επίσης προσδιορίζονται από GEA και ως εκ τούτου, συμπεριλήφθηκαν ως θετικοί έλεγχοι στις συστοιχίες. Παρά το γεγονός ότι αυτά τα γονίδια είναι γνωστό ότι ρυθμίζονται από STAT5, στα κύτταρα ΚΙΤ225 θέσεις δέσμευσης τους STAT5 δεν αναγνωρίζεται από το chip-on-chip ανάλυση, για την οποία δεν μπορούμε να αποκλείσουμε έναν τύπο κυττάρου συγκεκριμένο αποτέλεσμα. Να αποσαφηνίσει αυτά τα ευρήματα, IGV χρησιμοποιήθηκε για να απεικονίσει τις γονιδιωματικές θέσεις των γνωστών (SOCS2, SOCS3, IL2RA, CISH, BCL2, BCL6 και CDK6 (Εικόνα 4Α) είναι υπογραμμισμένα είναι εκείνα που προσδιορίζονται στην οθόνη μας) και 18 άγνωστα IL-2 στόχου /STAT5 γονίδια (Σχήμα 4Β). Μεταξύ αυτών, για παράδειγμα, CD69 (μέχρι 2,3 φορές) έχει δειχθεί ότι επηρεάζουν Th17 διαφοροποίηση, η οποία είναι ένας γνωστός STAT5 εξαρτώμενη διαδικασία [29]. CDKN2C, αλλιώς ονομάζεται ως ρ18 (μελάνι) 4c, είναι ένας γνωστός αναστολέας της έναρξης G1 του κυτταρικού κύκλου, η οποία εδώ είναι ρυθμισμένα προς τα κάτω περίπου 2-φορές με IL-2. Λεμφοκυττάρων κυτταροπλασματική πρωτεΐνη (LCP) 2 (1.7 φορές επάνω) είναι ένας στόχος για Ζαρ70 κινάσης σε Τ λεμφοκύτταρα και η ανεπάρκεια της είναι γνωστό ότι επάγει την απουσία + CD8 + θυμοκύτταρα διπλά θετικά CD4 και των περιφερικών κυττάρων T [30]. RAFTLIN (πρωτεΐνη σχεδία σύνδεσης) επίσης αποδειχθεί ότι επηρεάζουν Τ-κύτταρο ανοσοαποκρίσεων και Th17 διαφοροποίηση [31]. STK17B είναι μία κινάση σερίνης επίσης γνωστή ως DRAK (DAP που επάγει απόπτωση κινάση κινάση σχετίζονται) 2 το οποίο είναι γνωστό ότι μεσολαβεί απόπτωση που επάγεται από την IL-2 και τη ρύθμιση της ευαισθησίας των υποδοχέων των Τ κυττάρων στις αναπτυσσόμενες θυμοκύτταρα [32] – [33]. Φωσφοδιεστεράσης (PDE) 4 Β είναι μια τύπου 4 ΡϋΕ (μέχρι ~ 2 φορές) που ρυθμίζει TCR σηματοδότηση από επαναφορά την αρνητική επίδραση του cAMP [34] και σε CD4 + ανθρώπινα Τ κύτταρα μειωμένη έκφραση PDE4B οδηγεί σε μειωμένη παραγωγή IL-2 κατά την αντι -CD3 /CD28 συν-διέγερση [35]. Το ταυτοποιημένο θέση σύνδεσης τσιπ-on-chip STAT5 εντός της PDE4B δείχνεται στο Σχήμα 4Β, ορατές με την IGV. Περιέργως, η IL-2 αύξησε το επίπεδο της PDE4B, το οποίο περιέχει αρκετές θέσεις σύνδεσης ιντρονικές STAT5, με βάση τις μελέτες των Τ κυττάρων ποντικού [5].

Οπτικοποίηση των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται από το γονιδίωμα-ευρεία αναγνώριση του IL-2 που προκαλείται από γονίδια και θέσεις πρόσδεσης STAT5 (όπως περιγράφεται στο Σχ. 1) χρησιμοποιώντας την IGV.

η

(Α) Ορατή είναι γνωστά γονίδια-στόχους STAT5 συμπεριλαμβανομένων SOCS2, SOCS3, CISH και εκείνες που προσδιορίζονται και από chip-on -ChIP (IL2RA, BCL2, BCL6 και CDK6) και (Β) 18 πρόσφατα εντοπίστηκαν γονίδια υποκινητή που βρίσκεται ορατά με την IGV χρησιμοποιώντας hg19.

η

STAT5 καταλαμβάνει μια υποθετική IL-2 Κατανοητή GAS Ιστοσελίδας εντός της PDE4B Gene

in vivo

στα Ανθρώπινα PBMCs

για να επιβεβαιωθεί ότι η STAT5 είναι σε θέση να δεσμεύσει μια υποθετική θέση ΑΕΡΙΟ στο γονίδιο PDE4B (που βρίσκεται στο χρωμόσωμα 1, θέσεις hg18 66567898 έως 66573077) στο ένα IL-2 επαγώγιμο τρόπο, εκτελέσαμε πειράματα τσιπ ηρεμία ανθρώπινα PBMCs αφεθεί χωρίς θεραπεία (-) ή επεξεργασμένα με IL-2 για 30 λεπτά (+) που απομονώθηκαν από τρεις ανεξάρτητες δότες. Ως αποτέλεσμα, παρατηρήθηκε ότι STAT5 δεσμεύεται PDE4B σε ένα IL-2 εξαρτώμενη και σημαντικό τρόπο (ρ & lt? 0,05) με μία περίπου 1.7 φορές αύξηση σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 5Α). Η IL2RA PRR III χρησιμοποιήθηκε ως ένας θετικός έλεγχος (Σχήμα 5Β). Είναι ενδιαφέρον, το γονίδιο PDE4B περιέχονται τόσο STAT5A και STAT5b IL-2 ανταποκρίνεται θέσεις σύνδεσης έρευνας εντός πρωτογενή ανθρώπινα Τ κύτταρα [16] που επικαλύπτονται με μας chip-on-chip περιοχής. Επιπλέον, η αυξημένη δραστηριότητα δέσμευσης STAT5 DNA μετά IL-2 θεραπεία συσχετίζεται καλά με την παρατηρούμενη 2-φορές αύξηση στα επίπεδα mRNA (Πίνακας 1).

δοκιμασίες ChIP πραγματοποιήθηκε με αντισώματα STAT5 ή οροί ελέγχου (IgG) διεξήχθησαν έξω σε κατάσταση ηρεμίας (-) ή IL-2 διεγερμένων (30 min, +) hPBMCs απομονώθηκαν από τρεις ανεξάρτητους δότες για τη μέτρηση της εμπλουτισμό του ρυθμισμένη περιοχή PDE4B υποθετική STAT5 (Α) ή το IL2RA ενισχυτή PRR III (Β) που προσδιορίζονται από chip- on-chip. Είσοδοι αντιπροσωπεύουν το 1% της χρωματίνης που χρησιμοποιούνται σε δοκιμασίες chip και μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν τυπικές αποκλίσεις. * Αντιπροσωπεύει στατιστικώς σημαντικές διαφορές (ρ & lt? 0,05)

Η

Short Term IL-2 Θεραπεία (3 ώρες) Προκαλεί PDE4B Protein Expression σε ΡΗΑ-ενεργοποιημένα PBMCs Ανθρώπινα και CD8 +, αλλά όχι CD4 + κύτταρα

Για την περαιτέρω επικυρώνει ότι PDE4B ρυθμίζεται από την IL-2, εξετάσαμε επίσης αλλαγές επίπεδο πρωτεΐνης σε αφελή (Ν), ΡΗΑ-ενεργοποιημένα (Α), ηρεμίας (Q) και IL-2 διεγερμένα ανθρώπινα PBMCs στις 3 ώρες (+) σε δύο ανεξάρτητες δότες (Σχήμα 6Α). Το επίπεδο της πρωτεΐνης PDE4B αυξήθηκε περίπου 2-φορές (Σχήμα S4, ανάλυση πυκνομετρίας), η οποία συσχετίζεται με την -1.7-πλάσια αύξηση στη δραστικότητα δέσμευσης του DNA του STAT5 και 2-πλάσια αύξηση στα επίπεδα mRNA (Σχήμα 5Α και στον Πίνακα 1, αντίστοιχα) . Πρωτογενή ανθρώπινα CD4 + ή CD8 + Τ-κύτταρα ελέγχθηκαν επίσης (Σχήμα 6Β). YT ΝΚ κύτταρα που μοιάζουν χρησίμευσαν ως θετικός έλεγχος και β-ακτίνης ως ένας έλεγχος φόρτωσης. Τόσο ΡΗΑ ενεργοποίησης (72 ώρες) και βραχυπρόθεσμες IL-2 θεραπεία έκφραση πρωτεΐνης επάγεται PDE4B σε PBMCs και CD8 +, αλλά όχι CD4 + Τ-κύτταρα. Με βάση αυτά τα δεδομένα είναι ενδιαφέρον να υποθέσουμε ότι PDE4B θα μπορούσε να είναι η πρώτη «γραμμή άμυνας» σε PBMCs και CD8 + Τ-κυττάρων έναντι της αυξημένης σηματοδότησης cAMP που συμβαίνει με την διέγερση των Τ-κυττάρων [36]. Είναι γνωστό ότι ένας άλλος τύπος 4 ισομορφή, PDE4D εκφράζεται επίσης σε CD4 + Τ-κύτταρα [35], η οποία μας οδηγούν να υποθέσουμε ένα πιθανό μοντέλο όπου υπάρχει συνεχής σκλήρυνση του cAMP που επάγεται οδών σε σύγκριση με κύτταρα CD8 +. Μια άλλη δυνατότητα θα μπορούσε να είναι ότι η καθυστερημένη πάνω ρύθμιση του PDE4B σε κύτταρα CD4 + είναι να μειορυθμίζουν cAMP σε αυτά τα κύτταρα σε ένα απώτατο σημείο του χρόνου. Δοκιμές CD4 + vs κύτταρα CD8 + διεξήχθη από έναν μόνο δότη και πιστεύουμε παρέχει νέες ευκαιρίες για τη διερεύνηση του πιθανού ρόλου των PDE4B σε αυτούς τους τύπους των υποσυνόλων κυττάρων Τ.

Κανονικό ανθρώπινο PBMCs από τρεις ανεξάρτητους δότες (που παρουσιάζονται είναι 2 αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα) αφέθηκαν un-ενεργοποιημένα (Ν, αφελείς) ή ενεργοποιήθηκαν με ΡΗΑ (Α, Q, +) και στη συνέχεια καθίστανται αδρανείς μετά από 72 ώρες ενεργοποίησης ΡΗΑ από CO

2 απογύμνωση όπως περιγράφεται στο τμήμα Υλικά και Μέθοδοι (Q ) και, στη συνέχεια διεγείρονται με IL-2 για 3 ώρες (+). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και στη συνέχεια με στύπωμα Western με αντισώματα προς PDE4B ή β-ακτίνη όπως υποδεικνύεται στα δεξιά. Οι δείκτες μοριακού βάρους δείχνονται στα αριστερά. Στο κατώτερο πάνελ αμέσως μετά PBMC απομόνωση CD4 + (λωρίδες fi) ή CD8 + (λωρίδες είναι) κύτταρα αρνητικά επιλέγονται όπως περιγράφεται στο τμήμα Υλικά και Μέθοδοι χρησιμοποιώντας μαγνητικά σφαιρίδια, και στη συνέχεια ενεργοποιήθηκαν με ΡΗΑ, καθίστανται αδρανείς, διεγερμένα με IL-2 και Western στυπώθηκαν για PDE4B και β-ακτίνης, όπως περιγράφεται παραπάνω. κύτταρα ΥΤ χρησίμευσαν ως θετικοί μάρτυρες για την αποκωδικοποίηση PDE4B. (Γ) PDE4B εκφράζεται σε CD4 + λεμφοειδείς κυτταρικές σειρές όγκων. ΚΙΤ225, Η9, Molt3, ΜΤ2, HUT102 CD4 + και ΥΤ ΝΚ-όπως λεμφοειδείς κυτταρικές σειρές λύθηκαν και ίσες ποσότητες πρωτεΐνης με στύπωμα Western για PDE4B και β-ακτίνης, όπως περιγράφεται για το Σχήμα 6Α. Αντιπροσωπευτικά δεδομένα από δύο ανεξάρτητα πειράματα παρουσιάζονται.

Η

PDE4B εκφράζονται σε CD4 + λεμφοειδή γραμμές όγκου κυττάρων

Από PDE4B βρέθηκε ασυνήθιστα εκφράζεται σε διάχυτο μεγάλα δείγματα λεμφώματος Β-κυττάρου [35] ανέκυψε το ερώτημα τι θα μπορούσε να είναι η κατάσταση της έκφρασης PDE4B σε διάφορες άλλες λεμφοειδείς κυτταρικές σειρές καρκίνου CD4 + και. Ως εκ τούτου, ένα σύνολο λεμφοειδών κυτταρικών γραμμών όγκου ανθρώπινα CD4 + και μία ΝΚ-όπως κυτταρική γραμμή, ΥΤ, εξετάστηκαν με κηλίδωση Western που έδειξαν υψηλά εκφραζόμενη πρωτεΐνη PDE4B παρούσα σε αυτά τα κύτταρα (Σχήμα 6C). μονοπάτι σηματοδότησης STAT5 είναι σχετική με αρκετές από αυτές τις κυτταρικές σειρές: τα ανθρώπινα ΜΤ2 και HUT102 και να εμφανίσει υπερκινητικά STAT5 μονοπάτι [37], ενώ ΥΤ και τα κύτταρα ΚΙΤ225 υφίστανται απόπτωση όταν STAT5 έχει εξαντληθεί [11], [38]. Περιέργως, PDE4B βρέθηκε υπερεκφράζεται στο κλάσμα της διάχυτης μεγάλα δείγματα λεμφώματος Β-κυττάρου που ήταν ανθεκτικοί στην χημειοθεραπεία [39]. Θα ήταν, επομένως, ενδιαφέρον να διερευνηθεί κυτταρική μοίρα αν PDE4B θα μπορούσε να εξαντληθεί αποτελεσματικά και αν ο θάνατος μπορεί να προκύψει.

Στο σύνολό τους, είναι εύλογο να υποθέσουμε ότι η υπερέκφραση της PDE4B θα μπορούσε να είναι το αποτέλεσμα της ανώμαλης γονιδιωματικής δέσμευσης του DNA STAT5 ότι θα μπορούσαν στη συνέχεια να συμβάλει στην ογκογόνο φαινότυπο αυτών των κυτταρικών σειρών. Δοκιμή αυτής της υπόθεσης απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση.

Συμπεράσματα

Εν κατακλείδι, χρησιμοποιώντας μια συστηματική προσέγγιση, η οποία σε συνδυασμό με τον προσδιορισμό της επαγόμενης ανάλυσης STAT5 cistrome και την έκφραση του γονιδίου της IL-2 σε ένα μοντέλο ανθρώπινων κυττάρων λευχαιμίας ? και με την παρακολούθηση οντολογία γονιδίων, καθώς και μέσο επικύρωσης έκφραση απόδοση μεταγραφή στην πρωτογενή ανθρώπινα PBMCs έχουμε εντοπίσει 19 νέα γονίδια στόχους STAT5, μερικά με λειτουργίες ακόμη-να-να προσδιοριστεί και κάποια με ενδιαφέρον στα κύτταρα του ανοσοποιητικού. Έχουμε επικυρωμένες επίσης ένα νέο γονίδιο υποψήφιος στόχος, PDE4B σε πρωτεϊνικό επίπεδο σε PBMCs και διαπίστωσε ότι υπερεκφράζεται σε λεμφοειδείς γραμμές όγκου CD4 +. Αυτά τα δεδομένα επίσης δείχνουν ότι καρκινικά κύτταρα λεμφοειδούς προέλευσης θα μπορούσε να έχει ασύμμετρη γονιδιωματικές θέσεις δέσμευσης STAT5 και συνεπώς γονιδίων-στόχων σε σύγκριση με την κανονική λεμφοειδή κύτταρα (όπως προτείνεται από την σύγκριση των δεδομένων μας με ήδη υπάρχοντα δεδομένα στην βιβλιογραφία από Liao και συνεργάτες [16] )? Ως εκ τούτου, η εύρεση συγκεκριμένων στόχων για την εξάλειψη αυτών μπορεί να απαιτήσει τη χαρτογράφηση του γονιδιώματος, πάνω από μεγαλύτερα σύνολα δειγμάτων πρωτογενούς όγκου της ίδιας καταγωγής. Είτε λεμφικών κυττάρων με μια υπερδραστήρια οδό STAT5 θα μπορούσε να είναι ευαίσθητος στους αναστολείς PDE4B και ένα μηχανισμό για τον έλεγχο ορισμένων όγκων θα αποτελέσουν αντικείμενο μελλοντικών μελετών.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture και θεραπεία

Ο λεμφώματος ανθρώπινη κυτταρική σειρά ΥΤ [40], CD4 + ανθρωπίνων Τ-κυτταρικών γραμμών Hut-102 [41] και ΜΤ-2 [42], ο θύμος προερχόμενο CD4 + Τ-λεμφοκυττάρων κυτταρική γραμμή Molt-3 [43], CD4 + Τ-κυτταρική γραμμή Η9 [44] και την ανθρώπινη CD4 + IL-2 εξαρτώμενης κυτταρικής λευχαιμίας γραμμή ΚΙΤ225 [45] (ευγενώς από τον Dr. J. Johnston, Πανεπιστήμιο Queens, UK) καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφεται [4], [38]. IL-2 ελήφθη από την NCI Προκλινικά Repository. Ανθρώπινα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC) απομονώθηκαν, ενεργοποιημένα με ΡΗΑ και διατηρήθηκαν όπως περιγράφεται [46]. CD4 + ή CD8 + Τ-κύτταρα απομονώθηκαν με αρνητική επιλογή χρησιμοποιώντας Dynabeads® χωρίς να αγγιχτεί ™ Ανθρώπινα CD4 Τ κυττάρων (Cat. Ηο. 113.46D) ή ανθρώπινο CD8 Τ κυττάρων (Cat. Ηο. 113.48D) σετ, αντίστοιχα.

χρωματίνης Ανοσοκαταβύθιση

χρωματίνης ανοσοκατακρημνίσεις πραγματοποιήθηκαν από περίπου 5 × 10

7 ΚΙΤ225 κύτταρα όπως περιγράφεται [4] με αντισώματα αντι-STAT5A /Β (ανάμειξη SC-1081 και SC-835 (C-τερματικό STAT5A και STAT5b αντισωμάτων, αντίστοιχα)) ή με φυσιολογικό ορό κουνελιού (έλεγχος IgG) για 3 ώρες στους 4 ° C. Για να επιβεβαιωθεί ότι οι δοκιμασίες ήταν επιτυχείς, PCR ενίσχυση της γνωστής θέσης δέσμευσης STAT5 βρίσκεται 5 ‘ως προς το ανθρώπινο γονίδιο IL2RA εντός του θετική ρυθμιστική περιοχή III [23] (Forward: 5′-ACG TCT AGA AAG ΑΑΑ ΟΤΟ GTC-3′ Reverse : 5’-CTG TCC CTG GAT GAA ΚΔ AGT-3 ‘) έγινε χρησιμοποιώντας ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου. [4] Οι τιμές των μεταγραφών σε άγνωστα δείγματα ελήφθησαν με παρεμβολή (κύκλοι PCR για να κατωφλίου) Ct τιμές σε μια πρότυπη καμπύλη. Πρότυπες καμπύλες παρασκευάστηκαν από γνωστές ποσότητες καθαρισμένου, PCR-ενισχυμένο DNA. δοκιμασίες αστάρι ChIP qPCR για την επικύρωση της PDE4B ChIP παραγγέλθηκαν από SABiosciences, μια εταιρεία Qiagen (Cat # GPH900044 (-) 01A), παρέχοντας χρωμοσωμικές θέσεις για το 250 bp γύρω από την πιθανή θέση GAS (chr1:66569949-66570198, hg18). Οι αντιδράσεις PCR διεξήχθησαν με τη χρήση 2 χ SYBR Green βασικού μείγματος από BioRad και θερμοκυκλοποιητή BioRad iQ5 εις τριπλούν. Αυθαίρετες μονάδες που ορίζονται ως «σύνδεσης DNA, (δβ)» ελήφθη με 2∧ (-averageCt) και τυπική απόκλιση, όπως SD ≈ ln (2) * STDEV (averageCt) * Δβ.

Τυχαία Ενίσχυση της χρωματίνης ανοσοκατακρημνίστηκαν DNA

Για την παραγωγή βιβλιοθηκών από τσιπ ed DNA, τυχαία ενίσχυση διεξήχθη όπως περιγράφεται στο https://research.stowers-institute.org/gertonlab/protocols/RandomPCRamplification.pdf από το εργαστήριο DeRisi στο UC Σαν Φρανσίσκο. Εν συντομία, τα δείγματα του DNA τσιπ ed ενισχύθηκαν με μία τροποποιημένη εκδοχή μιας τυχαίας πρωτόκολλο PCR [47]. DNA συγκολλήθηκε στο PRIMER A (5′-GTTTCCCAGTAGGTCTCNNNNNNNN), και σύνθεσης δεύτερου κλώνου DNA εκτελέστηκε με Sequenase (US Biochemical). Αυτό το υλικό στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε ως το εκμαγείο για 35 κύκλους PCR με Primer Β (5′-GTTTCCCAGTAGGTCTC) χρησιμοποιώντας το ακόλουθο προφίλ: 30 s στους 94 ° C, 30 s στους 40 ° C, 30 s στους 50 ° C, 60 s στους 72 ° C και ένα μίγμα dNTP που περιέχει dUTP. Τα προϊόντα καθαρίστηκαν με κιτ καθαρισμού QIAGEN PCR, ποσοτικοποιούνται και να τρέξει σε ένα πήκτωμα αγαρόζης 1% για να ελέγξει για μέγεθος θραύσματος, στη συνέχεια εξετάζονται για εμπλουτισμό του Θετική ρυθμιστικής περιοχής III, όπως περιγράφεται παραπάνω.

in silico

Ανάλυση

Chip-on-chip αποτελέσματα αναλύθηκαν με ΜΑΤ (Model-based Ανάλυση του πίνακα Πλακάκια, [24] https://liulab.dfci.harvard.edu/MAT/) από τον Liu εργαστήριο στο Τμήμα Βιοστατιστικής και Υπολογιστικής Βιολογίας στο Ινστιτούτο Dana-Farber Cancer, Harvard School of Public Health. Εγγύς χαρτογράφηση γονιδίων των γονιδιακών αλληλουχιών έως 300 kb διεξήχθη χρησιμοποιώντας το cis-Ρυθμιστική Στοιχείο σύστημα σχολιασμού (ΚΕΣΑ https://liulab.dfci.harvard.edu/CEAS/). Τα αποτελέσματα εμφανίζονται δια IGV. Η μετατροπή των συντεταγμένων γονιδιώματος και τα αρχεία γονιδίωμα σχολιασμό των διαφορετικών εκδόσεων των συγκροτημάτων του ανθρώπινου γονιδιώματος έγινε με τη χρήση του εργαλείου UCSC γονιδίωμα Liftover σε https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgLiftOver.

Απομόνωση RNA και cDNA Synthesis

Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy (Qiagen). cDNA συντέθηκε με iScript cDNA Synthesis Kit BioRad του σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

μικροσυστοιχιών Ανάλυση

Ανάλυση γονιδιακής έκφρασης χρησιμοποιώντας Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 μικροσυστοιχίες διεξήχθησαν στην Εγκατάσταση μικροσυστοιχιών πυρήνα, Baylor College of Medicine, Houston, TX. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση GeneSpring GX στο Πανεπιστήμιο του Debrecen. συστοιχίες 1.0R Affymetrix GeneChip Ανθρωπίνων υποστηρικτής ανακρίνουν περιοχές κοντά σε θέσεις έναρξης της μεταγραφής και περιέχουν ανιχνευτές για περίπου 59 τοις εκατό των CpG νησίδων. Αυτοί οι πίνακες περιέχουν 4,6 εκατ ανιχνευτές πλακάκια με πάνω από 25.500 ανθρώπινες περιοχές υποκινητή σε μια μέση ανάλυση των 35 bp.