Αφηρημένο

Ιστορικό

Ο ενεργοποιητής πλασμινογόνου ουροκινάσης (υΡΑ) και του υποδοχέα του (uPAR /CD87) είναι σημαντικοί ρυθμιστές της αποικοδόμησης εξωκυττάριας μήτρας και εμπλέκονται στην κυτταρική μετανάστευση και την εισβολή υπό φυσιολογικές και παθολογικών καταστάσεων. Το σύστημα υΡΑ /υΡΑΚ υπήρξε μεγάλο ενδιαφέρον για την έρευνα του καρκίνου επειδή εμπλέκεται στην ανάπτυξη των περισσοτέρων επεμβατική φαινοτύπους καρκίνου και είναι ένας ισχυρός προγνωστικός παράγοντας της κακή επιβίωση του ασθενούς. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για τον ρόλο των υΡΑ /υΡΑΚ σε μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (SCLC), το πιο επιθετικό τύπο του καρκίνου του πνεύμονα. Ως εκ τούτου, καθορίζεται εάν υΡΑ και uPAR εμπλέκονται στην παραγωγή των ανθεκτικών στα φάρμακα φαινοτύπου SCLC κυττάρων.

Μέθοδοι και Ευρήματα

Θα προβληθεί έξι ανθρώπινα SCLC κυτταρικές σειρές για τους δείκτες επιφάνειας για υποτιθέμενη στέλεχος και καρκινικά κύτταρα. Χρησιμοποιήσαμε ενεργοποιημένων με φθορισμό διαλογή κυττάρων (FACS), μικροσκοπία φθορισμού και κλωνογενείς δοκιμασίες για να αποδειχθεί η έκφραση του uPAR σε έναν υποπληθυσμό κυττάρων που προέρχονται από πρωτογενή και μεταστατικό SCLC κυτταρικές σειρές. Κυτταροτοξικά δοκιμασίες χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί η ευαισθησία του uPAR-θετικών και uPAR-αρνητικά κύτταρα σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Οι uPAR-θετικών κυττάρων σε όλες τις γραμμές SCLC αποδειχθεί αντοχής πολυ-φαρμάκου, υψηλής κλωνογόνων δραστικότητα και συν-έκφραση των CD44 και MDR1, υποθετική δείκτες καρκίνου των βλαστικών κυττάρων.

Συμπεράσματα

Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι uPAR-θετικά κύτταρα μπορεί να ορίζει ένα λειτουργικά σημαντικό πληθυσμό των καρκινικών κυττάρων σε SCLC, τα οποία είναι ανθεκτικά στις παραδοσιακές χημειοθεραπείες, και θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως κρίσιμη στόχοι για πιο αποτελεσματικές θεραπευτικές παρεμβάσεις σε SCLC

Παράθεση:. Gutova M, J Najbauer , Gevorgyan Α, Μετς MZ, Weng Υ, Shih CC, et al. (2007) Ταυτοποίηση των uPAR θετικά στη χημειοθεραπεία κύτταρα σε μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 2 (2): e243. doi: 10.1371 /journal.pone.0000243

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Χριστόφορος Arendt, Sanofi-Aventis, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 15 Ιαν 2007? Αποδεκτές: 31, Γενάρη του 2007? Δημοσιεύθηκε: 28, Φεβρουαρίου 2007

Copyright: © 2007 Gutova et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται.

Εισαγωγή

μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (SCLC) είναι η πιο επιθετική μορφή του καρκίνου του πνεύμονα και έχει ομοιόμορφα κακή πρόγνωση. Μεταστάσεις αναπτύξουν γρήγορα, κυρίως στο μυελό των οστών και του εγκεφάλου, και είναι συνήθως παρόντες κατά τη στιγμή της διάγνωσης. Σε μη επεξεργασμένα ασθενείς, διάμεση επιβίωση είναι δύο μήνες από την έναρξη των συμπτωμάτων [1].

Σε διάφορους τύπους όγκων αυξημένα επίπεδα ενεργοποιητή πλασμινογόνου ουροκινάσης (υΡΑ) και του υποδοχέα του uPAR (CD87) συσχετίζονται έντονα με κακή πρόγνωση και δυσμενή κλινική έκβαση [2], [3], [4], [5], [6]. υΡΑ και uPAR είναι καθοριστική στον έλεγχο συνδεόμενες με μεμβράνη εξωκυτταρικό πρωτεόλυση και διαμεμβρανική σηματοδότηση, επηρεάζοντας έτσι την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή υπό φυσιολογικές και παθολογικές συνθήκες [2], [7], [8], [9], [10]. uPAR υπερ-έκφραση σε κακοήθη κύτταρα προκύπτει από την ενεργοποίηση αρκετών ογκογόνο οδούς, συμπεριλαμβανομένων των ΜΑΡΚ, RTK, ΕΚΚ2 και ΡΑΚ [2], [7], [9]. Πολλαπλές ογκογονικές μεταλλάξεις, συμπεριλαμβανομένων των ρ53 σε καρκινικά κύτταρα να οδηγήσει σε ανεξέλεγκτη έκφραση του υΡΑ /υΡΑΚ [11]. Η αναστολή της uPAR σε ένα μοντέλο ποντικού μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα και άλλων όγκων ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου, εισβολή, αγγειογένεση και μετάσταση [12], [13], [14]. Αυξημένα επίπεδα του υΡΑΚ συσχετίζεται με υψηλότερη θνησιμότητα σε ασθενείς με πλακωδών κυττάρων και μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [15], [16], ωστόσο λίγα είναι γνωστά σχετικά με το ρόλο της έκφρασης υΡΑ /υΡΑΚ σε SCLC.

Μια πρόσφατη μελέτη από Alfano

et al

υπογραμμίζει τη σημασία της uPAR σηματοδότησης στην πρόληψη της απόπτωσης από την αντίσταση των καρκινικών κυττάρων να anoikis (απόπτωση που προκαλείται από την απώλεια της αγκύρωσης). έκφραση uPAR προάγει κυτταρική επιβίωση μέσω της ενεργοποίησης του παράγοντα αντι-απόπτωσης Bcl-xL μεταγραφή μέσω της MEK /ERK- και ΡΙ3Κ /Akt οδοί που εξαρτώνται από [17]. Ως εκ τούτου, υποθέτουμε ότι η έκφραση του uPAR μπορεί να εμπλέκεται στην ανάπτυξη του φαινοτύπου του καρκίνου ανθεκτικών στα φάρμακα σε SCLC.

Αναφέρουμε εδώ την παρουσία ενός σπάνιου πληθυσμού των uPAR-θετικών κυττάρων στο ανθρώπινο SCLC κυτταρικές σειρές που επιδεικνύουν σημαντική ναρκωτικών αντίσταση σε παραδοσιακές χημειοθεραπευτικούς παράγοντες όπως η 5-φθοριοουρακίλη (5-FU), σισπλατίνη και ετοποσίδη. Οι uPAR-θετικά κύτταρα εξέφρασαν τη STEM και καρκίνος δείκτες κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων CD44 και MDR1. Ο προσδιορισμός και η στόχευση των uPAR-θετικών κυττάρων σε μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα μπορεί να παράσχει πολύτιμες πληροφορίες για τη βιολογία του καρκίνου του ανθρώπινου πνεύμονα και μπορεί να δημιουργήσει νέα κρίσιμη στόχους για πιο αποτελεσματικές αντικαρκινικές θεραπείες.

Μέθοδοι

Ανοσοβαφή και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

Πρωτοβάθμια (πνεύμονα) μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικών σειρών (SCLC) (H1688, H1417, H69AR), του μυελού των οστών (ΒΜ) μεταστατικό μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (H211, H1882) και του εγκεφάλου μεταστατικό μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (H250) κυτταρικές σειρές ελήφθησαν από ανθρώπινο πρωτογενές πνεύμονα και μεταστατικού ιστούς (ATCC), αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 τροποποιημένο μέσο (ATCC, Ν: 30-2001) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS). Η μεταστατική κυτταρική γραμμή BM (H1882) καλλιεργήθηκε σε πλήρες μέσο HITES (D-ΜΕΜ /F-12, Ν: 30-2006 συμπληρωμένο με ινσουλίνη 5 μg /ml, τρανσφερρίνη 10 μg /mL, σεληνίτη νατρίου 30 ηΜ, 10 ηΜ υδροκορτιζόνης , β-οιστραδιόλη 10 ηΜ, L-γλουταμίνη 2 mM, HEPES 10 mM και 5% FBS). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν για δύο εβδομάδες και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής, χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα αντισώματα: CD59 (CBL467P), CD109 (CBL585P), CD62E (CBL180F) από την Chemicon, CD87 (3936CJ) από την American Diagnostica, CXCR4 (FAB170F) από την Κ & amp? D συστήματα, CD24 (555.427), CD90 (555.596), CD38 (347.680), CD44 (555.478), CD45 (555.482), CD13 (555.394), CD49b (555.498), CD29 (555.443), CD3 (30104X) από BD Pharmingen, ABCG2 /BCRP1 (10400) από την Stem Cell Technologies, CD133 /2 (κλώνος 293C3) και CD133 /1 (κλώνος AC133) από τη Miltenyi Biotec, CD34 (347.660) από την Becton Dickinson, CD105 (326-050) από τον Αλέξη, MNF116 (F0859 ), Cyt18 (F7212) από DACO, και CD166 (3 ft) από το ΕΑΚ. Για ανάλυση FACS κάθε κυτταρική γραμμή αποσπάστηκε με θρυψινοποίηση και επανα-εναιωρήθηκαν σε χρώση ρυθμιστικό (SB) (HBSS, Irvine Scientific, 9228) συμπληρωμένο με 2% FBS και 10 mM HEPES σε πυκνότητα 5 χ 10

6 κύτταρα /ml. Πενήντα μΐ (2,5 χ 10

4 κύτταρα) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο ενός 96 φρεατίων σχήματος V πλάκα. Αντισώματα (FITC- ή ΡΕ-συζευγμένα) προστέθηκαν σε συγκεντρώσεις που συνιστώνται από τον κατασκευαστή (20 μl /10

6 κύτταρα). Αντισώματα για CD133, CD34, CD44, CD87 και MDR1 έχουν τιτλοποιούνται ξεχωριστά. Οι πλάκες 96 φρεατίων τοποθετήθηκαν σε πάγο και τα κύτταρα βάφτηκαν με αντισώματα για 30 λεπτά σε σκοτάδι. Μετά τη χρώση, 150 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης (HBSS, συμπληρωμένο με 15% FBS και 10 mM HEPES) /φρεάτιο και οι πλάκες φυγοκεντρήθηκαν σε 500 χ

g

για 5 λεπτά στους 4 ° C. Οι σβώλοι κυττάρων επαναιωρήθηκαν σε SB, συμπληρωμένο με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) (1 μg /ml) για τον αποκλεισμό μη βιώσιμα κύτταρα, που ακολουθείται από ανάλυση κυτταρομετρίας ροής.

Κυττάρων Χρώση και διαλογής

κυτταρικές γραμμές SCLC (H211, H69AR, H1417) αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 και 4 χ 10

6 κύτταρα συλλέχθηκαν και στη συνέχεια επαναιωρείται σε 800 μΙ SB, που ακολουθείται από χρώση με uPAR (CD87) -FITC-συζευγμένο αντίσωμα όπως περιγράφεται παραπάνω. uPAR-θετικά και uPAR-αρνητικά κύτταρα ταξινομήθηκαν με FACS, που ακολουθείται από καλλιέργεια σε «βάση» media μεθυλοκυτταρίνη (Stem Technologies Cell, 04 100) για 16 ημέρες στους 37 ° C, 5% CO

2.

κλωνογονική δοκιμασία του SCLC κυττάρων Lines

πλήρες RPMI 1640 προστέθηκε στο μέσο MethoCult H4100 (40 ml) για την επίτευξη ενός τελικού όγκου 100 ml. uPAR-θετικά και uPAR-αρνητικά κύτταρα που προέρχονται από SCLC κυτταρικές γραμμές (H211, H69AR, H1417) απλώθηκαν σε μέσο MethoCult εις τριπλούν που περιέχουν 3 × 10

3, 1 × 10

3, ή 1 × 10

2 κύτταρα /ml. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C, 5% CO

2 σε υγροποιημένο επωαστή για 16 ημέρες. Οι αποικίες μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο φωτεινού στους 4 × μεγέθυνση.

κυτταροτοξικότητας Δοκιμασία

Τα κύτταρα που προέρχονται από τρία SCLC γραμμές ανοσοχρωματίστηκαν και ταξινομούνται με ανάλυση κυτταρομετρία ροής (όπως περιγράφεται παραπάνω). Κυτταρικές γραμμές (H211, H69AR, H1417) μετρήθηκαν και τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων (4 χ 10

3 κύτταρα /φρεάτιο, εις τριπλούν) με τελικές συγκεντρώσεις των φαρμάκων 0, 3, 10, 100, 200 μg /ml . Μετά από επώαση για 72 ώρες, τόσο βιώσιμα και νεκρά κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία γκουάβα ViaCount, και μόνο τα βιώσιμα κύτταρα περιλαμβάνονται στην ανάλυση δεδομένων. Η δοκιμασία Γκουάβα ViaCount διακρίνει μεταξύ βιώσιμου και μη βιώσιμων κυττάρων με βάση την διαφορική διαπερατότητα των βαφών δέσμευσης DNA στο αντιδραστήριο ViaCount, και έτσι φθορισμού των χρωστικών επιτρέπει ποσοτική αξιολόγηση τόσο βιώσιμα και μη βιώσιμα κύτταρα σε εναιώρημα. Εναλλακτικά, μη-ταξινομημένα κύτταρα εφαρμόσθηκαν σε πλακίδια 48-φρεατίων (1 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με σισπλατίνη, ετοποσίδη και ο συνδυασμός τους σε συγκεντρώσεις 0, 3, 10, 100 μg /ml. Οι πυκνότητες σποράς ανά μονάδα επιφάνειας (mm

2) ήταν οι ίδιες τόσο για τις πλάκες 48- και 96-φρεατίων (πυκνότητα = 125 κύτταρα /mm

2). Μετά από 72 ώρες επώασης, τα βιώσιμα κύτταρα χρωματίστηκαν με uPAR-FITC αντισώματα και αξιολογήθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

Διπλή σήμανσης για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

Οι κυτταρικές σειρές χρωματίστηκαν με CD44-ΡΕ και MDR1- ΡΕ, πλύθηκαν και έπειτα χρωματίσθηκαν με uPAR-FITC (1 × 10

5 κύτταρα /1 μg αντισώματος). Iso-τύπου συμφωνημένα ΡΕ- ή ΡΙΤΟ-συζευγμένα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι. Βιτρώ κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

Αποτελέσματα

ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των Ανθρωπίνων SCLC κυτταρικών γραμμών

Για να εντοπιστούν οι πιο επεμβατικές SCLC φαινοτύπους, θα προβληθεί έξι ανθρώπινα SCLC κυτταρικές σειρές (H1688, H1417, H69AR που προέρχονται από πρωτογενή θέση όγκου σε πνεύμονα, H250 από μεταστάσεις στον εγκέφαλο, και H211, H1882 από μεταστάσεις στο μυελό των οστών) με ένα πάνελ αντισωμάτων για επιφάνεια καθοριστικούς παράγοντες των καρκινικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των uPAR, CD13, CD29, CD44 , CXCR4, CD105, CD109, CD166 και για τους δείκτες των βλαστικών κυττάρων CD34, CD90, CD133, ABCG2 /BCRP1. SCLC κυτταρικές σειρές που εμφανίζονται ετερογενή φαινοτύπων σε σχέση με τους καθοριστικούς παράγοντες της επιφάνειας του όγκου. Όλα τα έξι SCLC κυτταρικές σειρές ήταν θετικές για CD29 (20-99%), CD44 (8 – 98%), CD105 (3-34%), CD166 (85-98%), και αρνητικές για CD90, και CXCR4. uPAR (CD87) ήταν το μόνο αντιγόνο κυτταρικής επιφάνειας που εκφράζεται σε ένα μικρό υπο-πληθυσμό κυττάρων (1-4%) σε κάθε μία από τις έξι κυτταρικές γραμμές SCLC, όταν αναλύθηκε με FACS χρησιμοποιώντας αντι-uPAR-FITC αντίσωμα (Σχήμα 1,

κάτω πάνελ

).

ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της έκφρασης uPAR σε SCLC που προέρχονται από κυτταρικές σειρές. (Α, Β, C) Lung κυτταρικές γραμμές που παράγονται SCLC, (D, E) μεταστατικό μυελό των οστών και (F) μεταστατικές κυτταρικές γραμμές του εγκεφάλου. Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640, χρωματίστηκαν με uPAR-FITC αντίσωμα και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (

κάτω πάνελ

). χρώση ελέγχου πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας FITC-συζευγμένο, ισότυπο ποντικού IgG (

άνω πλαίσια

). Ένας μικρός πληθυσμός του uPAR-θετικών κυττάρων ανιχνεύθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν, και υποδεικνύεται ως ποσοστό του R1-περιορισμένου βιώσιμων κυττάρων. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Τα δείγματα ελέγχου χρωματίστηκαν με ισότυπο IgG-FITC ήταν αρνητικά για έκφραση του uPAR (Σχήμα 1,

άνω πλαίσια

). Η συνεπής παρουσία μιας μικρής uPAR-θετικά υποπληθυσμό κυττάρων σε όλα τα πρωτογενή (πνεύμονας, Σχήμα 1,

κάτω πάνελ

A, B, C) και μεταστατικό (του μυελού των οστών? Σχήμα 1,

κάτω πλαίσια

D, E, και τον εγκέφαλο? F) SCLC κυτταρικές σειρές, σε αντίθεση με άλλους δείκτες, οι οποίες ποικίλουν σε αφθονία, υποδηλώνει ότι uPAR-θετικά κύτταρα μπορεί να περιλαμβάνει ένα λειτουργικώς μοναδική υποπληθυσμό κυττάρων

χημειοαντίσταση του υΡΑΚ. -θετικό κύτταρα

Υποθέσαμε ότι η uPAR που εκφράζουν κυτταρικός πληθυσμός μπορεί να είναι ανθεκτικά στους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Πραγματοποιήσαμε δοκιμασίες κυτοτοξικότητας σε τρεις επιλεγμένες κυτταρικές γραμμές χρησιμοποιώντας μη ταξινομημένο (χύμα), καθώς και ταξινομημένο uPAR-θετικών και αρνητικών uPAR-κυτταρικούς πληθυσμούς. Αυξανόμενες συγκεντρώσεις από 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) (10, 100, 200 μg /ml) προστέθηκαν σε αυτές τις κυτταρικές καλλιέργειες και επωάστηκαν για 72 ώρες, ακολουθούμενο από μέτρηση του τόσο βιώσιμα και σκότωσε κύτταρα. Τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν στο 100%, το οποίο σηματοδότησε τον αριθμό των uPAR-θετικών και uPAR-αρνητικά κύτταρα χωρίς φάρμακο προστίθενται. Ένα αποτέλεσμα κύτταρο-θανάτωση ανιχνεύθηκε σε όλα τα τρία μη ταξινομημένα κυτταρικές γραμμές (H211, H69AR, H1417), όπου 40-80% των κυττάρων σκοτώθηκαν από 5-FU (Σχήμα 2Α). Σημαντικά, uPAR-θετικά ταξινομημένα κύτταρα από αυτές τις τρεις κυτταρικές γραμμές εμφάνισαν σημαντικά αυξημένη αντοχή σε 5-FU, με μόνο το 40-50% των κυττάρων που θανατώνονται σε περίπτωση H211 και H1417 (Σχήμα 2Β). Αν και η κυτταρική σειρά H69AR έδειξε επίσης απόκλιση θανάτωση uPAR-θετικών και uPAR-αρνητικά κύτταρα (π.χ., 10 μg /ml 5-FU σκότωσε 30% του uPAR-positve κύτταρα έναντι του 85% του uPAR-αρνητικών κυττάρων), σε υψηλή συγκέντρωση του 5-FU (200 μg /ml), το αποτέλεσμα θανάτωσης για τα δύο πληθυσμούς (H69AR) ήταν η ίδια (-100%). Στατιστική ανάλυση (2-way ANOVA) του uPAR (+) και uPAR (-) σύνολα δεδομένων αποκάλυψε σημαντικές διαφορές στην επιβίωση του υΡΑΚ (+) και uPAR (-) κυττάρων μετά την αγωγή με 5-FU (

P

= 0,0002, 0,0027, 0,0008 για H211, H69AR, H1417 κύτταρα, αντιστοίχως) (Σχήμα 2Β).

κυτταροτοξική δράση του 5-FU σε μη ταξινομημένο και ταξινομούνται (uPAR-θετικών και αρνητικών uPAR πληθυσμοί) που προέρχεται από SCLC κυτταρικές γραμμές. (Α) 1 × 10

4 κύτταρα (H211, H69AR, H1417) τοποθετήθηκαν σε φρεάτια μιας 48 φρεατίων εις τριπλούν και επωάστηκαν για 72 ώρες παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων 5-FU. (Β) κυτταρικές γραμμές SCLC είχαν FACS ταξινομημένο μετά από χρώση με αντι-uPAR αντισώματα και απλώθηκαν στην ίδια πυκνότητα σποράς (4 × 10

3 /φρεάτιο πλάκας 96-φρεατίων) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 5-FU σε 0, 10 , 100, 200 μg /ml για 72 ώρες. Η επιβίωση των κυττάρων εκτιμήθηκε μετά την προσθήκη του αντιδραστηρίου γκουάβα ViaCount και μέτρηση των ζωντανών και νεκρών κυττάρων. Μόνο βιώσιμα κύτταρα συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση δεδομένων, και 100% βιωσιμότητα ορίστηκε ως ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων που καλλιεργήθηκαν απουσία της 5-FU. Στατιστική ανάλυση (2-way ANOVA) του uPAR (+) και uPAR (-) σύνολα δεδομένων αποκάλυψε σημαντικές διαφορές μεταξύ βιωσιμότητα του υΡΑΚ (+) και uPAR (-) κύτταρα (

P

= 0,0002, 0,0027, 0,0008 για H211, H69AR, H1417 κύτταρα, αντίστοιχα). Τα σημεία των δεδομένων αντιπροσωπεύουν μέσους όρους ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων.

Η

παρομοίως διερευνήθηκε η κυτταροτοξική δράση της σισπλατίνης και ετοποσίδη, φάρμακα που χρησιμοποιούνται σήμερα για τη θεραπεία ασθενών με SCLC. Τα μη ταξινομημένα κυτταρικές γραμμές SCLC (H211, H69AR, H1417) χρησιμοποιήθηκαν σε κυτταροτοξική δοκιμασίες με σισπλατίνη και ετοποσίδη σε

in vitro

μελέτες (3, 10, 100 μg /ml) (Σχήμα 3Α). 60-80% των κυττάρων σκοτώθηκαν από σισπλατίνη και ετοποσίδη (που χρησιμοποιείται ξεχωριστά ή σε συνδυασμό) σε μη ταξινομημένο γραμμές (Σχήμα 3Α). Και πάλι, τα uPAR-θετικά ταξινομημένα κύτταρα από αυτές τις τρεις κυτταρικές γραμμές εμφάνισαν σημαντικά αυξημένη αντοχή στη σισπλατίνη και ετοποσίδη, με μόνο το 30-50% των κυττάρων να σκοτώνονται, σε σύγκριση με το 60-80% θανάτωση των uPAR αρνητικών ταξινομημένα κύτταρα (τα δεδομένα δεν απεικονίζεται). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το uPAR-θετικού κυττάρου υποπληθυσμό σε SCLC μπορεί να είναι υπεύθυνη για χημειοαντίσταση σε 5-FU και άλλα παραδοσιακά χημειοθεραπευτικά φάρμακα όπως σισπλατίνη και ετοποσίδη.

κυτταροτοξική δράση της σισπλατίνης και ετοποσίδη σε μη ταξινομημένα κύτταρα που προέρχονται από SCLC κυτταρικές γραμμές. (Α) SCLC κυτταρικές γραμμές (μη ταξινομημένα) που έλαβαν θεραπεία με σισπλατίνη, ετοποσίδη με συγκεντρώσεις 0, 3, 10, 100 μg /ml ή των συνδυασμών τους (σισπλατίνη και ετοποσίδη σε τελικές συγκεντρώσεις 10 μg /ml, 100 μg /ml) για 72 hr. Η επιβίωση των κυττάρων αξιολογήθηκε μετά την προσθήκη του αντιδραστηρίου γκουάβα ViaCount και καταμέτρηση των δύο επιζώντων και τα νεκρά κύτταρα με τη χρήση του λογισμικού γκουάβα ViaCount. Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν ως 100% βιωσιμότητα των κυττάρων που καλλιεργούνται σε απουσία φαρμάκων. Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν την τυπική απόκλιση τριπλών καλλιεργειών (αποτελέσματα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων). (Β) Μετά την σισπλατίνη και ετοποσίδη θεραπεία, βιώσιμα προσκολλημένα κύτταρα αποκολλήθηκαν με επεξεργασία με θρυψίνη και χρωματίστηκαν με αντισώματα αντι-uPAR-FITC και το ποσοστό του uPAR-θετικών κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση FACS. Δείγμα με IgG αντίσωμα ελέγχου ισοτύπου ποντικού χρησιμοποιήθηκε για να ορίσετε την τιμή της πύλης FACS, το οποίο εφαρμόζεται σε όλα τα δείγματα βάφονται με uPAR-FITC.

Η

Για να επιβεβαιωθεί ότι η έκφραση του uPAR προσδίδει αντίσταση όγκου σισπλατίνη και ετοποσίδη, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς κυτταροτοξικότητας στις ίδιες μη ταξινομημένη SCLC κυτταρικές σειρές και κοίταξε για τον εμπλουτισμό του uPAR-θετικών κυττάρων στον κυτταρικό πληθυσμό που επιβιώνουν. Πράγματι, εντοπίσαμε ένα σημαντικό εμπλουτισμό του uPAR-θετικών κυττάρων (40-70%) μεταξύ κυττάρων που επιβιώνουν, σε σύγκριση με μόνο 1-5% του uPAR-θετικών κυττάρων σε καλλιέργειες ελέγχου αναπτύχθηκαν απουσία αυτών των φαρμάκων (Σχήμα 3Β). Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν την υπόθεση ότι η έκφραση του uPAR παρέχει χημειοαντίσταση σε SCLC, και ότι οι uPAR-θετικά κύτταρα θα πρέπει να θεωρείται ως ένα νέο στόχο για περισσότερο αποτελεσματικές θεραπείες.

Κλωνογόνος Δραστηριότητα του uPAR-θετικών κυττάρων

Για να δείξει ότι uPAR-θετικά κύτταρα διαθέτουν υψηλή κλωνογονικού και αυτο-ανανέωση δυναμικό, ταξινομήσαμε πρωτογενή πνεύμονα (H1417, H69AR), μεταστατικό μυελού των οστών (H211) κυτταρικές σειρές με FACS χρησιμοποιώντας αντι-uPAR-FITC-συζευγμένα μονοκλωνικά αντισώματα. Μετά τη διαλογή (καθαρότητα 97%), uPAR-θετικά και uPAR-αρνητικά κύτταρα τοποθετήθηκαν σε μεθυλοκυτταρίνη μέσο σε πυκνότητες 3000, 1000, 100 κύτταρα /φρεάτιο (6-φρεατίων). uPAR-θετικά κύτταρα από αυτές τις πρωτογενείς και μεταστατικούς SCLC γραμμών που σχηματίζονται πολλαπλά διακριτά αποικίες (Σχήμα 4Α). Υπολογίσαμε ότι περίπου ~ 10% των uPAR-θετικά κύτταρα (πνεύμονα, H1417? Μυελού των οστών, H211) σχημάτισαν αποικίες (Εικόνα 4Β). Αντιστρόφως, οι uPAR-αρνητικά κύτταρα από την πρωτογενή κύτταρα πνεύμονα (H1417) δεν σχηματίζουν αποικίες, και από μεταστατικό μυελό των οστών (H211) και πνεύμονα (H69AR) σχηματίζεται μόνο λίγες αποικίες (Σχήμα 4Β). Μετά uPAR-θετικά κύτταρα αφέθηκαν να σχηματίσουν αποικίες για 16 ημέρες σε καλλιέργεια μεθυλοκυτταρίνης, 20 αποικίες απομονώθηκαν και αναλύθηκαν ως προς την έκφραση του uPAR με κυτταρομετρία ροής. Βρήκαμε δύο uPAR-θετικών και uPAR-αρνητικά κύτταρα σε κάθε αποικία που αναλύθηκαν (H1417), με 30-50% των κυττάρων που εμφανίζουν uPAR θετικότητα σε κάθε αποικία, μετά 18 ημέρες επώασης (Σχήμα 4C). Αυτό υποδηλώνει ότι uPAR-θετικά κύτταρα μπορεί να οδηγήσει σε δύο uPAR-θετικών και uPAR-αρνητικά κύτταρα. έκφραση uPAR αναλύθηκε επίσης στις αποικίες που προέρχονται από κυτταρικές σειρές H211 και H69AR. Σε όλες τις αποικίες που προέρχονται από ταξινομημένα uPAR-θετικά κύτταρα ανιχνεύσαμε τα δύο uPAR-θετικών και uPAR-αρνητικά κύτταρα (~ 50% κάθε μετά από 16 ημέρες σε καλλιέργεια μεθυλοκυτταρίνης) (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ανάλυση των αποικιών που προέρχονται από uPAR-αρνητικά κύτταρα (π.χ., H211 κυτταρική γραμμή) αποκάλυψε ένα μικρό ποσοστό του uPAR-θετικών κυττάρων σε αυτές τις αποικίες (& lt? 1%). Ο λόγος για αυτό μπορεί να είναι η πιθανή μόλυνση κατά τη διάρκεια της διαλογής. Εναλλακτικά, uPAR αρνητικά τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να αποκτήσουν την έκφραση του uPAR υπό ορισμένες συνθήκες καλλιέργειας. Αρκετές uPAR-θετικές αποικίες έχουν συλλέχθηκαν και αναπτύχθηκαν περαιτέρω για 2 εβδομάδες σε μέσο καλλιέργειας RPMI, ακολουθούμενη από FACS διαλογή και κλωνογονική δοκιμασία. Είναι ενδιαφέρον, εντοπίσαμε μια παρόμοια αναλογία του υΡΑΚ-θετικών και uPAR-αρνητικά κύτταρα (1-5% και 95-99%, αντίστοιχα) σε αυτές τις καλλιέργειες, γεγονός που υποδηλώνει ότι uPAR-θετικές αποικίες μπορούν να ανακεφαλαιώνουν τον φαινότυπο γονικού κυττάρου. Σε καλλιέργειες που προέρχονται από uPAR αρνητικά αποικίες από την άλλη πλευρά, ανιχνεύσαμε χαμηλότερα επίπεδα (0,1-0,8%) του uPAR-θετικών κυττάρων, και την κακή συνολική ανάπτυξη (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

δραστικότητα σχηματισμού αποικίας uPAR-θετικά και uPAR-αρνητικά κύτταρα που προέρχονται από κυτταρικές γραμμές μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα. (Α) H1417- προέρχεται, uPAR-θετικά ταξινομημένα κύτταρα σχηματίζονται πολλαπλές αποικίες σε μέσα μεθυλοκυτταρίνη, ενώ uPAR-αρνητικά κύτταρα από τα ίδια είδη που εμφανίζονται μικρή ή καθόλου δραστηριότητα κλωνογόνο. (Β) Γραφική απεικόνιση της ικανότητας σχηματισμού αποικίας του uPAR-θετικών και uPAR-αρνητικά κύτταρα σε διαφορετικές πυκνότητες επιμετάλλωσης 3000, 1000, 100 κύτταρα /πλάκα 6 φρεατίων (H1417, H69AR, H211). (C) Διανομή uPAR-θετικών κυττάρων στις αποικίες που προέρχονται από ταξινόμηση uPAR-θετικά κύτταρα που αναπτύσσονται σε μεθυλοκυτταρίνη μέσα ενημέρωσης. Συνολικά 20 αποικίες κυττάρων από την κυτταρική σειρά H1417 αναλύθηκαν.

Η

Συν-έκφραση του uPAR με CD44 και MDR1

Σας περαιτέρω Υποθέσαμε ότι αν uPAR-θετικά κύτταρα αντιπροσωπεύουν τα ναρκωτικά ανθεκτικά και κλωνογονικού πληθυσμού SCLC, μπορούν να εκφράζουν CD44 και MDR1 (ABCB1) γονίδια, τα οποία εμπλέκονται στην ανάπτυξη του καρκίνου του φαινοτύπου των βλαστικών κυττάρων και την αντίσταση σε πολλά φάρμακα. Για να χαρακτηριστεί περαιτέρω η uPAR-θετικό πληθυσμό, εκτελέσαμε πειράματα διπλής σήμανσης με uPAR-FITC, και CD44-ΡΕ, καθώς και MDR1-ΡΕ σε κυτταρικές σειρές H211, H69AR, H1417. uPAR-θετικά κύτταρα που προέρχονται από κυτταρικές γραμμές μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (H211, H69AR, H1417) που εκφράζεται CD44 επί 50-80%, ενώ MDR1 σε 10-40% των κυττάρων (Σχήμα 5Α). Η έκφραση των παραπάνω δεικτών επιβεβαιώθηκε επίσης χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φθορισμού (Σχήμα 5Β). Οι uPAR-αρνητικά κύτταρα εξέφρασαν επίσης CD44 (-70% για τα κύτταρα H211 και H69AR? ~ 10% για H1417) και MDR1 (1-10% για όλες τις κυτταρικές γραμμές) (Σχήμα 5Α).. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν εμπλουτισμό της έκφρασης CD44 σε H1417 κυττάρων, ενώ MDR-1 έδειξαν αυξημένη έκφραση του uPAR-θετικά κύτταρα που προέρχονται από όλες τις τρεις κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με uPAR-αρνητικά κύτταρα (Εικ. 5Α).

Η έκφραση της CD44 και MDR1 σε uPAR-θετικών και uPAR-αρνητικά κύτταρα. (Α) FACS ανάλυση, H211, H69AR και κυτταρικές σειρές H1417 SCLC διπλά επισημασμένου με uPAR-FITC και CD44-PE, MDR1-ΡΕ. Τα ποσοστά των κυττάρων που εκφράζουν CD44 και MDR1 υπολογίστηκαν χωριστά για uPAR-θετικών και uPAR-αρνητικά κύτταρα. (Β) Φθορίζουσες μικροσκοπική ανάλυση του διπλά επισημασμένου και FACS-ταξινομημένα κύτταρα. Παραδείγματα uPAR-FITC /CD44-PE διπλής επισήμανσης (a, b, c) και uPAR-FITC /MDR1-ΡΕ διπλή επισήμανση (d, e, f). (Bf-ένθετο) H1417 γραμμή κυττάρων βάφονται με ισοτόπου IgG ποντικού ελέγχου-ΡΕ (κόκκινο), ισοτόπου ελέγχου-FITC (πράσινο) και DAPI (μπλε).

Η

Συζήτηση

Η κύριο εύρημα αυτής της μελέτης είναι ο προσδιορισμός ενός σπάνιου υποπληθυσμού uPAR-θετικών κυττάρων σε SCLC κυτταρικές σειρές που προέρχονται από πνεύμονα και μετάσταση στο μυελό των οστών και του εγκεφάλου. Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι uPAR υπερέκφραση σε διάφορους κακοήθεις όγκους συσχετίζεται έντονα με τα περισσότερα επεμβατική φαινοτύπους καρκίνου και φτωχή πρόγνωση [2], [4], [15], [18].

Αρκετές μελέτες προτείνουν η παρουσία ενός σπάνιου πληθυσμού κυττάρων σε στερεούς όγκους και λευχαιμία που διαθέτουν την ικανότητα να αναγεννηθούν και διάδοση του όγκου [19], [20], [21], [22], [23]. Αυτά τα κύτταρα μπορούν επίσης να είναι υπεύθυνη για τη διατήρηση της κακοήθους δυναμικού του όγκου και να χρησιμεύσει ως η υποκείμενη αιτία της επανεμφάνισης του όγκου [24], [25]. Οι τρέχουσες στρατηγικές θεραπείας μπορεί να αποτύχει να στοχεύουν το ανθεκτικών στα φάρμακα υποπληθυσμό, και θα μπορούσε να εξηγήσει την αρχική θεραπευτική ανταπόκριση της πλειοψηφίας των καρκινικών κυττάρων, η οποία ακολουθείται από μια μεταγενέστερη υποτροπή.

Βρήκαμε ότι uPAR-θετικά κύτταρα ήταν πιο ανθεκτική στη θεραπεία με τον κυτταροτοξικό παράγοντα 5-FU, ενώ uPAR-αρνητικά κύτταρα θανατώθηκαν πολύ πιο αποτελεσματικά. Η κυτταροτοξική επίδραση της 5-FU έχει αποδοθεί σε λανθασμένη ενσωμάτωση της fluoronucleotides σε RNA και DNA και στην αναστολή του νουκλεοτιδίου συνθετικών ένζυμο θυμιδυλική συνθάση, που στοχεύει κυρίως τα γρήγορα διαιρούμενα κύτταρα [26]. Ερευνήσαμε επίσης σισπλατίνη και ετοποσίδη, χημειοθεραπευτικά φάρμακα που χρησιμοποιούνται σήμερα στη θεραπεία του SCLC ασθενών. Είναι σημαντικό ότι, η καλλιέργεια των SCLC κυττάρων παρουσία της σισπλατίνης και ετοποσίδη είχε ως αποτέλεσμα επιλεκτική θανάτωση uPAR-αρνητικών κυττάρων με ταυτόχρονη εμπλουτισμό του πληθυσμού uPAR-θετικού κυττάρου.

uPAR-θετικών κυττάρων που απομονώθηκαν από τρεις SCLC γραμμές ήταν σε θέση να πολλαπλασιάζονται και σχηματίζουν πολλαπλές αποικίες σε μεθυλοκυτταρίνη μέσα ενημέρωσης, ενώ uPAR-αρνητικά κύτταρα εμφανίζονται λίγο ή καθόλου κλωνογόνο δυναμικό. Δείξαμε επίσης συν-έκφραση του uPAR με CD44 και MDR1, η οποία μπορεί να εξηγήσει τη σχέση μεταξύ προχωρημένης κακοήθειας και αντοχής φαρμάκου. Αρκετές μελέτες έχουν ερευνήσει το ρόλο ατομικά του υΡΑΚ, CD44 και MDR1 σε διάφορες κακοήθειες [5], [13], [14], [17], [19], 24,27,28,29,30,31,32, ωστόσο, απ ‘όσο γνωρίζουμε αυτή είναι η πρώτη μελέτη που παρέχει αποδείξεις για την έκφραση του CD44 και MDR1 σε uPAR-θετικών κυττάρων σε SCLC. Διαπιστώσαμε επίσης CD44 και έκφραση MDR1 σε uPAR-αρνητικά κύτταρα, οι λειτουργικές επιπλοκές της οποίας απομένει να προσδιοριστεί.

ΑΤΡ-σύνδεσης κασέτας (ABC) μεταφορείς φάρμακο έχει αποδειχθεί ότι προστατεύει τον καρκίνο βλαστικών κυττάρων από χημειοθεραπευτικούς παράγοντες 33 . Μια σημαντική μεταφορέας της οικογένειας ABC είναι Ρ-γλυκοπρωτεΐνη, το προϊόν του γονιδίου MDR1, το οποίο παράγεται από αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα (HSC) 32. το γονίδιο MDR1 γίνεται κάτω ρυθμισμένα σε HSC κατά την κυτταρική διαφοροποίηση 32. Ρ-γλυκοπρωτεΐνη και CD44 έχουν χαρακτηριστεί και είναι γνωστό ότι είναι καθοριστικοί παράγοντες της αντοχής πολυ-φαρμάκου σε καρκινικά κύτταρα, η οποία διαμεσολαβείται από φυσικές και γενετικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ CD44 και MDR1 30. η ενεργοποίηση του CD44 συμβαίνει μέσω ετεροδιμερισμό του CD44 με υποδοχείς αυξητικού παράγοντα (π.χ., EGFR, FGFR, HGFR, VEGFR, ΤΟΡ-βΚ), η οποία οδηγεί στην ενεργοποίηση της ΜΑΡ κινάσης και μονοπάτια σηματοδότησης της ΡΙ3Κ-ΑΚΤ 34. CD44 διέγερση από υαλουρονάνη πρόσδεμά του up-ρυθμίζει την έκφραση του υΡΑ και uPAR mRNA, μέσω της ενεργοποίησης ΜΑΡΚ-Ras οδού , ενώ η ενεργοποίηση της PI3K διεγείρει την έκφραση MDR1 και λειτουργίας 34. PI3K επίσης ενεργεί ως θετικό βρόχο ανάδρασης για την τόνωση της παραγωγής υαλουρονάνη, το οποίο ενεργοποιεί CD44 35,36. Η σηματοδότηση CD44-ΜΑΡΚ-ΡΙ3Κ οδηγεί σε ανεξέλεγκτη έκφραση του υΡΑ /υΡΑΚ και MDR1, το οποίο προωθεί φαινότυπος ανθεκτικός καρκινικών κυττάρων επεμβατική και πολυ-φαρμάκου. Εκτός από την σηματοδότηση CD44-ΜΑΡΚ-ΡΙ3Κ, uPAR υπερέκφραση μπορεί να επάγει την κυτταρική επιβίωση με την ενεργοποίηση του παράγοντα αντι-απόπτωσης Bcl-xL μεταγραφή 17.

Οι μελλοντικές μελέτες σε ζωικά μοντέλα θα αντιμετωπίσει είτε τον uPAR θετικούς κύτταρα είναι υπεύθυνα για την πρωτογενή ανάπτυξη του όγκου και τον σχηματισμό του απομακρυσμένων μεταστάσεων σε SCLC. Συνοπτικά, έχουμε εντοπίσει το uPAR θετικών υποπληθυσμό SCLC κύτταρα που διαθέτουν υψηλή αντοχή πολυ-φαρμάκου και κλωνογονική δραστηριότητα, ενώ οι uPAR-αρνητικά κύτταρα είναι ευαίσθητα σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα και εμφανίζουν μικρή ή καθόλου δραστηριότητα κλωνογόνο. Πρέπει επίσης να παρέχουν αποδείξεις για τη συμμετοχή του υΡΑΚ, CD44 και έκφραση MDR1 σε SCLC κύτταρα. Περαιτέρω έρευνα είναι αναγκαία για να καθορίσει εάν στόχευση αυτού του πληθυσμού κυττάρων θα είναι κρίσιμη για τη θεραπευτική επιτυχία.

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Δρ Kristine Α Justus για την επεξεργασία των εμπειρογνωμόνων του χειρογράφου, Λούσι Μπράουν για βοηθήσει με τις μετρήσεις κυτταρομετρίας ροής και Σόφια Loera για βοήθεια σχετικά με ανοσοϊστοχημικές τεχνικές. Ευχαριστούμε τον Δρ Kemp Kernstine για την παροχή σισπλατίνη και ετοποσίδη. Το έργο αυτό είναι αφιερωμένο στην αγαπημένη μνήμη του Hrach Shahmanyan.