Abstract

Για την ανάπτυξη ορο-διαγνωστικοί δείκτες για καρκίνο του πνεύμονα, δημιουργήσαμε μονοκλωνικά αντισώματα χρησιμοποιώντας πνευμονική αδενοκαρκίνωμα (AD) προερχόμενο Α549 κύτταρα ως αντιγόνα με την χρησιμοποίηση της μεθόδου τυχαίας ανοσοποίηση. Τα υπερκείμενα υβριδώματος ανοσοϊστοχημικά σε διαλογή για αντισώματα με Amex-σταθερές και παρασκευάσματα ενσωματωμένες σε παραφίνη Α549 κυττάρων. Οι θετικοί κλώνοι monocloned δύο φορές μέσω περιοριστικές αραιώσεις. Από τα ληφθέντα μονοκλωνικά αντισώματα, επιλέξαμε ένα αντίσωμα που ορίζεται ως KU-Lu-5 η οποία έδειξε έντονη χρώση της μεμβράνης των κυττάρων Α549. Με βάση την ανοσοκατακρήμνιση και ανάλυση MADLI TOF /TOF-MS, αυτό το αντίσωμα είχε αναγνωριστεί ως καρβονικής ανυδράσης XII (CAXII). Για να αξιολογηθεί η χρησιμότητα αυτού του αντισώματος ως δείκτη ορο-διαγνωστικό για καρκίνο του πνεύμονα, εκτελέσαμε ανάλυση στυπώματος κηλίδας με ένα σύνολο εκπαίδευσης αποτελείται από ορούς από 70 ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα και 30 υγιείς μάρτυρες. Τα επίπεδα έκφρασης CAXII ήταν σημαντικά υψηλότερα σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα από ό, τι στους υγιείς μάρτυρες στο σύνολο εκπαίδευσης (Ρ & lt? 0,0001), και η περιοχή κάτω από την καμπύλη του ROC ήταν 0.794, με 70,0% και ειδικότητα 82,9% ευαισθησία. Σε καρκίνους του πνεύμονα, τα επίπεδα έκφρασης του CAXII ήταν σημαντικά μεγαλύτερη σε ασθενείς με πλακώδες καρκίνωμα (SCC) από ό, τι με την AD (P = 0,035). Επιπλέον, CAXII ήταν σημαντικά υψηλότερη σε καλά και μέτρια διαφοροποιημένο κλώνοι ενός κυττάρου από ό, τι φτωχά διαφοροποιημένο όνες (Ρ = 0,027). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η χρησιμότητα των επιπέδων CAXII ορού ως ορο-διαγνωστικό δείκτη, ένα πρόσθετο σύνολο που αποτελείται από ορούς από 26 ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα και 30 υγιείς ελέγχους διερευνήθηκε επίσης με ανάλυση στυπώματος κηλίδας ως μελέτη επικύρωσης. επίπεδα ορού CAXII ήταν επίσης σημαντικά υψηλότερος σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα σε σχέση με υγιείς μάρτυρες στο σύνολο επικύρωσης (P = 0,030). Έτσι, τα επίπεδα CAXII στον ορό θα πρέπει να εφαρμόζεται δείκτες διάκριση ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα από υγιείς μάρτυρες. Για τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη έκθεση που παρέχει αποδείξεις ότι CAXII μπορεί να είναι ένα μυθιστόρημα ορο-διαγνωστικό δείκτη για τον καρκίνο του πνεύμονα

Παράθεση:. Kobayashi Μ, Matsumoto T, Ryuge S, Yanagita Κ, Nagashio R, Kawakami Υ , et al. (2012) CAXII Είναι μια ορο-διαγνωστικό δείκτη για τον καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 7 (3): e33952. doi: 10.1371 /journal.pone.0033952

Συντάκτης: Vladimir Brusic, Dana-Farber Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 23 Σεπτεμβρίου του 2011? Αποδεκτές: 20 Φεβρουαρίου 2012? Δημοσιεύθηκε: 16 Μαρτίου, 2012

Copyright: © 2012 Kobayashi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε εν μέρει από μια επιχορήγηση-in-ενισχύσεις για Επιστημονικού Συμβουλίου Έρευνας (23590414) από την Ιαπωνία Εταιρείας για την Προώθηση της Επιστήμης, επιχορηγήσεις από το Τρίτο Όρος Έρευνας Ολοκληρωμένη Ελέγχου για τον Καρκίνο που διεξήχθη από το Υπουργείο Υγείας, Εργασίας και Πρόνοιας της Ιαπωνίας , καθώς και από το Ερευνητικό Πρόγραμμα (Αρ 2011-1006) της Σχολής της Allied Επιστημών Υγείας, Πανεπιστήμιο Kitasato. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση που έλαβε για την παρούσα μελέτη

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνου

πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο. , το οποίο περιέχει 13% (1,6 εκατομμύρια ευρώ) του συνόλου των περιπτώσεων καρκίνου και το 18% (1,4 εκατομμύρια) των θανάτων από καρκίνο στον κόσμο το 2008 [1], [2].

δείκτες όγκου έχουν ανιχνευθεί στον ορό , τα ούρα, και ιστών από ασθενείς με κακοήθεις όγκους, και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για μια ακριβή διάγνωση, διάκριση καλοήθων ή κακοήθων όγκων, την παρακολούθηση μετά θεραπείες, και πρόβλεψη της έκβασης του ασθενούς. Προς το παρόν, ορισμένοι ορο-διαγνωστικοί δείκτες που χρησιμοποιούνται για τον καρκίνο του πνεύμονα, όπως το καρκινοεμβρυϊκό αντιγόνο (CEA) και σιαλυλ Lewis Χ αντιγόνο (SLX) για αδενοκαρκίνωμα (AD), και κυτοκερατίνη 19 θραύσμα (Cyfra) και το αντιγόνο πλακώδες καρκίνωμα (SCCa) για πλακώδες καρκίνωμα (SCC) [3]. Οι θετικές τιμές του CEA, SLX, Cyfra και SCCa είναι σύμφωνα με πληροφορίες 57, 40~50, 50~60, και 60-80%, αντίστοιχα. Ωστόσο, έχει αναφερθεί ότι αυτοί οι δείκτες δεν δείχνουν επαρκή όγκο ή όργανο ιδιαιτερότητες? για παράδειγμα, μπορεί να δείξει SLX ψευδώς θετικά αποτελέσματα παρουσία πνευμονική φυματίωση και πνευμονική ίνωση και Cyfra μπορεί να ανυψώσει με διάμεση πνευμονία και νεφρική ανεπάρκεια.

Τα αντισώματα είναι συνήθως αναπτύσσονται με τη χρήση καθαρισμένων πρωτεϊνών ή συνθετικά πεπτίδια. Έχουμε παράγεται εξαντλητικά μονοκλωνικά αντισώματα (MoAbs) έναντι διαφόρων πρωτεϊνών που σχετίζονται με όγκους χρησιμοποιώντας την πνευμονική AD-προερχόμενο κύτταρο Α549 ως ένα αντιγόνο με τη μέθοδο τυχαίας ανοσοποίησης [4], και έχουν πάνω από 1.000 MoAbs ληφθεί [5]. Αυτή η μέθοδος αναμένεται να δημιουργήσει αντισώματα κατά των πρωτεϊνών με όγκο-ειδικό μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, οι οποίες είναι δύσκολο να ληφθούν με συμβατικές μεθόδους ανοσοποίησης.

Η καρβονική ανυδράση XII είναι ένα μεταλλοένζυμο διαμεμβρανική ψευδαργύρου που καταλύει την αναστρέψιμη ενυδάτωση του διοξειδίου του άνθρακα για να σχηματίσουν διττανθρακικό (H

2O + CO

2⇔H

++ ΕΤ

3

-), και είναι μέλος της καρβονικής ανυδράσης οικογένεια άλφα (CA). CAXII έχει προταθεί ότι εμπλέκεται στην αύξηση της οξύτητας του εξωκυτταρικό μικροπεριβάλλον, το οποίο είναι κατάλληλο για την ταχεία ανάπτυξη του όγκου. CAXII υπερέκφραση ανιχνεύθηκε αρχικά σε καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων, και μεταγενέστερες μελέτες επιβεβαίωσαν την έκφραση του σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους, όπως διάχυτη αστροκύτωμα, του μαστού, του παγκρέατος, και καρκίνωμα των ωοθηκών, καθώς επίσης και σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) [6] – [11]. Η έκφρασή του επηρεάστηκε τόσο από παράγοντες που σχετίζονται με τη διαφοροποίηση και την υποξία σε καρκίνο μαστού

in vivo

, και συνδέθηκε με μια ευνοϊκότερη πρόγνωση σε ασθενείς διηθητικό καρκίνωμα του μαστού [12]. Υψηλότερη έκφραση CAXII επίσης συσχετίστηκε με καλύτερη συνολική και συγκεκριμένες ασθένειες επιβίωση σε ασθενείς με χειρουργήσιμο ΜΜΚΠ [13]. Ωστόσο, καμία μελέτη δεν έχει αποσαφηνιστεί CAXII σε ορούς και την κλινική χρησιμότητα της ως δείκτη ορο-διαγνωστικό για ασθενείς με κακοήθεις όγκους.

Σε αυτή τη μελέτη, η ειδικότητα του ληφθέντος αντίσωμα αντι-CAXII επιβεβαιώθηκε με ανοσοϊστοχημεία (IHC ) και ανοσοκηλίδωση με κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα και των ιστών του καρκίνου του πνεύμονα. Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω τη χρησιμότητά του ως ορο-διαγνωστικό δείκτη, τα επίπεδα CAXII σε ορούς από ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα μελετήθηκαν με ανάλυση κηλίδας dot.

Υλικά και Μέθοδοι

1. Οι κυτταρικές σειρές

Το Α549 και κύτταρα LC-2 /διαφήμιση προέρχεται από πνεύμονα μ.Χ. αγοράστηκαν από την ιαπωνική Cancer Research Τράπεζα Πόρων (Τόκιο, Ιαπωνία) και RIKEN Bioresource Κέντρο (Ibaraki, Japan), αντίστοιχα. Τα κύτταρα ΕΚΦΤ-LC-AI που προέρχονται από πνεύμονα SCC αγοράστηκε από την Bioresource Κέντρου RIKEN. Τα κύτταρα που προέρχονται από N231 SCLC αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). LCN1, ένα μεγάλο καρκίνωμα νευροενδοκρινικά (αυτήν των άτυπων) γραμμή, ιδρύθηκε το εργαστήριό μας [14]. Αυτά τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε RPMI-1640 (Sigma, Steinheim, Germany) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS? Biowest, Miami, FL, USA), 100 μονάδες /ml πενικιλλίνης και 100 μg /ml στρεπτομυκίνης ( GIBCO, Όκλαντ, Νέα Ζηλανδία). Μετά τη συγκομιδή και πλύση δύο φορές με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό χωρίς δισθενή ιόντα (PBS-), υπο-συρρέοντα κύτταρα αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C για ανάλυση πρωτεομική ή σταθεροποιούνται σε 10% φορμαλίνη και εγκλείστηκαν σε παραφίνη για ανοσοϊστοχημεία. κύτταρα Α549 επίσης Amex-σταθερή [15] για την ανοσοϊστοχημική εξέταση. Τα /κυττάρων O-Ag14 SP2 που προέρχεται από ένα μυέλωμα ποντικού αγοράστηκαν από την Bioresource Κέντρο RIKEN, και αναπτύχθηκαν σε μέσο RPMI-1640 συμπληρωμένο με 1 χ 8-αζαγουανίνη (50 × Hybri-Max, SIGMA), 10% FBS, πενικιλίνη , και στρεπτομυκίνη.

2. Ηθική δήλωση

Όλα τα δείγματα που συλλέγονται σύμφωνα με τις ηθικές κατευθυντήριες γραμμές και γραπτή συγκατάθεση εντολή, και η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Kitasato Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου. Όλοι οι ασθενείς και υγιείς μάρτυρες προσεγγίστηκαν με βάση την εγκεκριμένη ηθικές κατευθυντήριες γραμμές, καθώς και εκείνοι που συμφώνησαν να συμμετάσχουν σε αυτή τη μελέτη ήταν υποχρεωμένοι να υπογράψουν έντυπα συγκατάθεσης. Οι ασθενείς θα μπορούσαν να αρνηθούν την είσοδο και να διακόψει τη συμμετοχή ανά πάσα στιγμή. Όλοι οι συμμετέχοντες παρείχαν έγγραφη συγκατάθεση.

2.1. Οι οροί

Οροί από 70 ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα. (AD: 29, SCC: 21, SCLC: 17, και αυτήν των άτυπων: 3) και 30 υγιείς μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν στο σύνολο εκπαίδευσης. Επιπλέον, ένας επικύρωσης που αποτελείται από ορούς από 26 ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα (AD: 20, SCLC: 5, και αυτήν των άτυπων: 1) και 30 υγιείς μάρτυρες μελετήθηκε επίσης. Τα κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά των δεδομένων ασθενών συνοψίζονται στον Πίνακα 1.

Η

Ασθενής οροί συλλέχθηκαν στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Kitasato και υγιείς οροί ελέγχου που παρέχονται από την Kyowa Medex Co., Ltd. (Tokyo, Japan) και διατηρήθηκε στους -80 ° C μέχρι τη χρήση.

3. Παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων

λύμα κυττάρου Α549 παρασκευάστηκε με PBS (-) χρησιμοποιώντας ένα υπερηχητικό ομογενοποιητή (UH-50? SMT Company, Tokyo, Japan). Πέντε εβδομάδων θηλυκούς ποντικούς BALB /c ανοσοποιήθηκαν ενδοπεριτοναϊκώς με 50 mg υγρο- βάρος του Α549 κυτταρικής λύσης σε 500 μΙ PBS (-) 3 φορές, με διάστημα δύο εβδομάδων. Ο τίτλος του αντισώματος ελέγχθηκε με IHC χρησιμοποιώντας 100 φορές αραιωμένο ορό από τα ανοσοποιημένα ποντίκια ως το πρώτο αντίσωμα επί Amex-σταθεροποιημένα κύτταρα Α549. Τρεις ημέρες πριν από τη σύντηξη των κυττάρων, το ζώο με τον υψηλότερο τίτλο ήταν ενδο-περιτοναϊκά ενισχυμένα από την ίδια ποσότητα υλικού λύσεως Α549. παρασκευή υβριδωμάτων και διαλογή IHC με Amex-στερεωμένα κύτταρα Α549 που περιγράφηκε προηγουμένως [4], [5].

4. Πρωτεομική ανάλυση

4.1. δωδεκυλ νατρίου ηλεκτροφόρηση πηκτής θειικό πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE).

πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν από κάθε ένα από Α549, LC-2 /διαφήμιση, ΕΚΦΤ-LC-AI, N231, και LCN1 κυττάρων με ρυθμιστικό απορρυπαντικό λύσης [16 ] χρησιμοποιώντας ένα υπερηχητικό ομογενοποίησης. Δέκα μg από κάθε εκχύλιση πρωτεϊνών έβρασαν και διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE με 10% πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου σε σταθερό ρεύμα 20 mA. Μετά SDS-PAGE, οι πρωτεΐνες σε πηκτώματα μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) (Millipore Corp., Billerica, ΜΑ, USA) για ανοσοκηλίδωση.

4.2. Ανοσοκηλίδωση.

Λεκιάζοντας μεμβράνες αποκλείσθηκαν με 0,5% καζεΐνη από το γάλα βοοειδών (Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι μεμβράνες στη συνέχεια αντιδρά με υπερκείμενο μη αραιωμένο υβριδώματος επί 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, που ακολουθείται από επώαση με 1000-φορές αραιωμένο υπεροξειδάση αρμορακίας-συζευγμένο αντι-ποντικού IgG πολυκλωνικού αντισώματος κουνελιού (Dako, Glostrup, Denmark) με 0,025% καζεΐνη για 45 λεπτά σε RT. Τέλος, τα σήματα αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Immobilon Δυτική HRP (Millipore Corp.).

4.3. Προσδιορισμός ισοτύπου αντισώματος.

Για να προσδιορισθεί ο ισότυπος της καθιερωμένης KU-Lu-5 αντίσωμα, χρησιμοποιήσαμε την Isostrip ™ μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού ισοτύπου Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

4.4. Ανοσοκαταβύθιση.

Ο μέθοδο ανοσοκαταβύθισης χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη αυτή περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Εν συντομία, τα κύτταρα Α549 πλένονται με PBS (-) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με δοκιμασία ραδιοανοσοκατακρήμνισης (RIPA) ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει Complete-mini EDTA-free (Roche Diagnostics) σε πάγο για 30 λεπτά. Μετά από φυγοκέντρηση στις 15.000 rpm για 30 λεπτά στους 4 ° C, το υπερκείμενο συλλέχθηκε και προκαταρκτική διαύγαση με πρωτεΐνη G-Sepharose (50% πολτός) (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ, USA) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Για να συζευχθεί το πρωτογενές αντίσωμα, 250 μL του πρωτογενούς αντισώματος (KU-Lu-5 υπερκείμενο υβριδώματος) και 20 μί σφαιριδίων σεφαρόζης G πρωτεΐνη αιωρούνται σε ρυθμιστικό διάλυμα RIPA επωάστηκαν με ανάμιξη στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Μετά από φυγοκέντρηση, το προϊόν σύζευξης αντίσωμα-Sepharose και 500 μg ολικής κυτταρικής πρωτεΐνης από την προκαταρκτική διαύγαση υπερκείμενο επωάστηκαν με ανάμιξη στους 4 ° C για 4 ώρες. Τα ανοσοϊζήματα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στις 15.000 rpm για 5 λεπτά στους 4 ° C. Μετά από πλύση τέσσερις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα RIPA, το υπερκείμενο απομακρύνθηκε προσεκτικά και τα ιζήματα επαναιωρήθηκαν σε 15 μΐ 1 χ ρυθμιστικού Laemmili του. Στη συνέχεια, 15 μλ δείγματα έβρασαν και διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE με 10% πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου. Μετά την SDS-PAGE, τα πηκτώματα Ζη-βάφτηκαν με τον αρνητικό κιτ Gel Stain MS (Wako Pure Chemical, Tokyo, Japan) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

4.5. Ταυτοποίηση των πρωτεϊνών αντιγόνου.

4.5.1. In-gel χώνευση.

Η κηλίδα πρωτεΐνη αποκόπηκε από την πηκτή SDS-PAGE και κιμά έως 1 mm

3, αποχρωματίζονται με διάλυμα αποχρωματισμού (Wako Pure Chemical), αφυδατωμένο με 100% (ν /ν) ACN, και ξηραίνεται υπό συνθήκες κενού. Θρυπτική πέψη διεξήχθη με ελάχιστο όγκο του διαλύματος πέψης το οποίο περιείχε 20 ng /μl θρυψίνης (θρυψίνη Gold, Φασματομετρία Μάζας Grade, Promega, Madison, WI, USA) και 25 mM ΝΗ

4HCO

3 για 24 ώρες στους 37 ° C. Μετά την επώαση, πέψη πρωτεϊνικά θραύσματα εκλούστηκαν σε διάλυμα συλλέχθηκαν, και τα πηκτώματα πλύθηκαν μία φορά σε 5% (ν /ν) τρ ιφθοροξ ικού οξέος /50% (ν /ν) ACN και συλλέγονται στο ίδιο σωληνάριο.

4.5.2. . Αναγνώρισης Protein

Τα συλλεχθέντα πεπτιδικά θραύσματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας autoflex III μήτρας που σχετίζονται με εκρόφηση λέιζερ /ιονισμός-χρόνος πτήσεως /ώρα πτήσεως σπεκτρομετρίας μάζης (MALDI-TOF /TOF MS? Bruker Daltonik, Βρέμη, Γερμανία). Μια μίας χρήσης πλάκα, εντόπισε α-κυανο-4-υδροξυκινναμωμικού οξέος για τα δείγματα, και PAC Peptide Calibstandard για τη βαθμονόμηση (Prespotted AnchorChip 96 σετ για Πρωτεϊνωματική, Bruker Daltonik) χρησιμοποιήθηκαν. Πεπτίδιο δακτυλικά αποτυπώματα μάζας (PMF) μετρήθηκαν και στη συνέχεια μερικές κορυφές που λαμβάνονται από PMF περαιτέρω μετρήθηκαν για τα διαδοχικά φάσματα μάζας τους ως μητρική μάζες. ΜΑΣΚΩΤ (https://www.matrixscience.com) χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων IPI Ανθρώπου (93.289 ακολουθίες? 36.994.704 υπολείμματα), που κυκλοφόρησε στις 3 Μαΐου, 2011 (https://www.matrixscience.com), χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των πρωτεϊνών από PMF και τα δεδομένα παράλληλα μάζα.

5. Η ανάλυση ανοσοστυπώματος με ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη CAXII

Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη CAXII και πρωτεΐνη Αφροδίτης ως αρνητικός έλεγχος με GST-tag παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας ένα απαλλαγμένο από κύτταρα σύστημα φύτρου σιταριού [18]. Δεκατέσσερα μg κάθε ανασυνδυασμένων CAXII και πρωτεΐνες Αφροδίτης έβρασαν και διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE, ακολουθούμενη από ανοσοστύπωμα με KU-Lu-5 αντίσωμα, όπως αναφέρεται στο σημείο 2.4.1.

6. Ανοσοϊστοχημική χρώση

Three-μm πάχους τομές, κατασκευασμένο από 10% σταθεροποιημένο με φορμαλίνη και εγκλεισμένα σε παραφίνη κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα και 37 χειρουργικά καρκίνων του πνεύμονα (AD: 28, SCC: 9) αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο, επανυδατωθεί σε μια σειρά αιθανόλης κατιόντα, και στη συνέχεια κατεργάζεται με υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% επί 20 λεπτά. Αφού το αντιγόνο ανακτήθηκε σε αυτόκαυστο σε 0.01 mol ρυθμιστικού /κιτρικό L (ρΗ 6,0) με 0,1% Tween 20 στους 121 ° C για 10 λεπτά, οι τομές αντέδρασαν με μη αραιωμένο-5 KU-Lu υπερκείμενο υβριδώματος για 16-18 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου (RT). Μετά το ξέπλυμα σε TBS τρεις φορές για 5 λεπτά η κάθε μία, οι τομές αντέδρασαν με αντιδραστήριο ChemMate Envision (Dako) επί 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, οι τομές έγιναν ορατά με σταθερό διάλυμα DAB (Invitrogen Corp.) και με αιματοξυλίνη Mayer του.

7. dot blot ανάλυση

7.1. Η προετοιμασία των δειγμάτων.

7.1.1. Απομάκρυνση της λευκωματίνης και IgG από δείγματα ορού.

Η άρση της λευκωματίνης και IgG από ορούς εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ProteoExtract αλβουμίνη /IgG kit αφαίρεσης (Merck, Darmstadt, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ένα δείγμα 60-μί κάθε ορούς αραιώνεται με 540 μL ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης, και αφήνεται να περάσει τη στήλη με ροή βαρύτητας. Το κλάσμα ροής διαμέσου συλλέχθηκε σε ένα σωλήνα συλλογής. Για να πλύνετε τη στήλη, ρυθμιστικού διαλύματος σύνδεσης αφέθηκε να περάσει τη στήλη με ροή βαρύτητας. Το κλάσμα ροής διαμέσου συλλέχθηκαν στον ίδιο σωλήνα συλλογής.

7.1.2. Η αφαλάτωση και συμπύκνωση με υπερδιήθηση.

Η αλβουμίνη και IgG-εξαντλημένο δείγματα ήταν ρυθμιστική-ανταλλαγή και συμπυκνώθηκαν χρησιμοποιώντας 10-kDa μοριακού βάρους αποκοπής VIVASPIN υπερδιήθηση 2 (Sartorius, Gottingen, Γερμανία). Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 6000 χ g στους 4 ° C μέχρι λιγότερο από 100 μL, και στη συνέχεια ανταλλάχθηκε το ρυθμιστικό για PBS (-) με συγκέντρωση 6000 χ g στους 4 ° C μέχρι συμπυκνώθηκε σε λιγότερο από 50 μL. Τα συμπυκνωμένα δείγματα ρυθμίστηκαν σε έναν τελικό όγκο 60 μι με PBS (-).

7.2. Η ανάλυση στυπώματος Dot

Ένα μΙ κάθε ένα από αλβουμίνη και IgG-εξαντλημένο δείγματα αραιώνονται έως 1:20 με PBS. (-) και IgG ποντικού (καθαρισμένο στο εργαστήριό μας) για θετικό έλεγχο κηλιδώθηκαν σε μια μεμβράνη PVDF (Millipore Corp.) με τη χρήση του συστήματος αυτόματης dot blot με ένα 256-στερεού διαμόρφωση ακίδων (Kakengeneqs Inc., Chiba, Japan). Δύο φύλλα μεμβράνης προετοιμάστηκαν για ένα σετ του πειράματος. Spotted μεμβράνες πλύθηκαν σε TBS για 10 λεπτά, και αποκλείστηκαν με 0.5% καζεΐνη (Sigma) για 1 ώρα σε RT. Μία μεμβράνη στη συνέχεια αντέδρασε με μη αραιωμένο υπερκείμενο υβριδώματος KU-Lu-5, και η άλλη μεμβράνη αντέδρασε με διάλυμα αραίωσης αντισώματος [20-φορές αραιωμένο 0,5% καζεΐνη με 0,1% Tween 20 προστέθηκε TBS (TBS-T)] για 30 min σε RT. Μετά το ξέπλυμα σε TBS-T 3 φορές για 5 λεπτά η κάθε μία, οι μεμβράνες επωάστηκαν με αντι-ποντικού IgG πολυκλωνικού αντισώματος 1000-φορές αραιωμένο συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας κουνελιού (Dako) επί 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, τα σήματα αναπτύχθηκαν με Immobilon Western αντιδραστήριο (Millipore Corp.). Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας DotBlotChipSystem Ver. 4.0 (Dynacom Co., Ltd., Chiba, Japan). Κάθε κανονικοποιημένο σήμα παρουσιάστηκε ως ο λόγος του θετικού ένταση έναντι του αρνητικού ένταση φόντο.

8. Στατιστική ανάλυση

Τα επίπεδα ορού CAXII σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα και υγιείς μάρτυρες αναλύθηκαν στατιστικά χρησιμοποιώντας το Mann-Whitney

U

-test. Ευαισθησία, ειδικότητα και προγνωστική αξία υπολογίστηκαν με το πακέτο λογισμικού SPBS (Ver. 9.42 για Windows) για κάθε μεταβλητή σε ένα αντίστοιχο cut-off. Διαχωριστική ανάλυση της λειτουργίας διεξήχθη για να κατατάξει τους ασθενείς στο «καρκίνο του πνεύμονα» εναντίον ομάδας «υγιή ελέγχου», σύμφωνα με την κατάσταση των βιοδεικτών, χρησιμοποιώντας το πακέτο λογισμικού SPBS. Η περιοχή κάτω από την καμπύλη (AUC) και το καλύτερο σημείο αποκοπής υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας λειτουργικού χαρακτηριστικού δέκτη ανάλυση (ROC). Τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν σημαντικά όταν

P

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

1. Επιβεβαίωση τίτλου αντισώματος σε ποντίκι ορούς

Ο τίτλος του αντισώματος ελέγχθηκε με IHC με 1000-φορές αραιωμένο ορό ανοσοποιημένων ποντικών ως το πρώτο αντίσωμα επί Amex-σταθεροποιημένα κύτταρα Α549. Ως αποτέλεσμα, οι οροί από ανοσοποιημένους ποντικούς περιείχαν αντισώματα που αντέδρασαν με διάφορα συστατικά των κυττάρων Α549.

Χρησιμοποιώντας Amex-σταθερών παρασκευασμάτων Α549 κυττάρου για την ανοσοϊστοχημική διαλογή υβριδωμάτων, ιδρύσαμε τελικά 188 MoAbs συνολικά και μια περαιτέρω μελέτη διεξήχθη με την KU-Lu-5 κλώνος, ο οποίος έδειξε έντονη χρώση σε κύτταρα Α549 (Σχ. 1 Α).

(Α) Ο τίτλος του αντισώματος ελέγχθηκε ανοσοϊστοχημικά χρησιμοποιώντας 1000-φορές αραιωμένους ορούς ανοσοποιημένων ποντικών ως το πρώτο αντίσωμα επί Amex σταθεροποιημένα κύτταρα Α549, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ως ανοσογόνο. Οι οροί ανοσοποιημένων ποντικών περιείχαν αντισώματα που αντέδρασαν με διάφορα συστατικά του κυττάρου, όπως τον πυρήνα (↑), μεμβράνη πλάσματος (▴), και κυτόπλασμα (↑↑). (Β) Ανοσοκαταβύθιση με KU-Lu-5 αντίσωμα. ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως με τη χρήση υπερκείμενου υβριδώματος KU-Lu-5 ως το πρώτο αντίσωμα [λωρίδα 1: Α549 λύμα, λωρίδα 2: Α549 λύματος σε συνδυασμό με την πρωτεΐνη G, λωρίδα 3: KU-Lu-5 αντίσωμα σε συνδυασμό με πρωτεΐνη G, λωρίδα 4: λύμα Α549 σε συνδυασμό με την KU-Lu-5 αντίσωμα]. Οι διαδρομές 2 έως 3 είναι αρνητικά δείγματα αναφοράς, και ανοσοκαταβυθίστηκαν προϊόν με KU-Lu-5 αντίσωμα ανιχνεύθηκε σε λωρίδα 4 (↑). (C) Επιβεβαίωση προσδιορίζονται πρωτεΐνης αντιγόνου. KU-Lu-5 αντίσωμα αντέδρασε με ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη CAXII (64 kDa), αλλά όχι με ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη Αφροδίτης.

Η

2. Ταυτοποίηση πρωτεϊνών αντιγόνου

Για να προσδιοριστεί η πρωτεΐνη αντιγόνο που αναγνωρίζεται από το αντίσωμα KU-Lu-5, εκτελέσαμε IP με κυτταρόλυμα από κύτταρα Α549. Τα αποτελέσματα της έρευνας που φαίνεται στο Σχ. 1 Β, C. Η αντιγονική πρωτεΐνη παρατηρήθηκε σε περίπου 40 kDa. Για να προσδιοριστεί η αντιγονική πρωτεΐνη που αναγνωρίζεται από KU-Lu-5 αντισώματος, που αποκόπηκαν και συλλέχθηκε το σημείο από το Zn-χρωματισμένο ζελέ, και προχώρησε με την πέψη σε γέλη. Μετά την ανάλυση χρησιμοποιώντας ένα MALDI-TOF /TOF MS και μια αναζήτηση ΜΑΣΚΩΤ, η πρωτεΐνη προσδιορίστηκε ως ισομορφή 2 της καρβονικής ανυδράσης XII (CAXII, ένταξη: IPI00221392), η οποία αποτελείται από 343 αμινοξέα με ένα προβλεπόμενο μοριακό βάρος του 38.384 Da. Το αποτέλεσμα επιβεβαιώθηκε με ανοσοστύπωμα ανάλυση με ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη CAXII χρησιμοποιώντας KU-Lu-5 υπερκείμενο υβριδώματος ως το πρώτο αντίσωμα (σχ. 1 D). Ο ισότυπος ανοσοσφαιρίνη της KU-Lu-5 αντισώματος προσδιορίστηκε ως IgG

1, κ.

3. Ανάλυση ανοσοκηλίδας

Η έκφραση της CAXII ανιχνεύθηκε μόνο σε Α549 κύτταρα ως περίπου πρωτεΐνη 40-kDa, και δεν υπάρχει σαφής ζώνη ανιχνεύθηκε σε άλλα κύτταρα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη (Εικ. 2 Α).

(Α) Ανοσοστύπωμα ανάλυση CAXII σε καρκινικές κυτταρικές σειρές πνεύμονα. CAXII ανιχνεύθηκε ως μια περίπου 40-kDa πρωτεΐνη με κύτταρα Α549. (Β) Η ανοσοχρώση CAXII σε Α549 κύτταρα (α), αδενοκαρκίνωμα (β), και το καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (γ) του πνεύμονα, και το καθένα έδειξε μεμβρανώδη χρώση CAXII.

Η

4. Η ανοσοϊστοχημική χρώση για CAXII

ανοσοϊστοχημικώς, μεμβρανώδη έκφραση CAXII παρατηρήθηκε μόνο σε κύτταρα Α549 (Εικ. 2 Β). Μεμβρανώδης ανιχνεύθηκε χρώση σε 2 από τα 28 διαφημίσεων (7,1%) και σε 2 από τις 9 κλώνοι ενός κυττάρου (22,2%) (Σχ. 2 C, D).

5. Ορός CAXII σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα

Τα επίπεδα CAXII ορού ήταν σημαντικά υψηλότερα σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα σε σχέση με υγιείς μάρτυρες στο σύνολο εκπαίδευσης (P & lt? 0,0001). Οι σχετικές τιμές των επιπέδων στον ορό CAXII κυμαίνονταν από 0,101 να 4,01 (διάμεσος: 1.520) σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα, αλλά 0,006 να 1.679 (διάμεση τιμή: 0,290) σε υγιείς μάρτυρες (Εικ. 3 Α). Στον καρκίνο του πνεύμονα, τα επίπεδα ορού των ασθενών CAXII SCC ήταν σημαντικά υψηλότερα από αυτά των ασθενών με AD (P = 0,03) (Σχ. 3 Α). Η περιοχή κάτω από την καμπύλη ROC (AUC) μεταξύ των καρκίνων του πνεύμονα και των υγιών μαρτύρων ήταν 0,794 (Εικ. 3 Β). Όταν εφαρμόστηκε μια βέλτιστη τιμή αποκοπής 0,387 για CAXII, η διαγνωστική ευαισθησία και ειδικότητα για τον καρκίνο του πνεύμονα ήταν 82,9 και 70,0, αντίστοιχα, και τα αρνητικά και θετικά προγνωστική τιμές ήταν 0,617 και 0,863, αντίστοιχα. Επιπλέον, εντός κλώνοι ενός κυττάρου, τα επίπεδα CAXII ορού ήταν σημαντικά υψηλότερα σε ασθενείς με καλά και μέτρια διαφοροποιημένο όγκους από εκείνα με χαμηλή διαφοροποίηση όνες (Ρ = 0,027) (Σχ. 4 Α), και έτεινε να είναι υψηλότερη σε ασθενείς με το μέγεθος του όγκου του λιγότερο από 3 cm και όχι περισσότερο από 3 cm (Ρ = 0.0538). Ωστόσο, δεν υπήρχε διαφορά στην ιστορία του καπνίσματος των ασθενών (Εικ. 4 Β). επίπεδα CAXII στο στάδιο Ι, ΙΙ, και ΙΙΙ διαφημίσεις ήταν 1.501, 0.704 και 1.001, αντίστοιχα, και τα επίπεδα CAXII στο στάδιο Ι, ΤΣΡ ΙΙ, και ΙΙΙ ήταν 1.764, 2.093 και 1.854, αντίστοιχα. Τα στοιχεία αυτά συνοψίζονται στον Πίνακα 2. Δεν σχέσεις μεταξύ των επιπέδων CAXII στον ορό και το στάδιο του όγκου ή η παρουσία της μετάστασης εντοπίστηκαν είτε για διαφημίσεις ή κλώνοι ενός κυττάρου. Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η χρησιμότητα των επιπέδων CAXII ορού ως ορο-διαγνωστικό δείκτη, 56 επιπλέον δείγματα ορών αναλύθηκαν με ανάλυση στυπώματος κηλίδας ως μελέτη επικύρωσης. Τα επίπεδα CAXII ορού ήταν σημαντικά υψηλότερα σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα σε σχέση με υγιείς μάρτυρες στο σύνολο επικύρωσης (P = 0,030). Οι σχετικές τιμές των επιπέδων στον ορό CAXII κυμαίνονταν από 0,000 να 8.023 (διάμεση τιμή: 3,921) σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα, αλλά 0,000 να 8.331 (διάμεση τιμή: 2,806) σε υγιείς μάρτυρες (Εικ. 5). Όταν ένα βέλτιστο τιμή αποκοπής των 3.086 για την εφαρμοσμένη, η διαγνωστική ευαισθησία και ειδικότητα για τον καρκίνο του πνεύμονα ήταν 65,4 και 70,0, αντίστοιχα.

Τα επίπεδα ορού CAXII σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα και υγιών μαρτύρων. (Α) Το μεσαίο επίπεδο CAXII στους ορούς από υγιείς ελέγχους ήταν 0.29, και ότι σε ορούς από ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα ήταν 1,52. Τα επίπεδα ορού CAXII ήταν σημαντικά υψηλότερα σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα (* Ρ & lt? 0.001). Επιπλέον, τα επίπεδα CAXII ορού ήταν υψηλότερα σε ΤΣΡ από τις διαφημίσεις (** P = 0,0381). (Β) Δέκτης-λειτουργικό χαρακτηριστικό ανάλυση καμπύλης των CAXII ως δείκτης ορού για καρκίνο του πνεύμονα. Οι αντίστοιχες περιοχές κάτω από τις καμπύλες ήταν 0,794 για CAXII. Με ειδικότητα 70,0%, η ευαισθησία των CAXII για τον καρκίνο του πνεύμονα ήταν 82,9%, σε μια τιμή αποκοπής που αντιστοιχεί σε 0.387.

Η

(Α) επίπεδα CAXII σε ορούς από ασθενείς με διαφημίσεις και κλώνοι ενός κυττάρου με εστίαση στη σκηνή και τη διαφοροποίηση. Σε ΕΕΑΚ επίπεδα CAXII ήταν σημαντικά υψηλότερα στα καλά και μέτρια διαφοροποιημένα όγκους σε σχέση με ελάχιστα διαφοροποιημένα αυτά (*** P = 0.0272). Στις διαφημίσεις, δεν ανιχνεύθηκε σημαντική διαφορά με βάση το βαθμό διαφοροποίησης. (Β) το ιστορικό καπνίσματος σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα. Το μεσαίο επίπεδο CAXII στους ορούς από τους μη καπνιστές ήταν 1,56, και ότι οι καπνιστές ήταν 1,54, που δεν παρουσιάζει σημαντική διαφορά.

Η

Για να επιβεβαιώσετε τη χρησιμότητα των επιπέδων CAXII ορού ως ορο-διαγνωστικό δείκτη, 56 επιπλέον οροί αναλύθηκαν με ανάλυση στυπώματος κηλίδας ως μελέτη επικύρωσης. Τα επίπεδα CAXII ορού ήταν σημαντικά υψηλότερα σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες (P = 0,030). Σχετικές τιμές των επιπέδων CAXII ορού κυμαίνονταν 0,000 – 8,023 (διάμεση τιμή: 3,921) σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα, αλλά και 0,000 – 8,331 (διάμεση τιμή: 2,806) σε υγιείς μάρτυρες

Η

Συζήτηση

.

σε αυτή τη μελέτη, με στόχο να ανακαλύψει χρήσιμες ορο-διαγνωστικοί δείκτες για καρκίνο του πνεύμονα, δημιουργήσαμε μονοκλωνικά αντισώματα χρησιμοποιώντας πνεύμονα AD-προερχόμενα κύτταρα Α549 ως αντιγόνα. Από τα λαμβανόμενα 188 αντισώματα, επικεντρωθήκαμε σε ένα αντίσωμα που αναγνωρίζει CAXII, και να διερευνηθούν κλινική χρησιμότητα του ως δείκτη ορο-διαγνωστικές για τον καρκίνο του πνεύμονα. Αυτή η μέθοδος τυχαίας ανοσοποίησης αναμένεται να αποδώσει αντισώματα έναντι ογκο-ειδικών πρωτεϊνών με μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, οι οποίες είναι δύσκολο να ληφθούν με συμβατικές μεθόδους ανοσοποίησης. Στην πραγματικότητα, αρκετοί συγγραφείς έχουν αναφέρει ότι τα μονοκλωνικά αντισώματα που παράγονται από αυτή τη μέθοδο είναι χρήσιμα ως διαγνωστικοί και προγνωστικοί δείκτες για καρκίνους [5], [17], [19]. Battke

et al.

[20], θέσπισε ένα αντίσωμα που αναγνωρίζει 6A10 CAXII χρησιμοποιώντας παρόμοια μεθοδολογία ανοσοποίησης. Ωστόσο, τα ληφθέντα αντισώματα περιορίζονταν σε αυτές μόνο που αντιδρούν με αντιγόνα κυτταρικής επιφάνειας, λόγω της χρήσης κυτταρομετρίας ροής για την διαλογή υβριδωμάτων. Στην παρούσα μελέτη, τα υβριδώματα υποβλήθηκαν σε διαλογή ανοσοϊστοχημικά που διευκόλυναν την απόκτηση των αντισωμάτων που αντιδρούν με σχετιζόμενο με τον όγκο πρωτεΐνες εντοπισμένες σε διάφορες ενδο-κυτταρικά διαμερίσματα. Το CAS αποτελούν μια οικογένεια πανταχού ενζύμων με σημαντικούς ρόλους σε πολλές φυσιολογικές και παθολογικές διαδικασίες που καταλύουν αντίστροφα τη μετατροπή του CO

2 + H

2O με την ΕΤ

3

– και H

+ , συμβάλλοντας στην ρύθμιση της ενδοκυτταρικής pH [6] – [11], [19]. Αρκετές κλινικές μελέτες έχουν δείξει μια σαφή σχέση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης υψηλής CAXII στα καρκινικά κύτταρα και μια ευνοϊκή πρόγνωση.

Watson

et al.

[12] ανέφερε ότι CAXII εκφράστηκε στο 75% της διεισδυτικής περιπτώσεις καρκινώματος του μαστού, και σχετίζεται σημαντικά με χαμηλότερη ιστολογική βαθμός (Ρ = 0,001), η θετική κατάσταση των οιστρογονικών υποδοχέων (Ρ & lt? 0,01), και αρνητικές υπερέκφραση του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (Ρ & lt? 0.001). Χρησιμοποιώντας μονοπαραγοντική ανάλυση, CAXII-θετικούς όγκους συσχετίστηκαν με χαμηλότερο ποσοστό υποτροπής (P = 0.04) και ένα καλύτερο λειτουργικό σύστημα (P = 0,01). Από την άλλη πλευρά, αν και το 98% των αστροκυτώματα ήταν ανοσοϊστοχημικά θετικά για CAXII, τα επίπεδα έκφρασης υψηλότερα CAXII συσχετίστηκαν με υψηλότερη ιστολογικό βαθμό και μια φτωχότερη έκβαση ασθενή είτε με μονοπαραγοντική (Ρ = 0,010) ή πολυμεταβλητών (Ρ = 0,039) ανάλυση επιβίωσης [ ,,,0],9].

Μια ανοσοϊστοχημική μελέτη της έκφρασης των CAXII στον καρκίνο του πνεύμονα αναφέρθηκε από Ilie

et al.

[13]. CAXII υπερέκφραση παρατηρήθηκε σε 105/555 περιπτώσεις, και σχετίζεται σημαντικά με καλύτερη διαφοροποίηση (P = 0.015) και SCC ιστολογικό τύπο (P & lt? 0.001). Επιπλέον, η έκφραση υψηλού CAXII επίσης συσχετίστηκε σημαντικά με καλύτερη συνολική και συγκεκριμένες ασθένειες επιβίωσης. Από τα αποτελέσματά μας, τα επίπεδα CAXII ήταν υψηλότερα σε ορούς από SCC ασθενείς από τις διαφημίσεις (Εικ. 3 Α). Επίσης, αυτοί συσχετίζονται περισσότερο ευνοϊκά με διαφοροποίηση (Εικ. 4 Α). Η ενσωμάτωση αυτών των αποτελεσμάτων, CAXII μπορεί όχι μόνο να είναι ένας δείκτης ιστού υποψήφιος, αλλά και ένας δείκτης ορο-διαγνωστικές για τον καρκίνο του πνεύμονα.

Αν και έχει αναφερθεί η συσχέτιση της έκφρασης CAXII και κλινικοπαθολογική παράγοντες και την έκβαση των ασθενών σε διαφορετικούς όγκους, με τις γνώσεις μας, καμία μελέτη σχετικά με τα επίπεδα της πρωτεΐνης CAXII ορού ή τα επίπεδα αυτοαντισωμάτων σε ασθενείς με όγκους έχει αναφερθεί.

για να επιβεβαιώσετε τη δυνατότητα CAXII ως ορο-διαγνωστικό δείκτη, μετρήσαμε τα επίπεδα στον ορό σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα και υγιών μαρτύρων. Δείξαμε ότι η πρωτεΐνη CAXII έρευσε έξω στον ορό και τα επίπεδα της σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα ήταν σημαντικά υψηλότερα από ό, τι στους υγιείς μάρτυρες και στα δύο σετ εκπαίδευσης (Ρ & lt? 0,0001) και σετ επικύρωσης (Ρ = 0,030). Είναι πιθανό ότι το χάσμα στο P-τιμή μεταξύ του σετ εκπαίδευσης που και επικύρωσης προκαλείται από το γεγονός ότι τα επίπεδα της CAXII της SCC ασθενείς ορού ήταν γενικά υψηλότερες από εκείνες των ασθενών με άλλες ιστολογίες, και το σύνολο επικύρωσης περιλαμβάνεται καμία περίπτωση SCC . Στο σύνολό τους, τα επίπεδα CAXII στον ορό θα πρέπει να εφαρμόζεται δείκτες διάκριση ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα από υγιείς μάρτυρες. Επί του παρόντος, αξονική τομογραφία ή ακτινογραφία θώρακος είναι η κύρια μέθοδος προσυμπτωματικού ελέγχου του καρκίνου του πνεύμονα [21]. Mazzone et al. πρότεινε ότι το αίμα και η αναπνοή δοκιμές πρέπει επίσης να συμπεριληφθεί για τον προσυμπτωματικό έλεγχο του καρκίνου του πνεύμονα, επειδή είναι τόσο εύκολο να εκτελέσει και χωρίς τους κινδύνους που συνδέονται με τη χορήγηση της δοκιμής [21], [22]. Σε αυτή τη μελέτη, αναλύσαμε τα επίπεδα CAXII σε ορούς από ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα και υγιείς μάρτυρες χρησιμοποιώντας μονοκλωνικό αντίσωμα, και τα αποτελέσματά μας πρότεινε ότι το επίπεδο CAXII ορού ήταν ένα χρήσιμο ορο-διαγνωστικό δείκτη για τον καρκίνο του πνεύμονα.