Αφηρημένο

Ανθρώπινο παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC) είναι ένας καρκίνος με μια μελαγχολική πρόγνωση. Η αποτελεσματικότητα των PDAC αντικαρκινικών θεραπειών είναι συχνά βραχύβια? Ωστόσο, υπάρχουν λίγες πληροφορίες σχετικά με το πώς αυτή η ασθένεια οντότητα τόσο συχνά αποκτά αντίσταση στη θεραπεία. Έχουμε υιοθετήσει την έννοια των καρκινικών βλαστικών κυττάρων (ΚΕΠ) για να εξηγήσει τον μηχανισμό της αντίστασης και αξιολόγησε την αποτελεσματικότητα ενός υποψηφίου αντικαρκινικό φάρμακο για τη στόχευση αυτών των ΚΕΠ θεραπεία-ανθεκτική. Εντοπίσαμε έναν υποπληθυσμό κυττάρων σε PDAC με χαρακτηριστικά CSC που εμπλουτίστηκαν για αφυδρογονάση αλδεΰδης (ΑΙ_ϋΗ), ένα δείκτη που εκφράζεται σε ορισμένες στελέχους /προγονικών κυττάρων. Αυτά τα κύτταρα ήταν επίσης πολύ ανθεκτικά σε αυτά, και περαιτέρω εμπλουτιστεί με, η θεραπεία με gemcitabine. Ομοίως, χειρουργικά δείγματα από PDAC ασθενείς έδειξε ότι όσοι είχαν υποβληθεί σε προεγχειρητική θεραπεία χημειο-ακτινοβολία πιο συχνά εμφανίζονται οι καρκίνοι με ALDH έντονα θετικό υποπληθυσμών σε σύγκριση με μη ασθενείς. Σημαντικά, αυτές οι ALDH-υψηλής καρκινικά κύτταρα ήταν ευαίσθητα σε δισουλφιράμη, έναν αναστολέα ΑΙ_ϋΗ, όταν δοκιμάζονται

in vitro

. Επιπλέον,

in vivo

ξενομοσχεύματος μελέτες έδειξαν ότι η επίδραση της δισουλφιράμης ήταν προσθετικά ότι γεμσιταβίνης χαμηλής δόσης, όταν εφαρμόζεται σε συνδυασμό. Εν κατακλείδι, η ανθρώπινη PDAC προερχόμενα κύτταρα που εκφράζουν υψηλά επίπεδα ALDH δείχνουν χαρακτηριστικά CSC και έχουν βασικό ρόλο στην ανάπτυξη της αντοχής σε αντικαρκινικών θεραπειών. Δισουλφιράμη μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να καταστείλει αυτήν την θεραπεία-ανθεκτική υποπληθυσμό

Παράθεση:. Kim SK, Kim H, Lee D-h, Kim T-s, Kim T, Chung C, et al. (2013) Αντιστροφή Οι ακανθώδεις Φύση του καρκίνου του παγκρέατος με την επιλεκτική στόχευση ΑΙ_ϋΗ-High, ανθεκτική στη θεραπεία των καρκινικών κυττάρων. PLoS ONE 8 (10): e78130. doi: 10.1371 /journal.pone.0078130

Επιμέλεια: Benedetta Bussolati, Κέντρο Μοριακής Βιοτεχνολογίας, Ιταλία

Ελήφθη: 1 Ιουλίου του 2013? Αποδεκτές: 17, Σεπτεμβρίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 23 του Οκτώβρη, 2013

Copyright: © 2013 Kim et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Creative πρωτοβουλίες Έρευνας Πρόγραμμα (2010-001827, https://www.nrf.re.kr). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Συν-συγγραφέας Hoguen Kim είναι μια Συντακτική μέλος του Διοικητικού Συμβουλίου PLoS ONE, και καταλαβαίνει ότι αυτή η δεν μεταβάλλει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Η πρόγνωση των ασθενών με αδενοκαρκίνωμα παγκρεατικού πόρου (PDAC) είναι εξαιρετικά κακή. Μόνο το 10-20% των PDACs είναι κατάλληλα για χειρουργική εκτομή κατά την αρχική διάγνωση, και το ποσοστό υποτροπής του όγκου έχει αναφερθεί να φτάσει μέχρι 70-90%, ακόμη και σε ασθενείς που έχουν υποβληθεί σε θεραπευτική εκτομή [1]. Οι θεραπευτικές επιλογές σε μια πλειοψηφία των ασθενών τελικά να γίνει μειωθεί σε ενταθεί χημειοθεραπεία και /ή ακτινοθεραπεία [1,2]. Ως εκ τούτου, η θεραπεία της PDAC είναι εξαιρετικά δύσκολο γιατί κερδίζει εύκολα ανθεκτικότητα στη θεραπεία χημειο-ακτινοβολία και γίνεται δυσεπίλυτο.

Ένα αυξανόμενο σώμα της έρευνας υποστηρίζει την ιδέα των καρκινικών βλαστικών κυττάρων (ΚΕΠ) ή καρκινικά κύτταρα-κίνηση. ΚΕΠ χαρακτηρίζουν μοναδικά χαρακτηριστικά, συμπεριλαμβανομένης της ικανότητας για απεριόριστες αυτο-ανανέωση, μεγάλη διάρκεια ζωής, υψηλού μεταστατικού δυναμικού, και την αντίσταση στη χημειοθεραπεία [3,4]. Έτσι, ΚΕΠ έχουν έρθει για να αναγνωριστεί ως έναν όγκο υπο-πληθυσμού που θα πρέπει να στοχεύει δυναμικά [2,3,5]. Αλλά ως πρακτικό θέμα, οι αποτελεσματικότητες των διαθέσιμων θεραπειών CSC-στόχευσης είναι καθόλου ικανοποιητική. Αρκετές μελέτες έχουν επικυρωθεί το ρόλο του ΚΕΠ στην ανάπτυξη θεραπευτικών αντοχής σε PDACs [4], και απέδειξαν ότι είναι συχνά ανθεκτικά στους συνηθέστερα χρησιμοποιούμενα αντικαρκινικά φάρμακα, όπως είναι η γεμσιταβίνη και 5-φθοριοουρακίλη [1,4,6].

σε αυτή τη μελέτη, τεκμαίρεται ότι η έννοια των ΚΕΠ θα μπορούσε να εξηγήσει γιατί τα αποτελέσματα του προτύπου χημειοθεραπείες συχνά περιορίζεται σε ασθενείς που λαμβάνουν επικουρική χημειοθεραπεία ή χημειο-ακτινοβολία [7-11]. Υποθέσαμε περαιτέρω ότι ορισμένα μοναδικά χαρακτηριστικά των ΚΕΠ θα μπορούσε να αξιοποιηθεί για την εκ νέου ευαισθητοποιήσει PDACs σε αντικαρκινικές θεραπείες και στη συνέχεια να αντιστρέψει την δυσεπίλυτο φύση? την προσοχή μας συντάχθηκε με αφυδρογονάση αλδεΰδη (ΑΙ_ϋΗ), η οποία έχει αναγνωριστεί ως ένα νέο δείκτη ΚΕΠ, ιδίως ως μέρος μιας ομάδας δεικτών των βλαστικών κυττάρων [12-18]. Συσσωρευμένα απόδειξη υποστηρίζει την ιδέα ότι η αυξημένη έκφραση του ALDH συνδέεται με δυσμενείς πρόγνωση σε μαστού, του πνεύμονα, και καρκίνων του προστάτη [15,16,18]. Προσθέτοντας σε αυτή τη λίστα, Rasheed et al. Πρόσφατα αναφέρθηκε ότι ΑΙ_ϋΗ1-θετικά καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος να επηρεάσει αρνητικά την επιβίωση των ασθενών PDAC [12].

Disulfiram (1- [diethylthiocarbamoyldisulfanyl] -Ν, Ν-διαιθυλ-methanethioamide) είναι ένας μη αναστρέψιμος αναστολέας της ΑΙ_ϋΗ που έχει έχουν χρησιμοποιηθεί για να επιτευχθεί συμπεριφορά αλκοόλ αποφυγή κατά τη διάρκεια της θεραπείας αλκοολικών [19]. Disulfiram έχει κερδίσει την προσοχή ως υποψήφιο αντικαρκινικό φάρμακο και μέχρι σήμερα έχει ελεγχθεί για αρκετές συμπαγείς όγκους, όπως του καρκίνου του μαστού, το μελάνωμα, και καρκίνο του παχέος εντέρου [20-22]. Αν και ο ακριβής μηχανισμός βασίζεται η αντικαρκινική δράση του παράγοντα αυτού δεν έχει πλήρως διευκρινιστεί, αρκετές σημαντικές ενδείξεις έχουν προκύψει [20-26]. Πρόσφατα, Dalla Pozza et al. ανέφεραν ότι η συνδυασμένη θεραπεία με γεμσιταβίνη και δισουλφιράμη με ιόν ψευδαργύρου ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου ξενομοσχεύματος παγκρεατικού καρκίνου κύτταρα [27]. Ωστόσο, η άμεση επίδραση της δισουλφιράμης στο ΚΕΠ της PDACs σε σχέση με ALDH είναι απροσδιόριστο.

Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε τη σημασία της έκφρασης ALDH και των πληθυσμών CSC στην PDAC. Συγκρίναμε αποκρίσεις σε δισουλφιράμη μεταξύ όγκου υπο-πληθυσμούς με διαφορετικά επίπεδα έκφρασης ALDH και διαπίστωσε ότι ΑίϋΗ ισχυρώς θετικά κύτταρα ήταν ευαίσθητα στην δισουλφιράμη. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν τη δυνατότητα εφαρμογής της δισουλφιράμης ως ένας παράγοντας αντι-CSC που θα μπορούσε ενδεχομένως να βελτιώσει την αποτελεσματικότητα των τυποποιημένων χημειοθεραπείες ενάντια PDAC.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και τα αντιδραστήρια

Οι ακόλουθες ανθρώπινες κυτταρικές σειρές χρησιμοποιήθηκαν: CFPAC-1, ΜΙΑ PaCa-2, PANC-1, και ASPC-1 (παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές)? hTERT-HPNE (κανονική παγκρεατικού πόρου επιθηλιακή κυτταρική γραμμή). Όλες οι κυτταρικές γραμμές αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) έχουν .Οι κυτταρικές γραμμές έχουν δοκιμαστεί χρησιμοποιώντας αναγνωριστικό AmplFLSTR κιτ PCR Ενίσχυση (Applied Biosystems, Foster, CA, cat. 4.322.288) και επικυρώνονται από KCLB το Φεβρουάριο 2013. Δισουλφιράμη και γεμσιταβίνη (Sigma) χρησιμοποιήθηκαν για

in vitro

βιωσιμότητα και

in vivo

ξενομόσχευμα δοκιμασίες.

ανθρώπινα νεοπλασματικά δείγματα

Αυτή η αναδρομική μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Yonsei Ιατρικό Κέντρο. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε ασθενή για την αποθήκευση και τη χρήση του δείγματος και ιατρικών πληροφοριών. κριτήρια ένταξης μας ορίζεται πληθυσμό μελέτη των 57 PDAC ασθενείς που είχαν διαγνωστεί ιστολογικά και λειτουργεί Yonsei University Medical Center από το 2005 έως το 2008. Η κλινική αξιολόγηση έγινε με βάση την αμερικανική μεικτής επιτροπής για τον Καρκίνο ΤΝΜ (όγκος-node-μετάσταση) ταξινομήσεις. Επειδή σταδίου ΙΙΙ και IV του παγκρέατος είναι ανεγχείρητο σύμφωνα με TNM ταξινομήσεων [28], αναλύσαμε μόνο στάδιο ΙΙ PDAC ασθενείς που έλαβαν τη λειτουργία ή Whipple του πυλωρού, διατηρώντας pancreatoduodenectomy με λεμφαδένων. Για προεγχειρητική χημειοθεραπεία /CCRT, γεμσιταβίνη χρησιμοποιήθηκε στην πλειοψηφία. (18/20? 90%) των ασθενών

Η κυτταρομετρία ροής

Όλες οι κυτταρικές σειρές αναλύθηκαν για την έκφραση ΑΙ_ϋΗ με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας ένα κιτ Aldefluor (Aldagen, Inc.) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για τη σύγκριση των ALDH-φωτεινά και ALDH-αρνητικά κύτταρα, CFPAC-1 καρκινικά κύτταρα ταξινομήθηκαν με βάση την ένταση της ΑΙ_ϋΗ δραστηριότητάς τους μετρήθηκε με FACS (ενεργοποιούμενη με φθορισμό ταξινόμηση κυττάρων, διαλογέα κυττάρου FACS BD Aria ™ II). Βιοτίνη-συζευγμένο αντι-CD24 και PerCP-Cy5.5 αντι-CD44 αντισώματα (eBioscience) χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με ένα πρωτόκολλο ανοσοφαινότυπου περιλαμβάνονται στο εγχειρίδιο που παρέχεται από τον πωλητή. ΫΑΡΙ (4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη) χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση των πυρήνων των ζωντανών κυττάρων. Ένα κιτ PE Annexin V Ανίχνευσης Απόπτωσης I (BD Bioscience) χρησιμοποιήθηκε σε σύζευξη με 7-AAD (eBioscience) για τον εντοπισμό πρώιμων αποπτωτικών καρκινικών κυττάρων. Για την ανάλυση της LSK (Κυτταρική γραμμή- Sca + c-kit +) αιμοποιητικών συχνότητα αρχέγονων κυττάρων στο μυελό των οστών από μηριαίο οστό και κνήμη ποντικού, χρησιμοποιήσαμε γράμμωσης (CD11b-βιοτίνη, Gr1-βιοτίνη, CD4-βιοτίνη, CD8-βιοτίνη, Β220 βιοτίνη, TER119-βιοτίνη) -στρεπταβιδίνη-PerCP-Cy5.5, PEcy7-συζευγμένο Sca-1, και APC-συζευγμένα αντισώματα c-kit (eBioscience).

κηλίδωση Western

εκχυλίσματα πρωτεΐνης ελήφθησαν από κύτταρα ή μάζες όγκου χρησιμοποιώντας ένα διάλυμα εκχυλίσματος πρωτεΐνης (Pro-Prep? INTRON) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση στυπώματος Western περιλαμβάνονται αντι-ALDH1A1 (Abcam), GAPDH και αντι-β-ακτίνης (Sigma).

σε πραγματικό χρόνο αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)

Απομόνωση RNA και cDNA σύνθεση πραγματοποιήθηκαν ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (RiboEx? Intron). SYBR πράσινο-με βάση σειρά PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του iQ5 Πολύχρωμο Real-Time Σύστημα Ανίχνευσης PCR (Bio-Rad). Οι αλληλουχίες των διαφόρων εκκινητές PCR είναι διαθέσιμα κατόπιν αιτήματος. τα επίπεδα έκφρασης σε σχέση mRNA υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τη συγκριτική μέθοδο Ct με κανονικοποίηση σε β-ακτίνη.

πειράματα Ποντίκι

φροντίδα των ζώων και πειραματικές διαδικασίες έγιναν με την έγκριση της επιτροπής Φροντίδα και Χρήση KAIST ζώων . Χρησιμοποιήσαμε 6 εβδομάδων αρσενικό

Foxn1

nu

SCID ποντίκια για αναλύσεις ξενομόσχευμα (Orient Bio). δισκία Disulfiram (Ind-Swift) διαλύθηκαν σε αραβοσιτέλαιο (Sigma) για χορήγηση από το στόμα μέσω ενός sonde. Γεμσιταβίνη (Sigma) εγχύθηκε ενδοπεριτοναϊκά (Ι.Ρ.) για

in vivo δοκιμασίες

παλινδρόμησης.

Για τη μέτρηση της απόκρισης δισουλφιράμη, χωρίσαμε τις ξένο μόσχευμα ποντίκια σε ποντίκια δισουλφιράμη φάρμακο (300 mg /m

2, δύο φορές την εβδομάδα, χορηγούνται μέσω ενός sonde) και τα ποντίκια έλεγχο του πετρελαίου που έλαβαν καλαμποκιού. Για τη μέτρηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας συνδυασμού με δισουλφιράμη και gemcitabine χαμηλή δόση, διαιρέσαμε τις ξένο μόσχευμα ποντίκια σε πέντε ομάδες όπως δισουλφιράμης μόνο αγωγή ποντίκια (300 mg /m

2, δύο φορές την εβδομάδα, χορηγείται μέσω ενός sonde) , γεμσιταμπίνη χαμηλής δόσης αγωγή ποντίκια (40 mg /m

2 επιφάνειας σώματος, IP, εβδομαδιαία) [29], χαμηλή δόση γεμσιταβίνης σε συνδυασμό με από του στόματος δισουλφιράμη, 10 φορές υψηλότερη δόση των ποντικών που έλαβαν γεμσιταβίνης (400 mg /m

2 επιφάνειας σώματος, εβδομαδιαία), και PBS-αγωγή ποντίκια ελέγχου (ΠΕ).

συνιστάται η από του στόματος φάρμακο δισουλφιράμη λαμβάνεται μία αρχική δόση των 500 mg ακολουθούμενη από ημερήσια δόση συντήρησης 250 mg σε ανθρώπινο [30]. Η μετάφραση δόση από το ένα ζωικό είδος στο άλλο με τη μέθοδο της κανονικοποίησης επιφάνεια σώματος (BSA) συνιστάται [31]. Σύμφωνα με αυτόν τον τύπο, θα χορηγηθεί δισουλφιράμη των 300mg /m

2 σε ποντίκια δύο φορές την εβδομάδα

ανά στόματος

.

μετρήσεις όγκου των όγκων

Τα ποντίκια είχαν εγγραφεί για θεραπεία απεξάρτησης όταν οι όγκοι τους είχαν φθάσει σε ένα μέγεθος τουλάχιστον 200 mm

3. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε με ένα παχύμετρο, και ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε με τον κανονικό τύπο, Μήκος x πλάτος

2 x 0.5 (mm

3). την έναρξη του όγκου σε καρκινικές κυτταρικές ένεση ποντικών παρακολουθήθηκε καθημερινά, και το μέγεθος του όγκου προσδιορίστηκε κάθε εβδομάδα για 3 έως 5 εβδομάδες, όπως υποδεικνύεται.

Ανοσοϊστοχημεία

ξενομοσχεύματα όγκου μονιμοποιήθηκαν σε φορμαλίνη, εγκλείστηκαν σε παραφίνη , τεμαχίστηκαν, και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε). Ανοσοϊστοχημεία (IHC) με το αντίσωμα αντι-ALDH1A1 (Abcam) πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα Dako Envision Kit σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών. Χρησιμοποιήσαμε εσωτερικά πρότυπα για τον ορισμό ALDH1A1 ισχυρά θετικά κύτταρα όταν το πλάτος του σήματος ήταν ίση ή μεγαλύτερη από εκείνη των φυσιολογικών αρχέγονων /προγονικών κυττάρων βρίσκεται στο άνευ όγκου περιοχή του ίδιου ολισθητήρα (Σχήμα S1).

Πραγματοποιήσαμε IHC ανάλυση ALDH1A1 και σύγκριση αδενικό διαφοροποίηση με την έκφραση ALDH1A1 για τα ανθρώπινα PDAC δείγματος (Εικόνα 1Α). Να εκφράσει την αντιστοιχία αριθμητικά, μετρήσαμε ALDH1A1 έντονα θετικά καρκινικά κύτταρα ανά συνολικό καρκινικών κυττάρων αποτελούνται από καλά διαφοροποιημένο και κακώς διαφοροποιημένο αδένες, αντίστοιχα. Εξετάσαμε τρία καλά διαφοροποιημένη και τρία ελάχιστα διαφοροποιημένο PDAC περιπτώσεις ανθρώπινης σε 10 πεδία υψηλής ισχύος (X400 μεγέθυνση).

(Α) IHC ανάλυση ALDH1A1 σε χειρουργικά δείγματα ανθρώπινου χρόνιας παγκρεατίτιδας και PDAC. Άνω πάνελ, H & amp? E λεκέ και κάτω φύλλα, ALDH1A1 IHC λεκέ. (Β) Η συχνότητα των ALDH1A1 έντονα θετικά κύτταρα ανάμεσα σε καλά διαφοροποιημένα και κακώς διαφοροποιημένο PDACs. (Γ) Τα προφίλ δραστηριότητας ALDH της ανθρώπινης PDACs ανάλογα με το αν πραγματοποιήθηκε προεγχειρητική θεραπεία. * P & lt? 0.05. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν τυπικές αποκλίσεις.

Η

Ο περιορισμός της αραίωσης ανάλυση

Για να εκτιμηθεί η συχνότητα των αποικιών σχηματισμού, εμείς αραιωμένο CFPAC-1 κύτταρα σε ένα μόνο κύτταρο ανά φρεάτιο (100μL) και καλλιεργήθηκαν σε τρυβλίο 96 φρεατίων στο 5% CO

2 επωαστήρα στους 37 ° C. Μετά από δύο εβδομάδες, υπολογίζεται κάθε απόφυση αποικία από ένα μόνο κύτταρο και υπολογίζεται αριθμός αποικιών από το σύνολο των φρεατίων.

Βιωσιμότητα δοκιμασία

Πραγματοποιήσαμε ανάλυση βιωσιμότητας του WST (υδατοδιαλυτό άλας τετραζολίου) χρωστική (κιτ δοκιμασίας κυτταρικής βιωσιμότητας EZ-cytox, itsBIO), σύμφωνα με τις οδηγίες του προμηθευτή. Τα δείγματα αναγνώσθηκαν με έναν αναγνώστη μικροπλάκας χρησιμοποιώντας 450nm μήκος κύματος απορροφητικότητας. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό της βιωσιμότητας των κυττάρων, προσδιορίσαμε τις μέσες τιμές από εις τριπλούν ή τετραπλούν αναγνώσεις και να έχεις πρότυπη καμπύλη χρησιμοποιώντας GraphPad Prism 5 λογισμικού.

Στατιστικά

Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση GraphPad Prism 5 λογισμικού. Για την ανάλυση της βιωσιμότητας των κυττάρων και ο όγκος του όγκου σύμφωνα με την φαρμακευτική αγωγή, σημαντικές διαφορές μεταξύ των μέσων τιμών προσδιορίστηκε με ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA) που ακολουθείται από t-tests. IHC και κυτταρομετρία ροής αποτελέσματα αναλύθηκαν με t-test και η αναλογία των όγκων που περιέχουν ALDH-έντονα θετική καρκινικά κύτταρα σε χειρουργικά-εκτομή PDACs συγκρίθηκε με chi-square μέθοδο. Συγκρίναμε σχηματισμού απόδοσης κατά την ανάλυση του t-test αποικία. Όλες οι αναφερόμενες τιμές Ρ είναι δύο όψεων, και Ρ-τιμές μικρότερες από 0.05 θεωρήθηκαν για να υποδείξει στατιστική σημαντικότητα.

Αποτελέσματα

έκφραση ΑΙ_ϋΗ1 σε αφαίρεση των νεοπλασματικών και μη νεοπλασματικών ανθρώπινη παγκρεατική ιστούς

έχουν Terminal πόρου κύτταρα έχουν αναφερθεί ως παγκρέατος βλαστικά /προγονικά κύτταρα σε διάφορες μελέτες [32-34] και Rovira et al. χαρακτηριζόμενη το μοτίβο ΑΙ_ϋΗ1 έκφρασης αυτών των κυττάρων σε ποντικούς [35]. Ωστόσο, το πρότυπο έκφρασης του ΑΙ_ϋΗ1 σε μη οιδηματώδης ανθρώπινο παγκρεατικό ιστό δεν έχει αναφερθεί. Έχουμε έτσι εξετάστηκαν ανθρώπινα δείγματα και διαπίστωσε ότι, παρόμοια με τα ποντικού πάγκρεας, ανθρώπινη χρόνια παγκρεατίτιδα εμφάνισαν αναγεννητική μεταπλασία και πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα των πόρων που θα ήταν η άμεση απόγονοι των παγκρεατικών αρχέγονων /προγονικών κυττάρων [32,35] {Rovira 2010 # 96} επίσης έδειξαν υψηλά επίπεδα έκφρασης ALDH1A1 (Σχήμα 1Α).

Στην ανθρώπινη PDAC, έκφραση ALDH1A1 ποικίλει μεταξύ διαφορετικών κυττάρων σε ένα ευρύ φάσμα από αρνητική σε έντονα θετικό (Εικόνα S1). Αξίζει να σημειωθεί ότι, κακώς διαφοροποιημένο PDACs εμφανίζεται πιο άφθονη ALDH1A1 ισχυρώς θετικά καρκινικά κύτταρα από καλά διαφοροποιημένο PDACs είχε (Σχήμα 1Α). Το σχήμα 1Β δεικνύει την στατιστική διαφορά στην συχνότητα του ALDH1A1 ισχυρώς θετικά κύτταρα ανάμεσα σε καλά διαφοροποιημένα (n = 7) και ελάχιστα διαφοροποιημένα (n = 7) PDACs. Μετρήσαμε τα καρκινικά κύτταρα στους τομείς υψηλής ισχύος 10 (X400) του εκπροσώπου διαφάνεια από κάθε ένα από τα δείγματα PDAC.

Στη συνέχεια, εξετάσαμε τα χειρουργικά δείγματα, οι οποίοι είτε έλαβαν προεγχειρητική χημειοθεραπεία /θεραπεία ταυτόχρονη χημειο-ακτινοβολία ( CCRT? n = 20) ή όχι (n = 37), και αναζήτηση για την παρουσία ALDH1A1 ισχυρώς θετικά (Πίνακας S1). Αυτά τα κύτταρα τα οποία προσδιορίζονται από τη σύγκριση του επιπέδου ALDH1A1expression ενός ατόμου καρκινικού κυττάρου με εκείνη ενός κανονικού στελέχους /προγονικών κυττάρων που περιλαμβάνονται στο παρακείμενο σχετίζονται με τον όγκο χρόνιας παγκρεατίτιδας ιστού (Σχήμα S1). Βρήκαμε ότι η συχνότητα των όγκων που διαθέτουν ΑίϋΗ ισχυρώς θετικά κύτταρα ήταν υψηλότερα στους ασθενείς που έλαβαν χημειοθεραπεία /CCRT πριν τη χειρουργική επέμβαση (80,0%) σε σύγκριση με εκείνη των ασθενών που έλαβαν μόνο χειρουργική εκτομή (51,4%) (Σχήμα 1 C) , γεγονός που υποδηλώνει ότι η ΑΙ_ϋΗ έντονα θετικά καρκινικά κύτταρα εμπλουτίστηκαν με συμβατική χημειοθεραπεία /CCRT.

τα καρκινικά κύτταρα που διαθέτει υψηλής έκφρασης πολλαπλών οθόνη ΑΙ_ϋΗ CSC

Για να δημιουργήσετε μια

in vitro

πλατφόρμα , εμείς διαλογή μία κανονική παγκρεατικού πόρου επιθηλιακά κυτταρική γραμμή ανθρώπου (hTERT-HPNE) και τέσσερις ανθρώπινες PDAC προερχόμενων κυτταρικών σειρών (CFPAC-1, μΙΑ PaCa-2, PANC-1 και ASPC-1). Μετρήσαμε δραστικότητα ALDH σε κάθε κυτταρική σειρά με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας κιτ Aldefluor (Εικόνα S2). Επειδή ALDH1A1 είναι ένα σημαντικό προϊόν του

ΑΙ_ϋΗ

ένταση γονίδιο, φθορισμού πρέπει θετικά συσχετίζονται με ALDH1A1 [36]. Έτσι, ένα υποπληθυσμό των κυττάρων ιδιαίτερα εκφράζουν ALDH στην κυτταρομετρία ροής θα μπορούσε να αντιστοιχεί με την ALDH1A1 έντονα θετικά κύτταρα παρατηρήθηκαν σε ανθρώπινα PDAC δείγματα.

Εμείς ορίζονται τρεις υποσύνολο των κυττάρων με βάση την κατανομή κυτταρομετρίας ροής τους σε σχέση με τον ηλεκτρονικό περιορισμό της ϋΕΑΒ αρνητικός έλεγχος είτε ως ΑΙ_ϋΗ-αρνητικό (κύτταρα που βρίσκονται μέσα στην περιοχή περιφραγμένη με έλεγχο ϋΕΑΒ), ΑΙ_ϋΗ-υψηλή (κύτταρα που βρίσκονται στην περιοχή πάνω από τον έλεγχο ϋΕΑΒ), και ALDH-φωτεινό (ένας υποπληθυσμός των ΑΙ_ϋΗ-υψηλής κύτταρα). Σε hTERT-HPNE, ο ΑίϋΗ εξαιρετικά εκφράζουν υποσύνολο αποτελούσαν λιγότερο από το 5% του συνολικού πληθυσμού. Μεταξύ των τεσσάρων PDAC κυτταρικές σειρές, ΜΙΑ PaCa-2 (& gt? Το 90% του συνολικού πληθυσμού) και CFPAC-1 (περίπου 50%) κατέδειξαν άφθονο ALDH-υψηλής καρκινικά κύτταρα. Σε PANC-1 και κύτταρα ASPC-1, οι αναλογίες των ΑΙ_ϋΗ-υψηλών πληθυσμών ήταν συγκρίσιμες με ή μικρότερη από εκείνη των κυττάρων hTERT-HPNE. Σταθερά, ALDH1A1 πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε σε σημαντικές ποσότητες σε ΜΙΑ PaCa-2 και CFPAC-1 κυτταρικές σειρές, αλλά μόνο σε ελάχιστα επίπεδα στο PANC-1 και ASPC-1 κύτταρα (Σχήμα S2).

Με βάση την προηγούμενη βιβλιογραφία [12-14,18,37] και τις παρατηρήσεις μας, έχουμε υποθέσει ότι ΑΙ_ϋΗ-φωτεινό καρκινικά κύτταρα μπορεί να αντιπροσωπεύουν πραγματικά ΚΕΠ. Προηγούμενες μελέτες έχουν εφαρμοστεί ΑΙ_ϋΗ, ως μέρος ενός πάνελ με άλλους δείκτες αρχέγονων κυττάρων, για τον προσδιορισμό της κανονικής και βλαστικών κυττάρων καρκίνου στο πάγκρεας [12,13,37]. Δοκιμάσαμε εάν ALDH από μόνο του μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ένα bona fide δείκτης βλαστικών κυττάρων και εάν τα κύτταρα με υψηλά επίπεδα έκφρασης ALDH που αντιπροσωπεύονται πραγματικά ΚΕΠ. Για να γίνει αυτό, χρησιμοποιήσαμε CFPAC-1 κυτταρική γραμμή, επειδή είναι γνωστό ότι ο υποπληθυσμός CFPAC-1 είναι εμπλουτισμένο με καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν [38] και βρήκαμε ότι CFPAC-1 έδειξαν ομοιόμορφα κατανεμημένη ALDH-υψηλό και καρκίνος -αρνητική κυττάρων σε δοκιμασία Aldefluor. Έχουμε περαιτέρω διαλογή κυττάρων με βάση το μέγεθος της δραστηριότητας ΑΙ_ϋΗ τους προσδιορίζονται από FACS και συνέκρινε την άνω και κάτω του 5% των κυττάρων, τα οποία ορίσαμε ως ALDH-φωτεινά και ALDH-αρνητικών υποπληθυσμών, αντίστοιχα. επίπεδα ALDH1A1 mRNA και η πρωτεΐνη ήταν συνεπή με τα επίπεδα που προσδιορίζονται από ΑΙ_ϋΗ FACS (Σχήμα S2).

επόμενο αναλύθηκαν CFPAC-1 κυττάρων με διαφορετικά επίπεδα ALDH για την συν-έκφραση των CD24 και CD44, τα οποία χρησιμοποιούνται συνήθως σημειωτές βλαστοκυττάρων [14]. Αυτό αποκάλυψε ότι η δραστικότητα ALDH συσχετίζεται θετικά με εκείνες των CD24 και CD44 (Σχήμα 2Α). Μια δοκιμασία σχηματισμού αποικιών περιοριστικής αραίωσης αποκάλυψε ότι ΑίϋΗ φωτεινή κύτταρα είχαν μεγαλύτερη δραστικότητα σχηματισμού αποικίας από ΑίϋΗ-αρνητικά κύτταρα (Σχήμα 2Β). Εμείς χωριστά καλλιεργημένα ALDH-φωτεινά και ALDH-αρνητικά κύτταρα, και ανέλυσε τη δραστικότητα ALDH μετά από 2 εβδομάδες (Σχήμα 2C). Οι απόγονοι των ΑΙ_ϋΗ-φωτεινό κυττάρων περιλαμβάνονται τόσο ALDH-φωτεινά και ΑίϋΗ-αρνητικά κύτταρα? ως εκ τούτου, ΑίϋΗ-φωτεινό κύτταρα με επιτυχία αποκατασταθεί το αρχικό πληθυσμό. Σε αντίθεση, ΑίϋΗ-αρνητικά κύτταρα απέτυχε να ανακτήσει πλήρως το κυτταρικό πληθυσμό ALDH-φωτεινό.

(Α) FACS ανάλυση για CD24

+ CD44

+ CFPAC-1 κύτταρα κατηγοριοποιούνται σε ΑΙ_ϋΗ

φωτεινό, ΑΙ_ϋΗ

υψηλή και ALDH

αρνητικές ομάδες. (Β) στον περιορισμό προσδιορισμούς σχηματισμού αποικίας αραίωση εκτελείται με FACS ταξινομημένα κύτταρα-CFPAC-1. δραστηριότητα (C) ΑΙ_ϋΗ μετρήθηκε με ανάλυση FACS σε ALDH

αρνητική και ALDH

φωτεινά κύτταρα CFPAC-1 καλλιεργήθηκαν χωριστά για 2 εβδομάδες. (Δ) Προσδιορισμός των ΑΙ_ϋΗ

φωτεινά και ALDH

αρνητικά τη βιωσιμότητα των κυττάρων CFPAC-1 μετά από θεραπεία με gemcitabine. (Ε) Εκπρόσωπος της εικόνας και γράφημα που συγκρίνει συχνότητα εμφάνισης όγκου μετά την ένεση της FACS-ταξινομημένο ΑΙ_ϋΗ

φωτεινές ή ALDH

αρνητικά κύτταρα CFPAC-1. Ποντικοί εγχύθηκαν με το δηλούμενο αριθμό κυττάρων (ALDH

Br, 5 χ 10

5 [

n

= 5]? ALDH

Ng, 5 χ 10

5 [

n

= 5]? και ALDH

Ng, 1 x 10

6 [

n

= 5]? ΑΙ_ϋΗ

Br, 1 x 10

6 [ ,,,0],

n

= 10]) στη δεξιά πλευρά και παρατηρήθηκαν για 5 εβδομάδες. 1X10

5ALDH

αρνητικά καρκινικά κύτταρα απέτυχαν να παράγουν οποιαδήποτε οζίδιο, ακόμη και όταν η περίοδος παρατήρησης παρατάθηκε μέχρι 14 εβδομάδες. ΑΙ_ϋΗ

Br, ALDH-φωτεινά και ALDH

Ng, ALDH αρνητικά. * P & lt? 0,05 και *** P & lt? 0.0005.

Η

Μια άλλη καλά χαρακτηρισμένη χαρακτηριστικό των ΚΕΠ είναι η αντοχή τους στη χημειοθεραπεία ή /και ακτινοβολία-θεραπεία [3]. Ως εκ τούτου, αξιολογήσαμε την ευαισθησία του ALDH-φωτεινά και καρκίνος -αρνητική κυττάρων σε ένα συμβατικό αντικαρκινικό φάρμακο, γεμσιταβίνη. ΑΙ_ϋΗ φωτεινή καρκινικά κύτταρα ήταν πολύ ανθεκτικά σε γεμσιταβίνη σε σύγκριση με ALDH αρνητικά καρκινικά κύτταρα, απαιτούν σημαντικά υψηλότερες συγκεντρώσεις για να σκοτώσουν 50% των κυττάρων (το ήμισυ της μέγιστης συγκέντρωσης αναστολής, IC

50) (Σχήμα 2D). Το αποτέλεσμα αυτό είναι συμβατό με αυτά τα δεδομένα στους ανθρώπους που ΑΙ_ϋΗ έντονα θετικά καρκινικά κύτταρα εμπλουτίστηκαν με συμβατική χημειοθεραπεία /CCRT (Σχήμα 1C).

Στη συνέχεια, υποδόρια ένεση 5 χ 10

5 FACS ταξινομημένο CFPAC-1 ADLH-φωτεινά και -αρνητική καρκινικά κύτταρα στα πλευρά γυμνών ποντικών, αντίστοιχα. Τα κύτταρα ξενομοσχεύτηκε ALDH φωτεινή άρχισε να σχηματίσουν ένα οζίδιο μέσα σε 1 εβδομάδα μετά την ένεση, και στις 5 εβδομάδες το 60% των ποντικών είχε επιτυχώς σχηματίσει οζίδιο (Σχήμα 2Ε). Ωστόσο, ο ίδιος αριθμός ALDH αρνητικών καρκινικών κυττάρων απέτυχε να παράγει κάποιο οζίδιο, ακόμη και όταν η περίοδος παρατήρησης επεκτάθηκε μέχρι και 14 εβδομάδες. ΑΙ_ϋΗ-αρνητικών καρκίνων ήταν σε θέση να αποδείξει μόνο οζίδια όγκου όταν ο αριθμός έγχυση των κυττάρων αυξήθηκε σε 1 χ 10

6. Για ιστολογική εξέταση, οι όζοι ξενομόσχευμα προήλθε από ΑΙ_ϋΗ-φωτεινό καρκινικά κύτταρα παρουσίασαν δομές με διάφορους βαθμούς διαφοροποίησης, που κυμαίνονται από καλά διαφοροποιημένα κύτταρα που σχηματίζονται με επιτυχία διοργάνωσε αδένες με ένα αυλό με ελάχιστα διαφοροποιημένα κύτταρα που μόλις και μετά βίας σχηματίστηκε άκαρπη αδενικό αρχιτεκτονικές (Εικόνα S2). καρκινικά κύτταρα που βρίσκονται μέσα σε ελάχιστα διαφοροποιημένες περιοχές εκτίθενται συχνά ένα σχετικά άτυπη και πλειομορφικούς μορφολογία και εμφανίζονται παράξενες πυρήνες σε σύγκριση με εκείνα από καλά διαφοροποιημένο περιοχές. IHC για ALDH1A1 έδειξε πιο έντονα θετικά κύτταρα στο στερεό φύλλο από ό, τι καλοσχηματισμένα αδένες (Σχήμα S2), κατά τρόπο συνεπή με εκείνα της ανθρώπινης PDAC δείγματα (Σχήμα 1Α-Β).

Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι επίπεδα ΑΙ_ϋΗ είναι επαρκής για να καθορίσει έναν υποπληθυσμό παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα που επιδεικνύει κακή διαφοροποίηση, ανακατάληψης ικανότητες, αντοχή σε γεμσιταβίνη, και μεγαλύτερη ογκογονικότητα, τα οποία είναι συμβατά με τα τυπικά χαρακτηριστικά της ΚΕΠ.

PDAC κύτταρα ALDH-φωτεινό είναι επιλεκτικά και αποτελεσματικά αποβάλλεται από δισουλφιράμη

Επειδή εντοπίσαμε ΑΙ_ϋΗ-φωτεινό καρκινικά κύτταρα ως ιδιαίτερα γεμσιταμπίνη ανθεκτικά, έχουμε την υποψία ότι ΑίϋΗ έντονα θετικά κύτταρα ήταν υπεύθυνοι για την αντίσταση χημειοθεραπεία. Για την εξάλειψη επιλεκτικά ΑίϋΗ-φωτεινά κύτταρα, στραφήκαμε σε δισουλφιράμη, η οποία είναι ένα πολύ γνωστό μη αναστρέψιμος αναστολέας της ΑΙ_ϋΗ [19], και διερευνήθηκε η συσχέτιση μεταξύ του επιπέδου της έκφρασης ALDH και ευαισθησία δισουλφιράμη και στις τέσσερις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές PDAC. Εμείς αντιμετωπίζονται δισουλφιράμη και υπολογίζεται IC

50 τιμές βασίζονται σε αναλύσεις βιωσιμότητας. Παρατηρήσαμε μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ του ποσοστού των κυττάρων που εκφράζουν ALDH και IC

50 τιμές για δισουλφιράμη (Σχήμα 3Α και Σχήμα S3).

(Α) IC

50 δισουλφιράμη, σύμφωνα με την έκφραση ALDH. (Β) Aldefluor προσδιορισμό της δραστηριότητας ΑΙ_ϋΗ σε CFPAC-1 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με δισουλφιράμη (επάνω πάνελ) ή θεραπεία παροδικά με δισουλφιράμη ακολουθούμενη από τη διακοπή του φαρμάκου (πάνελ κάτω). (C) κυτταρομετρίας ροής δοκιμασία για 7ΑΑΌ

-AnnexinV

+ πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων μετά από θεραπεία 12 ωρών με δισουλφιράμη (10μΜ). (D) Αντιπροσωπευτική κηλίδες Western που δείχνει τα επίπεδα πρωτεΐνης ALDH1A1 σε CFPAC-1 υπό συνθήκες ελέγχου, τα κύτταρα δισουλφιράμη-αγωγή, και σε παροδικά δισουλφιράμης-κατεργασμένα κύτταρα με επακόλουθη απόσυρση της δισουλφιράμης. μετρήσεις (Ε) RT-PCR και qRT-PCR της έκφρασης mRNA σε ALDH1A1 ελέγχου και κυττάρων δισουλφιράμης-θεραπεία. * P & lt? 0.05.

Η

Η τοξικότητα των χημειοθεραπευτικών παραγόντων στο φυσιολογικό ιστό είναι μια άλλη σημαντική εκτίμηση κατά τη διάρκεια της αντικαρκινικής θεραπείας. Ως εκ τούτου, μπορούμε προσομοίωση την τοξικότητα της δισουλφιράμης μετρώντας τα αποτελέσματά τους σε μια κανονική παγκρεατικών επιθηλιακών κυττάρων γραμμή, hTERT-HPNE (Σχήμα S3). κυττάρων hTERT-HPNE ήταν σε μεγάλο βαθμό επηρεάζεται από σχετικά υψηλές συγκεντρώσεις δισουλφιράμη. Αξίζει να σημειωθεί ότι, το IC

50 δισουλφιράμης για hTERT-HPNE κύτταρα υπερέβαινε κατά πολύ εκείνες του Mia PaCa-2 και CFPAC-1 κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι ένα αρκετά ευρύ θεραπευτικό παράθυρο μπορεί να ασφαλιστεί. Σε αντίθεση με τις επιδράσεις της δισουλφιράμης επί MiaPaCa-2 και CFPAC-1 κύτταρα, το IC

50 αξίες της δισουλφιράμης για κυτταρικές σειρές PANC-1 και ASPC-1 καρκίνος ήταν πολύ υψηλό, μια διαφορά που αποδίδουμε στο χαμηλό ποσοστό του PANC-1 και κύτταρα ASPC-1 που εκφράζουν ALDH.

Στη συνέχεια, εξετάσαμε περαιτέρω τις επιπτώσεις της δισουλφιράμης επί ALDH-φωτεινό καρκινικών κυττάρων, αξιολογώντας τα επίπεδα ΑΙ_ϋΗ με κυτταρομετρία ροής στα υπόλοιπα βιώσιμα CFPAC-1 καρκινικών κυττάρων μετά από θεραπεία με δισουλφιράμη (10 μΜ) για 12 ώρες ( Σχήμα 3Β). Αυτά τα πειράματα αποκάλυψαν ότι δισουλφιράμη δεν επηρέασε σημαντικά την ALDH-χαμηλό πληθυσμό. Για να ελέγξετε εάν η επίδραση δισουλφιράμη διατηρήθηκε ακόμα και αφού είχε αφαιρεθεί, είχε αποσυρθεί από τα μέσα ενημέρωσης και τα κύτταρα στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν για 2 επιπλέον εβδομάδες. Είναι ενδιαφέρον, αφού είχε αποσυρθεί δισουλφιράμη, τα κύτταρα απέτυχαν να ανακτήσει την αρχική ιεραρχία του όγκου και επέδειξε μία επίμονη μετατόπιση προς τα αριστερά πλευρά της κατανομής κυτταρομετρίας ροής. Επιπλέον, δισουλφιράμη φάνηκε να επάγουν αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε CFPAC-1 κύτταρα, αυξάνοντας την αναλογία του 7ΑΑΌ-αρνητικών και αννεξίνης V-θετικών κυττάρων που εκπροσωπούν τους πληθυσμούς που υποβάλλονται σε πρώιμη απόπτωση (Σχήμα 3C και το Σχήμα S3). ALDH1A1 mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης παρέμεινε σταθερά μειώθηκε στις ανασυσταθείσες κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι η έκφραση ΑΙ_ϋΗ δεν αποκαταστάθηκε (Σχήμα 3D-Ε). Συλλογικά, τα αποτελέσματα αυτά υπογραμμίζουν το δυναμικό της δισουλφιράμη να επιλεκτικά και αποτελεσματικά στόχο και την εξάλειψη των ΚΕΠ που διαφορετικά θα είναι ανθεκτικά σε πρότυπο αντικαρκινικές θεραπείες. Επιπλέον, πραγματοποιήσαμε

in vitro

δοκιμασία σχηματισμού αποικιών με τη χρήση δισουλφιράμης-προεπεξεργασία κύτταρα CFPAC-1. Όπως αναμενόταν, η δισουλφιράμη προεπεξεργασμένων κύτταρα σχηματίζονται αποικίες πολύ λιγότερο συχνά από ό, τι τα κύτταρα ελέγχου έκαναν (Σχήμα S3).

Στοματική χορήγηση δισουλφιράμης επιλεκτικά απομακρύνει ALDH-υψηλής καρκινικά κύτταρα και αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου σε συνδυασμό με χαμηλή δόση gemcitabine

Για να ελεγχθεί η επίδραση της δισουλφιράμης

in vivo

, εμείς υποδόρια ένεση ποντίκια με CFPAC-1 καρκινικά κύτταρα και διαιρείται το ξένο μόσχευμα ποντίκια σε δισουλφιράμη αγωγή και το καλαμπόκι ομάδες ελέγχου λαδιού-θεραπεία. Η ανάπτυξη του όγκου καθυστέρησε σημαντικά με τη χορήγηση του δισουλφιράμης (Σχήμα 4Α). IHC για ALDH1A1 του ξενομοσχεύματος όγκων αποκάλυψε ότι η συχνότητα του ALDH1A1 ισχυρώς θετικά καρκινικά κύτταρα ήταν σημαντικά μειωμένη με δισουλφιράμη-αγωγή (Σχήμα 4Β). Μετρήσαμε τα καρκινικά κύτταρα στα πεδία υψηλής ισχύος 10 (X400) του αντιπροσώπου slide από όγκους ξενομοσχεύματος του ελέγχου (n = 3) και (η = 3) ομάδες που υπέστησαν αγωγή disulfiram. επίπεδα πρωτεΐνης ALDH1A1 μειώθηκαν επίσης σε όγκους δισουλφιράμης-αγωγή (Σχήμα 4C). Μία ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των κυττάρων που εκφράζουν ALDH-διαχωριστεί από όγκους αποκάλυψε μια μετατόπιση προς τα αριστερά της κατανομής σε ποντικούς δισουλφιράμης-θεραπεία, δείχνοντας ότι η δραστηριότητα ALDH καταστάλθηκε με δισουλφιράμη (Σχήμα 4D και σχήμα S4). Πραγματοποιήσαμε

in vivo

δοκιμασίες ογκογενετικότητας χρήση δισουλφιράμης-προεπεξεργασία κύτταρα CFPAC-1. Όπως ήταν αναμενόμενο, δισουλφιράμη-προεπεξεργασία κύτταρα είχαν την τάση να δημιουργούν μικρότερο οζίδια, σε σύγκριση με τα αντίστοιχα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα S4, P & lt? 0,05).

(Α) Ο ρυθμός αύξησης των CFPAC-1 ξενομοσχευμάτων μετρήθηκε και παρουσιάζεται ως ποσοστιαία μεταβολή του όγκου μετά από θεραπεία με δισουλφιράμη (300 mg /m

2, PO, n = 4). (Β) ανάλυση Η ιστολογική και ποσοτικοποίηση σύγκριση της συχνότητας του ALDH1A1 ισχυρώς θετικών κυττάρων στον έλεγχο και ξενομοσχεύτηκε ποντίκια δισουλφιράμης-αγωγή CFPAC-1. Γράφημα δείχνει την ποσοτικοποίηση των ALDH1A1 έντονα θετικά κύτταρα κάτω X400 μεγέθυνση σε ομάδες ελέγχου και δισουλφιράμη-θεραπεία. (C) Εκπρόσωπος κηλίδα Western που δείχνει την έκφραση της πρωτεΐνης ALDH1A1 στον έλεγχο και όγκους δισουλφιράμη-θεραπεία. (D) Aldefluor δοκιμασία της δραστικότητας ALDH σε διαχωρισμένες καρκινικά κύτταρα προέρχονται από τον έλεγχο και την δισουλφιράμη επεξεργασμένα ξενομοσχεύματα CFPAC-1. (Ε), ποσοστό αύξησης των CFPAC-1 ξενομοσχευμάτων μετρήθηκε και παρουσιάζεται ως η ποσοστιαία μεταβολή του όγκου μετά τη θεραπεία των ποντικιών με όχημα (έλεγχος), δισουλφιράμη (300 mg /m

2, PO), χαμηλή δόση gemcitabine (40 mg /m

2, ΠΕ), γεμσιταβίνη υψηλή δόση (400 mg /m

2, ΙΡ), είτε disulfiramand χαμηλή δόση gemcitabine μαζί (n ≥ 3). * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,005 και *** P & lt? 0.0005.

Η

Τέλος, θα διερευνηθούν τα πιθανά οφέλη των συνδυασμένων δισουλφιράμη και η θεραπεία γεμσιταβίνη. Αρκετές προηγούμενες κλινικές δοκιμές έχουν υιοθετήσει συνδυαστικές θεραπείες που βασίζονται σε πρωτόκολλα γκεμσιταμπίνης χαμηλή δόση για να αποφευχθεί σοβαρή τοξικότητα [29,39-41]. Ομοίως, σχεδιάσαμε ένα πρωτόκολλο που εγκρίθηκε με χαμηλή δόση γεμσιταβίνης [29] μαζί με από του στόματος δισουλφιράμη. Είναι ενθαρρυντικό, ο συνδυασμός γεμσιταβίνης χαμηλής δόσης και δισουλφιράμη κατέστειλε αποτελεσματικά την ανάπτυξη του όγκου σε ένα βαθμό συγκρίσιμο με εκείνο ενός 10-φορές υψηλότερη δόση gemcitabine (Σχήμα 4Ε). Ως εκ τούτου, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η δισουλφιράμη όχι μόνο θα μπορούσε να επιτύχει πρόσθετο /συνεργική αντικαρκινική επίδραση κατά τη θεραπεία συνδυασμού σε μας

in vivo

PDAC μοντέλα, αλλά θα επιτρέψει επίσης μια σημαντική μείωση στην απαιτούμενη δόση των κυτταροτοξικών παραγόντων.

Συζήτηση

Η θεραπεία της PDAC είναι εξαιρετικά δύσκολο, καθώς αυτό όγκος είναι συχνά ανθεκτική στη συμβατική αντικαρκινικών θεραπειών. Οι περισσότεροι ασθενείς παρουσιάζουν μια ανεγχείρητο όγκο όταν αρχικά διαγνωστεί? Ως εκ τούτου, η εντατική νεο-επικουρική ή /και μετεγχειρητικής χημειοθεραπείας /CCRT ενδείκνυται για την πλειοψηφία των ασθενών σε μια παρηγορητική σκοπό. Στην παρούσα μελέτη, περιγράφεται ένα σενάριο με το οποίο PDAC γίνεται δυσεπίλυτο σε αντικαρκινικές θεραπείες από τη σκοπιά των ΚΕΠ.