Αφηρημένο

υδαρής επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών (EOC), οι ασθενείς συχνά υποκύπτουν σε επιθετική μεταστατική νόσο, αλλά λίγα είναι γνωστά σχετικά με τη συμπεριφορά και τη γενετική της μετάστασης του καρκίνου των ωοθηκών. Εδώ, στόχος μας είναι να καταλάβουμε πώς επιπλοϊκά μεταστάσεις διαφέρουν από πρωτογενείς όγκους και πώς αυτές οι διαφορές μπορούν να επηρεάσουν τη χημειοθεραπεία. Αναλύσαμε τα προφίλ έκφρασης των miRNAs των πρωτοπαθών όγκων ΕΓΚ και των αντίστοιχων επιπλοϊκά μεταστάσεις τους από 9 ασθενείς που χρησιμοποιούν συστοιχίες miRNA Taqman qPCR. Βρίσκουμε 17 miRNAs με διαφορική έκφραση στο επιπλοϊκά βλάβες σε σύγκριση με πρωτογενείς όγκους. miR-21, miR-150 και miR-146a έχουν χαμηλή έκφραση στις περισσότερες πρωτογενείς όγκους με σημαντικά αυξημένη έκφραση σε επιπλοϊκά βλάβες, με ταυτόχρονη μειωμένη έκφραση των προβλεπόμενων στόχων mRNA με βάση την έκφραση του mRNA. Θεωρούμε ότι το miR-150 και miR-146a μεσολαβούν σφαιροειδές μέγεθος. Τόσο miR-146a και miR-150 αυξάνει τον αριθμό των υπολειμματικών κυττάρων που επιβιώνουν κατά 2-4 φορές όταν προκλήθηκαν με θανατηφόρες συγκεντρώσεις σισπλατίνης. Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι τουλάχιστον δύο από τα miRNAs, miR-146a και miR-150, up-ρυθμίζονται σε επιπλοϊκά βλαβών, την τόνωση της επιβίωσης και αύξηση της ανοχής του φαρμάκου. Οι παρατηρήσεις μας δείχνουν ότι τα καρκινικά κύτταρα σε επιπλοϊκά όγκοι εκφράζουν κλειδί miRNAs με διαφορετικό τρόπο από ό, τι πρωτοπαθών όγκων, και ότι τουλάχιστον ορισμένες από αυτές microRNAs μπορεί να είναι κρίσιμη ρυθμιστές της εμφάνισης ανθεκτικών στα φάρμακα ασθενειών

Παράθεση:. Βανγκ S, Wu ΗΤ , Fischer Α, Miller DH, MacLaughlan S, Douglass E, et al. (2013) Προσδιορισμός των ωοθηκών Μεταστατικό Καρκίνο miRNAs. PLoS ONE 8 (3): e58226. doi: 10.1371 /journal.pone.0058226

Επιμέλεια: Jin Ερ Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 21 του Σεπτεμβρίου 2012? Αποδεκτές: 31ης Γενάρη 2013? Δημοσιεύθηκε: 12, Μάρ 2013

Copyright: © 2013 Βανγκ et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Brown University κέντρο για την Υπολογιστική Μοριακή Βιολογία, βραβείο Σπόρος από το Εθνικό κέντρο Πανεπιστημίου Brown αριστείας στην Υγεία των Γυναικών, και το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας /Εθνικό κέντρο Έρευνας Πόρων χορηγήσει 5P41RR001395. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

υδαρής τα επιθηλιακά καρκίνου των ωοθηκών (EOC) είναι μια επιθετική ασθένεια για την οποία υπάρχουν λίγες αποτελεσματικές βιοδείκτες και θεραπείες. EOC συχνά διαγιγνώσκεται μετά τα καρκινικά κύτταρα έχουν ανακοινωθεί εντός της περιτοναϊκής κοιλότητας [1]. Παρά το γεγονός ότι οι μεταστάσεις αποτελούν την πλειονότητα των θανάτων που σχετίζονται με ασθένειες, μετάσταση καρκίνου των ωοθηκών παραμένει λίγο κατανοητή [1].

Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να προσδιορίσει τα χαρακτηριστικά που μπορεί να είναι σημαντική για τη δημιουργία μεταστάσεων και να καθορίσει πώς αυτοί οι παράγοντες μπορούν να επηρεάσουν τη χημειοθεραπεία απαντήσεις. Σύνθετη μεταστατική νόσος παραμένει μια αποθαρρυντική πρόκληση για τη θεραπεία, τις περισσότερες φορές οδηγεί σε επαναλαμβανόμενες, ανθεκτικών στα φάρμακα όγκων. Μεταστάσεις μπορεί να εμπλουτιστεί για μια ξεχωριστή μεταλλακτική φάσμα σε σύγκριση με πρωτογενείς όγκους [2], [3], [4]. Συγκρίνοντας πρωτογενών και μεταστατικών όγκων έχει παραγάγει σημαντικές γνώσεις σχετικά με την εξέλιξη της νόσου τόσο σε μοντέλα ζώων [5] και σε ασθενείς [2]. Για τη βελτίωση της θεραπείας της μεταστατικής νόσου, είναι ζωτικής σημασίας να κατανοήσουμε τα γονίδια και τα μονοπάτια που εμφανίζονται στα μεταστάσεις που μπορεί να μην είναι παρόντες σε πρωτογενείς όγκους. Αν και το μεταστατικό δυναμικό μπορεί να προβλεφθεί με βάση την πρωτογενή όγκο [6], [7], η παρατήρηση αυτή δεν είναι αμοιβαία αποκλειόμενες με την πιθανότητα ότι τα βασικά χαρακτηριστικά αναδύονται σε μεταστάσεις που δεν παρατηρούνται σε πρωτογενείς όγκους. Για παράδειγμα, το νέο μικροπεριβάλλον μπορεί να προκαλέσει σημαντικές φαινοτυπικές αλλαγές στα καρκινικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των αλλαγών σε μεταβολική δραστηριότητα στο επίπλουν [8], και την αύξηση της αντίστασης στα φάρμακα [9].

Προηγούμενες μελέτες έκφρασης mRNA αφού εξέτασε συμφωνημένα ωοθηκών πρωτογενή και μεταστατικούς όγκους από τον ίδιο ασθενή, υποστηρίζουν ένα μοντέλο «πρωτογενή προδιάθεση όγκου [6], [10], [11], [12]. στοιχεία έκφρασης mRNA χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες νωρίς γενιά υποδηλώνουν υπάρχουν λίγες σημαντικές διαφορές έκφραση μεταξύ επιπλοϊκά αλλοιώσεις και πρωτογενείς όγκους [13], [14], [15], ωστόσο, πολλές μελέτες έχουν περιγράψει διαφορική έκφραση των βασικών ρυθμιστικών παραγόντων μεταξύ πρωτογενών όγκων και μεταστάσεων, συμπεριλαμβανομένων E-cadherin [16], MMPs [17], [18] και οι ιντεγκρίνες [19]. Για την αντιμετώπιση αυτού εμφανής διαφορά και να αποκτήσουν νέες γνώσεις σχετικά με την κατάσταση των καρκινικών κυττάρων σε μεταστάσεις, έχουμε προφίλ έκφρασης των miRNAs σε ζεύγη των πρωτογενών ορώδες επιθηλιακών ωοθηκών (EOC) όγκους και επιπλοϊκά βλάβες. miRNA προφίλ έκφρασης προσδιορίζει miR-150 και miR-146a να είναι up-ρυθμίζονται επιπλοϊκά μεταστάσεις. Θεωρούμε ότι το miR-150 και miR-146a προωθήσει το σχηματισμό σφαιροειδές και να αυξήσει το ποσοστό των υπολειμματικών κυττάρων που επιβιώνουν μετά από έκθεση σισπλατίνη. Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι η υψηλότερη έκφραση του miR-146a και miR-150 στο επιπλοϊκά βλάβες μπορεί να οδηγήσει σε πιο επιθετική, χημειοθεραπεία ασθένεια.

Αποτελέσματα

Εντοπίσαμε 9 Στάδιο IIIC ασθενείς ορώδες επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών με ζεύγη δειγμάτων μεταστατικού όγκου πρωτοβάθμιας και επιπλοϊκά (Σχήμα S1, Πίνακας S1). Όλοι οι ασθενείς ήταν μετα-εμμηνοπαυσιακές (& gt? 55 ετών κατά τη στιγμή της διάγνωσης) και είχαν μεταστατική νόσο στο επίπλουν. Μετρήσαμε την έκφραση των miRNAs χρήση Taqman qPCR κάρτες σειρά στις 9 ζεύγη των όγκων. Κάθε όγκος είχε & gt? 70% των καρκινικών κυττάρων, και η καλή ποιότητα του RNA (Agilent Bioanalyzer RIN & gt? 5). Στόχος μας είναι να κατανοήσουμε τις αλλαγές που εκδηλώνεται κατά τη διάρκεια της εξέλιξης της νόσου, και ως εκ τούτου έχουμε επικεντρωθεί στη σύγκριση των μεταστάσεων στους πρωτοπαθείς όγκους και δεν θεωρούν φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα των ωοθηκών.

Αναγνώριση των miRNAs που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ πρωτογενών και μεταστατικών όγκων

Μετρήσαμε 377 miRNAs χρησιμοποιώντας συστοιχίες ΑΒΙ Taqman qPCR, ειδικά για ώριμη miRNAs [20], σε 9 συμφωνημένα πρωτοπαθών και μεταστατικών όγκων στον άνθρωπο. Τα 180 miRNAs εκφράζονται, σε δύο τουλάχιστον όγκους, χωρίς παγκόσμια άνω ή προς τα κάτω ρύθμιση αυτών των miRNAs μεταξύ των πρωτογενών και μεταστατικών όγκων. Σχήμα 1Α συνοψίζει τα miRNAs με μεγάλες επαναλαμβανόμενες διαφορές έκφρασης όπως προσδιορίζονται από ζεύγη t-test (Σχήμα S2). Δοκιμάσαμε την έκφραση του miR-146a και miR-150 σε δοκιμασίες που στοχεύουν ακριβώς αυτά τα miRNAs σε δύο ζεύγη των ασθενών για να επιβεβαιώσετε ότι οι αναλύσεις Taqman είναι ειδικά για αυτά τα miRNAs χωρίς cross-talk από τους άλλους 376 προσδιορισμούς (Σχήμα S3).

Α. miRNA προφίλ έκφρασης με συστοιχίες Taqman qPCR προσδιορίζει 17 miRNAs που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ 9 ζεύγη των πρωτοπαθών όγκων και επιπλοϊκά βλάβες. Επιλέχθηκαν 0.05 (paired t-test)? miRNAs με ρ & lt. Το επίπεδο έκφρασης παρουσιάζεται ως η μέση τιμή +/- τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (S.E.M.) της πτυχής αλλαγή με τη χρήση της ΔΟ

t μέθοδος σε σχέση με U6 snRNA. Κόκκινο, χαμηλότερη έκφραση σε μεταστάσεις, μπλε, υψηλότερη έκφραση σε μεταστάσεις. Β Αριστερά, χωρίς επίβλεψη ιεραρχική ομαδοποίηση των φορές οι αλλαγές των αναλυθεί ασθενών. Δεξιά, ένωση ανάλυση οικόπεδο της έκφρασης των miRNAs προσδιορίζει συστάδες miRNA αναγράφεται στο κόκκινο. Ομαδοποίηση έγινε σε Gene-E] 50].

Η

Ιεραρχική ομαδοποίηση της πτυχής αλλαγή μεταξύ πρωτογενών και μεταστατικών όγκων για τις 17 miRNAs παρουσιάζει τρεις διαφορετικές ομάδες (Εικόνα 1Β). Οι ασθενείς ήταν συγκεντρωμένα με παρόμοιες μεταβολές φορές σε έκφραση miRNA (Σχήμα 1Β, αριστερό πάνελ). Διακριτές ομάδες miRNA είναι πιο εύκολα ορατές όταν οι miRNAs συγκεντρωμένα ανεξάρτητος από τους ασθενείς (Σχήμα 1Β, δεξιό πλαίσιο). Επειδή miR-146a, miR-21 και miR-150 είναι αντιπροσωπευτικά των τριών μεγάλων πάνω ρυθμισμένα συμπλέγματα, αποφασίσαμε να επικεντρώσουμε τις προσπάθειές μας να κατανοήσουμε τις πιθανές λειτουργίες τους στον καρκίνο των ωοθηκών. Βρήκαμε ότι η έκφραση του miR-21, miR-146a, miR-150 συσχετίζεται αρνητικά με προβλεπόμενη στόχους mRNA τους (Σχήμα S4), υποδηλώνοντας ότι αυτές οι miRNAs καταστολή ενεργά έκφραση mRNA σε μεταστάσεις σε σύγκριση με πρωτογενείς όγκους. Εμείς επιλέξαμε να εστιάσουμε σε miR-146a και miR-150, επειδή αυτές οι δύο miRNAs δεν έχουν προηγουμένως εξεταστεί σε καρκίνο των ωοθηκών σε γνώση μας.

Για να καθοριστεί εάν η έκφραση αλλάζει προέρχονται από τα καρκινικά κύτταρα ή στρώμα, χρησιμοποιώντας ένα ορθογώνιο δοκιμασία, πραγματοποιήσαμε

in situ υβριδισμού

(ISH). miR-21 εκφράζεται στα δύο καρκίνο και στρώμα κυττάρων, και ρυθμίζεται προς τα πάνω σε επιπλοϊκά βλάβες, σύμφωνα με την οθόνη Taqman qPCR (Εικόνα 2Α). Με ISH, παρατηρούμε ότι τα απόλυτα επίπεδα έκφρασης είναι μεταβλητή, αλλά όλες οι 8 επιπλοϊκά βλάβες δοκιμάστηκαν δείχνουν αυξημένη έκφραση των καρκινικών κυττάρων miR-21 σε σύγκριση με την αντίστοιχη πρωτογενή όγκο (Σχήμα 2 και Σχήμα S5). Στα χέρια μας, ISH ευαισθησία είναι κακή και εξαρτάται από την ποιότητα του καθετήρα, και ήμασταν σε θέση να αποκτήσει αξιόπιστο σήμα για άλλα miRNAs, ακόμη και μετά από εξαντλητική εξέταση των βασικών μεταβλητών όπως η θερμοκρασία υβριδισμού, συγκέντρωση πρωτεϊνάσης Κ, και της συγκέντρωσης του ανιχνευτή. Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι το miR-21 προέρχεται τόσο από τον καρκίνο και τα κύτταρα του στρώματος, και ότι οι αυξήσεις των miR-21 έκφρασης σε επιπλοϊκά μεταστάσεις στα καρκινικά κύτταρα.

Α.

In situ υβριδισμού

του miR-21. Τα καρκινικά κύτταρα χρωματίζονται κόκκινα από Nuclear Red. Υψηλότερες έκφραση σε επιπλοϊκά μεταστάσεις παρατηρείται σε κάθε περίπτωση, ακόμη και με τα δύο σχετικά υψηλή και χαμηλή έκφραση miR-21 στον πρωτογενή όγκο. Τα βέλη υποδεικνύουν περιοχές της έκφρασης miR-21 συν-εντόπιση με την πυρηνική Red χρώση. Β Laser Capture μικροανατομίας (LCM) των δύο υποθέσεων αποκαλύπτει miRNAs πιθανό εκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα. Ο χάρτης θερμότητας δείχνει την αλλαγή φορές για τις 17 miRNAs που εντοπίζονται στην οθόνη χύμα όγκου. Παρόμοια μοτίβα διαφορικής έκφρασης παρατηρήθηκαν για τα miRNAs που εκφράζονται σε καρκινικά κύτταρα όπως παρατηρήθηκε σε χύμα όγκου. Μαύρο δείχνει ότι η miRNA δεν ήταν ανιχνεύσιμη στις LCM απομονώθηκαν καρκινικά κύτταρα

Η

Για να ακολουθήσει μια πιο σφαιρική ανάλυση, εμπλουτίσαμε για τα καρκινικά κύτταρα με σύλληψη Laser μικροανατομίας (LCM) της H & amp?. Ε βάφονται τα καρκινικά κύτταρα, και πραγματοποιήθηκε συστοιχίες Taqman qPCR από τις δύο περιπτώσεις. 11 από τις 17 miRNAs, τα οποία προσδιορίζονται στην οθόνη χύμα όγκου (Σχήμα 1Α), εκφράζονται σε LCM εμπλουτισμένο καρκινικά κύτταρα, και η διαφορική έκφραση μεταξύ πρωτογενών όγκων και επιπλοϊκά βλάβες είναι ποιοτικώς το ίδιο (Σχήμα 2Β, εικόνα S6). Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι η παρατηρούμενη μεταβολή στην έκφραση πιθανόν προέρχονται από τα καρκινικά κύτταρα για αυτούς τους 11 miRNAs (Σχήμα 2Β). miRNAs δεν εκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα, αλλά με μεγάλες αλλαγές έκφραση στον όγκο χύμα, όπως miR-124 και miR-370, μπορεί να υποδεικνύει την παρουσία συγκεκριμένων τύπων κυττάρων στρώματος όπως ινοβλάστες ή κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. Ήμασταν αρχικά εντυπωσιάστηκε από miR-509-3-5p, miR-508-3p, και miR-508-5p καθώς αυτά ήταν τα μόνα miRNAs κάτω-ρυθμίζονται σε μεταστάσεις στις μετρήσεις χύδην όγκου. Ωστόσο, αυτές οι τρεις miRNAs δεν εκφράζεται στα LCM εμπλουτισμένο καρκίνος κυτταρικών πληθυσμών (Σχήμα 2Β), και δεν εκφράζονται σε σημαντικό βαθμό τις εξετασθείσες κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών (Εικόνα S7), και ως εκ τούτου δεν εξετάστηκαν περαιτέρω.

Αν και LCM επιλεγμένα καρκινικά κύτταρα δεν είναι 100% του καρκίνου κύτταρα, αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν έντονα ότι miR-146a και miR-150 είναι πιθανό εκφράζονται σε καρκινικά κύτταρα και ότι η έκφραση τους είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε επιπλοϊκά μεταστάσεις. Σημαντικά, βρίσκουμε έκφραση αυτών των miRNAs σε Η &? Ε βάφονται, LCM εμπλουτισμένο καρκινικά κύτταρα σε αμφότερες τις πρωτογενείς και μεταστατικούς όγκους, σε συμφωνία με πιθανή έκφραση τους σε καρκινικά κύτταρα. TCGA διαπίστωσε ότι το miR-150 και miR-146a εκφράζονται σε χαμηλά επίπεδα στις περισσότερες πρωτογενείς όγκους [21], σύμφωνα με τις παρατηρήσεις μας.

miR-150 και miR-146a προωθήσει το σχηματισμό σφαιροειδές

συστοιχίες Taqman qPCR αποκάλυψε ότι 8 από τους 17 μεταστατικών miRNAs (Σχήμα 1Α) εκφράζονται σε πολλαπλασιαζόμενα OVCAR-8 και SKOV-3 κύτταρα (Σχήμα S7) και σε καρκινικά κύτταρα στο ανθρώπινο όγκους (Σχήμα 2Β). miR-146a εκφράζεται σε σχετικά χαμηλά επίπεδα και miR-150 δεν εκφράζεται σημαντικά, καθώς ανιχνεύθηκε μόνο πάνω από τη συνιστώμενη C

t όρια στα πολλαπλασιαζόμενα κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών ελέγχονται.

Υποθέσαμε ότι miRNAs up-ρυθμίζονται στα επιπλοϊκά βλάβες θα τονώσει την ανάπτυξη ως μέρος της ικανότητάς τους να προωθήσουν επιθετική νόσο. Δοκιμάσαμε miRNAs που εκφράζονται σε καρκινικά κύτταρα στους όγκους (Σχήμα 2Β) που επίσης συγκρατημένα εκφράζονται σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών να αποφευχθεί η υπερβολική έκφραση miRNAs σε συγκεντρώσεις υπερ-φυσιολογικά συμπεριλαμβανομένων miR-150, miR-146a, miR-708, και miR -193a-5P. Για να μοντελοποιήσουμε την υψηλότερη έκφραση των miRNAs που παρατηρείται σε επιπλοϊκά βλάβες, μπορούμε εκτοπικά εξέφρασε συνθετικό προ-Mirs και εκτελούνται κέρδος οθόνες λειτουργίας στην βιωσιμότητα των κυττάρων και σισπλατίνη αναλύσεις ευαισθησίας. Η επιμόλυνση του προ-Mirs οδηγούν σε υψηλή υπερέκφραση του miR-146a (Σχήμα S8, ενώ miR-150 είναι συγκρατημένα εκφρασμένη σε σύγκριση με U6 snRNA (ΔΟ

t ~ 3). Η έκτοπη έκφραση του miR-150 αύξησε μετρίως τον αριθμό των βιώσιμων κύτταρα σε SKOV-3 και IGROV-1 πάνω από τέσσερις ημέρες, αλλά όχι σε OVCAR-8 κύτταρα (Σχήμα 3). Κανένα από τα άλλα προ-Mirs επάγεται σημαντική, αναπαραγώγιμη αποτελέσματα επί της ανάπτυξης σε περισσότερες από μία κυτταρική γραμμή.

24 ώρες μετά την επιμόλυνση με 50 ηΜ προ-Mirs, τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων και αναπτύχθηκαν για 4 ημέρες. τα βιώσιμα κύτταρα προσδιορίστηκαν με WST -1 κανονικοποιημένη σε κύτταρα επιμολυσμένα με προ-Mirs ράβδοι σφάλματος αρνητικός έλεγχος. (SEM) αντιπροσωπεύουν indendent βιολογική τριπλούν Κάθε αναπαράγουν consistes της αποτελείται από τρία φρεάτια σε πλάκα 96 φρεατίων **, p & lt?.. 0.01, *, p & lt? 0,05 από t-test του Student

η

σφαιροειδή μοντέλο πολυκύτταρους αδρανών υλικών. στον ασκίτη των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών που καθιερώνουν μεταστάσεων [22]. τα σφαιροειδή είναι μια πιο ακριβή αναπαράσταση των όγκων και την αύξηση στοιχεία δείχνουν ότι οι αντιδράσεις του φαρμάκου είναι καλύτερα να μοντελοποιηθούν σε σφαιροειδή ό, τι σε μονοστρωματική καλλιέργεια [23], [24], [25], [26]. σχηματισμός σφαιροειδές τυπικά απαιτεί έναν ελάχιστο αριθμό κυττάρων, ακολουθούμενη από αυθόρμητη συσσωμάτωση, επιβίωση υπό αγκυροβόλιο ανεξάρτητες συνθήκες, και συμπύκνωση για την ενίσχυση της επιβίωσης των αδρανών [27]. Για να αξιολογηθεί η λειτουργία miRNA σε σφαιροειδή, έχουμε σχηματίσει ομοιόμορφο σφαιροειδή με σπορά κυττάρων σε micromolds αγαρόζης [28]. Είναι ενδιαφέρον ότι όλες οι εκφραζόμενες miRNAs είναι πάνω ρυθμισμένα σε 3D σφαιροειδή σε σύγκριση με μονοστοιβάδας χρησιμοποιώντας μια Taqman κάρτα array (Σχήμα S4). Δοκιμάσαμε miR-146a και miR-21 έκφρασης με Taqman qPCR, χρησιμοποιώντας τους εκκινητές που στοχεύουν μόνο αυτά τα δύο miRNAs, και επαναλήψιμα τηρούν up-ρύθμιση αυτών των δύο miRNAs σε σφαιροειδή (Εικόνα 4Α). Για να ελέγξετε αν τα πάνω ρύθμιση του miR-146a είναι σημαντική για το σχηματισμό σφαιροειδές, θα αναστέλλεται miR-146a με ένα κλειδωμένο νουκλεϊκό οξύ (LNA) αναστολέα. αναστολή miR-146a προκαλεί άμορφο, πιο χαλαρά σχηματίζονται σφαιροειδή και στις δύο SKOV-3 και OVCAR-8 κυττάρων μετά από δύο ημέρες (Σχήμα 4Β), σε σύγκριση με τις πιο συμπαγή σφαιροειδή που σχηματίζονται στους αρνητικούς μάρτυρες. Το αποτέλεσμα είναι πιο δραματική σε SKOV-3 από Ovcar-8. Λόγω της άμορφης φύσης αυτών των πρώτων σχηματίζουν ημέρα 2 σφαιροειδή, δεν θα μπορούσαμε να προσδιορίσει με αξιοπιστία τα μεγέθη τους. Η παρατήρηση αυτή υποδηλώνει ότι η πρόωρη σχηματισμό σφαιροειδές επηρεάζεται από μια μείωση της δραστηριότητας miR-146a. Μετά από 4 ημέρες, όταν σφαιροειδή ελέγχου έχουν πληρέστερα που σχηματίζεται μετά υποβάλλονται σε συμπίεση, η αναστολή της miR-146a με έναν αναστολέα LNA μειώνει το μέγεθος σφαιροειδή, σε σύγκριση με ένα αρνητικό LNA ελέγχου, σε SKOV-3, αλλά μόνο μέτρια σε OVCAR-8 (Σχήμα 4C ). 45 σφαιροειδή μετρήθηκαν σε κάθε επανάληψη, και τρεις ανεξάρτητες επαναλήψεις διεξήχθησαν. Το μέγεθος κάθε σφαιροειδούς προσδιορίστηκε με ImageJ και η κατανομή μεγέθους των σφαιριδίων παριστάνεται με οικόπεδα κουτί (Σχήμα 4C και 4D). σχηματισμό σφαιροειδές μπορεί να είναι προκλητική λόγω μικρές διαφορές στον αριθμό των κυττάρων που χρησιμοποιούνται για τους σπόρους κάθε σφαιροειδές. Με καλούπια αγαρόζη, αξιολογούμε ένα μεγάλο αριθμό σφαιροειδών να ξεπεράσει τις ανησυχίες με σφάλματα στον αριθμό κυττάρων που χρησιμοποιούνται για τους σπόρους των σφαιροειδών σε κάθε φρεάτιο επιτρέποντας διακριτές εξαρτώμενες διαφορές miRNA που πρέπει να τηρούνται.

24 ώρες μετά την επιμόλυνση με αντι- αναστολείς miR LNA ή μιμείται προ-miR όπως υποδεικνύεται, 700 /μl SKOV-3 ή 600 /μl OVCAR-8 κύτταρα σπάρθηκαν σε 35 micromolds καλά αγαρόζης με ένα σφαιροειδές που σχηματίζουν σε κάθε φρεάτιο. Α miR-21 και miR-146a είναι πάνω ρυθμισμένα σε 4 ημέρα SKOV-3 και OVCAR-8 σφαιροειδή ανιχνευθεί χρησιμοποιώντας Taqman qPCR κάρτες συστοιχία σε δύο αντίγραφα. Οι ράβδοι σφαλμάτων είναι s.e.m. B. Αναστολή της miR-146a με 10 ηΜ LNA καθυστερήσεις σχηματισμός σφαιροειδές και οδηγεί σε πιο άμορφη και χαλαρότερη σχηματίζονται σφαιροειδή σε SKOV-3 και OVCAR-8 μετά από 2 ημέρες. Κόκκινη γραμμή είναι 400 μm. Γ Box και οικόπεδο μουστακιού δείχνει ότι η αναστολή του miR-146a με LNAs μειώνει σημαντικά σφαιροειδές μέγεθος μετά από 4 ημέρες σε SKOV-3, και σεμνά σε OVCAR-8. Εκπρόσωπος της έκφρασης φαίνεται από τέσσερις επαναλήψεις. Δ έκτοπη έκφραση του miR-150 και miR-146a ενισχύει σημαντικά το σχηματισμό σφαιροειδές μετά από 4 ημέρες. SKOV-3 και OVCAR-8 κύτταρα επιμολύνθηκαν με 50 ηΜ προ-miR miR-150 και miR-146a προ-Mirs πριν τον σχηματισμό σφαιροειδών. SKOV-3 ή OVCAR-8 κύτταρα επιμολύνθηκαν όπως υποδεικνύεται. Αντιπροσωπευτικά σφαιροειδή εμφανίζονται. Κόκκινη γραμμή είναι 400 μm. Box και μουστακιού οικόπεδα της κατανομής μεγέθους των 45 σφαιροειδή από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα. Πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές. P-τιμές προσδιορίζονται από t-test του Student.

Η

Σύμφωνα με αυξημένη έκφραση των miRNAs σε σφαιροειδή είναι κρίσιμη για το σχηματισμό σφαιροειδές, υψηλότερα miR-150 και η έκφραση του miR-146a προώθηση μεγαλύτερων σφαιριδίων σε SKOV-3 και OVCAR-8 (Σχήμα 4D). Εισαγωγή miR-150 και miR-146a δείχνουν τις πιο συνεπείς και μεγαλύτερη επιπτώσεις στην σφαιροειδή σε σύγκριση με τον αρνητικό μάρτυρα και τις άλλες προ-Mirs δοκιμαστεί. Για miR-146a, παρατηρούμε μικρότερα σφαιροειδή όταν miR-146a αναστέλλεται (Σχήμα 4C) και μεγαλύτερα σφαιροειδή κατόπιν έκτοπη έκφραση (Εικόνα 4D) μετά από 4 ημέρες σχηματισμού σφαιροειδών. Μαζί, αυτές οι παρατηρήσεις, υποστηρίζουν miR-146a προώθηση σχηματισμό σφαιροειδές.

miR-150 και miR-146a ανοχής αύξηση σισπλατίνη

Μόλις είναι εγκατεστημένοι μεταστάσεις, ο καρκίνος των ωοθηκών είναι πολύ δύσκολο να αντιμετωπιστεί ως επαναλαμβανόμενες ανθεκτικά όγκοι συχνά επανεμφανιστούν μετά την αρχική χημειοθεραπεία. Οι αλλαγές στην έκφραση miRNA μπορεί να υποδεικνύει μια διαφορετική φυσιολογική κατάσταση για τα καρκινικά κύτταρα των μεταστάσεων που επηρεάζουν το πώς αυτές οι αλλοιώσεις θα ανταποκρίνονται στη χημειοθεραπεία. Δοκιμάσαμε το αποτέλεσμα αυξημένης έκφρασης του τέσσερα miRNAs, επάνω ρυθμισμένη σε επιπλοϊκά βλάβες, την ευαισθησία σισπλατίνη. εξαρτώμενη από τη δόση μελέτες χρησιμοποιώντας δοκιμασίες Wst-1 αποκαλύπτουν ότι υψηλότερη έκφραση του miR-150 αυξάνει συγκρατημένα η σισπλατίνη IC

50 σε SKOV-3, αλλά όχι κύτταρα της σειράς OVCAR-8 και IGROV-1 (Σχήμα 5Α). Άλλα miRNAs, όπως miR-146a, που επηρεάζονται είτε SKOV-3 ή IGROV-1, αλλά όχι τόσο σε στατιστικά σημαντικό τρόπο.

Α. Η επεξεργασία των κυττάρων με προ-miR-150 μιμούνται αυξάνει μετρίως το IC50 σισπλατίνης σε SKOV-3 και IGROV-1, αλλά όχι κύτταρα της σειράς OVCAR-8 κύτταρα. δοκιμασίες WST -1 διεξήχθησαν 48 ώρες μετά την κατεργασία σισπλατίνη. Γράφημα δείχνει μέσο όρο 3 βιολογικής επαναλήψεις. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν S.E.M. B. Σχηματική της δοκιμασίας σισπλατίνη επιβίωσης. Τα κύτταρα κατεργάστηκε δύο φορές με υψηλές συγκεντρώσεις σισπλατίνης που οδηγούν στην επιβίωση κατά περίπου 1% των κυττάρων. Γ miR-150 και miR-146a είναι πάνω ρυθμισμένα σε κύτταρα που επιβίωσαν μετά από 6 ημέρες από 50 μΜ cisplatin σε SKOV-3 και 7 ημέρες από 30 μΜ cisplatin σε OVCAR-8 κυττάρων σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα, πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα. Τα δεδομένα είναι εις διπλούν και οι ράβδοι σφάλματος είναι s.e.m. Η φορές αλλαγή για miR-150 είναι πολύ μεγάλη, γιατί miR-150 δεν ήταν ανιχνεύσιμη σε πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα. C

t ορίστηκε στο μέγιστο κύκλο δοκιμαστεί, 40, για να εκτιμηθεί η πολλαπλή μεταβολή. D. Αναστολή της miR-146a με 10 αναστολέα LNA ηΜ μειώνει σημαντικά τον αριθμό των υπολειμματικών κυττάρων σε SKOV-3 και μετρίως μειώνει τα επιζώντα κύτταρα σε OVCAR-8 μετά από 6 ημέρες από 50 μΜ cisplatin σε SKOV-3 και 7 ημέρες από 30 μΜ σισπλατίνη σε OVCAR-8 κύτταρα. Τα επιζώντα βιώσιμα κύτταρα προσδιορίστηκαν με δοκιμασία εξαίρεσης κυανούν τρυπανίου. Τα βιολογικά πειράματα εις τριπλούν φαίνεται. Οι ράβδοι σφαλμάτων είναι s.e.m. Ε Επιμόλυνση των 50 ηΜ προ-miR-146a και προ-miR-150 αυξάνουν μακροχρόνια επιβίωση μετά από 6 ημέρες από 50 μΜ cisplatin σε SKOV-3 και 7 ημέρες από 30 μΜ cisplatin σε OVCAR-8 κύτταρα.

η προσεκτική εξέταση των κυττάρων σε μονοστρωματική καλλιέργεια κατά τη διάρκεια της θεραπείας με σισπλατίνη πρότεινε ότι πιο υγιή κύτταρα επέζησαν με υψηλότερη έκφραση του miR-146a και miR-150 σε υψηλές συγκεντρώσεις σισπλατίνης. Η δυναμική περιοχή των εναπομενόντων κυττάρων είναι κάτω από το όριο ανίχνευσης της δοκιμασίας Wst-1. Πρόσφατες μελέτες έχουν προσδιορίσει αναστρέψιμες φαρμάκου ανεκτικής αδρανή κύτταρα που επιβιώνουν θανατηφόρες συγκεντρώσεις φαρμάκων [29]. Έτσι, η εξέταση των επιζώντων κυττάρων αποτελεί ένα εναλλακτικό μοντέλο για να εξετάσει πώς τα καρκινικά κύτταρα να επιβιώσουν χημειοθεραπεία. Για να ελεγχθεί αν τα μεταστατικά miRNAs προάγουν την επιβίωση σε θανατηφόρες δόσεις cisplatin, εξετάσαμε την έκφραση miRNA επιβίωσης υπολειμματικά κύτταρα σε καλλιέργεια μονοστιβάδας που εκτίθενται σε θανατηφόρες δόσεις σισπλατίνης για 6-7 ημέρες. Θεωρούμε ότι το miR-150 και miR-146a είναι σημαντικά πάνω ρυθμισμένα στα επιζόντα κύτταρα σε σύγκριση με τον πληθυσμό πολλαπλασιαζόμενο (Σχήμα 5C). miR-150 είναι μη ανιχνεύσιμο σε OVCAR-8 κυττάρων και κάτω από την ΑΒΙ συνιστώμενο κατώτατο όριο σε SKOV-3 κύτταρα (C

κύκλοι t~36) σε πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα, αλλά γίνεται σημαντικά εκφράζεται σε υπολειμματικά κύτταρα που επιβιώνουν στις δύο κυτταρικές σειρές, γεγονός που υποδηλώνει μια πιθανό ρόλο στην επιβίωση σισπλατίνη. Για να ελεγχθεί αν miR-146a επηρεάζει την ικανότητα των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών να επιβιώσουν μακροχρόνια θεραπεία σισπλατίνη, η αναστολή της miR-146a με LNAs μειώνει τον αριθμό των βιώσιμων επιβιώνουν υπολειμματικών κυττάρων συγκρατημένα σε OVCAR-8, και περισσότερο σημαντικά σε SKOV-3 κύτταρα (Σχήμα 5D). Συνεπής με αυξημένη έκφραση τους στα κύτταρα που επιβιώνουν, βρίσκουμε ότι υψηλότερη έκφραση του miR-150 ή miR-146a αυξάνει σημαντικά τον αριθμό των επιζώντων βιώσιμων κυττάρων με δοκιμασία εξαίρεσης κυανούν τρυπανίου, έξι (SKOV-3) ή επτά (OVCAR-8) ημέρες μετά την προσθήκη θανατηφόρες συγκεντρώσεις σισπλατίνης (Σχήμα 5Ε). Trypan blue είναι ένας δείκτης του αριθμού βιώσιμων κυττάρων και αντανακλά την αύξηση του αριθμού των επιζώντων κυττάρων που παρατηρείται οπτικά. Δεν είναι όλα τα εκτοπικά εξέφρασε miRNAs βελτίωση της επιβίωσης γεγονός που υποδηλώνει ότι τα αποτελέσματα του miR-150 και miR-146a είναι συγκεκριμένες. Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι η αυξημένη έκφραση του miR-150 και miR-146a προάγει την επιβίωση, ή τουλάχιστον, να καθυστερήσει προκαλείται από τη σισπλατίνη κυτταρικό θάνατο, σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

Συζήτηση

βασικά ευρήματα μας δείχνουν ότι μεταστατικούς όγκους πλειορύθμιση ειδικών miRNAs σε σύγκριση με πρωτογενείς όγκους τους και ότι, μεταξύ αυτών των miRNAs, miR-146a και miR-150 προάγουν τον σχηματισμό 3D σφαιροειδές και να αυξήσει την ανοχή έναντι σισπλατίνης σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, προτείνοντας ένα ρόλο για αυτά τα miRNAs για την επιβίωση σε συγκεκριμένες συνθήκες. Παρατηρούμε σημαντική κοινή υποτροπή της διαφορικής ρύθμισης των 17 miRNAs, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι απαιτήσεις για να προσαρμοστούν στο επίπλουν είναι πολύ παρόμοια στην πλειοψηφία των ασθενών ΕΓΚ. Μαζί, αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν την ιδέα ότι οι επιπλοϊκά αλλοιώσεις εμπλουτίζονται για τα χαρακτηριστικά της επιθετικής νόσου, η οποία μεσολαβούν επίσης την απόκριση του ασθενούς στη χημειοθεραπεία. Μερικά από αυτά τα χαρακτηριστικά, όπως το miR-146a και την έκφραση του miR-150 μπορεί να είναι μοναδικό για μεταστάσεις, καθώς είναι πολύ ταπεινός εκφράζονται σε περισσότερες πρωτογενείς όγκους στο σύνολο δεδομένων μας και TCGA [21]. Χαμηλή έκφραση αυτών των miRNAs σε πρωτογενείς όγκους συσχετίζεται με κακή συνολική επιβίωση των ασθενών [21]. Επειδή αυτά τα miRNAs είναι συχνά up-ρυθμίζονται σε επιπλοϊκά αλλοιώσεις και υψηλή συσχέτιση με την έκφραση σε πρωτογενείς όγκους (Pearson = 0,7 για το miR-150 και 0,78 για το miR-146a), προβλέπουμε ότι η υψηλότερη έκφραση σε μεταστάσεις θα πρέπει να σχετίζεται με μικρότερη συνολική επιβίωση και την εξέλιξη της νόσου.

Ένας από τους στόχους αυτής της μελέτης ήταν να κατανοήσουμε πώς παρόμοιες ή διαφορετικές πρωτογενείς όγκους των ωοθηκών είναι από επιπλοϊκά μεταστάσεις. Προηγούμενες προσπάθειες σύγκριση αυτών των όγκων έχουν εφαρμοστεί οι τεχνολογίες των μικροσυστοιχιών για να εξετάσει τα επίπεδα έκφρασης του mRNA. Με αυστηρά όρια, σχετικά μικρές διαφορές μεταξύ των πρωτογενών και μεταστατικών όγκων έχουν αναφερθεί [15]. Ωστόσο, ένας αριθμός από μελέτες αναφέρουν σημαντικές διαφορές με άλλες μεθόδους συμπεριλαμβανομένης ανοσοϊστοχημείας Ε-καδερίνης [19], MMPs [17] και το πρόσφατο εύρημα της σηματοδότησης των λιποκυττάρων που επηρεάζουν καρκινικά κύτταρα στο επίπλουν [8]. miRNAs έχουν αναδειχθεί ως βασικούς ρυθμιστές της κυτταρικής τύχης και πολυάριθμες μελέτες προφίλ miRNA προτείνουν ότι miRNAs μπορεί να έχει ένα μεγαλύτερο δυναμικό εύρος σε διαφορές έκφραση τους σε ιστούς που επιτρέπουν την ταυτοποίηση των χαρακτηριστικών των ιστών και των ειδικών υπογραφές έκφραση του όγκου.

Επειδή η στρωματικά κύτταρα διαφέρουν μεταξύ των δύο όγκων, μερικές από τις μεγάλες διαφορές miRNA έκφραση θα μπορούσε να προέρχεται από αυτά τα κύτταρα. Για να προσδιορίσει ποια, εάν υπάρχουν, διαφορές έκφραση miRNA προέρχονται από τα καρκινικά κύτταρα, εκτελέσαμε δύο πειράματα. Ήμασταν σε θέση να ανιχνεύσει miR-21 από την ISH, η οποία δείχνει αυξημένη miR-21 έκφρασης στην H & amp? Ε χρώση των καρκινικών κυττάρων (Σχήμα 2Α και Σχήμα S5). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν επίσης ότι ορισμένα αυξημένη έκφραση miR-21 σε μερικούς ασθενείς προέρχονται από κύτταρα στρώματος. Για να εκτελέσετε μια πιο ολοκληρωμένη ανάλυση, είμαστε σε συνδυασμό συστοιχίες Taqman qPCR με LCM να εξετάσει ένα εμπλουτισμένο πληθυσμό καρκινικών κυττάρων. Αυτά τα δεδομένα αποκαλύπτουν ότι ορισμένα από τα miRNAs προσδιορίζονται στο χύμα οθόνη (MIR-370, miR-124, miR-508, miR-509) είναι πιθανό να μην εκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα, καθώς δεν ανιχνεύθηκαν εύκολα στην LCM εμπλουτισμένο πληθυσμό. Από την άλλη πλευρά, 11/17 των miRNAs, συμπεριλαμβανομένων miR-146a και miR-150, τα οποία προσδιορίζονται μαζικά όγκων εκφράζονται και να διατηρούν παρόμοιες διαφορές έκφραση στα LCM εμπλουτισμένο καρκινικά κύτταρα.

Expression profiling τόσο από χύμα όγκου και LCM εμπλουτισμένο πληθυσμοί κυττάρων του καρκίνου, καθώς και δεδομένα ISH υποδηλώνουν σημαντική αυξητική ρύθμιση του miR-21 σε σύγκριση με μεταστάσεις πρωτογενών όγκων. miR-21 είναι γνωστό ότι είναι ένα αντι-αποπτωτικό, προ-επιβίωσης miRNA σε πολλούς καρκίνους, συμπεριλαμβανομένων των ωοθηκών [30], και προκαταρκτικές παρατηρήσεις μας υποστηρίζουν επίσης ρόλο miR-21 στην προώθηση σχηματισμού σφαιροειδές (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτές οι παρατηρήσεις υποστηρίζουν την ιδέα ότι επιπλοϊκά μεταστάσεις μπορεί να επιλεγεί ώστε να είναι πιο ανθεκτικά στην χημειοθεραπεία που επιβίωσαν διαφυγή από τον πρωτογενή όγκο.

miRNAs συχνά ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση μέσω δέσμευσης του 3’UTR του mRNA. Η επίδραση επί της σταθερότητας του mRNA και των συνολικών επιπέδων RNA είναι συχνά μέτριες [31], [32], εκτίμηση των αλλαγών έκφρασης mRNA μπορεί να είναι δύσκολο να παρατηρηθούν. Να αποκτήσουν εικόνα για το πώς ρυθμίζεται προς τα πάνω είναι μεταστατικά miRNAs μεσολαβούν τον πολλαπλασιασμό και την ανταπόκριση σισπλατίνη, αξιολογήσαμε προβλέψει τους στόχους τους. Θεωρούμε ότι το miR-21, οι στόχοι miR-146a και miR-150 mRNA είναι σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε σύγκριση με τυχαία επιλεγμένα σύνολα ισοδύναμα μεγέθους γονιδίου (Σχήμα S4), σύμφωνα με αυτά τα miRNAs ενεργά καταστολή mRNAs σε μεταστατικούς όγκους.

miR-150 είναι πιο γνωστός για το ρόλο της στη ρύθμιση της διαφοροποίησης των Β-κυττάρων και το χρονοδιάγραμμα της έκφρασης είναι ζωτικής σημασίας για τη σωστή ρόλο της στην προώθηση της ανάπτυξης των κυττάρων Β [33], [34]. Πρόσφατες εκθέσεις δείχνουν ότι το miR-150 μπορεί είτε να προάγουν ή αναστέλλουν όγκους [35], [36], [37], [38], υπογραμμίζοντας την κοινή θέμα του πλαισίου λειτουργιών που εξαρτώνται από miRNAs [39], [40]. Εμείς δεν τηρούν αντίστροφη συσχέτιση με την έκφραση προηγουμένως εντοπιστεί miR-150 στόχους P2RX7 [41] ή EGR2 [35] στα δεδομένα μας πρωτοβάθμια /μεταστατικού όγκου.

miR-146a έχει αναγνωριστεί ως καταστολέας των όγκων μέσω κάτω ρύθμιση του NFkB ενεργοποιητές IRAK1 και TRAF6 [42], [43]. Ωστόσο, βρίσκουμε ότι IRAK1 και TRAF6 δεν εκφράζονται σε SKOV-3 ή OVCAR-8 με qPCR (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Υπό ορισμένες συνθήκες, miR-146a είναι ογκογόνο, καταστέλλοντας BRCA1 [44] ή FAS [45]. Δεν παρατηρήσαμε σημαντική μείωση του BRCA1, BRCA2, ή έκφραση FAS κατά miR-146a έκτοπη έκφραση (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Καταστολή του BRCA1, δεν θα είχε νόημα με αυξημένη επιβίωση, η μειωμένη BRCA1 /οι λειτουργίες επιδιόρθωσης του DNA με τη μεσολάβηση BRCA2 σχετίζονται με μεγαλύτερη ευαισθησία σισπλατίνη [46]. Έτσι, miR-146a φαίνεται να λειτουργεί μέσω ενός νέου μηχανισμού σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών για την αύξηση της επιβίωσης.

Υποθέσαμε ότι οι αλλαγές στην έκφραση miRNA σε μεταστάσεις σε σύγκριση με πρωτογενείς όγκους μπορεί να υποδεικνύει λειτουργίες στο μεταστατικό περιβάλλον που διαφέρουν από την πρωταρχικό περιβάλλον του όγκου. Για να αρχίσει να μοντελοποιήσουμε το πώς αυτά τα miRNAs μπορούν να υποστηρίξουν την αειφόρο ανάπτυξη και την επιβίωση των μεταστατικών όγκων, ξεκινήσαμε μια σειρά λειτουργικών πειραμάτων χρησιμοποιώντας καθιερωμένες κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών. Χρησιμοποιήσαμε το κέρδος και την απώλεια των μελετών λειτουργίας σε σισπλατίνη δοκιμασίες κυτταρικής βιωσιμότητας για να βρείτε σημαντικές επιδράσεις του miR-146a και miR-150 στην ευαισθησία φαρμάκου ή την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. Προκαταρκτικές μελέτες έλεγχο της μετανάστευσης δεν αποκάλυψαν σημαντική εξαρτάται επιπτώσεις miRNA (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, διαπιστώνουμε ότι το miR-146a και miR-150 διαμεσολαβούν το σχηματισμό και το μέγεθος των σφαιριδίων. Καθώς τα καρκινικά κύτταρα να ξεφύγουν από την πρωτοπαθή όγκο και να εισέλθουν στην περιτοναϊκή κοιλότητα, συχνά σχηματίζουν συσσωματώματα 50-750 μm σε μέγεθος. Τα σφαιροειδή θυμίζουν εν λόγω μεγεθών απομονώθηκαν από ασθενείς [47] και μοιάζουν ξενομοσχεύματος όγκους καλύτερα από μονοστρωματική καλλιέργεια [48]. Μερικές από τις αλλαγές όπως αυξημένη έκφραση των ιντεγκρινών δει σε καθιερωμένες μεταστάσεις παρατηρούνται επίσης σε αυτά τα σφαιροειδή (τα δεδομένα δεν φαίνονται) και μπορεί να αντανακλά την κοινότητα αποτέλεσμα θυμίζει περισσότερο ανθρώπινης ασθένειας [19], [47], [49]. Οι παρατηρήσεις μας ότι miR-146a είναι πάνω ρυθμισμένα σε ανθρώπινο επιπλοϊκά μεταστάσεις, με ταυτόχρονη μείωση της προβλεπόμενης στόχους mRNA, και σφαιροειδή σε συνδυασμό με την αύξηση και την απώλεια των προσδιορισμών λειτουργίας όλα υποδεικνύουν ένα σημαντικό ρόλο για miR-146a στο σχηματισμό και τη συντήρηση των μεταστάσεων . Τα δεδομένα αυτά υποστηρίζουν, επίσης, ένα ρόλο για το miR-150, αν και χωρίς απώλεια των δεδομένων λειτουργίας, τα συμπεράσματα βασίζονται στα λειτουργικά πειράματα δεν είναι τόσο ισχυρή. Μαζί με τη δοκιμασία ανοχής σισπλατίνη, αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν την πιθανότητα ότι το miR-146a και miR-150 είναι ανάγκη να υποστηρίξουν την επιβίωση κάτω από ακραίες συνθήκες, όπως σφαιροειδές ανάπτυξης, οι υψηλές συγκεντρώσεις της θεραπείας με σισπλατίνη, και η προσαρμογή στις νέες συνθήκες περιβάλλοντος κατά τη διάρκεια της διάδοσης σε ασθενείς.

Μια προειδοποίηση αυτής της μελέτης είναι ότι αυτές οι κυτταρικές σειρές δεν μπορεί να ανακεφαλαιώσω τα βασικά χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων σε όγκους, συμπεριλαμβανομένων έκφραση του miR-150 παρατηρήθηκε σε όγκους των ωοθηκών. Η αδυναμία μας να μοντελοποιήσει σωστά τον καρκίνο των ωοθηκών

in vitro

ή

in vivo

μπορεί να επισκιάζεται πρόσθετες λειτουργίες αυτών των miRNAs πάνω ρυθμισμένα σε επιπλοϊκά μεταστάσεις. Βραχυπρόθεσμες καλλιέργειες πρόσφατα κυτταρικές σειρές που προέρχονται ή εξέταση της λειτουργίας των miRNA σε ζωικά μοντέλα μπορεί να είναι αναγκαία για την αναγνώριση επιπλέον λειτουργίες αυτών των miRNAs σε μετάσταση. Τα στοιχεία αυτά υπογραμμίζουν πώς μερικοί miRNAs μπορεί να είναι σημαντική για την επιβίωση σε συγκεκριμένες συνθήκες και έτσι επιλέγονται για αυξημένη έκφραση σε μεταστάσεις. Μελλοντικές μελέτες που εξετάζουν miR-146a και miR-150 χρησιμοποιώντας το

in vivo

μοντέλα και συστήματα συγκαλλιέργειας μπορεί να βοηθήσει παρέχουν πληροφορίες για τις λειτουργίες αυτών των miRNAs.

Μία από τις μεγαλύτερες προκλήσεις στην αντιμετώπιση προχωρημένο