Αφηρημένο

BORIS /CTCFL είναι ένα μέλος της οικογένειας αντιγόνου καρκίνου των όρχεων που εκφράζεται συνήθως σε βλαστικά κύτταρα. Σε όγκους, αυτό εκφράζεται μη φυσιολογικά αν και οι λειτουργίες της δεν είναι εντελώς καλά καθορισμένες. Για την καλύτερη κατανόηση των λειτουργιών του BORIS στον καρκίνο, επιλέξαμε τα εμβρυϊκά καρκινικά κύτταρα ως μοντέλο. Χρησιμοποιώντας ένα μοριακό φάρο, το οποίο στοχεύει ειδικά

BORIS

mRNA, αποδείξαμε ότι BORIS θετικά κύτταρα είναι ένα μικρό υποπληθυσμό των κυττάρων του όγκου (3-5% του συνόλου). Οι BORIS-θετικά κύτταρα απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας BORIS-μοριακό φάρο, εξέφρασε την υψηλότερη τελομεράση

hTERT

, βλαστικών κυττάρων (

Nanog, Oct4, SOX2

) και τα γονίδια σήμανσης του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων (

CD44

και

ΑΙ_ϋΗ1

) σε σύγκριση με τα BORIS-αρνητικά κύτταρα όγκου. Προκειμένου να καθορίσει το λειτουργικό ρόλο της BORIS, σταθερή BORIS-εξαντλημένο εμβρυϊκά καρκινικά κύτταρα δημιουργήθηκαν.

BORIS

φίμωση έντονα κάτω ρυθμίζεται η έκφραση

hTERT

, τα βλαστικά γονίδια σήμανσης κυττάρων των κυττάρων και βλαστικών καρκίνο. Επιπλέον, η knockdown BORIS αυξημένη κυτταρική γήρανση σε εμβρυϊκά καρκινικά κύτταρα, αποκαλύπτοντας ένα υποθετικό ρόλο του BORIS στο βιολογικό πρόγραμμα γήρανσης. Τα δεδομένα μας δείχνουν μια συσχέτιση της BORIS κυττάρων που εκφράζουν υποπληθυσμός με την έκφραση των γονιδίων βλαστική ικανότητα, τονίζοντας τον κρίσιμο ρόλο που διαδραματίζουν οι BORIS σε εμβρυϊκά νεοπλασματική νόσο

Παράθεση:. Alberti L, Renaud S, Losi L, Leyvraz S, Benhattar J (2014) υψηλή έκφραση του

hTERT

και γονίδια βλαστική ικανότητα στην BORIS /CTCFL Θετικά κύτταρα που απομονώθηκαν από τα κύτταρα του καρκίνου εμβρυϊκά. PLoS ONE 9 (10): e109921. doi: 10.1371 /journal.pone.0109921

Επιμέλεια: Gabriele Saretzki, Πανεπιστήμιο του Νιούκαστλ, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 20 του Ιουνίου 2014? Αποδεκτές: 12 Σεπτεμβρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 3η Οκτωβρίου 2014

Copyright: © 2014 Alberti et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση: Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από το Ελβετικό Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών (αριθμός επιχορήγηση: 31003A-113505? Www.snf.ch).? και Emma Ίδρυμα Muschamp (www.s-a-v.org/-Fondations-associees-.html). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Ένας από τους συγγραφείς (JB) απασχολείται από ένα εργαστήριο μοριακής παθολογίας (Lab Biopath ). Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Αδελφός του ρυθμιστή των χώρων αποτύπωση (ΜΠΟΡΙΣ) επίσης σχεδιαστεί ως CTCFL, CCCTC δεσμευτικό παράγοντα -όπως είναι μια δεσμευτική του DNA πρωτεΐνη με λειτουργίες στον καρκίνο δεν είναι πλήρως κατανοητοί. CTCF είναι μια εξαιρετικά συντηρημένη, εκφράζεται παντού, πολυλειτουργικό παράγοντα χρωματίνη που παίζει ρόλο ως ογκοκατασταλτικό γονίδιο [1] – [3]. ΜΠΟΡΙΣ είναι ένα θηλαστικό παράλογο της CTCF, μοιράζονται την ίδια 11 τομείς ψευδαργύρου-δακτύλου, αλλά διαφέρουν σε Ν- και C- άκρα. Μέσα σε αυτό το πεδίο ψευδαργύρου-δακτύλου, BORIS και CTCF παρουσιάζουν 70% ομολογία [4]. Σε φυσιολογικούς ιστούς,

BORIS

έκφραση περιορίζεται σε γεννητικά κύτταρα, όπου εμπλέκεται σε επιγενετικές επαναπρογραμματισμό [4], [5].

BORIS

εκφράζεται σε σπερματοκύτταρα κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης αρσενικό βλαστικής, προφανώς ελλείψει CTCF [4]. Σε όγκους, BORIS εκφράζεται μη φυσιολογικά και μεταγραφή του ανιχνεύθηκε σε διάφορα επίπεδα σε αρκετές καρκινικές κυτταρικές σειρές και σε πρωτογενείς όγκους [6]. Λόγω της περιορισμένης έκφρασης του στην κανονική του βλαστικού ιστούς και επανέκφραση του σε μια ευρεία ποικιλία όγκων, BORIS ανήκει στο καρκινικό αντιγόνο όρχεων οικογένεια (CTA). Έχει δειχθεί ότι BORIS επαγόμενη έκφραση άλλων γονιδίων CTA, ως ΜΑΟΕ-Α1, NY-ESO-1 [7], [8] και Spanx [9], αλλά όχι σε όλους τους όγκους [10], [11]. Επιπλέον, έχουμε προηγουμένως έδειξαν ότι BORIS ενεργοποιείται

hTERT

έκφραση με σύνδεση με το πρώτο εξόνιο του

hTERT

γονίδιο της τελομεράσης σε εμβρυϊκά και ωοθήκης κύτταρα όγκου [12]. Επιπλέον, σε μελέτες του εξωγενούς έκφρασης BORIS σε φυσιολογικά BORIS-αρνητικά κύτταρα, αποδείξαμε ότι αυτά τα επιμολυσμένα κύτταρα εμφάνισαν υψηλά επίπεδα

hTERT

mRNA [12]. Όλα αυτά τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ένα σημαντικό ρόλο στον Boris στη διαδικασία αθανατοποίηση κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης. Είναι ενδιαφέρον, οι τρέχουσες εκθέσεις δείχνουν μια συσχέτιση μεταξύ

hTERT

έκφρασης και βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με ιδιότητες [13] – [17]. Περαιτέρω έρευνες σχετικά με τη σχέση μεταξύ των λειτουργιών BORIS και τους κύριους ρόλους της hTERT στην αθανατοποίηση και βλαστική ικανότητα ιδιότητες πρέπει να εκτελεστεί. Ένα άλλο ζήτημα δεν έχει ακόμη ξεκάθαρα απαντηθεί είναι το πώς πολλά κύτταρα, μέσα σε μια κυτταρική γραμμή όγκου, εκφράζουν

BORIS

. Σε αυτή την εργασία, θα αντιμετωπίσει αυτά τα ζητήματα. Για το σκοπό αυτό, επιλέξαμε να χρησιμοποιήσουμε την τεχνολογία απεικόνισης μοριακών φάρων (ΜΒ), καθώς είναι εγκεκριμένη μέθοδος για την ανίχνευση και επίσης για να απεικονίσει την έκφραση του mRNA [18]. MBs είναι ολιγονουκλεοτίδια δομημένη ως φουρκέτας stem-loop με ένα καταστολέα φθορισμού στο ένα άκρο και, στο αντίθετο άκρο, μία φθορίζουσα χρωστική που ονομάζεται επίσης φθοροφόρο. Λόγω της ιδιαίτερης δομής τους, MBs εκπέμπουν σήματα φθορισμού μόνο όταν συνδέεται με τους στόχους τους. Για να διερευνηθεί η συχνότητα του BORIS-θετικών κυττάρων εντός καρκινικές κυτταρικές σειρές, η πρώτη μας σχεδιάστηκε ένας

BORIS

mRNA στόχευσης MB, και στη συνέχεια, αναλύσαμε

BORIS

έκφρασης σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές εμβρυϊκών και των ωοθηκών, αντίστοιχα NCCIT και OVCAR3. Μετά την επαλήθευση ότι BORIS-MB επιτρέπουν FACS διαλογή των BORIS-θετικών κυττάρων, δείξαμε ότι οι απομονωθεί BORIS-θετικών κυττάρων εκφράζεται υψηλότερο επίπεδο του mRNA της

hTERT

και βλαστική ικανότητα γονίδια σε σύγκριση με BORIS αρνητικά και μη ταξινομημένα κύτταρα NCCIT . Επιβεβαιώσαμε περαιτέρω αυτό το αποτέλεσμα από το

BORIS

φίμωση μελέτες. Επιπλέον, δείξαμε ότι BORIS προστατεύει από τη διαδικασία γήρανσης. Συνολικά, τα στοιχεία μας επιβεβαιώνουν άμεσο ρόλο της BORIS στην εμβρυϊκή νεοπλασματική νόσο

Υλικά και Μέθοδοι

Cells

Οι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές (BJ, ινοβλάστες ακροποσθίας?. HeLa, του τραχήλου της μήτρας αδενοκαρκίνωμα? NCCIT, εμβρυϊκά καρκίνωμα? OVCAR3, ωοθήκη καρκίνωμα) αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C με 5% CO

2, είτε σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ? Gibco, Invitrogen) για κύτταρα HeLa και BJ, ή σε μέσο RPMI-1640 (Gibco, Invitrogen) για NCCIT και OVCAR3 , συμπληρωμένο με 10% της θερμότητας αδρανοποιημένου ορού εμβρύου βοός (Invitrogen) και 1% Πενικιλλίνη-Στρεπτομυκίνη (Gibco, Invitrogen).

μοριακών φάρων (MB) σχεδιασμός

Ακολουθίες BORIS-ΜΒ1 και BORIS-MB2 σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας Beacon Designer (Premier Biosoft).

BORIS

mRNA δευτεροβάθμια δομές είχαν προβλεφθεί χρησιμοποιώντας το λογισμικό mFOLD (mFOLD, https://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/) και ειδικότητα προσδιορίστηκε από την αναζήτηση BLAST (NCBI). Η αλληλουχία στόχος του BORIS-ΜΒ1 βρίσκεται στο εξόνιο 2 και ότι από τον Boris-ΜΒ2 βρίσκεται σε εξώνιο 11 του

BORIS

mRNA. Αυτές οι θέσεις επελέγησαν διότι δεν εμπίπτουν στο πεδίο ψευδαργύρου-δακτύλου και δεν cross-υβριδισμό με τις ομολογία περιοχές CTCF. Επιπλέον, η προηγούμενη μελέτη έχει δείξει ότι η εκκίνησης και τα τελειώνει περιοχές του mRNA είναι η πιο προσιτό για MBs υβριδοποίηση [19]. Η τυχαία-MB που χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας δεν ταιριάζει με καμία σειρές θηλαστικών [19]. Αλληλουχίες ήταν οι ακόλουθες: BORIS-MB1 5′-CGCTGTCTCTGCACACTCCGTCTTCAGCG-3 ‘? BORIS-ΜΒ2 5’-CAGCCATTCCTCTTTGACTCTGGCTG-3 ‘και τυχαία-ΜΒ 5′-CGACGCGACAAGCGCACCGATACGTCG-3′ (υπογραμμισμένη βάσεις αναφέρονται εκείνα συμπληρωματικές προς τις αλληλουχίες-στόχους). Ένα φθοροφόρο (Cy3 ή ATTO647) ήταν 5′-συζευγμένο και μια μαύρη τρύπα Σπρέι (BHQ-2) συνδέθηκε στο 3’-άκρο. Τα MBs αγοράστηκαν από τη Sigma και καθαρίστηκαν με υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης.

In vitro

προσδιορισμό της ειδικότητας MB

Τα ολιγονουκλεοτίδια σχεδιάστηκαν να είναι ειδικές των MBs στόχοι (BORIS-ΜΒ1 συγκεκριμένο στόχο: 5′-AAGACGGAGTGTGCAGAGAGA-3 ‘? συγκεκριμένο στόχο BORIS-MB2: 5′-CAGCCAGAGTCAAAGAGGAA-3′ και τυχαία-MB συγκεκριμένο στόχο: 5’-TATCGGTGCGCTTGTCG-3 ‘). Ένα μη-ειδικό ολιγονουκλεοτίδιο χρησιμοποιήθηκε για την

in vitro

δοκιμή των διαφόρων ΜΒ. Αυτή η μη-ειδική ολίγο, 5′-CGATGCCGAACCAATTCTCCAC-3 ‘, αντιστοιχεί σε μία παραλλαγή μεταγραφής του CTCF. Για να δοκιμαστεί η εξειδίκευση σε διάλυμα, 200 ηΜ του ΜΒ αναμίχθηκε ή όχι με 1 μΜ ολίγο σε 10 μι μέσου Opti-ΜΕΜ (Invitrogen).

Η εκπομπή προφίλ φθορισμού ελήφθησαν μετά από θέρμανση του MB-στόχος ολίγο μείγμα σε μια προοδευτική αύξηση της θερμοκρασίας που κυμαίνεται από 15 έως 80 ° C χρησιμοποιώντας 1 ° C βήματα. σήμα φθορισμού αποκτήθηκε στο τέλος του κάθε αυξανόμενο βαθμό και ανιχνεύεται στο κανάλι Cy3 χρησιμοποιώντας ένα ρότορα Gene 6000 Real-Time PCR σύστημα (Corbett Life Science).

MB παράδοσης και του φθορισμού των κυττάρων απεικόνισης

τα κύτταρα αποκολλήθηκαν χρησιμοποιώντας 0.05% θρυψίνη-ΕϋΤΑ (Invitrogen) και επαναιωρήθηκαν σε μέσο DMEM ελεύθερο ορού σε συγκέντρωση 10

6 κύτταρα /ml. Πρώτον, Cy3-BORIS-ΜΒ ή Cy3-τυχαία-ΜΒ (200 ηΜ) επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου σε παρουσία 1 μλ /κ.εκ αντιδραστηρίου επιμόλυνσης Lipofectamine RNAiMAX siRNA (Invitrogen) χρησιμοποιώντας μέσο Opti-ΜΕΜ. Το αντιδραστήριο Lipofectamine RNAiMAX χρησιμοποιήθηκε ως όχημα διανομής δεδομένου ότι σε συνθήκες μας έδωσε λιγότερο φόντο σε σύγκριση με άλλα αντιδραστήρια όπως στρεπτολυσίνη (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μετά από 10 λεπτά, το μίγμα μορφομετατροπής προστέθηκε στα αιωρούμενα κύτταρα και μαζί επωάζονται για 1 ώρα στους 37 ° C. Hoechst 33342 (Invitrogen) προστέθηκε σε συγκέντρωση 5 μg /ml κατά τη διάρκεια του τελευταίου 10 λεπτά επώασης. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν χρησιμοποιώντας Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS, Invitrogen) και επαναιωρήθηκαν σε PBS με 5 mM EDTA. Τα επιμολυσμένα κύτταρα cytocentrifugated επάνω γυάλινο πλακίδιο χρησιμοποιώντας ένα φυγοκεντρητή cytospin και εξετάστηκαν κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού (Axioplan2 Imaging, Zeiss). Το σήμα φθορισμού Cy3-coniugated MB αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το κόκκινο κανάλι και Hoechst παρατηρήθηκε 33342 εκπομπής φθορισμού σύμφωνα με μπλε καναλιού.

FACS ανάλυση και διαλογή χρησιμοποιώντας MB

Για την ανάλυση FACS και διαλογή κυττάρων, χρησιμοποιήσαμε ΜΒ συζευγμένο με ATTO 647, μία χρωστική η οποία χαρακτηρίζεται από υψηλή photostability του [20]. Τα κύτταρα παρασκευάστηκαν και επωάστηκαν με ΜΒ όπως περιγράφηκε παραπάνω (εκτός από το ότι δεν προστέθηκε Hoechst 33342) και ήταν άμεσα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρόμετρο ροής Γάλλιο (Beckman Coulter). Τουλάχιστον 10.000 συμβάντα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν με Kaluza Software. Οι BORIS-θετικά και BORIS αρνητικών πληθυσμοί διαχωρίστηκαν μετά τον αποκλεισμό των νεκρών κυττάρων από ιωδιούχου προπιδίου (PI) χρώση χρησιμοποιώντας FACSAria Ι (Becton Dickinson) μέσου στην Εγκατάσταση κυτταρομετρίας ροής των UNIL (Πανεπιστήμιο της Λωζάνης, Ελβετία). Σειρές των 2 × 10

4-9 × 10

4 BORIS-θετικών κυττάρων και 2 × 10

5-9 × 10

5 BORIS-αρνητικά κύτταρα ταξινομημένο.

BORIS νοκ ντάουν από επαγώγιμου λεντοϊού σύστημα shRNA

σταθερές κυτταρικές σειρές με επαγώγιμα εκφράζει τα siRNAs που στοχεύουν ανθρώπινη

BORIS

mRNA παρήχθησαν χρησιμοποιώντας την δοξυκυκλίνη επαγόμενο λεντοϊού σύστημα shRNA, pINDUCER [21]. Οι φορέα λεντοϊού pINDUCER11 εκφράζει ιδιοσυστατικά την πρωτεΐνη φθορισμού ανταποκριτή eGFP, η οποία επιτρέπει να παρακολουθείτε κύτταρα που μετατρέπονται από τον ιό. Αυτός ο φορέας περιέχει επίσης μια κασέτα με δοξυκυκλίνη επαγώγιμο προαγωγέα που ελέγχει την μεταγραφή ενός γονιδίου ανταποκριτή TRFP μαζί με το shRNA, το οποίο επιτρέπει την ανίχνευση των κυττάρων με δοξυκυκλίνη ενεργοποιημένα shRNA μεταγραφής [21]. Τέσσερα διαφορετικά shRNAmiR (shRNA) που στοχεύουν ειδικά

BORIS

, και όχι parolog του

CTCF

(ΜΠΟΡΙΣ-SH1: 5′-ATTCACCAAGATCAAAGAACTC-3 ‘, BORIS-SH2: 5’-GTTCTCACAGTTTCAAATTCAA-3 ‘, BORIS-SH3: 5′-TTCATCCCGACTGTTTACAAAT-3’, BORIS-SH4: 5’TCCGACAGAAGCAACTTCTAAA-3 ‘) και ένας έλεγχος shRNA με ομελέτα ακολουθία (CTR sh: 5’CAGAGCTAACTCAGATAGTACT3’) συντέθηκαν (Sigma). Είχαν PCR ενισχυμένο και κλωνοποιήθηκε στον σκελετό pINDUCER11 χρησιμοποιώντας

EcoRI

και

XhoI

ένζυμα περιορισμού. Οι αλληλουχίες όλων των κατασκευασμάτων επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση. Lentivirus παρήχθησαν με συν-επιμόλυνση του κατάλληλου shRNA κατασκευάσματα μαζί με τους φορείς συσκευασίας (pMD2G-VSVG, pCMV-dR8.74) σε κύτταρα ΗΕΚ-293Τ χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Fugene 6 (Roche Diagnostics) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Viral υπερκείμενα συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, διηθείται μέσω ενός φίλτρου 0,45 μm πόρου, ultracentrifugated για 1.5 ώρες σε 19.500 rpm σε ρότορα Beckman SW28 και επαναιωρήθηκαν σε μέσο RPMI. Το ιικό εναιώρημα σε συνδυασμό με 8 μg /ml polybrene (Sigma) χρησιμοποιήθηκε για να μολύνει κύτταρα-στόχους (NCCIT). Είκοσι τέσσερις ώρες μετά τη μόλυνση το μέσο αντικαταστάθηκε και σταθερά μολυσμένα κύτταρα eGFP-διαλογή χρησιμοποιώντας όργανο FACSAria Ι (Becton Dickinson) στην Εγκατάσταση κυτταρομετρίας ροής των UNIL. Η επαγωγή της έκφρασης shRNA ελήφθη με προσθήκη στο μέσο του 2 μg /ml δοξυκυκλίνης (Sigma). Για να διατηρηθεί το knockdown, μεσαίου δοξυκυκλίνη περιέχον αναζωογονήθηκε κάθε 3 ημέρες.

έκφραση έκτοπη BORIS σε κύτταρα HeLa

Η προηγούμενη διαμόλυνση ημέρα, τα κύτταρα HeLa σπάρθηκαν σε πυκνότητα 2 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο σε 12 φρεατίων /πλακών. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 3 μg του προηγουμένως περιγραφέντος φορέα pCMV-BORIS [12] χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο διαμόλυνσης Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 2 ημέρες μετά την επιμόλυνση για απεικόνιση φθορισμού των κυττάρων.

Ποσοτική RT-PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy μίνι (Qiagen) συμπεριλαμβανομένων των στήλη DNAse θεραπεία σύμφωνα με την τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η συγκέντρωση του RNA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας Nanodrop 2000 (Thermo Scientific) και qubit φθορισμού Technology (Invitrogen).

Ένα σημαντικό βήμα περιοριστικό ήταν η χαμηλή ποσότητα του συνολικού RNA που απομονώνεται από κυτταρική διαλογή. Για να λυθεί αυτό το τεχνικό περιορισμό, εφαρμόσαμε μια μέθοδο που έχει ήδη περιγραφεί και επικυρωθεί [22], [23]. Πρώτον, 200 ng ολικού RNA αναδρομικά μεταγραφομένων χρησιμοποιώντας τυχαία εξαμερή και ανάστροφης μεταγραφάσης Superscript III (Invitrogen) σε τελικό όγκο 20 μΙ. Στη συνέχεια, 2 μΙ cDNA χρησιμοποιήθηκαν για μια αντίδραση προενίσχυση αποτελείται σε πολλαπλή PCR γίνεται με ένα μίγμα εκκινητών (Πίνακας S1) σε 0,1 μΜ τελική συγκέντρωση, 0,5 μονάδα Platinum Taq DNA πολυμεράσης (Invitrogen), ρυθμιστικό 1Χ PCR, και 2 mM MgCl

2 σε ένα συνολικό όγκο 25 μΙ

για προενίσχυση, συνθήκες κύκλων της PCR ήταν:. ένα στάδιο μετουσίωσης στους 95 ° C για 5 λεπτά που ακολουθείται από 15 κύκλους ενίσχυσης (45 sec στους 95 ° C , 30 sec στους 60 ° C, 1 λεπτό στους 72 ° C). Τέλος, για την ποσοτική PCR, η αντίδραση προενίσχυση ήταν 20-φορές αραιωμένα και 2 μΙ αυτού του διαλύματος χρησιμοποιήθηκαν ως εκμαγείο. Η αντίδραση συμπληρώθηκε με 0.5 μονάδες Platinum Taq DNA πολυμεράσης (Invitrogen), ρυθμιστικό PCR 1Χ, 2.5 mM MgCl

2, 2,5 μΜ SYTO9 πράσινο (Invitrogen) και 0.1 μΜ του κάθε γονιδίου ειδικό εναρκτήρα (Sigma) σε έναν τελικό όγκο 20 μλ. Οι συνθήκες PCR ήταν: 95 ° C για 5 λεπτά που ακολουθείται από κύκλους (5 sec στους 95 ° C, 30 sec στους 60 ° C, 45 sec στους 72 ° C). Τήξη αναλύσεις καμπύλη διεξήχθησαν στο τέλος της ενίσχυσης για τον έλεγχο της καθαρότητας των αμπλικονίων. Τα προϊόντα PCR επίσης φορτώθηκαν σε πηκτή αγαρόζης για να επιβεβαιωθεί το σωστό μέγεθος των ενισχυμένων προϊόντων. Ποδηλασία και φθορισμού απόκτηση έγιναν στο Rotor-Gene 6000 Real-Time PCR σύστημα (Corbett Life Science). Η ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Rotor-Gene 6000 λογισμικό. Σχετικά επίπεδα έκφρασης προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο ΔΔCt με επίπεδα έκφρασης κανονικοποιούνται σε

GAPDH

επίπεδο. Η αποτελεσματικότητα της PCR κυμαινόταν από 94 με το 101%, με συντελεστή συσχέτισης (r

2) που κυμαίνεται από 0,96 έως 1,0 για όλα τα ενισχυμένα γονίδια-στόχους. Οι τιμές Ct του

GAPDH

ήταν περίπου το ίδιο (Ct = 10.07 ± 0.25) για όλα τα κύτταρα που χρησιμοποιούνται στα ποσοτικά πειράματα RT-PCR.

Το ανθρώπινο ειδικούς εκκινητές (Πίνακας S1) έχουν σχεδιαστεί με τη χρήση Primer3 (https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) και το λογισμικό OLIGO Primer ανάλυση. Εξειδίκευση επαληθεύτηκε χρησιμοποιώντας BLAST έρευνα (NCBI). Οι σχεδιασμένο ζεύγη εκκινητών διασχίζουν τα όρια ιντρονίου-εξονίου για να αποφευχθεί η γενωμική μόλυνση DNA. BORIS εναύσματα επιλέχθηκαν (μεταξύ εξόνιο 8 και 9) με βάση τα αποτελέσματα που λαμβάνονται στο παρελθόν [24], προκειμένου να ενισχύσει το πιο άφθονο

BORIS

ισομορφές.

μεθυλίωσης του DNA ανάλυση

DNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας κιτ DNeasy (Qiagen). Μια σειρά από 200 ng (από ταξινομημένα κύτταρα) και 500 ng του DNA χρησιμοποιήθηκε για αντίδραση όξινου θειώδους χρησιμοποιώντας κιτ EpiTect Bisulfite (Qiagen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το τροποποιημένο DNA χρησιμοποιήθηκε για να ενισχύσουν ένα θραύσμα 123 bp του υποκινητή BORIS.

Η δοκιμασία μεθυλίωσης σχεδιάστηκε χρησιμοποιώντας την PyroMark Assay Design Software 1.0 (Qiagen). Αυτή η δοκιμασία επέτρεψε αλληλούχιση του 50 bp (από τη θέση -968 -918 να) μέσα στο προαγωγό Β

BORIS

[25] και περιλαμβάνονται 10 CpG. Για την εκτέλεση της αλληλουχίας, 3 μΐ κατεργασμένο με όξινο θειώδες ϋΝΑ πρώτα ενισχύθηκαν με PCR. Αλληλουχίες των εκκινητών PCR ήταν: BORIS-πυρο Forward 5 ‘TGGTTTGTGGGTTTTGT 3’ και BORIS-πυρο ΒΙΟ Reverse 5 ‘CCCTTCACCCCCCCTCTTT 3’. Οι συνθήκες PCR ήταν ως εξής: 95 ° C για 5 λεπτά? 45 κύκλοι των 95 ° C για 30 s, 58 ° C για 15 s και 72 ° C για 1 λεπτό? και ένα τελικό στάδιο επέκτασης στους 72 ° C για 10 λεπτά. Στη συνέχεια, ο καθαρισμός και η επακόλουθη επεξεργασία του βιοτινυλιωμένου θραύσμα μονόκλωνου PCR διεξήχθησαν σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Pyrosequencing αυτού θραύσματος PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα όργανο PyroMark Ε24 χρησιμοποιώντας Pyro Gold Ε24 Αντιδραστήρια (Qiagen). Το αστάρι Pyrosequencing (5 ‘GTGTTGTAGTTTATAGT 3’) χρησιμοποιήθηκε σε τελική συγκέντρωση 0,3 μΜ. Τα προκύπτοντα δεδομένα αναλύθηκαν και ποσοτικοποιούνται με το λογισμικό PyroMark Ε24 (Qiagen) η οποία υπολογίζει το ποσοστό μεθυλίωσης για κάθε θέση CpG, επιτρέποντας ποσοτικές συγκρίσεις.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ . ΜΤΤ (3- (4,5-διμεθυλο-2-θειαζολύλιο) -2,5-διφαινυλτετραζολίου, Sigma) αντιδραστήριο χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, σταθερώς μολυσμένα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 25 χ 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σε 24 φρεατίων /πλάκες με μέσο δοξυκυκλίνη περιέχουν. Μετά από 3 ημέρες, τα κύτταρα επωάστηκαν με αντιδραστήριο ΜΤΤ (200 μg /ml τελική συγκέντρωση) επί 3 ώρες στους 37 ° C. Στη συνέχεια, τα κύτταρα λύθηκαν προσθήκη ισοπροπανόλης /HCl για 10 λεπτά και οι πλάκες ανακινήθηκαν ήπια για 5 λεπτά. Οι τιμές απορρόφησης προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας μια συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας (Synergy Mx, BioTek) στα 570 nm. Κάθε πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν και 3 ανεξάρτητα πειράματα διεξήχθησαν.

Η απόπτωση ανάλυση

Η απόπτωση μετρήθηκε εις τριπλούν χρησιμοποιώντας αννεξίνη V Apoptosis Detection Kit (BD Bioscience) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Εν συντομία, 5 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο σπάρθηκαν σε 12 φρεατίων /πλάκες και αναπτύχθηκαν σε παρουσία δοξυκυκλίνης μέχρι συρροής (5-7 ημέρες). Τα επιπλέοντα κύτταρα καθώς και σε επεξεργασία με θρυψίνη κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με PBS και επαναιωρήθηκαν σε 100 μΙ ρυθμιστικό δέσμευσης. Στη συνέχεια, προστέθηκαν και επωάστηκαν με τα κύτταρα για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου 5 μΐ αννεξίνης V-V500 και 5 μΐ 7AAD. Μετά την προσθήκη 400 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος σύνδεσης τα δείγματα αναλύθηκαν αμέσως με Γάλλιο κυτταρόμετρο ροής (Beckman Coulter). Τουλάχιστον 5 × 10

4 γεγονότα μετρήθηκαν για όλα τα δείγματα. Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων εκτιμήθηκε μετά gating για eGFP και TRFP (σε μεταγωγή και δοξυκυκλίνη προκαλούμενη, αντίστοιχα) θετικά κύτταρα.

Western ανάλυση κηλίδος

λύματα ολόκληρων κυττάρων ελήφθησαν με τη χρήση ρυθμιστικού διαλύματος RIPA (Sigma ) παρουσία αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ (Sigma) και ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία BCA (Thermo Scientific). Τριάντα μικρογραμμάρια πρωτείνης φορτώθηκαν σε ένα 10% SDS-πολυακρυλαμιδίου, ακολουθούμενη από κηλίδωση σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης χρησιμοποιώντας μία συσκευή ημι-ξηράς μεταφοράς (ΒΙΟ RAD). Η μη ειδική δέσμευση παρεμποδίστηκε με ολονύκτια επώαση σε 5% άπαχο ξηρό γάλα σε ρυθμιστικό ΤΒδ-Τ (0,1% Tween 20 σε tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, TBS) στους 4 ° C. Οι μεμβράνες στη συνέχεια ανιχνεύθηκαν με αντι-ανθρώπινο BORIS /CTCFL μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (που παράγεται και ευγενώς από τον Dr Dmitri Loukinov, ΝΙΗ /niaD) χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1: 1000 σε 1% ρυθμιστικό διάλυμα μπλοκαρίσματος (1% χαμηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά γάλα σε σκόνη σε TBS -Τ ρυθμιστικού) και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 1,5 ώρες. Ως μάρτυρας φόρτωσης, αντι-ανθρώπινο αντίσωμα ποντικού β-ακτίνης (Sigma) σε αραίωση 1: 5000 σε ρυθμιστικό διάλυμα μπλοκαρίσματος 1% χρησιμοποιήθηκε και επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 45 λεπτά. Οι μεμβράνες πλύθηκαν 3 χ με ΤΒδ-Τ και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα με ραφανιδική υπεροξειδάση (HRP) -επισημασμένο κουνελιού αντι-ποντικού IgG (Sigma) σε αραίωση 1: 5000 σε ρυθμιστικό αποκλεισμού 5%. Μετά από 3 × πλύση με TBS-Τ, οι μεμβράνες αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας WesternBright Quantum (Advansta) και οπτικοποιήθηκαν με Fusion FX Χημειοφωταύγειας System (Vilber Lourmat).

Γήρανση σχετιζόμενη β-Γαλακτοσιδάση χρώση

χρώση με γήρανση συνδέεται β-γαλακτοσιδάσης (SA-β-gal) εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας κιτ χρώσης β-γαλακτοσιδάσης (BioVision), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 5 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο σπάρθηκαν σε 12 φρεατίων /πλάκες παρουσία δοξυκυκλίνης και αναπτύχθηκαν μέχρι συρροής (5-7 ημέρες). Στη συνέχεια, τα κύτταρα ξεπλύθηκαν με PBS, σταθεροποιήθηκαν για 15 λεπτά και επωάστηκαν με φρεσκοπαρασκευασμένο διάλυμα χρώσης SA-β-Gal σε 37 ° C για 24 ώρα. Μετά την πλύση με PBS, δραστικότητα SA-β-gal παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Nikon) με ανίχνευση του μπλε προετοιμασμένα κύτταρα. επιλέχθηκαν τουλάχιστον 10 ξεχωριστά πεδία. Για κάθε πεδίο μετρήθηκαν ο αριθμός των μπλε χρωματισμένο κυττάρων και ο αριθμός των συνολικών κυττάρων. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ποσοστό του SA-β-gal-θετικά κύτταρα υπολογίστηκε ως: (αριθμός μπλε κυττάρων /αριθμός συνολικών κυττάρων) χ 100.

δραστικότητα τελομεράσης

δραστικότητα της τελομεράσης μετρήθηκε με τη χρήση κιτ ανίχνευσης τελομεράσης TRAPEZE RT (Millipore). Αυτή η δοκιμασία προσδιορίζει ποσοτικά τη δράση της τελομεράσης με SYBR Green πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR [26]. Εν συντομία, τα κύτταρα λύθηκαν σε 200 μΙ ρυθμιστικού CHAPS και οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν με Nanodrop 2000. Δείγματα κυτταρολύματος (1,5 μg πρωτεΐνης /δείγμα) χρησιμοποιήθηκαν. Δείγματα αδρανοποιημένου, οι αντιδράσεις μη-πρότυπο, και θετικός έλεγχος προσδιορίστηκαν επίσης για τον έλεγχο της ποιότητας. Μία πρότυπη καμπύλη παρασκευάστηκε με διαδοχική αραίωση του προτύπου ελέγχου TSR8 ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. πολλαπλασιασμούς πραγματικό χρόνο διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας Platinum Taq DNA πολυμεράσης (2 μονάδες /δείγμα, Invitrogen). Ποδηλασία και φθορισμού απόκτηση έγιναν στο Rotor Gene 6000 σε πραγματικό χρόνο σύστημα PCR (Corbett Life Science). δράση της τελομεράσης ήταν υπολογίζονται συγκρίνοντας τις μέσες τιμές Ct από κάθε δείγμα κατά την πρότυπη καμπύλη που παράγεται από το πρότυπο ελέγχου TSR8.

Η στατιστική ανάλυση

Η στατιστική σημαντικότητα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας δύο-tailed Student t-test ανάλυση. P-value & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

In vitro

επικύρωση των μοριακών φάρων (ΜΒ)

Δύο διαφορετικές MBs συγκεκριμένες. να

BORIS

mRNA (BORIS-ΜΒ1 και BORIS-MB2) και ένας τυχαίος-MB χρησιμοποιήθηκαν σε αυτό το πείραμα. Οι θερμοκρασίες υβριδοποίησης και η εξειδίκευση των ΜΒ ελέγχθηκαν πρώτα σε διάλυμα. Η εκπομπή φθορισμού από αυτά τα MBs παρακολουθήθηκε σε θερμοκρασίες που κυμαίνονται από 25 έως 80 ° C, κάτω από διαφορετικές συνθήκες: MB μόνος, MB στην παρουσία του ειδικού στόχου, σε παρουσία ενός μη-συγκεκριμένο στόχο ή σε παρουσία ενός πλασμιδίου που περιέχει BORIS cDNA (pCMV-BORIS). Όπως φαίνεται στο Σχήμα S1, αξιοσημείωτη σήμα φθορισμού ανιχνεύθηκε μόνο όταν τα ΜΒ αναμείχθηκαν με τους συγκεκριμένους στόχους. Βέλτιστη εκπομπής φθορισμού με αποδεκτή σήματος προς υπόβαθρο αναλογία (& gt? 4) παρατηρήθηκε κάτω από τους 40 ° C. Η δοκιμασία έδειξε επίσης ότι BORIS-MBs διακρίσεις έλικος δομές μονά και διπλά, αφού δεν εκπέμπουν φθορισμό όταν επωάζεται με το πλασμίδιο pCMV-BORIS. Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι ΜΒ υβριδοποιούνται ειδικά με τις αλληλουχίες-στόχους τους και έντονα πρότειναν ότι αυτά τα MBs θα είναι σε θέση να δεσμεύονται ειδικά mRNA και όχι γονιδιωματικό DNA.

Ανίχνευση

BORIS

mRNA χρησιμοποιώντας BORIS-ΜΒ

Θα πρέπει πρώτα να εξακριβώσει αν BORIS-MBs θα μπορούσε να είναι σε θέση να διακρίνουν τις θετικές και αρνητικές BORIS κυττάρων που εκφράζουν στα ζωντανά κύτταρα. Ποσοτική RT-PCR ανιχνεύεται ισχυρά επίπεδα του

BORIS

mRNA σε κυτταρικές σειρές NCCIT και OVCAR3, ενώ αυτό το επίπεδο ήταν πολύ χαμηλή σε κύτταρα HeLa και δεν ανιχνεύεται στα κύτταρα BJ (Εικόνα 1Α), σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες [12 ]. Ως εκ τούτου, για να μελετηθεί η εξειδίκευση του ΜΒ, NCCIT χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος και κύτταρα BJ ως αρνητικός έλεγχος. κύτταρα NCCIT επιμολύνθηκαν με BORIS-MB1 ή BORIS-ΜΒ2 και εκπομπές φθορισμού μετρήθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Οι μέσες σήματα φθορισμού των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με τον Boris-ΜΒ ήταν υψηλότερο σε σύγκριση με τη μέση σήμα φθορισμού των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με τυχαία-ΜΒ. Μια αύξηση του 23,2 και 4,7 παρατηρήθηκε για BORIS-ΜΒ1 και BORIS-ΜΒ2, αντίστοιχα (Εικόνα 1Β-C). Ωστόσο, δεδομένου ότι BORIS-ΜΒ1 παρέχεται υψηλότερο (5 φορές) σημαίνει επιλέχθηκε σήμα φθορισμού σε σύγκριση με BORIS-MB2, BORIS-ΜΒ1 για τη μετέπειτα ανάλυση. Από εδώ και μετά BORIS-ΜΒ1 αναφέρεται ως BORIS-MB. Όπως ήταν αναμενόμενο, όταν BORIS αρνητικά κύτταρα BJ επιμολύνονται με BORIS-MB, που δεν έδειξε κανένα σήμα φθορισμού (Σχήμα 1D).

(Α)

BORIS

έκφρασης σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές. Ολικό RNA απομονώθηκαν από ανθρώπινο όγκων κυτταρικές σειρές: NCCIT (εμβρυϊκά), OVCAR3 (ωοθηκών), HeLa (τραχηλικό) και φυσιολογικά κύτταρα BJ (ινοβλάστες). τα επίπεδα mRNA της

BORIS

αναλύθηκαν από qRT-PCR. Τα αποτελέσματα ήταν κανονικοποιούνται στο

GAPDH

και σχετίζονται με κύτταρα NCCIT. BJ και NCCIT θεωρήθηκαν ως αρνητικός και θετικός έλεγχος, αντίστοιχα. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD 3 ανεξάρτητων πειραμάτων. (Β) Τα σήματα φθορισμού που μετράται με κυτταρομετρία ροής των κυττάρων NCCIT επιμολυσμένα με ATTO647-BORIS-ΜΒ1 (σκούρο γκρι κορυφή) και με ATTO647-τυχαία-MB (λευκή κορυφή). (C) Τα σήματα φθορισμού που μετράται με κυτταρομετρία ροής των κυττάρων NCCIT επιμολυσμένα με ATTO647-BORIS-MB2 (ασθενής γκρίζα κορυφή) και με ATTO647-τυχαία-MB (λευκή κορυφή). (Δ) Τα σήματα φθορισμού που μετράται με κυτταρομετρία ροής των κυττάρων BJ αντιμετωπίζονται με ATTO647-BORIS-ΜΒ1 (από εδώ αναφέρεται και μετά να BORIS-MB, γκρι κορυφή) και με ATTO647-τυχαία-MB (λευκή κορυφή). (Ε)

BORIS

έκφρασης σε κύτταρα HeLa χρησιμοποιώντας BORIS-MB. Αντιπροσωπευτικές εικόνες μεταβατικά μεταμολυσμένα κύτταρα HeLa με το φορέα έκφρασης BORIS, pCMV-BORIS (κάτω) και μη επιμολυσμένα κύτταρα ελέγχου (επάνω), 20 × μεγέθυνση. (F)

BORIS

έκφρασης σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές, όπως ανιχνεύεται με χρήση BORIS-MB. Εκπρόσωπος εικόνες της BJ, NCCIT και τα κύτταρα OVCAR3, 20 × μεγέθυνση. Για την απεικόνιση φθορισμού, 1 × 10

6 κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για 1 ώρα σε μέσο ελεύθερο ορού ϋΜΕΜ με Cy3-BORIS-ΜΒ (200 ηΜ). Hoechst 33342 5 μg /mL προστέθηκαν κατά τα τελευταία 10 λεπτά επώασης. Διαφάνειες αναλύθηκαν με μικροσκοπία φθορισμού.

Η

Για να αμφισβητήσει περαιτέρω την ειδικότητα του BORIS-MB, κύτταρα HeLa που εξέφραζαν

BORIS

mRNA σε χαμηλό επίπεδο, ήταν παροδικά επιμολυνθεί με το ρΟΜν πλασμίδιο έκφρασης BORIS, ο οποίος περιέχει το ανθρώπινο cDNA BORIS συγχωνευμένο με πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη γονιδίου (GFP). Όπως αναμένεται, τα διαμολυσμένα κύτταρα παρουσιάζονται υψηλά σήματα φθορισμού των δύο GFP και BORIS (Σχήμα 1 Ε). Όλα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν την ικανότητα του BORIS-ΜΒ για την αξιόπιστη και ειδικά ανιχνεύει

BORIS

mRNA σε ζωντανά κύτταρα.

Ως εκ τούτου, οι κυτταρικές σειρές επιμολύνθηκαν με το BORIS-ΜΒ για να απεικονίσει

BORIS

έκφραση του mRNA με απεικόνιση φθορισμού. Όπως μπορεί να φανεί από το Σχήμα 1F, το σήμα φθορισμού από τον Boris-ΜΒ ήταν σαφώς ορατή σε NCCIT και OVCAR3 κύτταρα, στα οποία μόνο ένα υποσύνολο των κυττάρων ήταν φθορίζουσα. Το ποσοστό των θετικών κυττάρων BORIS σε αυτές τις κυτταρικές σειρές βρέθηκε να είναι μεταξύ 3 και 5%. Όπως ήταν αναμενόμενο, σε BJ φυσιολογική κυτταρική σειρά δεν παρατηρήθηκαν φθορίζοντα κύτταρα. Σε κύτταρα HeLa, ο αριθμός των θετικών κυττάρων BORIS ήταν εξαιρετικά χαμηλή, μικρότερη από 0,1% (Σχήμα 1 Ε). Συνολικά αυτά τα πειράματα έδειξαν ότι εντός κυτταρικές σειρές όγκων,

BORIS

mRNA δεν είναι παρούσα σε όλα τα κύτταρα, αλλά μάλλον συμβαίνει μόνο σε ένα υποσύνολο των κυττάρων.

Απομόνωση κυτταρικού πληθυσμού που εκφράζει

BORIS

mRNA χρησιμοποιώντας BORIS-ΜΒ

NCCIT χρησιμοποιήθηκε για την απομόνωση του BORIS-θετικά κύτταρα. FACS διαλογή εκτελέστηκε μετά από κυτταρική επιμόλυνση με BORIS-ΜΒ. Οι BORIS-θετικά και BORIS-αρνητικά κύτταρα (8.4 ± 1.5 και 41.5 ± 7.2% του συνόλου, αντίστοιχα? Μέση ± SD) ταξινομήθηκαν (Σχήμα 2Α)

(Α) κύτταρα NCCIT επιμολύνθηκαν με ATTO647-. RANDOM-MB (λευκή κορυφή) και ATTO647-BORIS-MB (γκρι κορυφή). Οι δύο υποπληθυσμούς, BORIS-αρνητικών και BORIS-θετικά κύτταρα επιλέχθηκαν με σύγκριση του σήματος φθορισμού των τυχαίων-ΜΒ με εκείνη του BORIS-ΜΒ. Μετά τον αποκλεισμό των νεκρών κυττάρων με χρώση ΡΙ, τα δύο κλάσματα ταξινομημένο. (Β)

BORIS

έκφραση των απομονωμένων BORIS αρνητικά και BORIS-θετικά κλάσματα αναλύθηκε με qRT-PCR. Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν για να

GAPDH

και που σχετίζονται με τα κύτταρα μη ταξινομημένο NCCIT. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD 3 ανεξάρτητων πειραμάτων. Αστερίσκος υποδηλώνει στατιστικά σημαντική διαφορά (p & lt? 0,05). Μεταξύ BORIS-θετικά και μη ταξινομημένα κύτταρα

Η

BORIS

ανάλυση της έκφρασης έδειξε ότι το επίπεδο

BORIS

mRNA της ταξινομημένο BORIS-θετικών κυττάρων ήταν 20 φορές υψηλότερη σε σύγκριση με τα μη ταξινομημένα κύτταρα (Σχήμα 2Β). Αυτό το αποτέλεσμα απέδειξε την αποτελεσματικότητα της μεθόδου διαλογής και την επιτυχή εμπλουτισμό ενός πληθυσμού κυττάρων που εκφράζουν

BORIS

mRNA.

Τα απομονωμένα BORIS-θετικών και BORIS-αρνητικά κύτταρα έχουν παρόμοιο πρότυπο μεθυλίωσης του BORIS υποστηρικτής Β

σε μια προηγούμενη μελέτη, δείξαμε ότι

BORIS

έκφραση ελέγχεται από τρεις εναλλακτικές υποστηρικτές, που αντιστοιχεί σε θέσεις έναρξης της μεταγραφής σε -1447, -899 και -658 bp ανοδικά του πρώτα ATG και έχει οριστεί ως υποκινητές Α, Β και C, αντίστοιχα [25]. Είναι ενδιαφέρον, έχει παρατηρηθεί ότι σε όγκους, απομεθυλίωση BORIS προαγωγού Β, κατά κανόνα σχετίζεται με την έκφραση του

BORIS

, η οποία δεν είναι η περίπτωση για τους φορείς C και μία [25]. Ως εκ τούτου, εμείς ανέκριναν την πιθανή συσχέτιση μεταξύ μεθυλίωσης του υποκινητή Β και

BORIS

έκφραση στα ταξινομημένα κύτταρα. BORIS επίπεδο μεθυλίωσης αυτού του υποκινητή μετρήθηκε με Pyrosequencing, μετά όξινο θειώδες τροποποίηση του DNA που εξάγεται από BORIS-θετικών και BORIS-αρνητικά κύτταρα. Αποτελέσματα Pyrosequencing έδειξαν ότι και στις δύο κλάσματα, τα CpGs ήταν βαριά μεθυλιωμένα (85-100% μεθυλίωση) και δεν ανιχνεύθηκαν διαφορές (Σχήμα 3Α). Αυτό επιβεβαίωσε ότι στα κύτταρα NCCIT,

BORIS

έκφραση που δεν ρυθμίζονται από τον υποστηρικτή Β και πρότεινε ότι η διαφορετική έκφραση του

BORIS

μεταξύ των ταξινομημένα κλάσματα δεν καθοδηγείται από την κατάσταση μεθυλίωσης του DNA του προαγωγού Β, αλλά μάλλον εμπλέκονται άλλα επίπεδα ελέγχου. ανάλυση

(Α) η μεθυλίωση του 10 CpG νησίδων εντός του

BORIS

περιοχή του υποκινητή (υποκινητής Β). Ο εκπρόσωπος γράφημα δείχνει το ποσοστό της μεθυλίωσης του κάθε νησιού CpG για την απομονωμένη BORIS θετικά (λευκό), -αρνητικοί (γκρι) και μη ταξινομημένα κύτταρα (μαύρο) NCCIT. ανάλυση (Β) Έκφραση της απομονωμένης BORIS-θετικά (λευκό) και BORIS-αρνητικό (γκρι) κλάσματα.