Abstract

Ιστορικό

CD166, επίσης γνωστή ως ενεργοποιημένο μόριο προσκόλλησης λευκοκυττάρων (ALCAM), εκφράζεται από διάφορα κύτταρα σε αρκετούς ιστούς συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου. Ωστόσο, ο ρόλος του CD166 σε κακοήθεις όγκους είναι αμφιλεγόμενη, ειδικά στον καρκίνο του παγκρέατος. Αυτή η μελέτη είχε ως στόχο να αποσαφηνίσει το ρόλο και τη σημασία της έκφρασης CD166 με καρκίνο του παγκρέατος.

Μέθοδοι

Πραγματοποιήσαμε ανοσοϊστοχημείας και κυτταρομετρίας ροής για την ανάλυση της έκφρασης του CD166 σε χειρουργική παγκρέατος ιστούς και παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές . Οι διαφορές μεταξύ των απομονωμένων CD166 + και CD166- παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα αναλύθηκαν με προσδιορισμούς εισβολή και τη μετανάστευση, και σε μοντέλα ξενομοσχεύματος ποντικού. Πραγματοποιήσαμε επίσης ποσοτικής RT-PCR και μικροσυστοιχιών αναλύσεις για την αξιολόγηση των επιπέδων έκφρασης του CD166 και σχετικών γονιδίων σε καλλιεργημένα κύτταρα.

Αποτελέσματα

Η ανοσοϊστοχημεία έδειξε υψηλή έκφραση του CD166 σε παγκρεατικά καρκινικούς ιστούς (12,2% ? 12/98) σε σύγκριση με εκείνη σε φυσιολογικούς μάρτυρες πάγκρεας (0%? 0/17) (p = 0,0435). Η κυτταρομετρία ροής έδειξε ότι CD166 εκφράστηκε σε 33,8 – 70,2% των κυττάρων σε χειρουργικές παγκρεατικών ιστών και μηδέν έως 99,5% των παγκρεατικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών. δοκιμασίες εισβολή και τη μετανάστευση απέδειξαν ότι CD166- παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα έδειξαν ισχυρότερη επεμβατική και μεταναστευτικές δραστηριότητες από εκείνες του CD166 + καρκινικά κύτταρα (ρ & lt? 0,05). Από την άλλη πλευρά, τα κύτταρα CD166 + Panc-1 έδειξε μία σημαντικά ισχυρότερη δραστικότητα σχηματισμού αποικίας από εκείνη των κυττάρων CD166- Panc-1 (ρ & lt? 0,05).

In vivo

ανάλυση αποκάλυψε ότι CD166 + κυττάρων που προκαλείται σημαντικά μεγαλύτερη ανάπτυξη του όγκου από εκείνη των κυττάρων CD166- (ρ & lt? 0,05) και στα δύο μοντέλα υποδόρια και ορθοτοπική όγκου ποντικού. mRNA έκφραση της επιθηλιακής-μεσεγχυματικής ενεργοποιητής μετάβαση Zeb1 ήταν υπερ-εκφράζεται σε κύτταρα CD166- (ρ & lt? 0.001). ανάλυσης μικροσυστοιχιών έδειξαν ότι TSPAN8 και BST2 ήταν υπερ-εκφράζεται σε CD166 + κύτταρα, ενώ BMP7 και Col6A1 ήταν υπερ-εκφράζεται σε κύτταρα CD166-.

Συμπεράσματα

CD166 + παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα είναι έντονα ογκογόνο, ενώ CD166- παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα εμφανίζουν συγκριτικά ισχυρότερη επεμβατική και μεταναστευτικών δραστηριότητες. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η έκφραση CD166 συνδέεται με διαφορετικές λειτουργίες σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

Παράθεση:. Fujiwara K, Ohuchida Κ, Sada Μ, Horioka Κ, Ulrich CD ΙΙΙ, Shindo K, et al. (2014) Έκφραση CD166 /ALCAM είναι χαρακτηριστικό της Ογκογονικότητα και επεμβατική και μεταναστευτικών Δραστηριότητες κύτταρα καρκίνου του παγκρέατος. PLoS ONE 9 (9): e107247. doi: 10.1371 /journal.pone.0107247

Επιμέλεια: Ντχιάνι Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 11 Απριλίου 2014? Αποδεκτές: 8 Αύγ, 2014? Δημοσιεύθηκε: 15 Σεπτεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Fujiwara et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. δεδομένων των μικροσυστοιχιών είναι διαθέσιμα από Gene Expression Omnibus (GEO) στο NCBI (αριθμός ένταξης GSE55294)

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από επιχορηγήσεις-in-Aid από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας της Ιαπωνίας (αριθμός Grant: 23390327, 24390318, 24390319, 25670584, 25670585, 25670586, 241237) και το Ίδρυμα Φουκουόκα για το Sound Υγείας (https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/) ( https://www.sukoken.or.jp/). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια από τις πιο θανατηφόρες ανθρώπινες κακοήθειες, με ποσοστό επιβίωσης 5 ετών μικρότερη από 5% [1]. Αυτή η κακή έκβαση είναι σε μεγάλο βαθμό επειδή η έγκαιρη διάγνωση είναι ασυνήθιστο και συμβατικά θεραπευτικά όπως χειρουργική εκτομή, χημειοθεραπεία, ακτινοθεραπεία και έχουν περιορισμένη αποτελεσματικότητα [1], [2]. Ως εκ τούτου, οι νέες στρατηγικές απαιτούνται επειγόντως για τη θεραπεία του καρκίνου. Πρόσφατα, η έννοια των καρκινικών βλαστικών κυττάρων (ΚΕΠ) έχει λάβει σημαντική προσοχή. ΚΕΠ περιλαμβάνουν ένα πολύ μικρό πληθυσμό των καρκινικών κυττάρων που έχουν την ικανότητα να ξεκινήσει και να διατηρήσει το σχηματισμό όγκων [3]. Κατά συνέπεια, στοχευμένη θεραπεία αυτού του μικρού πληθυσμού κυττάρων σε καρκίνο θα μπορούσε να είναι πιο αποτελεσματική από τις τρέχουσες θεραπείες συμπεριλαμβανομένων εκείνων για τον καρκίνο του παγκρέατος.

CD166, επίσης γνωστή ως ενεργοποιημένα λευκοκύτταρα μόριο κυτταρικής προσκόλλησης (ALCAM), είναι ένα μέλος της ανοσοσφαιρίνης υπεροικογένεια [4]. Είναι ανιχνεύσιμη σε μία ευρεία ποικιλία τύπων κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των επιθηλιακών κυττάρων, λεμφοειδών κυττάρων, μυελοειδή κύτταρα, ινοβλάστες, νευρωνικά κύτταρα, ηπατοκύτταρα και κύτταρα μυελού των οστών [5]. CD166 έχει αναφερθεί ότι είναι ένας δείκτης για CSCs σε καρκίνο του παχέος εντέρου και του καρκίνου του προστάτη, γεγονός που υποδεικνύει ισχυρή ογκογονικότητα [6], [7]. Επιπλέον, η υπερέκφραση του έχει αναφερθεί ως ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης για ορισμένες μορφές καρκίνου [8]. Από την άλλη πλευρά, η αναστολή της CD166 έχει αποδειχθεί ότι ενισχύει διεισδυτική και μεταναστευτική δραστηριότητες σε κύτταρα καρκινώματος και γλοιοβλαστώματος ωοθηκών [9], [10]. Στον καρκίνο του παγκρέατος, υπήρξαν στοιχεία που αναφέρθηκαν σχετικά με τη σχέση ανάμεσα στην έκφραση και την πρόγνωση των δεδομένων CD166, αλλά εξακολουθεί να είναι αμφιλεγόμενη [11] – [13]

Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε τη σημασία της έκφρασης CD166. στον καρκίνο του παγκρέατος. Βρήκαμε ότι CD166 + παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα παρουσίασαν ισχυρότερη ογκογενετικότητας από εκείνη των κυττάρων CD166-, ενώ CD166- καρκίνο του παγκρέατος κύτταρα παρουσίασαν συγκριτικά ισχυρότερη επεμβατική και μεταναστευτικών δραστηριότητες. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η έκφραση CD166 συνδέεται με διαφορετικές λειτουργίες σε καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Kyushu (αριθμός έγκρισης: 24-222) και διεξάγονται σύμφωνα με τις Ηθικές οδηγίες για Ανθρώπινου Γονιδιώματος /Gene Έρευνας ψηφίστηκε από την ιαπωνική κυβέρνηση και η Διακήρυξη του Ελσίνκι. Όλοι οι ασθενείς που παρέχονται υπεγράφη ενημερωμένη συγκατάθεση για την έγκριση της χρήσης των ιστών τους για ερευνητικούς σκοπούς απροσδιόριστη. πειράματα ποντίκι εγκρίθηκαν από την επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Kyushu (αριθμός έγκρισης: Α-24-262-0). Τα ζώα στεγάστηκαν κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες χωρίς παθογόνα.

Ασθενείς και του παγκρέατος ιστούς

παγκρέατος καρκινικών ιστών ελήφθησαν από ασθενείς οι οποίοι υποβλήθηκαν σε εκτομή του παγκρέατος στο ίδρυμά μας. Για ανοσοϊστοχημεία, τα δείγματα συλλέχθηκαν από 98 ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος, συμπεριλαμβανομένων 62 άνδρες και 36 γυναίκες με μέση ηλικία 65,2 έτη (εύρος: 36 έως 81 χρόνια). Τα κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά των ασθενών που περιγράφονται στον Πίνακα 1. Η συνολική επιβίωση ήταν με βάση την ημερομηνία της πράξης μέχρι την ημερομηνία θανάτου ή την τελευταία παρακολούθηση. Προγνώσεις προσδιορίστηκαν το Σεπτέμβριο του 2013. Η διάμεση συνολική χρόνος επιβίωσης ήταν 16 μήνες (εύρος: 1-135 μήνες). Εξήντα έξι ασθενείς δεν κατάφερε να επιβιώσει για την παρακολούθηση. Παρακείμενους ιστούς με τα υποδείγματα που αξιολογήθηκαν ιστολογικά σύμφωνα με τα κριτήρια της Παγκόσμιας Οργάνωσης Υγείας. Το στάδιο του όγκου αξιολογήθηκε σύμφωνα με την κατάταξη της Ένωσης για θέματα Διεθνούς Ελέγχου του Καρκίνου. Όπως ιστούς ελέγχου, λάβαμε 17 δείγματα φυσιολογικού παγκρεατικού ιστού από ανέπαφα παγκρέατα που αποκόπηκαν για τον καρκίνο του χοληφόρου πόρου, νευροενδοκρινούς όγκου, ή καλοήθη στερεάς pseudopapillary όγκου. Για την ανάλυση κυτταρομετρίας ροής, του παγκρέατος καρκινικούς ιστούς συλλέχθηκαν από πέντε ασθενείς, μεταξύ των οποίων τρεις άνδρες και δύο γυναίκες με μέση ηλικία τα 62,0 χρόνια (εύρος = 37-80 έτη), η οποία είχε εκτομή στο ίδρυμά μας μεταξύ Ιουλίου 2013 και Νοέμβριος, 2013.

η

Ανοσοϊστοχημική διαδικασίες και

αξιολόγησης

CD166 ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (κλώνος MOG /07, 1: 450? Novocastra, Newcastle upon Tyne, Ηνωμένο Βασίλειο) με ολονύκτια επώαση στους 4 ΝΤΟ. Το σύστημα EnVision (Dako, Glostrup, Denmark) χρησιμοποιήθηκε για την οπτικοποίηση της ανοσοχρώση. Τα κύτταρα θεωρήθηκαν θετικά ανοσοχρωματίστηκε όταν η μεμβράνη ή το κυτταρόπλασμα ήταν λεκιασμένο. Οι ιστοί χωρίς χρώση ή ασθενής και μέτρια ένταση χρώσης σε & lt? 70% και & lt? 30% των κυττάρων, αντίστοιχα, θεωρήθηκαν ως CD166

χαμηλή. CD166

υψηλή ανατέθηκε στους ιστούς με αδύναμο και μέτρια ένταση χρώσης σε ≥70% και ≥30% των κυττάρων, αντίστοιχα. Τμήματα αξιολογήθηκαν ανεξάρτητα από δύο ερευνητές, χωρίς καμία γνώση των κλινικών χαρακτηριστικών της κάθε περίπτωσης.

Κύτταρα και συνθήκες καλλιέργειας

Ανθρώπινο παγκρεατικά κύτταρα διαχωρίστηκαν από χειρουργική παγκρέατος ιστούς χρησιμοποιώντας έναν όγκο διαστάσεως Kit (ανθρώπινο ) και gentleMACS διαστάσεως (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach-, Γερμανία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αμέσως μετά την διάσπαση, τα κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Επιπλέον, αναλύσαμε τις ακόλουθες εννέα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές: BxPC3, CFPAC-1, SW1990, AsPC1, και Capan-2 (American Type Culture Collection, Manassas, Va)? Panc-1 (RIKEN, Tsukuba, Japan)? MIAPaCa2, κοστούμι-2, και KP-2 (Health Science Research Resources Bank, Osaka, Japan). Αναλύσαμε επίσης δύο κανονικές επιθηλίου παγκρεατικού πόρου κυτταρικές σειρές: ένα πρωτεύον κανονική παγκρεατική κυτταρική σειρά ανθρώπινων επιθηλιακών, CS-ΡΕ (DS Pharma Biomedical Co., Osaka, Japan), και ένα αθανατοποιημένο παγκρεατικού πόρου επιθηλιακή κυτταρική γραμμή, HPDE6-E6E7 κλώνο 6 ( ένα δώρο από τον Δρ Ming-Ήχος Τσάο, Πανεπιστήμιο του Τορόντο, Τορόντο, Καναδάς). Επιπλέον, τα ανθρώπινα παγκρεατικά αστεροειδή κύτταρα (ΚΕΕ) απομονώθηκαν από φρέσκο ​​παγκρεατικά δείγματα χρησιμοποιώντας τη μέθοδο έκφυση [14]. Η μεταστατική κυτταρική γραμμή SUIT-2 έχει προηγουμένως αποδειχθεί στο εργαστήριο μας [15]. Η ίδια μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί η μεταστατική κυτταρική γραμμή Panc-1. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16].

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής και κυτταρική διαχωρισμό με ανοσοαντιδραστικότητα

Τα κύτταρα από υποσυρρέουσες καλλιέργειες μονοστοιβάδας αιωρήθηκαν σε ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο διάλυμα (PBS) και επωάζονται με μονοκλωνικό αντι -ανθρώπινη ALCAM-φυκοερυθρίνη (ΡΕ) (R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ), αντι-ανθρώπινο CD24-ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) (eBioscience Inc, San Diego, CA), αντι-ανθρώπινο CD44-FITC (MBL, Nagoya, Japan), και μονοκλωνικό αντι-ανθρώπινο CD133-FITC (Ancell Corp, Bayport, ΜΝ) αντισώματα. Mouse ανοσοσφαιρίνης G1 Κ ισότυπου ελέγχου ΡΕ (eBioscience Inc) χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Mouse IgG1 Κ ισότυπου ελέγχου ΡΕ και αντι-CD11b-FITC (Miltenyi Biotec) χρησιμοποιήθηκαν για τον αποκλεισμό κυττάρων ποντικού από αναλύσεις. Τα επισημασμένα κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρόμετρο ροής (EC800? Sony Biotechnology, Tokyo, Japan). Για το διαχωρισμό των κυττάρων, επωάσαμε μαγνητικά μικροσφαιρίδια συζευγμένα με αντιδραστήριο αντι-ΡΕ (Miltenyi Biotec) με επισημασμένα κύτταρα για 15 λεπτά στους 4 ° C. Τα επισημασμένα κύτταρα απομονώθηκαν με τη διέλευση του εναιωρήματος διαμέσου ενός PRO διαχωριστή AutoMACS (Miltenyi Biotec). Unlabeled κύτταρα αρνητικά επιλέγονται και συλλέγονται με την μέθοδο εξάντληση μέσω του PRO διαχωριστή AutoMACS.

εισβολή και τη μετανάστευση προσδιορισμούς Matrigel

Η διεισδυτικότητα των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων εκτιμήθηκε από τον αριθμό των κυττάρων που εισέβαλαν μέσω Matrigel (20 μg /φρεάτιο? BD Biosciences, Bedford, μΑ) -επικαλυμμένα transwell θαλάμους με 8-μm πόρους (BD Biosciences) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16], [17]. Τα καρκινικά κύτταρα (5 × 10

4 κύτταρα /0,25 mL) σπάρθηκαν στα ανώτερα θαλάμους και επωάστηκαν για 24 ώρες (κύτταρα Panc-1) 48 ώρες (κύτταρα SW1990), ή 72 ώρες (SUIT-2 κύτταρα). Τα καρκινικά κύτταρα που μετανάστευσαν στην κάτω επιφάνεια των μεμβρανών μονιμοποιήθηκαν με 70% αιθανόλη, χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε), και πέντε τυχαία πεδία στα 200 χ μεγέθυνση μετρήθηκαν για Panc-1 και κύτταρα SW1990 ή ένα πεδίο κέντρο σε 100 × μεγέθυνσης για SUIT-2 κύτταρα κάτω από ένα μικροσκόπιο φωτός (BZ-9000E? Keyence, Osaka, Japan). Η μετανάστευση των κυττάρων του καρκίνου του παγκρέατος εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας μη επικαλυμμένα ενθέματα transwell. Οι διάρκειες επώασης για τη δοκιμασία της μετανάστευσης ήταν 18 ώρες για τα κύτταρα Panc-1, 40 ώρες για τα κύτταρα SW1990, και 24 ώρες για τα κύτταρα SUIT-2. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως ο μέσος αριθμός των μεταναστευτικών κυττάρων σε πέντε τυχαία πεδία στα 200 × μεγέθυνση. Κάθε πειραματική συνθήκη εξετάστηκε εις τριπλούν, και τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε με μέτρηση της έντασης φθορισμού του ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18 ]. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε έξι φρεάτια μιας πλάκας 24-φρεατίων (Becton Dickinson Labware, Bedford, ΜΑ) σε πυκνότητα 1 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο. Μετά από επώαση για τους υποδεικνυόμενους χρόνους, PI (30 μmol /L) και διγιτονίνη (600 μmol /L) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο για να πυρήνων ετικέτα με ΡΙ. Η ένταση φθορισμού του ΡΙ, η οποία αντιστοιχούσε στο συνολικό αριθμό κυττάρων, μετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη άπειρο F200 πολύτροπη (TECAN, Männedorf, Ελβετία).

Colony δοκιμασία σχηματισμού

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα πυκνότητα 1 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σε Nunc πιάτα 6 φρεατίων καλλιέργειας κυττάρων (Thermo Fisher Scientific ΚΚ, Yokohama, Japan) και επωάστηκαν για 10 ημέρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες και ο αριθμός των αποικιών μετρήθηκε με το Σύστημα XRS ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν πιάτα.

Σφαίρα δοκιμασία σχηματισμού

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 5 χ 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σε 6-φρεατίων εξαιρετικά χαμηλής πλάκες στερεώσεως ( Corning Inc., Corning, ΝΥ) και καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ άνευ ορού: μέσου Ham F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA) που περιείχε 20 ng /ml ανθρώπινου ανασυνδυασμένου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (PeproTech, Rocky Hill, NJ), 10 ng /ml ανθρώπινο ανασυνδυασμένο αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών-2 (PeproTech), 1% ινσουλίνη-τρανσφερίνης-Σελήνιο Solution (ITS-G), 200 U /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη. Μετά από 12 ημέρες, ο αριθμός των σφαιρών που αποτελούνται από & gt? 20 κύτταρα μετρήθηκε και απεικονίστηκε υπό μικροσκόπιο φωτός. Το πείραμα διεξήχθη δυο φορές.

δοκιμασίας προσκόλλησης

Η δοκιμασία προσκόλλησης διεξήχθη όπως περιγράφεται σε μια προηγούμενη μελέτη [12] με μικρές τροποποιήσεις. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 1 × 10

6 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 24-φρεατίων (Becton Dickinson Labware). Μετά από 60 λεπτά, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS για να απομακρυνθούν τα μη προσκολλημένα κύτταρα. Οι συγκολλητικές κύτταρα χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες και μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός. Όλες οι συνθήκες ελέγχθηκαν εις τετραπλούν και το πείραμα διεξήχθη δύο φορές.

In vivo πειράματα

Πέντε εβδομάδων θηλυκών γυμνών ποντικών εμφυτεύθηκαν υποδορίως ή ορθοτοπικά με καρκινικά κύτταρα αιωρούνται σε 100 μι PBS ως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. Τρισδιάστατο διάμετροι μετρήθηκαν για τον υπολογισμό του όγκου του όγκου. Οι ποντικοί θανατώθηκαν την υποδεικνυόμενη ημέρα και τα υποδόρια ή ορθοτοπική όγκοι αποκόπηκαν και ζυγίστηκαν. Για την ανάλυση κυτταρομετρίας ροής, κύτταρα όγκου διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας την Tumor διαστάσεως Kit (ανθρώπινη) και gentleMACS διαστάσεως.

Η σίγαση της έκφρασης CD166 με μικρό παρεμβαλλόμενο RNA

κύτταρα

Καρκίνος σε περίπου 90% συρροή επιμολύνθηκαν με CD166-7 (SI02780169) μικρές RNA παρεμβολής (siRNA) (Qiagen, Tokyo, Japan) με ηλεκτροδιάτρηση χρησιμοποιώντας το Σύστημα Nucleofector (Lonza, Bazel, Switzerland) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για να επαληθεύσετε το νοκ ντάουν ειδικότητα, χρησιμοποιήσαμε ένα στοιχείο ελέγχου siRNA (Qiagen). Τα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν σε μεταγενέστερα πειράματα σε 24-144 ώρες μετά την επιμόλυνση.

Ποσοτική RT-PCR (qRT-PCR)

Ολικό RNA εξήχθη από καλλιεργημένα κύτταρα χρησιμοποιώντας υψηλής καθαρότητας Κιτ Απομόνωσης RNA (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) και ϋΝάση Ι (Roche Diagnostics) θεραπεία σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. qRT-PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ QuantiTect SYBR Green Reverse Transcription-PCR (Qiagen) και το CFX96 Real-Time PCR System (Bio-Rad Laboratories). Οι εκκινητές αγοράστηκαν από την Takara Bio Inc (Tokyo, Japan). Οι αλληλουχίες εκκινητών φαίνονται στον Πίνακα 2. Κάθε μίγμα της αντίδρασης επωάστηκε πρώτα στους 50 ° C για 30 min για την αντίστροφη μεταγραφή για να συνθέσει πρώτου κλώνου συμπληρωματικού DNA με εκκίνηση το συνολικό RNA με ένα γονίδιο-ειδικό εκκινητή. PCR άρχισε με επώαση στους 95 ° C για 15 λεπτά για να ενεργοποιηθεί η πολυμεράση, που ακολουθείται από 40 κύκλους των 95 ° C για 5 s, 60 ° C για 20 s, και 72 ° C για 30 s. επίπεδα έκφρασης γονιδίων υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας μια πρότυπη καμπύλη κατασκευασμένη με ολικό RNA από Panc-1, κοστούμι-2, ή ειδικά ΚΕΕ. Τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων κανονικοποιήθηκαν προς εκείνες των β-ακτίνης ως εσωτερικό έλεγχο και εκφράζονται ως ο λόγος της έκφρασης γονιδίου-στόχου σε β-ακτίνης έκφρασης. Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν εις τριπλούν, και κάθε δείγμα αναλύθηκε τουλάχιστον δύο φορές. Κανένα ανιχνεύσιμο PCR προϊόντα ενισχύθηκαν χωρίς προηγούμενη αντίστροφης μεταγραφής. Η ακρίβεια και η ακεραιότητα των προϊόντων της PCR επιβεβαιώθηκαν χρησιμοποιώντας Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies Inc, Palo Alto, CA)

Η

μικροσυστοιχιών αναλύσεις

.

Πραγματοποιήσαμε μικροσυστοιχιών αναλύσεις των κύτταρα CD166 + και CD166- προέρχονται από δύο κυτταρικές σειρές Panc-1 και SW1990. Η ποιότητα των δειγμάτων RNA αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας την Agilent 2100 Bioanalyzer. Μια Ανθρώπινη HT-12v4 Έκφραση BeadChip (Illumina, San Diego, CA) χρησιμοποιήθηκε για τις αναλύσεις. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας BeadStudio έκδοση λογισμικού 3.2.3 (Illumina).

Στατιστική ανάλυση

Οι τιμές εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση. Συγκρίσεις μεταξύ δύο ομάδων έγιναν με την t-test Student. Η στατιστική σημαντικότητα ορίσθηκε ως ρ & lt? 0.05. Το τεστ χ2 χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της συσχέτισης μεταξύ της έκφρασης CD166 και κλινικοπαθολογικών χαρακτηριστικά που παρατηρούνται στην ανοσοϊστοχημική μελέτη. Επιβίωσης υπολογίστηκε με ανάλυση Kaplan-Meier και καμπύλες επιβίωσης συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία log-rank. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση JMP 9.0.2 λογισμικό (SAS Institute, Cary, NC).

Αποτελέσματα

περιπτώσεις καρκίνου του παγκρέατος είναι συχνά CD166

Υψηλή

η ανοσοϊστοχημική χρώση για CD166 διεξήχθη χρησιμοποιώντας χειρουργικά ιστούς του παγκρέατος (Σχήμα 1Α). Συνεπής με μια προηγούμενη μελέτη, βρήκαμε ισχυρή χρώση CD166 σε κύτταρα νησιδίων και μέτρια χρώση στα νεύρα ως θετικοί μάρτυρες [11] – [13]. Σε ορισμένες περιπτώσεις, CD166 εκφράστηκε μέτρια στα κυψελοειδή κύτταρα. Σε 17 δείγματα φυσιολογικού παγκρεατικό ιστό, παγκρεατικού πόρου επιθηλιακά κύτταρα δεν εκφράζουν CD166 ή έδειξαν ασθενή έκφραση CD166. Όλες οι κανονικές παγκρέατος ιστούς προσδιορίστηκαν ως CD166

χαμηλή. Σε παγκρέατος καρκινικούς ιστούς, μερικά καρκινικά κύτταρα βάφτηκαν μέτρια για CD166, και εντοπίσαμε 12,2% (12/98) των παγκρεατικών καρκινικών ιστών ως CD166

υψηλή. Το ποσοστό των CD166

υψηλή παγκρέατος καρκινικούς ιστούς ήταν σημαντικά υψηλότερη από ότι στην κανονική του παγκρέατος ιστούς (p = 0,0435). Σε παγκρεατικό καρκινικούς ιστούς, βρήκαμε ότι η έκφραση CD166 συσχετίστηκε με περινευρικό εισβολή (ρ = 0.037, Πίνακας S1), αλλά όχι πρόγνωση χρησιμοποιώντας ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier (p = 0,1473, Σχήμα 1Β).

(Α ) η ανοσοϊστοχημική χρώση για CD166 διεξήχθη χρησιμοποιώντας εκτομή του παγκρέατος ιστούς. (Α) στην κανονική του παγκρέατος, του CD166 εκφράστηκε έντονα στην μεμβράνη των κυττάρων των νησιδίων (μαύρα βέλη) και ασθενώς σε φυσιολογικά κύτταρα παγκρεατικού πόρου (μαύρο βέλος). (Β) Σε ορισμένες παγκρεατικό καρκινικούς ιστούς, τα καρκινικά κύτταρα ήταν θετικά για CD166. Αρχική μεγέθυνση: 200 ×. Ένθετα: 600 ×. (Β) ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier έδειξε ότι η ένταση της έκφρασης CD166 σε καρκίνο του παγκρέατος δεν συσχετιζόταν με πρόγνωση (p = 0,1473). (Γ) Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της έκφρασης CD166 σε κύτταρα διαχωρίζονται με βάση την έκφραση του EpCAM. Ο θετικός ρυθμός έκφρασης (%) ενδείκνυται για κάθε δείκτη.

Η

Θα αξιολογηθεί επίσης CD166expression σε παγκρεατικά ιστούς με κυτταρομετρία ροής. Σε παγκρέατος καρκινικούς ιστούς, το CD166 + επιτόκιο κυμαίνονταν 15,2 έως 45,3% (μέσος όρος = 29,1%). Επειδή CD166 εκφράζεται σε διάφορους τύπους κυττάρων [5], χρησιμοποιήσαμε επιθηλιακών μόριο κυτταρικής προσκόλλησης (EpCAM), η οποία εκφράζεται αποκλειστικά σε επιθήλια και νεοπλάσματα επιθηλιακής προερχόμενο, για τον αποκλεισμό μη επιθηλιακό ιστό από την ανάλυση. Μεταξύ EpCAM + κύτταρα (10 έως 56,5% των κυττάρων, σημαίνει = 20,6%), το θετικό ποσοστό CD166 κυμαίνονταν από 33,8% έως 70,2% (μέσος όρος = 47,9%) (Σχήμα 1C). Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ CD166 και τα ποσοστά θετικότητας EpCAM (p = 0,3488).

CD166 Έκφραση σε ανθρώπινο παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές

Στη συνέχεια, αναλύσαμε την CD166 + ρυθμό σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές με κυτταρομετρία ροής, και βρήκαν ότι CD166 εκφράστηκε σε ένα ευρύ φάσμα κυττάρων (μηδέν έως 99,5%) (Σχήμα 2Α). Αξίζει να σημειωθεί ότι, καμία σχέση δεν βρέθηκε μεταξύ του CD166 + ρυθμό και κακοήθεις δυνατότητες, όπως η εισβολή, τη μετανάστευση και τον πολλαπλασιασμό, η οποία ήταν σύμφωνη με τα ευρήματα σε προηγούμενη έκθεση (Πίνακας S2 και το σχήμα S1) [20]. Για να αξιολογηθεί περαιτέρω η σημασία της έκφρασης CD166 σε καρκίνο του παγκρέατος, αναλύσαμε SW1990 και τα κύτταρα Panc-1 μεταξύ των οποίων 77,7 έως 99,3% (μέσος όρος = 86.4%) και 38,5 έως 54,0% (μέσος όρος = 46.9%) εξέφρασε CD166, αντίστοιχα. Μετά το διαχωρισμό των + και CD166- υποπληθυσμών CD166, CD166 ελέγξαμε εβδομαδιαία έκφραση σε γονική, CD166 +, και τα κύτταρα CD166- σε μια περίοδο 6 εβδομάδων (Σχήματα 2Β, C). Το CD166 + ρυθμός δεν άλλαξε σημαντικά σε CD166 + κύτταρα, ενώ ότι και στις δύο γονικών και CD166- κύτταρα αυξάνεται σταδιακά. Αξίζει να σημειωθεί ότι δεν παρατηρήσαμε εμφανείς μορφολογικές διαφορές μεταξύ CD166 + και CD166- Panc-1 κύτταρα (Σχήμα 2D).

(Α) CD166 ποσοστά θετικότητας σε δύο κανονικά επιθηλίου παγκρεατικού πόρου κυτταρικές σειρές, παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, και του παγκρέατος αστεροειδή κύτταρα (ΚΕΕ). (Β, C) SW1990 (Β) και κύτταρα Panc-1 (C) (γονικά κύτταρα) διαχωρίστηκαν με βάση την έκφραση CD166 (CD166 + και CD166-) από ένα διαχωριστικό PRO AutoMACS. Αλλαγές στην έκφραση CD166 σε γονική και CD166 +/- υποπληθυσμών παρακολουθούνταν συχνά με κυτταρομετρία ροής πάνω από 6 εβδομάδες. (Δ) Μορφολογία κυττάρων Panc-1 διαχωρίστηκε με βάση την έκφραση CD166. Αρχική μεγέθυνση:. 40 ×

Η

CD166- κύτταρα δείχνουν υψηλό επεμβατική και μεταναστευτικών δραστηριότητες, ενώ CD166 + κύτταρα εμφανίζουν ισχυρότερη δραστηριότητα σχηματισμού αποικιών

Για να διερευνήσει τις επιπτώσεις της CD166 στον καρκίνο του παγκρέατος, διάφορες διαδικασίες σχετίζονται με τον καρκίνο ελέγχθηκαν σε παγκρεατικά κυτταρικές σειρές που διαχωρίστηκαν με βάση την έκφραση CD166. Συγκρίναμε τις επεμβατικές και μεταναστευτικά ικανότητες των κυττάρων CD166 + και CD166- που προέρχονται τόσο από SW1990 και κυτταρικές σειρές Panc-1. CD166- SW1990 και CD166- κύτταρα Panc-1 εμφάνισαν σημαντικά μεγαλύτερη εισβολή των κυττάρων από εκείνο των αντίστοιχων κυττάρων CD166 + τους (p & lt? 0,05? Σχήμα 3Α). Επιπλέον, τα κύτταρα CD166- παρουσίασαν σημαντικά αυξημένη μεταναστευτικών δυναμικό σε σύγκριση με εκείνη του CD166 + κυττάρων από δύο SW1990 και κυτταρικές σειρές Panc-1 (ρ & lt? 0,05? Σχήμα 3Β). Χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία πολλαπλασιασμού, βρήκαμε ότι CD166 + κύτταρα έδειξαν μεγαλύτερη πολλαπλασιαστική δραστικότητα από εκείνη των κυττάρων CD166- από την κυτταρική γραμμή SW1990 (ρ & lt? 0,0001), αλλά όχι CD166- κύτταρα από την κυτταρική σειρά Panc-1 (Σχήμα 3C). Στην δοκιμασία σχηματισμού αποικίας, κύτταρα CD166 + Panc-1 έδειξε μία σημαντικά ισχυρότερη δραστικότητα σχηματισμού αποικίας από εκείνη των κυττάρων CD166- Panc-1 (ρ & lt? 0,05? Σχήμα 3D). Σε αναλύσεις σχηματισμού σφαίρας και πρόσφυση, δεν βρέθηκαν διαφορές μεταξύ των ικανοτήτων του CD166 + και κυττάρων (Σχήμα 3Ε και 3F) CD166- 1 Panc-.

(Α) δοκιμασίες εισβολή των κυττάρων CD166 + και CD166- προέρχεται από SW1990 και κυτταρικές σειρές Panc-1 διεξήχθησαν με καλλιέργεια των κυττάρων σε επικαλυμμένα με Matrigel ένθετα transwell. Μετά χρόνους που υποδεικνύονται, τα κύτταρα στην κάτω μεμβράνη των ενθέτων βάφτηκαν με Η &? Ε (τα αντιπροσωπευτικά εικόνες φαίνεται) και ποσοτικά. (Β) δοκιμασίες Μετανάστευση των CD166 + και CD166- κύτταρα από SW1990 και κυτταρικές σειρές Panc-1 διεξήχθησαν με καλλιέργεια των κυττάρων σε ένθετα. Μετά χρόνους που υποδεικνύονται, τα κύτταρα στην κάτω μεμβράνη των ενθέτων βάφτηκαν με Η &? Ε (τα αντιπροσωπευτικά εικόνες φαίνεται) και ποσοτικά. Αρχική μεγέθυνση: 200 ×. (Γ) Πολλαπλασιασμός CD166 + και κυττάρων που προέρχονται από CD166- SW1990 και κυτταρικές σειρές Panc-1 μετρήθηκε στους υποδεικνυόμενους χρόνους μετά την αρχική σπορά. (Δ) Ποσοτικοποίηση και αντιπροσωπευτικές εικόνες των δυνατοτήτων σχηματισμού αποικιών των CD166 + και CD166- κύτταρα Panc-1. (Ε) Ποσοτικοποίηση και αντιπροσωπευτικές εικόνες της σφαίρας ικανότητες σχηματισμό CD166 + και CD166- κύτταρα Panc-1. (F) Ποσοτικοποίηση και αντιπροσωπευτικές εικόνες των συγκολλητικών ικανότητες του CD166 + και CD166- κύτταρα Panc-1. Αρχική μεγέθυνση: 40 ×. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD? *,

σ

& lt? 0,05? **

σ

& lt? 0,01? ***

σ

& lt? 0,0001? NS, δεν είναι σημαντική.

Η

CD166 + κύτταρα παρουσιάζουν ισχυρή ογκογονικότητα σε μοντέλα ξενομοσχεύματος ποντικού

Για να αξιολογηθούν τα αποτελέσματα της CD166 στο

in vivo

ανάπτυξη του όγκου, είμαστε υποδορίως μεταμοσχευθεί κύτταρα CD166 + ή CD166- σε γυμνά ποντίκια. Βρήκαμε ότι CD166 + κύτταρα είχαν σημαντικά μεγαλύτερη από εκείνη ογκογονικότητα των κυττάρων CD166- προέρχεται από την κυτταρική γραμμή Panc-1 (p = 0,0082? Σχήμα 4Α και Πίνακας 3). Παρομοίως, SW1990 προερχόμενα CD166 + κυττάρων είχαν την τάση να παράγουν μεγαλύτερους όγκους από εκείνα των κυττάρων CD166-, αν και η διαφορά δεν ήταν στατιστικώς σημαντική (Σχήμα S2 και S3 Πίνακα). Σε μοντέλα ξενομοσχεύματος ποντικού ορθοτοπική, όγκους που προέρχονται από τα κύτταρα CD166 + Panc-1 ήσαν βαρύτερα από εκείνα από κύτταρα CD166- Panc-1 (ρ & lt? 0,05? Σχήμα 4Β). Ανάλυση των υποδόριας και ορθοτοπική μοντέλα ξενομοσχεύματος με κυτταρομετρία ροής έδειξε ότι το CD166 + ποσοστό σε όγκους από τα κύτταρα CD166 + ήταν σημαντικά υψηλότερη από εκείνη σε όγκους από τα κύτταρα CD166-, αν και ανοσοϊστοχημεία δεν έδειξε σημαντικές διαφορές στην έκφραση CD166 (Εικόνες 4C-F). Επίσης δεν υπήρχε σημαντική σχέση μεταξύ του μεγέθους των όγκων και του CD166 + ποσοστό των κυττάρων (Εικόνα 4G).

(Α) Ποντικοί υποδορίως μεταμοσχευθεί με γονική, CD166 + και κύτταρα CD166- από το κύτταρο Panc-1 γραμμή (αντιπροσωπευτική εικόνα), και των όγκων όγκοι μετρήθηκαν τακτικά για 7 εβδομάδες. (Β) ποντίκι μοντέλα ξενομοσχεύματος όγκου ορθοτοπική δημιουργήθηκαν επίσης από CD166 + και CD166- κύτταρα Panc-1. Οι όγκοι αποκόπηκαν και υγρή ζυγίστηκαν. (C, E) Ανοσοϊστοχημική ανάλυση CD166 σε υποδόρια (C) και ορθοτοπική (Ε) όγκους που προέρχονται από CD166 + και CD166- SW1990 και τα κύτταρα Panc-1. Αρχική μεγέθυνση: 100 ×. (D, F) έκφραση CD166 αναλύθηκε σε υποδόρια (D) και ορθοτοπική (F) όγκους που προέρχονται από τα κύτταρα CD166 + και CD166- με κυτταρομετρία ροής. (G) Ανάλυση της σχέσης μεταξύ του βάρους του όγκου και του ρυθμού θετικότητας των κυττάρων CD166 σε ορθοτοπική όγκους που προέρχονται από CD166 + και CD166- κύτταρα Panc-1. Όλα τα γραφήματα δείχνουν τη μέση τιμή ± SD? *,

σ

& lt? 0,05, **,

σ

& lt?. 0.01

Η

CD166- κύτταρα υπερ-εκφράζουν την επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (EMT) ενεργοποιητής Zeb1

Hong et al. ανέφεραν ότι knockdown του CD166 με παρεμβολή RNA δεν έχει καμία επίδραση στην ανάπτυξη ή εισβολή του παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα [12]. Μπορούμε επίσης ανέστειλε την έκφραση CD166 με παρεμβολή RNA στο παγκρεατικό καρκίνο κυτταρική σειρά SUIT-2. Ως αποτέλεσμα, knockdown του CD166 δεν επηρέασε εισβολή, τη μετανάστευση, τον πολλαπλασιασμό, ή δραστηριότητες σχηματισμό αποικίας (Σχήματα 5Α, 5Β, και S3A-C). Για να διαλευκανθεί βασικούς παράγοντες που υπογραμμίζει τις λειτουργικές διαφορές μεταξύ CD166 + και τα κύτταρα CD166-, είμαστε δίπλα επικεντρώθηκε στην έκφραση των δεικτών για την EMT και του παγκρέατος ΚΕΠ. Αξιολογήσαμε την έκφραση των δεικτών ΕΜΤ σε SW1990 και Panc-1 κύτταρα χρησιμοποιώντας qRT-PCR. Κατά το πρώτο στάδιο της EMT, τα κύτταρα χάνουν την έκφραση των επιθηλιακών δεικτών, εκφράζουν δείκτες μεσεγχυματικών, και να αποκτήσουν κινητικά και επεμβατική ιδιότητες [21]. Το επίπεδο της Zeb1 mRNA, έναν ενεργοποιητή ΕΜΤ, ήταν μεγαλύτερη σε κύτταρα CD166- από εκείνο στο CD166 + κυττάρων, αν και δεν υπήρχε διαφορά στα επίπεδα mRNA των επιθηλιακών δείκτη Ε-καδερίνης (Εικόνα 5Ε). Το επίπεδο της Ν-καδερίνης mRNA, ένα μεσεγχυματικά δείκτη, ήταν υψηλότερη σε κύτταρα CD166 + από ότι στα κύτταρα CD166-. Επιπλέον, το επίπεδο της μεταλλοπρωτεϊνάσης 2 (ΜΜΡ2) mRNA, το οποίο έχει σχέση με τα κινητά διεισδυτικότητας, αυξήθηκε σε CD166- κύτταρα σε σύγκριση με εκείνη σε κύτταρα CD166 + [22]. Στη συνέχεια, ανέλυσε τη σχέση μεταξύ της έκφρασης CD166 και CSC Σημάδια CD24, CD44 και CD133? Ωστόσο, εμείς δεν βρούμε σημαντικές αλλαγές στην έκφρασή τους μεταξύ των κυττάρων CD166 + και CD166- προέρχεται από Panc-1 κύτταρα (Σχήμα 5D) [23], [24].

ανάλυση (Α) qRT-PCR της τα επίπεδα mRNA του CD166 στο κοστούμι-2 κύτταρα μετά από παρεμβολή RNA διεξήχθη στις υποδεικνυόμενες ημέρες μετά την επιμόλυνση. Ελέγχου (siControl) ή CD166 σιγήσει κύτταρα (siCD166) αναλύθηκαν με προσδιορισμούς (Β) το σχηματισμό αποικιών στις υποδεικνυόμενες ημέρες μετά την επιμόλυνση. (C) Ανάλυση qRT-PCR του ΕΜΤ Σημάδια Ε-καδερίνης, Ν-cadherin, Zeb-1, και ΜΜΡ2 σε CD166 + και CD166- Panc-1 και τα κύτταρα SW1990. (Δ) Οι σχέσεις μεταξύ της έκφρασης του CD166 και CSC δείκτες CD24, CD44, CD133 και σε κύτταρα Panc-1 αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD? *,

σ

& lt? 0,05? NS, δεν είναι σημαντική.

Η

ανάλυση μικροσυστοιχιών δείχνει υπερέκφραση του TSPAN8 και BST2 στο CD166 + κύτταρα, ενώ BMP7 και Col6A1 είναι υπερ-εκφράζεται σε κύτταρα CD166-

Για τον εντοπισμό άλλων βασικών μόρια που εμπλέκονται στην έκφραση CD166, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις των μικροσυστοιχιών CD166 + και CD166- κύτταρα από δύο κυτταρικές σειρές Panc-1 και SW1990. Συγκρίσεις των δεδομένων των μικροσυστοιχιών εντόπισαν 26 γονίδια που ρυθμίστηκαν προς τα πάνω κατά περισσότερο από 2 φορές σε κύτταρα CD166 + (Πίνακας S4) και 11 γονιδίων που ρυθμίζεται προς τα πάνω κατά περισσότερο από 2 φορές σε κύτταρα CD166- (Πίνακας S5). Από αυτά τα γονίδια, επιλέξαμε TSPAN8, BST2, BMP7, και Col6A1 για περαιτέρω ανάλυση, επειδή αυτά τα γονίδια έχουν αναφερθεί ότι εμπλέκονται σε ογκογονικότητας ή καρκίνο εισβολή κυττάρων και μετανάστευση. ανάλυση qRT-PCR πραγματοποιήθηκε στη συνέχεια για την επικύρωση δεδομένων μικροσυστοιχιών (Σχήμα 6Α) [25] – [29]. Για να αξιολογηθούν τα αποτελέσματα της CD166 knockdown για την έκφραση αυτών των τεσσάρων γονιδίων, τα επίπεδά τους mRNA εκτιμήθηκαν στο κοστούμι-2 κυττάρων μετά από παρεμβολή RNA. Ως αποτέλεσμα, δεν υπήρξαν σημαντικές αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης αυτών των γονιδίων (Σχήμα S4).

(Α) qRT-PCR χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθούν τα επίπεδα του mRNA του TSPAN8, BST2, BMP7, και Col6A1, τα οποία βρέθηκαν να ρυθμίζεται προς τα πάνω κατά περισσότερο από 2 φορές σε κύτταρα CD166 + και CD166- στις συγκρίσεις των δεδομένων των μικροσυστοιχιών. (Β) Το ποσοστό θετικότητας του CD166 στο μεταστατικό SUIT-2 κυτταρικές σειρές Panc-1 και μεταστατικό μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής. ανάλυση (C) qRT-PCR χρησιμοποιήθηκε επίσης για να εξεταστούν τα επίπεδα CD166 mRNA στα μεταστατικές κυτταρικές γραμμές. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD? *,

σ

& lt? 0,05, **,

σ

& lt? 0,01, ***

σ

& lt?. 0.001

Η

να διερευνηθεί κατά πόσον CD166 παίζει ένα ρόλο στη μετάσταση, χρησιμοποιήσαμε δύο προηγουμένως καθιερωμένων μεταστατικών παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές που δημιουργήθηκαν από μεταστάσεις ήπατος σε γυμνά μοντέλα ξενομοσχεύματος ποντικού [15]. Αυτές οι κυτταρικές σειρές, μεταστατικό Panc-1 και μεταστατικό SUIT-2, έδειξε μια ισχυρότερη συκώτι μεταστατικό δυναμικό σε σύγκριση με εκείνη του γονικές κυτταρικές σειρές τους. Στη μεταστατική κυτταρική γραμμή Panc-1, ο ρυθμός έκφραση CD166 ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με εκείνη των γονικών κυττάρων (99,2% έναντι 46,9%, Εικόνα 6Β). Στην κυτταρική γραμμή SUIT-2, τα περισσότερα κύτταρα εξέφρασαν CD166 και στις δύο γονικά κύτταρα κοστούμι-2 (99.3%) και μεταστατικά κύτταρα κοστούμι-2 (99.4%). ανάλυση qRT-PCR έδειξε ότι τα επίπεδα του CD166 mRNA τόσο μεταστατικό Panc-1 και μεταστατικό κοστούμι-2 κυττάρων ήταν σημαντικά μεγαλύτερες από εκείνες στην γονικές κυτταρικές σειρές τους (ρ & lt? 0.0001 και ρ = 0.0015 για Panc-1 και κοστούμι-2,