Αφηρημένο

Ιστορικό

Forkhead κουτί L1 (FOXL1), η οποία θεωρείται ως ένα μυθιστόρημα υποψήφιος ογκοκατασταλτικό, καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό και εισβολή σε ορισμένους καρκίνους. Ωστόσο, η ρύθμιση και η λειτουργία του FOXL1 στον καρκίνο της χοληδόχου κύστης (GBC) παραμένει ασαφής.

Μέθοδοι

έκφραση FOXL1 σε mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης στο GBC ιστούς και κυτταρικές σειρές εξετάστηκαν με RT-PCR, ανοσοϊστοχημεία και δοκιμασία κηλίδος Western. έκφραση FOXL1 σε κυτταρικές γραμμές GBC ήταν πάνω ρυθμισμένα με επιμόλυνση με pcDNA-FOXL1. Οι επιδράσεις της υπερέκφρασης FOXL1 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την απόπτωση, τη μετανάστευση και εισβολή αξιολογήθηκαν in vitro ή in vivo. Επιπλέον, το καθεστώς των μεσολαβητών που εμπλέκονται στη μετανάστευση, εισβολή και η απόπτωση εξετάστηκε χρησιμοποιώντας western blot μετά από επιμόλυνση με pcDNA-FOXL1.

Αποτελέσματα

FOXL1 ήταν συχνά προς τα κάτω σε GBC ιστούς και κυτταρικές σειρές. υψηλότερη έκφραση της σχετίζεται με καλύτερη πρόγνωση, ενώ χαμηλότερη έκφραση του σχετίζεται με προχωρημένο στάδιο TNM και φτωχών διαφοροποίηση. FOXL1 υπερέκφραση σε κύτταρα NOZ καταστέλλει σημαντικά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή in vitro και ογκογονικότητα σε γυμνούς ποντικούς. FOXL1 υπερέκφραση διαταράσσεται μιτοχονδριακό διαμεμβρανικό δυναμικό και ενεργοποιείται μιτοχόνδρια μεσολάβηση απόπτωση σε κύτταρα NOZ. Επιπλέον, η υπερέκφραση FOXL1 κατασταλεί ZEB1 έκφρασης και έκφραση που προκαλείται από Ε-καδερίνης σε κύτταρα NOZ.

Συμπέρασμα

Τα ευρήματά μας πρότεινε ότι απορυθμισμένη FOXL1 εμπλέκεται στην ογκογένεση και την πρόοδο της GBC και μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα προγνωστικός δείκτης της κλινικής έκβασης ή ακόμα και ένα θεραπευτικό στόχο για ασθενείς με GBC

Παράθεση:. Τσιν Υ, Γκονγκ W, Zhang Μ, Wang J, Tang Ζ, Quan Z (2014) Forkhead ασφαλείας L1 συχνά μειωτικά στο χοληδόχου κύστης Καρκίνος και αναστέλλει την κυτταρική ανάπτυξη μέσω απόπτωση επαγωγή από μιτοχονδριακή δυσλειτουργία. PLoS ONE 9 (7): e102084. doi: 10.1371 /journal.pone.0102084

Επιμέλεια: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Catolica de Chile, Ιατρική Σχολή, Χιλή

Ελήφθη: 10 Ιαν, 2014? Αποδεκτές: 14 Ιούν του 2014? Δημοσιεύθηκε: 10 Ιουλίου 2014

Copyright: © 2014 Qin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Αρ 81272747 και Νο 81372642). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνο της χοληδόχου κύστης (GBC), η οποία αντιπροσωπεύει την πιο κοινή και επιθετικός τύπος μεταξύ των κακοηθειών των χοληφόρων οδών χαρακτηρίζεται από μη-ειδική παρουσίαση, η καθυστερημένη διάγνωση και η έλλειψη αποτελεσματικής θεραπείας. Παρά το γεγονός ότι οι πρόσφατες πρόοδοι στη διάγνωση και τη θεραπεία, τα αποτελέσματα της τρέχουσας θεραπείες, όπως χειρουργική επέμβαση, χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία (μόνο του ή σε συνδυασμό) έχει αποδειχθεί ότι είναι μελαγχολική. Είναι σχετίζεται με κακή πρόγνωση με μέση διάρκεια επιβίωσης των 4 μηνών [1] και το ποσοστό επιβίωσης 5-χρόνια λιγότερο από 10% [2]. Ως εκ τούτου, υπάρχει επείγουσα ανάγκη να αναπτυχθούν νέες και αποτελεσματικές αγωγές θεραπείας για GBC ασθενείς. Ωστόσο, η περιορισμένη γνώση σχετικά με την ογκογένεση του καρκίνου της χοληδόχου κύστης εμποδίζει την ανάπτυξη της διάγνωσης και της θεραπείας για GBC. Μια καλύτερη κατανόηση της μοριακής βιολογίας και καρκινογόνου μηχανισμοί που διέπουν την ανάπτυξη και την εξέλιξη της GBC μπορεί να βοηθήσει στην δημιουργία πιο αποτελεσματικών θεραπειών.

Forkhead κουτί (FOX) πρωτεΐνες είναι μια υπεροικογένεια παραγόντων μεταγραφής οι οποίες μοιράζονται μία άκρως συντηρημένη δέσμευσης DNA τομέα (το κουτί forkhead ή φτερωτό τομέα έλικα) ελέγχουν μια ποικιλία βιολογικών διεργασιών, συμπεριλαμβανομένου του μεταβολισμού, τη διαφοροποίηση, πολλαπλασιασμό και την απόπτωση [3]. Από FOX πρωτεΐνες ρυθμίζουν αυτές τις ζωτικής σημασίας διεργασίες στην ανάπτυξη και την ανάπτυξη, κέρδος ή ζημία της λειτουργίας FOX προκαλεί έκπληξη το γεγονός γενετικών ασθενειών στον άνθρωπο, συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων. Η απορύθμιση της αρκετές υπο-οικογένειες FOX όπως FOXO, FOXM, FOXP, FOXC και FOXA εμπλέκεται στην ογκογένεση και την εξέλιξη ορισμένων καρκίνων [4]. Αν και FOX πρωτεΐνες μοιράζονται το πεδίο εξαιρετικά διατηρημένη δέσμευσης DNA, τη ρύθμιση και τη λειτουργία τους διαφέρουν σημαντικά μεταξύ των οικογενειών. FOX πρωτεΐνες έχουν διάφορες λειτουργίες και να δρουν ως καταστολείς των όγκων ή ογκογονίδια κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης και την εξέλιξη των διαφόρων μορφών καρκίνου. Για παράδειγμα, FOXO1 δρα ως καταστολέας όγκου που μπορεί να προκαλέσει απόπτωση και κύκλου κυττάρου σε καρκινικά κύτταρα [5]. Σε αντίθεση με FOXO1, FOXM1 δείχνει ογκογόνους δραστηριότητες και στόχευση FOXM1 διεγείρει απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα [6]. Ένα αυξανόμενο σώμα της στοιχεία έχουν δείξει πειστικά ότι FOX πρωτεΐνες μπορεί να αντιπροσωπεύουν ελκυστικούς στόχους για θεραπευτική παρέμβαση ενάντια σε πολλές μορφές καρκίνου.

πρωτεΐνη FOXL1 είναι μέλος του FOX υπερ που αρχικά ανακαλύφθηκε στο μεσέγχυμα του γαστρεντερικού σωλήνα. Μέχρι στιγμής, η σχέση μεταξύ FOXL1 και γαστρεντερικού καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων του στομάχου, του παχέος εντέρου και του παγκρέατος έχει διερευνηθεί σε διάφορες μελέτες [7] – [8]. Ωστόσο, η βιολογική λειτουργία του FOXL1 σε GBC μένει να διευκρινιστεί. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήσαμε την σημασία της έκφρασης FOXL1 σε ασθενείς με GBC σε σχέση με κλινικά χαρακτηριστικά και την πρόγνωση. Διενεργήσαμε επίσης λειτουργικές μελέτες για να αξιολογηθούν τα αποτελέσματα της υπερέκφρασης FOXL1 στον πολλαπλασιασμό, απόπτωση, μετανάστευση και διείσδυση των κυττάρων GBC in vitro ή in vivo. Επιπλέον, έχουμε προκαταρκτικές διερευνήθηκε η έκφραση Ε-καδερίνης και ψευδαργύρου-δακτύλου E-box δέσμευσης ομοιοακολουθίας 1 (ZEB1), η οποία μπορεί να συμβάλλουν στις ανασταλτικές επιδράσεις της υπερέκφρασης FOXL1 GBC.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Τα πειράματα που αφορούν τα ανθρώπινα και τα ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Xinhua νοσοκομείο, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. Γραπτή πληροφορημένες συγκαταθέσεις ελήφθησαν από όλους τους ασθενείς.

Ασθενείς και ιστών συλλογή

35 ασθενών με GBC (13 άνδρες και 22 γυναίκες, εύρος ηλικίας 51-71 ετών, μέσης ηλικίας 61,9 ± 5,4 ετών ) που έλαβαν θεραπεία με ριζική χολοκυστεκτομή (χωρίς προηγούμενη ακτινοθεραπεία ή χημειοθεραπεία) μεταξύ του 2008 και του 2013 στο Τμήμα γενικής χειρουργικής, Xinhua νοσοκομείο, Shanghai Jiaotong Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου εντάχθηκαν σε αυτή τη μελέτη. δείγματα όγκου (n = 35) και των παρακείμενων δειγμάτων μη όγκου (n = 12) συλλέχθηκαν αμέσως μετά το χειρουργείο και βυθίσθηκε σε υγρό άζωτο. Σύμφωνα με το σύστημα ΤΝΜ σταδιοποίηση (AJCC, 7

ου, 2010), οι όγκοι οργάνωσαν (4 σταδίου Ι, 12 σταδίου ΙΙ, 14 σταδίου ΙΙΙ, και 5 σταδίου IV). Ο βαθμός διαφοροποίησης σύμφωνα με τα κριτήρια του ΠΟΥ ήταν ως εξής: 13 περιπτώσεις ήταν καλά διαφοροποιημένα (WD), 15 μετρίως διαφοροποιημένων (MD) και 7 φτωχά διαφοροποιημένα (PD). Η ιστολογική διάγνωση όλων των GBC επιβεβαιώθηκε από δύο παθολόγους.

Η ανοσοϊστοχημεία

Τα κατεψυγμένα δείγματα ιστών ενσωματωμένα στην ένωση βέλτιστη θερμοκρασία κοπής (OCT). 5-μm τομές πάχους του ιστού των όγκων και μη όγκου ιστοί κόπηκαν από τεμάχια ιστού, και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν σε ψυχρή ακετόνη στους 4 ° C για 20 λεπτά. Οι τομές ιστού επωάσθηκαν με 3% (ν /ν) H

2O

2 σε μεθανόλη για την εξάλειψη της ενδογενούς ενεργότητας υπεροξειδάσης και στη συνέχεια αποκλείστηκαν με φυσιολογικό ορό κατσίκας. Στη συνέχεια, οι τομές υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι FOXL1 (αραίωση 1: 100? Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) και δευτερεύον αντίσωμα (1: 500 αραίωση? Santa Cruz Bio). Τέλος, οι τομές επωάστηκαν με σύμπλεγμα υπεροξειδάσης και οπτικοποιήθηκαν με τετραχλωριούχο 3,3′-διαμινοβενζιδίνη (DAB). Όλα τα ανοσοχρωματισμένες τομές τυφλά επανεξετάζεται από δύο ανεξάρτητους παθολόγους. Η ένταση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα 3-κλίμακα (0, αρνητικά? 1, αδύναμη? 2, μέτρια? 3, ισχυρή). Το ποσοστό θετικότητας αξιολογήθηκε επίσης χρησιμοποιώντας ένα σύστημα 3-κλίμακα (0, & lt? 5%? 1, 5% -25%? 2, 25% -50%? 3, & gt? 50%). Η συνολική επιμέτρησης βαθμολογία ανοσοϊστοχημεία υπολογίστηκε πολλαπλασιάζοντας το σκορ ένταση χρώσης και το σκορ του ποσοστού των θετικών κυττάρων. επίπεδα έκφρασης FOXL1 κατατάχθηκαν ως εξής: – (0-1), + (σκορ 2-3), ++ (σκορ 4-6) και +++ (βαθμολογία & gt? 6). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της FOXL1 ανοσοχρώση, GBC ασθενείς ταξινομήθηκαν σε δύο ομάδες: χαμηλή έκφραση (- ή +) και υψηλή έκφραση (++ ή +++)

Οι κυτταρικές σειρές και συνθήκες καλλιέργειας

Τέσσερις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές GBC GBC-SD, SGC-996, NOZ και OCUG-1 χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. κυτταρική σειρά GBC-SD αγοράστηκε από την Τράπεζα Κυττάρων της Κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών, Σαγκάη, Κίνα? κυτταρική σειρά ΓΓΕ-996 [9] παρέχεται από Tumor Cell Biology Research Institute του Πανεπιστημίου Tongji, Σαγκάη, Κίνα? NOZ και OCUG-1 κυτταρικές σειρές αγοράστηκαν από την Επιστήμη Υγεία Bank Research Πόρων, Osaka, Japan. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν είτε σε DMEM ή RPMI1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) συμπληρωμένο με 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Invitrogen) και 10% (ν /ν) εμβρυϊκό βόειο ορό (HyClone, Logan, UT, USA) στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 θερμοκοιτίδα.

οι επιμολύνσεις

Για να ρυθμίζουν προς τα πάνω την έκφραση των FOXL1, pcDNA-FOXL1 (κωδικοποιεί FOXL1 cDNA) κατασκευάστηκαν και διαμολύνθηκε σε GBC κύτταρα. Το κενό φορέα pcDNA3.1 (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Η κλωνοποίηση και τον περιορισμό στρατηγική χάρτες ανασυνδυασμένα πλασμίδια που φαίνεται στο Σχήμα S1. Το αντιδραστήριο επιμόλυνσης Lipofectamine 2000 χρησιμοποιήθηκε κατά την επιμόλυνση σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Invitrogen). Για να ληφθεί σταθερά επιμολυσμένα, το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​πλήρες μέσο συμπληρωμένο με 300 μg /ml γενετικίνης (G418) μετά από 48 ώρες από την επιμόλυνση. Το επιλεκτικό μέσο ανανεώθηκε κάθε 3-4 ημέρες μέχρις ότου μπορεί να ταυτοποιηθεί G418-ανθεκτικών κλώνων. επίπεδα έκφρασης FOXL1 σε κυτταρικές γραμμές εξετάστηκαν με RT-PCR και προσδιορισμός στυπώματος Western.

απομόνωση RNA και RT-PCR ανάλυση

Ολικό RNA εξήχθη από δείγματα κατεψυγμένου ιστού και κυτταρικές σειρές GBC χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ κιτ αντιδραστηρίων (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA). Τα RNA μετατρέπεται σε cDNA χρησιμοποιώντας Takara RNA PCR kit (Takara Bio Inc, Dalian, Κίνα). Το ληφθέν cDNA ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας ακόλουθη διαδικασία: 94 ° C (5 λεπτά), στη συνέχεια 30 κύκλους στους 94 ° C (30 s), 59 ° C (45 δευτερόλεπτα), 72 ° C (45 δευτερόλεπτα). Οι αλληλουχίες των εκκινητών για FOXL1 ήταν ως εξής: Sense: cacggtactccacttccagt? Αντι-νόημα:. Aacacttccctgaacccaca

Κυτταρική βιωσιμότητα και δοκιμασίες σχηματισμού αποικίας

Τα υδατοδιαλυτά τετραζόλιο (WST) -1 δοκιμασία διεξήχθη για να μετρηθεί η βιωσιμότητα των κυττάρων μετά την επιμόλυνση. 5 × 10

3 επιμολυσμένων κυττάρων ανά φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και καλλιεργήθηκαν για 24, 48, 72, ή 96 h. Στη συνέχεια, τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με WST-1 αντιδραστηρίου για 2 ώρες στους 37 ° C. Η απορρόφηση στα 450 nm μετρήθηκε με τη χρήση ενός αυτοματοποιημένου αναγνώστη μικροπλάκας (Bio-Rad 5 Model 550, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) και η καμπύλη ανάπτυξης υπολογίστηκε.

Για την δοκιμασία σχηματισμού αποικίας , 1 × 10

3 επιμολυσμένων κυττάρων ανά φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και αναπτύχθηκαν σε πλήρες μέσο στους 37 ° C. Μετά από 14 ημέρες για τον πολιτισμό, αποικίες βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες και ο αριθμός των αποικιών μετρήθηκε με αυτόματο μετρητή αποικιών (η Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA).

πειράματα ξενομοσχεύματος όγκου

Η υποδόρια ξενομοσχεύματα σε γυμνούς ποντικούς διεξήχθησαν για να αξιολογηθούν τα αποτελέσματα της υπερέκφρασης FOXL1 στην κυτταρική ανάπτυξη και ογκογονικότητα ίη νίνο. Άνδρες και Γυναίκες αθυμικών (ηυ /ηυ) γυμνά ποντίκια ηλικίας 6-8 εβδομάδων ελήφθησαν από τη Σαγκάη Εργαστήριο Κέντρο Ζώων του κινεζικού Επιστημών της Ακαδημίας και στεγάζεται κάτω από ειδικές άνευ παθογόνου (SPF) κατάσταση. κύτταρα NOZ διαμολύνθηκαν σταθερά με pcDNA-FOXL1 ή pcDNA3.1. Περίπου 1 χ 10

7 κυττάρων FOXL1 υπερεκφράζουν ή κύτταρα ελέγχου αιωρήθηκαν σε ένα συνολικό όγκο 200 μι 1/1 (ν /ν) PBS /Matrigel (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) και στη συνέχεια υποδορίως σε λαγόνες των ποντικών. Περίπου 4 εβδομάδες μετά την ένεση των κυττάρων του όγκου, οι όγκοι ορατό υποδόριο όγκο μετρήθηκαν εβδομαδιαία με παχύμετρο και των όγκων του όγκου σε κάθε ομάδα υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τον τύπο: όγκος = μήκος Χ πλάτος

2/2. Όλα τα ποντίκια θυσιάστηκαν μετά από 6 εβδομάδες παρατήρησης. Ξενομοσχεύματος όγκοι μονιμοποιήθηκαν σε φορμαλίνη και στη συνέχεια εγκλείστηκαν σε παραφίνη. βάρος όγκου μετρήθηκε και καταγράφηκε.

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της απόπτωσης

Η απόπτωση των κυττάρων in vitro προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας αννεξίνη V-FITC Apoptosis Detection Kit (BD Bioscience) σύμφωνα με τον κατασκευαστή του πρωτόκολλο. Εν συντομία, 24, 48 και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση με pcDNA-FOXL1 ή pcDNA3.1, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με PBS, και επαναιωρήθηκαν σε 1 χ ρυθμιστικό δέσμευσης. Στη συνέχεια, τα κύτταρα βάφτηκαν με ΡΙΤΟ-αννεξίνης V και ΡΙ για 15 λεπτά και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

TUNEL δοκιμασία

Η απόπτωση σε τομές ιστών από ξενομοσχεύματος όγκων εκτιμήθηκε με Terminal δεοξυνουκλεοτιδυλοτρανσφεράσης dUTP nick τέλος επισήμανση (TUNEL) χρώση χρήση in situ κιτ ανίχνευσης θανάτου κυττάρου, φλουορεσκεΐνη (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, ξενομόσχευμα δείγματα όγκου αποπαραφινοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ξυλόλιο και αιθανόλη. Οι τομές ιστού επωάσθηκαν με διάλυμα K πρωτεϊνάσης για 15 λεπτά, ακολουθούμενη από επώαση με μίγμα της αντίδρασης TUNEL. Κατόπιν τομές ιστών επωάστηκαν με μετατροπέα-POD και αντίθετα με 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ). Ο φθορισμός δει με μικροσκοπία φθορισμού χρησιμοποιώντας κατάλληλα φίλτρα διέγερσης και εκπομπής.

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυνητικών

Η μεταβολή στο μιτοχονδριακό διαμεμβρανικό δυναμικό προσδιορίστηκε με cytomery ροής χρησιμοποιώντας το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης ευαίσθητες φθοριόχρωμα βαφής JC-1. Εν συντομία, τα κύτταρα NOZ συλλέχθηκαν 24, 48 και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση με pcDNA-FOXL1 ή pcDNA3.1 και πλένονται με PBS. Τα κύτταρα επωάστηκαν με JC-1 (10 μg /ml σε PBS) στους 37 ° C για 10 λεπτά. Χρωματισμένα κύτταρα πλύθηκαν με PBS δύο φορές και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

μιτοχονδριακού και κυτοσολίου παρασκευή εκχυλίσματος

Τα ποσά του μιτοχονδριακού κυτοχρώματος c και κυτοσολικό κυτόχρωμα c προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας μιτοχονδριακή εκχύλισμα και εκχύλισμα κυτταρολύματος αντίστοιχα. Μιτοχονδριακή και κυτοσολικά κλάσματα εκχυλίζονται από καλλιεργημένα κύτταρα με μιτοχόνδρια /κυτοσόλιο Κλασμάτωση Kit (Abcam, Cambridge, UK) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, μετά πλένεται με παγωμένο PBS, τα επιμολυσμένα κύτταρα επωάστηκαν με ρυθμιστικό εκχύλισης κυτοσόλιο μείγμα που περιέχει διθειοθρεϊτόλη (DTT) και αναστολείς πρωτεάσης σε πάγο για 10 λεπτά. Τα κύτταρα ομογενοποιήθηκαν απαλά χρησιμοποιώντας ένα παγωμένο γυάλινο ομογενοποιητή. Το κυτταρικό εναιώρημα φυγοκεντρήθηκε στις 3000 rpm στους 4 ° C για 10 λεπτά. Τα υπερκείμενα φυγοκεντρήθηκαν και πάλι στις 13.000 rpm για 30 λεπτά προς διαχωρισμό ανέπαφα μιτοχόνδρια (pellets) και κυτοσολικό κλάσμα (υπερκείμενα). Τα σφαιρίδια επαναιώρηση με 100 μΙ του μιτοχονδριακού εκχύλισης μίγματος ρυθμιστικού που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης και DTT και στροβιλίστηκαν για 10 δευτερόλεπτα. Το μίγμα αποθηκεύτηκε ως μιτοχονδριακό κλάσμα.

Δυτική

δοκιμασία κηλίδος

Σύνολο πρωτεΐνες που προέρχονται από τα κύτταρα NOZ 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με pcDNA-FOXL1 ή pcDNA3.1. Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη προσδιορίστηκε ποσοτικά με δοκιμασία πρωτείνης Bradford. 40 μg πρωτεΐνης διαχωρίζονται με 10-12% SDS-PAGE και ηλεκτρομεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA). Η μεμβράνη μπλοκαρίστηκε με 5% μη λιπαρό ξηρό γάλα, και ανιχνεύθηκαν με αντίστοιχη πρωτοταγή αντισώματα (Santa Cruz Bio) όλη τη νύκτα στους 4 ° C, που ακολουθείται από επώαση με δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση αγριοραπανίδος (Santa Cruz Bio). δραστικότητα υπεροξειδάσης χράνου έγινε ορατή χρησιμοποιώντας ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (ECL) κιτ (Pierce, Rockford, IL, USA) και εκτέθηκαν σε Χ-ΟΜΑΤ-Μπλε φιλμ (Kodak, Rochester, ΝΥ, USA).

μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή δοκιμασία

μετανάστευση των κυττάρων και προσδιορισμού εισβολή διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας 24 φρεατίων transwell θάλαμο (Corning Inc, Corning, ΝΥ, USA) με 8 μm πόρους σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα επιμολυσμένα κύτταρα σπάρθηκαν σε μη επικαλυμμένο (δοκιμασία μετανάστευσης) ή (δοκιμασία εισβολής) επικαλυμμένα με Matrigel άνω compartement θάλαμος με RPMI1640 ελεύθερο ορού. RPMI1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου τοποθετήθηκαν στα κάτω θαλάμους ως χημειοπροσελκυστικό. 24 ώρες μετά την επώαση, τα κύτταρα επί της άνω πλευράς της μεμβράνης φίλτρου απομακρύνθηκαν με ένα βαμβάκι. Κύτταρα που κολλούν στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 30 λεπτά και στη συνέχεια χρωματίζονται με κρυσταλλικό ιώδες επί 20 λεπτά.

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± SD . Η στατιστική ανάλυση έγινε με SPSS 11.0 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA). Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας t-test ή One-Way ANOVA Μαθητή ή Kaplan-Meier log-rank ή τεστ chi-sqaured. Η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε ως Ρ & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

έκφραση FOXL1 στο GBC και η σχέση της με κλινικοπαθολογοανατομικές μεταβλητές

FOXL1 mRNA και πρωτεΐνης εξετάστηκαν σε ιστούς όγκων και μη όγκου ιστούς με RT-PCR, ανάλυση κηλίδας και ανοσοϊστοχημεία Western, αντιστοίχως. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α και Β, FOXL1 mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης μειώθηκαν σε καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με συμφωνημένα μη όγκου ιστούς. Επιπλέον, 2 από τα δείγματα όγκων στερούνται έκφρασης mRNA FOXL1 και 3 δείγματα όγκων στερούνται την έκφραση της πρωτεΐνης.

(Α) έκφραση FOXL1 mRNA σε GBC ιστούς και συμφωνημένα μη όγκου των ιστών. Τ: GBC ιστούς? Ν, συμφωνημένα μη όγκου των ιστών. (Β) έκφραση της πρωτεΐνης FOXL1 στο GBC ιστούς και συμφωνημένα μη όγκου των ιστών. Ανάλυση (Γ) Η ανοσοϊστοχημεία των FOXL1 στο GBC ιστούς και συμφωνημένα μη όγκου των ιστών. Η μεγέθυνση είναι 200 ​​× και η κλίμακα μπαρ είναι 50 μm. Α: Θετική χρώση FOXL1 σε μη όγκου ιστούς? β: Θετική χρώση των FOXL1 σε καλά διαφοροποιημένοι όγκοι (WD)? γ: Θετική χρώση των FOXL1 σε μετρίως διαφοροποιημένων (MD) όγκους? δ: Θετική χρώση των FOXL1 σε φτωχές διαφοροποιημένα (PD) όγκους? (D) βαθμολογία IHC ιστών GBC και μη όγκου ιστούς (P & lt? 0,05). βαθμολογία (Ε) IHC της πρώιμο στάδιο ΤΝΜ (Ι και ΙΙ), οι όγκοι και το στάδιο αργά ΤΝΜ (III και IV) όγκους (P & lt? 0,05). βαθμολογία (F) IHC όγκων WD και όγκους MD + PD (P & lt? 0,05). καμπύλες (G) Kaplan-Meier με βάση τα επίπεδα έκφρασης FOXL1 με ανοσοϊστοχημεία σε GBC. Οι ασθενείς με υψηλή έκφραση του FOXL1 έχουν καλύτερη έκβαση σε σύγκριση με εκείνες με χαμηλή έκφραση του FOXL1 (Ρ & lt? 0,05). (Η) Η έκφραση mRNA και πρωτεΐνης FOXL1 στο GBC-SD, SGC996, NOZ και κυτταρικές σειρές OCUG-1. (Ι) Η επιμόλυνση με pcDNA-FOXL1 αποκατασταθεί έκφραση FOXL1 σε κύτταρα NOZ. * Υποδηλώνει σημαντική διαφορά.

Η

Ανοσοϊστοχημική ανάλυση έδειξε ότι FOXL1 πρωτεΐνη εντοπίζεται κυρίως στην πυρηνική των καρκινικών κυττάρων και φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα (Σχήμα 1 C). πρωτεΐνη FOXL1 είχε εκφράζεται σε αφθονία σε φυσιολογικούς ιστούς, αλλά σχετικά λιγότερο εκφράζεται σε ιστούς καρκίνου. Το σκορ του FOXL1-θετικών ανοσοχρώση σε ιστούς GBC ήταν πολύ χαμηλότερη από ότι σε φυσιολογικούς ιστούς (Ρ & lt? 0,05, σχήμα 1Δ). έκφραση FOXL1 ήταν σημαντικά υψηλότερη σε όγκους με προγενέστερο στάδιο (Ι και II) σε σύγκριση με εκείνους με προχωρημένο στάδιο (III και IV) (Ρ & lt? 0,05, Σχήμα 1 Ε). Διαφορά στη βαθμολογία των FOXL1-θετική ανοσοχρώση μετρήθηκε επίσης μεταξύ των βαθμών των όγκων (WD vs PD + MD) και βρέθηκε να είναι σημαντική (P & lt? 0.05, Σχήμα 1F), με υψηλότερες βαθμολογίες FOXL1 σε ομάδες WD. Επιπλέον, ένα υψηλότερο επίπεδο της γονιδιακής έκφρασης FOXL1 συσχετίστηκε με καλύτερη πρόγνωση. (Ρ & lt? 0,05, Σχήμα 1G)

κυτταρικές σειρές

Η ενδογενής FOXL1 mRNA και της πρωτεΐνης ήταν ανιχνεύσιμα σε GBC-SD, SGC996 και OCUG-1 , αλλά όχι στην κυτταρική γραμμή NOZ οποίο επομένως επιλέγεται για τα επόμενα πειράματα (Σχήμα 1). Η επιμόλυνση με pcDNA-FOXL1 αποκατέστησε τα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης FOXL1 στην κυτταρική σειρά NOZ (Σχήμα 1Θ).

FOXL1 υπερέκφραση καταστέλλει πολλαπλασιασμό κυτταρικής γραμμής NOZ in vitro και in vivo

Η in vitro επίδραση της υπερέκφρασης FOXL1 στον πολλαπλασιασμό και την ανάπτυξη των κυττάρων NOZ εκτιμήθηκε με WST-1 προσδιορισμό. Η υπερέκφραση του FOXL1 αναστέλλει σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα NOZ (Ρ & lt? 0,05? Σχήμα 2Α). Και αυτή η αναστολή της ανάπτυξης ήταν εξαρτώμενη από το χρόνο

(Α) Η ανάπτυξη των κυττάρων NOZ αναστάλθηκε σημαντικά μετά από επιμόλυνση με pcDNA-FOXL1 (Ρ & lt? 0,05).. (Β) το σχηματισμό αποικιών από κύτταρα NOZ. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών πειραμάτων. (Γ) Η επιμόλυνση με pcDNA-FOXL1 μείωσε σημαντικά τον αριθμό των αποικιών σε κύτταρα NOZ (Ρ & lt? 0,05). (Δ και Ε) FOXL1 υπερέκφραση μείωσε τον όγκο και το βάρος του ξενομοσχεύματος όγκου (Ρ & lt? 0,05). * Υποδηλώνει σημαντική διαφορά.

Η

Τα πιο μακροπρόθεσμη ανασταλτικές επιδράσεις της υπερέκφρασης FOXL1 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων εκτιμήθηκε με δοκιμασία σχηματισμού αποικίας. Μια σημαντική μείωση του αριθμού αποικιών παρατηρήθηκε σε κύτταρα FOXL1 υπερεκφράζουν σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Ρ & lt? 0,05, Σχήμα 2Β και C).

Για την περαιτέρω διερεύνηση του ρόλου της FOXL1 σε ογκογονικότητας και την ανάπτυξη των GBC in vivo, ξενομοσχεύματα σε γυμνά ποντίκια καθορίστηκαν με υποδόρια εμφύτευση FOXL1 υπερεκφράζουν και κύτταρα ελέγχου. Ξενομοσχεύματα που σχηματίζονται από κύτταρα που υπερεκφράζουν FOXL1 αυξήθηκαν με πολύ βραδύτερο ρυθμό από ό, τι εκείνα που σχηματίζονται από τα κύτταρα ελέγχου. FOXL1 υπερέκφραση in vivo προκάλεσε μια σημαντική μείωση τόσο του όγκου του όγκου (Ρ & lt? 0,05, Εικόνα 2D) και το βάρος του όγκου (Ρ & lt? 0,05, Σχήμα 2Ε). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι FOXL1 καταστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων GBC τόσο in vitro όσο και in vivo.

FOXL1 υπερέκφραση προωθούνται απόπτωση στην κυτταρική σειρά NOZ in vitro και in vivo

Η επαγωγή της απόπτωσης από FOXL1 υπερέκφραση σε vitro και in vivo εξετάστηκε χρησιμοποιώντας αννεξίνη V /δοκιμασία ΡΙ και δοκιμασία TUNEL, αντίστοιχα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α και Β, σημαντική αύξηση του ποσοστού των αποπτωτικών κυττάρων NOZ (πρώιμη απόπτωση συν αργά απόπτωση) παρατηρήθηκε μετά από επιμόλυνση με pcDNA-FOXL1 (Ρ & lt? 0,05). Και η αναλογία των αποπτωτικών αργά ή νεκρωτικών κυττάρων αυξήθηκε με χρονο-εξαρτώμενο τρόπο (που άρχισε από τις 24 ώρες και έφτασε στο απόγειο σε 72 ώρες).

(Α) απόπτωση κυττάρων NOZ in vitro εξετάστηκε με Annexin V /PI διπλή χρώση. Κύτταρα που λεκιάζουν αρνητικό τόσο για αννεξίνη V και ΡΙ είναι βιώσιμα κύτταρα (κάτω αριστερά). Τα κύτταρα που χρωματίζονται θετικά για αννεξίνη V και αρνητικά για ΡΙ που υποβάλλονται σε πρώιμη απόπτωση (κάτω δεξιά). Τα κύτταρα που χρωματίζονται θετικά τόσο για αννεξίνη V και ΡΙ είτε στο τελικό στάδιο της απόπτωσης, ή υποβάλλονται σε νέκρωση (επάνω δεξιά). Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών πειραμάτων. (Β) Ο αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων NOZ (συμπεριλαμβανομένης της πρόωρης απόπτωσης, αργά απόπτωσης και νέκρωσης) ήταν σημαντικά αυξημένη μετά από επιμόλυνση με pcDNA-FOXL1 (P & lt? 0,05). (Γ) Η απόπτωση των NOZ κυττάρων in vivo προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία TUNEL. Τα αποπτωτικά κύτταρα απεικονίζονται ως έντονα πράσινη φθορίζουσα κύτταρα. Ο αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων καταγράφηκε υπό πεδία υψηλής ισχύος (400 Χ). Localization σε πυρήνες οπτικοποιήθηκε με ϋΑΡΙ αντικηλίδωση με (μπλε). (D) FOXL1 υπερέκφραση προώθησε σημαντικά την απόπτωση των κυττάρων NOZ in vivo (Ρ & lt? 0,05). * Υποδηλώνει σημαντική διαφορά.

Η

δοκιμασία TUNEL έδειξε ότι FOXL1 υπερέκφραση προώθησε την απόπτωση των κυττάρων NOZ σε όγκους ξενομοσχεύματος. Υπήρχαν λιγότερες TUNEL-θετικών κυττάρων σε όγκους ξενομοσχεύματος που σχηματίζονται από τα κύτταρα ελέγχου. Αντίθετα, ο μέσος αριθμός των TUNEL θετικών κυττάρων αυξήθηκε σημαντικά σε όγκους ξενομοσχεύματος που σχηματίζονται από FOXL1 κύτταρα που υπερεκφράζουν (Ρ & lt? 0,05, Σχήμα 3C και D)

FOXL1 υπερέκφραση επάγεται μιτοχονδριακό διαμεμβρανικό εκπόλωση και cytochromec απόπτωση που διαμεσολαβείται

η απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΔΨ) υποδεικνύει την έναρξη και την ενεργοποίηση ορισμένων αποπτωτικών καταρράκτες. Στην παρούσα μελέτη, ΔΨm εξετάστηκε με χρώση JC-1. Απώλεια ΔΨπι προσδιορίστηκε από τη μεταβολή του JC-1 φθορισμού από κόκκινο σε πράσινο. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α και Β, το ποσοστό των ερυθρού φθορισμού-θετικών κυττάρων μειώθηκε, ενώ η αναλογία πράσινου φθορισμού-θετικών κυττάρων αυξήθηκε μετά την επιμόλυνση με pcDNA-FOXL1 (Ρ & lt? 0,05), προτείνοντας FOXL1 υπερέκφραση προκάλεσε μια εμφανή μείωση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης .

(Α) Η απώλεια της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικό (ΔΨm) υποδεικνύεται από μια μείωση στο κόκκινο πράσινο αναλογία /ένταση φθορισμού. άξονα Χ δείχνει πράσινο ένταση φθορισμού? άξονας Υ δείχνει κόκκινο ένταση φθορισμού. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών πειραμάτων. (Β) Η αναλογία του ερυθρού φθορισμού-θετικών κυττάρων μειώθηκε, ενώ η αναλογία πράσινου φθορισμού-θετικών κυττάρων αυξήθηκε μετά την επιμόλυνση με pcDNA-FOXL1 (Ρ & lt? 0,05). (Γ) ανάλυση κηλίδας Western έδειξε το επίπεδο κυτοσολικού κυτοχρώματος c σημαντικά αυξημένη, ενώ το επίπεδο του μιτοχονδριακού κυτοχρώματος c αισθητά μειωθεί. (D) Τα επίπεδα του διασπασμένη κασπάση-9, 3 και PARP και Βαχ ήταν αυξημένα, ενώ το επίπεδο του bcl-2 μειώθηκε. * Υποδηλώνει σημαντική διαφορά.

Η

μιτοχονδριακού και κυτοσολικές κυτόχρωμα c εξετάστηκε με δοκιμασία κηλίδος Western. Το επίπεδο της κυτοσολικής κυτοχρώματος c ήταν σημαντικά αυξημένα, ενώ το επίπεδο του μιτοχονδριακού κυτοχρώματος c ήταν σημαντικά μειωμένη 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με pcDNA-FOXL1, υποδηλώνοντας ότι η υπερέκφραση FOXL1 προωθείται απελευθέρωση κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια στο κυτοσόλιο (Σχήμα 4C). Οξειδάσης κυτοχρώματος ο υπομονάδα IV (Cox IV) και β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος για μιτοχονδριακή πρωτεΐνη και κυτοσολική πρωτεΐνη, αντίστοιχα. Επιπλέον, βρήκαμε pcDNA-FOXL1 προκάλεσε αύξηση στην αναλογία Ββχ /Bcl-2, η οποία μπορεί να προκαλέσει την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια στο κυτοσόλιο.

Οι επιδράσεις της υπερέκφρασης FOXL1 στην ενεργοποίηση κασπασών σε κύτταρα NOZ ήταν εξετάστηκε περαιτέρω με κηλίδα Western. Βρήκαμε ότι η διάσπαση της κασπάσης-9 και -3 ήταν αυξήθηκε σημαντικά 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με pcDNA-FOXL1. Επιπλέον, η διάσπαση πολυ (ADP) ριβόζης πολυμεράσης (PARP), το οποίο είναι το σήμα κατατεθέν της απόπτωσης ήταν επίσης αυξημένη αξιοσημείωτα μετά από επιμόλυνση με pcDNA-FOXL1 (Εικόνα 4D). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι FOXL1 ενεργοποιηθεί η υπερέκφραση καταρράκτες κασπάσης στα κύτταρα NOZ.

FOXL1 κατέστειλε τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων NOZ και επάγεται η έκφραση Ε-καδερίνης

Δεδομένου ότι η συσχέτιση της έκφρασης FOXL1 με κλινικό στάδιο και λεμφαδένα μετάσταση της GBC είχε αποδειχθεί παραπάνω, είναι αναμενόμενο ότι FOXL1 μπορεί να παίξει ένα ρόλο στη μετανάστευση και την εισβολή των GBC. Ως εκ τούτου, αξιολογήσαμε την επόμενη το ρόλο της FOXL1 στη μετανάστευση και την εισβολή των GBC. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α-C, επιμόλυνση με pcDNA-FOXL1 προκάλεσε μια σημαντική μείωση στον αριθμό των μεταναστευτικών και μεταστατικών κυττάρων NOZ σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου (Ρ & lt? 0,05), προτείνοντας FOXL1 υπερέκφραση αλλοίωσε τη μεταναστευτικών και επεμβατικές ικανότητες των κυττάρων NOZ . Επιπλέον, βρήκαμε επίπεδο πρωτεΐνης Ε-καντερίνη ήταν σημαντικά αυξημένα 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με pcDNA-FOXL1, ενώ το επίπεδο των ZEB1 πρωτεΐνης ήταν σημαντικά μειωμένη (Σχήμα 5D).

(Α) Ο αριθμός των μεταναστευτικών και επεμβατική κύτταρα βάφονται με κρυσταλλικό ιώδες αντανακλάται μεταναστευτικών και επεμβατική ιδιότητά τους. Οι αριθμοί των αποδημητικών ή επεμβατικές NOZ κυττάρων ανά οπτικό πεδίο μετρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο μετά από χρώση με κρυσταλλικό ιώδες (× 100). Η επιμόλυνση (C B και) με pcDNA-FOXL1 ανέστειλε σημαντικά τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων NOZ (Ρ & lt? 0,05). (D) έκφραση ZEB1 κατεστάλη και η έκφραση Ε-καδερίνης προκλήθηκε με FOXL1 υπερέκφραση. * Υποδηλώνει σημαντική διαφορά.

Η

Συζήτηση

Οι ρόλοι των μελών της οικογένειας Forkhead όπως FOXOs, FOXMs και FOXPs σε καρκίνους έχουν ευρέως ερευνηθεί. Ωστόσο, υπάρχουν λίγες έρευνες σχετικά με τη ρύθμιση και τη λειτουργία της FOXL1 σε καρκίνους. Στην παρούσα μελέτη, ο ρόλος της FOXL1 στην ανάπτυξη, την απόπτωση, τη μετανάστευση και την εισβολή του GBC κυττάρου προκαταρκτικά μελετήθηκε. Βρήκαμε τα επίπεδα των FOXL1 mRNA και της πρωτεΐνης μειώθηκαν σημαντικά σε GBC ιστούς σε σύγκριση με συμφωνημένα μη όγκου ιστούς. Εκτός GBC, μια μείωση στην έκφραση της FOXL1 παρατηρήθηκε επίσης από άλλους ερευνητές σε όγκους του παγκρέατος [10], [11]. Επιπλέον, η έκφραση FOXL1 σχετίστηκε αρνητικά με προχωρημένο στάδιο TNM και την κακή διαφοροποίηση των GBC. Επιπλέον, μια υψηλότερη έκφραση FOXL1 συσχετίστηκε με καλύτερη πρόγνωση σε ασθενείς που υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση για GBC. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι downexpression του FOXL1 μπορεί να εμπλέκεται στην ογκογένεση και την πρόοδο της GBC και FOXL1 μπορούν να χρησιμεύσουν ως ένα χρήσιμο προγνωστικό παράγοντα πρόγνωση για τους ασθενείς που υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν επίσης σε μυελώματος και του καρκίνου του παγκρέατος [8], [12]. Ωστόσο, οι μηχανισμοί για downexpression έκφρασης FOXL1 σε αυτούς τους καρκίνους δεν έχουν διασαφηνιστεί ακόμη. Αρκετοί μηχανισμοί όπως χρωμοσωμική διαγραφή [13], χρωμοσωμικές μεταθέσεις [14], [15], η μεθυλίωση προαγωγού [16], αλλοίωση σε ανάντη ρυθμιστές [17], [18] και μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις [4] έχει αποδειχθεί ότι συνεισφέρουν στην απορρύθμιση των παραγόντων Fox. Με βάση τα σημερινά αποτελέσματα, είναι δύσκολο να πούμε ποια μηχανισμός ήταν υπεύθυνος για την αρνητική ρύθμιση της FOXL1 στο GBC. θα πρέπει να διενεργείται με διευκρινίσει το θέμα περαιτέρω έρευνα σχετικά με τη γενετική και επιγενετικών μηχανισμών για την απορυθμισμένη γονιδιακή έκφραση FOXL1.

Η συσχέτιση των υψηλότερη έκφραση FOXL1 με πρώιμο στάδιο και καλύτερη πρόγνωση πρότεινε δυναμικό ρόλο κατασταλτικό της στην ανάπτυξη των κυττάρων GBC και προχώρηση. Ως εκ τούτου πραγματοποιήσαμε μια σειρά λειτουργικών μελετών για να αξιολογηθεί η επίδραση του FOXL1 στην ανάπτυξη, η απόπτωση, μετανάστευση και εισβολή του GBC κυτταρικής γραμμής.

Η υπερέκφραση του FOXL1 αναστέλλει σημαντικά την ανάπτυξη των κυττάρων NOZ in vitro και in vivo, και αυτή η αναστολή της ανάπτυξης μπορεί να αποδοθεί στην επαγωγή απόπτωσης από FOXL1 υπερέκφραση. Η απόπτωση είναι μια βιολογική διαδικασία που περιλαμβάνει μια γενετικά προγραμματισμένο σειρά των γεγονότων που οδηγούν στο θάνατο του κυττάρου. Κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας, πολλά σημαντικά γεγονότα συμβαίνουν στα μιτοχόνδρια, συμπεριλαμβανομένης της απελευθέρωσης του κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια στο κυτταρόπλασμα και την απώλεια του μιτοχονδριακού διαμεμβρανικό δυναμικό (ΔΨm) [19], [20]. ΔΨπι είναι μία σημαντική παράμετρος της μιτοχονδριακής λειτουργίας και έχει χρησιμοποιηθεί ως δείκτης των βιώσιμων κυττάρων. Bcl-2 οικογένειας που αποτελείται από προ- αποπτωτικών και αντι-αποπτωτικά μέλη ρυθμίζει την μιτοχονδριακή μονοπάτι της απόπτωσης με τον έλεγχο της διαπερατότητας της εξωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης και το άνοιγμα των εξαρτώμενων από την τάση κανάλι ανιόντων (VDAC). Προ-αποπτωτική πρωτεΐνη όπως Βαχ επιταχύνει το άνοιγμα του VDAC, ενώ η αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-x (L) κλείνει VDAC μέσω σύνδεσης με το απ ‘ευθείας. Αύξηση του λόγου Bax /Bcl-2 μπορεί να οδηγήσει σε διαταραχή της ΔΨm και το άνοιγμα των VDAC. Στη συνέχεια, το μιτοχονδριακό κυτόχρωμα c μπορεί να μετατοπιστεί προς τον κυτταρόπλασμα μέσω VDAC και να κινήσει τη διαδικασία της απόπτωσης [21].