Αφηρημένο

επιθετικότητα νόσος παραμένει ένας κρίσιμος παράγοντας για την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη. Ο μετασχηματισμός των επιθηλιακών κυττάρων σε μεσεγχυματικά γενεαλογία, που συνδέεται με την απώλεια της Ε-καδερίνης, προσφέρει σημαντικά επεμβατική δυναμικό και την ικανότητα μετανάστευσης. Πρόσφατα, Ειδικές ΑΤ-πλούσιες σε πρωτεΐνη πρόσδεσης (SATB1) έχει συνδεθεί με την εξέλιξη του όγκου. SATB1 είναι ένα κύτταρο-τύπου περιορίζεται πυρηνική πρωτεΐνη, η οποία λειτουργεί ως οργανωτής ιστοειδική αλληλουχιών DNA κατά την διάρκεια της κυτταρικής διαφοροποίησης. Τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν ότι SATB1 διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στον προστάτη εισβολή όγκου και τη μετανάστευση και την πυρηνική εντόπιση του συσχετίζεται με επιθετικότητα της νόσου. Κλινική ανάλυση δείγμα έδειξε ότι SATB1 ήταν κυρίως εκφράζεται στον πυρήνα των όγκων υψηλής ποιότητας σε σύγκριση με χαμηλού βαθμού όγκου και καλοήθη ιστό. Μια προοδευτική αύξηση των πυρηνικών επίπεδα SATB1 παρατηρήθηκε σε καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με καλοήθη δείγματα. Ομοίως, τα επίπεδα της πρωτεΐνης SATB1 ήταν υψηλότερα σε έναν αριθμό των καρκινικών κυττάρων του προστάτη

δηλαδή

. HPV-CA-10, DU145, DuPRO, PC-3, PC-3M, LNCaP και C4-2B, σε σύγκριση με τα κύτταρα μη ογκογόνα PZ-HPV-7. Πυρηνική έκφραση SATB1 ήταν υψηλότερη σε βιολογικά επιθετικό υποκλώνους κυττάρων καρκίνου του προστάτη με τις αντίστοιχες γονικές κυτταρικές σειρές τους. Επιπλέον, έκτοπη διαμόλυνση SATB1 ανατίθενται αυξημένη κυτταρική κινητικότητα και διεισδυτικότητα σε αθανατοποιημένα κύτταρα επιθηλιακά ανθρώπινου προστάτη PZ-HPV-7, η οποία συσχετίζεται με την απώλεια της έκφρασης Ε-καδερίνης. Κατά συνέπεια, νοκ ντάουν της SATB1 σε ιδιαίτερα επιθετικό καρκίνο του προστάτη στον άνθρωπο κύτταρα PC-3M ανέστειλε εισβολής και της ανάπτυξης των όγκων

in vivo

μαζί με αύξηση στην έκφραση της πρωτεΐνης Ε-cadherin. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι SATB1 έχει την ικανότητα να προωθήσει προστάτη επιθετικότητα του καρκίνου μέσω επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση

Παράθεση:. Shukla S, Sharma Η, Αμπάς Α, MacLennan GT, Fu P, Danielpour D, et al. (2013) Η αναβάθμιση του SATB1 συνδέεται με τον καρκίνο του προστάτη επιθετικότητα και την εξέλιξη της νόσου. PLoS ONE 8 (1): e53527. doi: 10.1371 /journal.pone.0053527

Επιμέλεια: Surinder Κ Batra, Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 22 Αύγ, 2012? Αποδεκτές: 3 Δεκ 2012? Δημοσιεύθηκε: 7 Ιανουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Shukla et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η χρηματοδότηση που προβλέπεται από Ηνωμένες Πολιτείες Δημόσιας Υγείας Υπηρεσία Χορηγιών RO1CA115491 και Endowment κεφάλαια για να SG. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι η δεύτερη κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται θανάτου μεταξύ των ανδρών στις Ηνωμένες Πολιτείες, με σχεδόν 33.720 θάνατοι σημειώθηκαν κατά το έτος 2011 [1]. Κακή πρόγνωση του καρκίνου του προστάτη συνδέεται με την επιθετικότητα των καρκινικών κυττάρων που τους προικίζει με αυξημένη ικανότητα να intravasate στο αγγειακό και λεμφατικό διαμερίσματα, μετάσταση σε απομακρυσμένες θέσεις, και να προκαλέσει υποτροπή, ακόμη και μετά την οριστική θεραπείες όπως η χειρουργική επέμβαση και ακτινοβολία [2], [3 ]. Μεταβάσεως επιθηλίου-μεσεγχύματος (ΕΜΤ) είναι ένα γεγονός κλειδί στην διαδικασία εισβολής όγκου σύμφωνα με την οποία λαμβάνεται από επιθηλιακό κύτταρο όγκου αποκτά χαρακτηριστικά μεσεγχυματικά, χάνουν πολικότητα και κυττάρου-κυττάρου επαφές τους και υφίστανται βαθιές κυτταροσκελετού αναδιαμόρφωση [4] – [6]. Η απώλεια της έκφρασης Ε-καδερίνης είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα του ΕΜΤ [7], [8]. Ε-καδερίνη (Cdh1) παίζει κεντρικό ρόλο στη κόμβους προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου σε συντήρηση του κυττάρου πολικότητα και το περιβάλλον [7]. Η απώλεια της έκφρασης Ε-καδερίνης συνήθως συνδέεται με την εισβολή όγκου, μετάσταση και φτωχή πρόγνωση σε διαφόρους ανθρώπινους καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη [8], [9]. Ταυτοποίηση των πρωτεϊνών που προκαλούν μοριακές επαναπρογραμματισμό του EMT θα μπορούσαν να οδηγήσουν στην ταυτοποίησή τους ως προγνωστικούς βιοδείκτες και θεραπευτικών στόχων, επιτρέποντας έτσι την ανάπτυξη νέων στρατηγικών για τη μείωση του προστάτη επιθετικότητα του καρκίνου.

Ειδικές ΑΤ-πλούσια δεσμευτική πρωτεΐνη 1 (SATB1) είναι ένας παράγοντας μεταγραφής που λειτουργεί ως διοργανωτής γονιδίωμα [10], [11]. Τείνει να δεσμεύει με την AT πλούσια βάση μη ζευγαρωμένα αλληλουχίες του γονιδίου-στόχου [11]. SATB1 αποκτά μια δομή «3 D chickenwire» με τη διαμόρφωση άγκυρα βρόχους γύρω από χρωματίνης, στρατολογεί συγκροτήματα αναδιαμόρφωση της χρωματίνης στα αγκυροβόλιο χώρους, και ρυθμίζει τις τροποποιήσεις των ιστονών, καθιστώντας ακολουθίες DNA προσιτές ή απρόσιτες για μεταγραφή [12], [13]. Μεταγραφή GenBank αναφοράς δύο παραλλαγές μεταγραφή SATB mRNA στον άνθρωπο: SATB1 και SATB2 [14]. Συστατική ενεργοποίηση SATB1 έχει αποδειχθεί κυρίως σε κύτταρα αιμοποιητικής γραμμής και εμπλέκεται στα στάδια της ανάπτυξης των κυττάρων Τ και διαφοροποίηση ελέγχει την έκφραση του γονιδίου bcl-2 μέσω του μείζονος σημείο διακοπής περιοχή BCL-2 (MBR) που βρίσκεται εντός της 3′- UTR [15], [16]. SATB2 εμπλέκεται ως ένα αναπτυξιακό ρυθμιστής νευρωνικής διαφοροποίησης [17]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ανώμαλη έκφραση του SATB1 σε μια ποικιλία επιθηλιακών καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του μελανώματος, του λάρυγγα καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων, και καρκινωμάτων του μαστού, του παχέος εντέρου, του πνεύμονα, των ωοθηκών, και του ήπατος [18] – [24]. Η υπερέκφραση του SATB1 έχει ταυτοποιηθεί ως ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης για καρκίνο του στομάχου [25], και έχει δειχθεί ότι παίζει ένα ρόλο στην πρόοδο του όγκου του μαστού μέσω μιας διαδικασίας επαναπρογραμματισμού γονιδιακής έκφρασης και με τον τρόπο αυτό την προώθηση της ανάπτυξης του όγκου και τη μετάσταση [26]. Λίγα είναι γνωστά σχετικά με την επίδραση της έκφρασης SATB1 για την βιολογική συμπεριφορά του καρκίνου του προστάτη.

Αν και SATB1 έχει αναφερθεί ότι ενεργοποιείται σε διάφορους τύπους καρκίνου, ο ρόλος του στην εξέλιξη του καρκίνου δεν είναι σαφής. Μια πλήρης ανάλυση γονιδιακής έκφρασης δειγμάτων καρκίνου του προστάτη κλινικών αποκάλυψε διακριτό επαναπρογραμματισμό μεταγραφική σχετίζεται με μεταστατικό δυναμικό [27]. Λειτουργική προφίλ των γονιδίων πρότεινε τη σύνδεση της SATB1 με την τροποποίηση της χρωματίνης που επηρεάζουν μεταγραφική ρύθμιση των γονιδίων που ρυθμίζουν τα μόρια κυτταρικής προσκόλλησης και EMT [9], [12]. Δεδομένου του σημαντικού ρόλου των EMT σε διηθητικότητας του καρκίνου του προστάτη, έχει υποτεθεί ότι η υπερ-έκφραση του SATB1 στον καρκίνο του προστάτη θα μπορούσε να προωθήσει τη διεισδυτικότητα του καρκίνου του προστάτη με προς τα κάτω ρύθμιση της Ε-καδερίνης. Μέχρι στιγμής, δεν έχει υπάρξει καμία δεδομένα σχετικά με το ρόλο του SATB1 στον καρκίνο του προστάτη. Σε αυτή τη μελέτη της έκφρασης SATB1, πυρηνικά και κυτταροπλασματικά εντοπισμός του αξιολογήθηκε σε έναν αριθμό πρωτογενών προστάτη δειγμάτων καρκινικού ιστού και καθιερωμένες κυτταρικές σειρές μέσω ενός συνδυασμού ανοσοϊστοχημεία και στύπωμα Western. Τα αποτελέσματά μας αποδεικνύουν ότι η πυρηνική παρουσία SATB1 συσχετίζεται σημαντικά με την επιθετικότητα του καρκίνου του προστάτη και την εξέλιξη της νόσου. Συνεπής με τα κλινικά ευρήματα, έκτοπη μεταβολές στην έκφραση SATB1 οδήγησε σε αλλαγές στην κυτταρική κινητικότητα και την εισβολή και

in vitro

και

in vivo

. Αυτή η γραμμή των αποδεικτικών στοιχείων καταδεικνύει την προγνωστική σημασία της SATB1 στον καρκίνο του προστάτη και αποσαφηνίζει περαιτέρω την επιρροή της SATB1 στην προώθηση της εισβολής του καρκίνου του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

Ανθρώπινο τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη, LNCaP, 22Rv1, DU145, PZ-HPV-7, ΟΑ-HPV-10 και PC-3 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). Ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του προστάτη

δηλαδή

. PC-3M παρεσχέθη από τον Dr. ME Kaighn στο Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου [28]? C4-2B κύτταρα από τον Δρ Robert Sikes στο Πανεπιστήμιο του Delaware [29], και τα κύτταρα DuPRO από τον Δρ Rajvir Dahiya στο Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια στο Σαν Φρανσίσκο [30]. Προηγούμενες εκθέσεις έχουν τεκμηριώσει τη δημιουργία αυτών των κυτταρικών σειρών [28] – [30]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 με 10% ορό εμβρύου μόσχου απενεργοποιημένο με θέρμανση, 100 μg /ml πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (Invitrogen, Carlsbad, CA), διατηρήθηκε σε έναν επωαστήρα με υγροποιημένη ατμόσφαιρα 95% αέρα και 5% CO

2 στους 37 ° C. Τα καλλιεργημένα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε περίπου 60% συρροή και λύματα (συνολικά λύματα, του κυτταροπλάσματος και η πυρηνική λύματα) παρασκευάστηκαν σύμφωνα με το προηγούμενο πρωτόκολλο για περαιτέρω ανάλυση.

Ανθρώπινο προστάτη δείγματα ιστών και ανοσοϊστοχημεία

Δείγματα των απορριπτόμενων ιστό ανθρώπινου προστάτη ελήφθησαν από το Μηχανισμό Tissue Προμηθειών του Πανεπιστημίου Νοσοκομεία υπόθεση Ιατρικό Κέντρο και το τμήμα Midwestern του Συνεταιρισμού ανθρώπινο Δίκτυο ιστών. Δεν δόθηκε η συγκατάθεση για αυτές απορρίπτονται ιστούς ανά πολιτικών νοσοκομείο και πρωτόκολλα Institutional Review Board. Αυτές οι μελέτες εγκρίθηκαν από το Διοικητικό Συμβούλιο αναθεώρηση Θεσμικών στην υπόθεση Ιατρικό Κέντρο του Πανεπιστημίου Νοσοκομεία. Οι ασθενείς από τους οποίους προμηθεύονται οι ιστοί αυτοί είχαν υποβληθεί σε χειρουργικές επεμβάσεις για τη νόσο του προστάτη και δεν είχε λάβει οποιαδήποτε μορφή της επικουρικής θεραπείας. Ο βαθμός Gleason και το σκορ του αδενοκαρκινώματος σε δείγματα ιστών αποδόθηκαν από μια χειρουργική παθολόγο εμπειρία στην ουροποιητικό παθολογία. Αμέσως μετά την προμήθεια, τα δείγματα καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C στη φάση ατμών υγρού αζώτου μέχρι περαιτέρω χρήσης. Για τις μελέτες IHC μια μικροσυστοιχία ιστό ανθρώπινου προστάτη (Cat # 73-5063) αγοράστηκαν από τη Zymed Laboratories (San Francisco, CA), συμπεριλαμβανομένων των πυρήνων της κανονικής προστάτη, καλοήθης υπερπλασίας του ιστού του προστάτη, καρκίνους χαμηλής ποιότητας και του καρκίνου του προστάτη υψηλής ποιότητας. Σε αυτά τα δείγματα, ανοσοϊστοχημική ανάλυση πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Biocare Medicals, Concord, CA).

παροδική επιμόλυνση

ανδρογόνων πυρίμαχα υψηλής μεταστατικό καρκίνο του ανθρώπινου προστάτη PC-3M, οι οποίες διαθέτουν υψηλότερη έκφραση του SATB1, ενώ, PZ-HPV-7, το οποίο έχει πολύ χαμηλό βασικό επίπεδο SATB1in πυρήνα χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη. Εν συντομία, αυτά τα κύτταρα απλώθηκαν σε πλάκες των 100-mm και αφήνονται να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Περίπου το 70% συρροή PZ-HPV-7 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με 8 & lt? Mu & gt? Γρ είτε pCMV6-AC True Κλώνος DNA πλασμιδίου Ανθρώπινα περιείχε SATB1 (SC320672) έκφραση αγοράστηκε από ΟηΟεηε (Rockville, MD) ή κενού φορέα, ενώ, κύτταρα PC-3M μολύνθηκαν με shRNA (SATB1) ανθρώπινο DNA πλασμιδίου να knockdown την έκφραση του γονιδίου SATB1? το οποίο περιέχει δεξαμενή 3 ειδικού στόχου φορέα λεντοϊού που κωδικοποιεί κάθε 19-25 nt (συν φουρκέτα) (SC-36460-SH) και το άδειο φορέα shRNA πλασμίδιο-Α (SC-108060) (Santa Cruz Biotechnology, CA) χρησιμοποιώντας Fugene 6 αντιδραστήριο επιμόλυνσης. Μετά από 6 ώρες το μέσο συμπληρώθηκε με μέσο καλλιέργειας ορού, και τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή για 48 ώρες. Αργότερα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανάλυση ανοσοστυπώματος, καθώς και τη μετανάστευση των κυττάρων και δοκιμασίες εισβολής.

Western Blotting

προϊόντα λύσης όγκου, καθώς επίσης προϊόντα λύσης κυττάρου (σύνολο, κυτοσολική και πυρηνικά) παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν να ανάλυση ανοσοκηλίδας. Πρωτεΐνη (40 & lt? Mu & gt? Ζ) από συνολικά κυτταρολύματα ή προϊόντα λύσης όγκου ανθρώπινου προστάτη επιλύθηκε επί 4-20% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Μετά από αποκλεισμό με ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού (PBS που περιέχει 0.1% Tween-20 και 10% FBS) για 2 ώρες, η μεμβράνη επωάστηκε με πρωτογενές αντίσωμα για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν SATB1 (Cat # ab49061, Abcam, Cambridge, ΜΑ)? Ιστόνης Η4 (Cat # 07-108, Millipore, Denvers, ΜΑ)? Ε-καδχερίνη (Cat # SC-8426)? MMP-9 (Cat # SC-10737)? & Lt? Beta & gt? Ακτίνης (Cat # SC-47778) και Cytokeratin-18 (Cat # SC-6259) από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Η μεμβράνη στη συνέχεια επωάστηκε με συζευγμένο με HRP δευτερογενούς αντισώματος για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Η πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε με αντιδραστήρια υποστρώματος ECL (Amersham Biosciences, Arlington Heights, IL).

Δοκιμασία Κυττάρων Invasion

Παροδικά επιμολύνει SATB1 σε PZ-HPV-7 (SATB1over κύτταρα που εκφράζουν) και PC -3M μολυσμένα (κύτταρα knockdown SATB1) ελήφθησαν στη μελέτη για να εξετάσει την επίδραση της γονιδιακής SATB1 στην εισβολή κυττάρων καθώς και στη μετανάστευση. Μετά από 48 ώρες μόλυνσης γονιδίου SATB1 στα κύτταρα, μέσα που περιέχουν ορό απομακρύνθηκε από τα κύτταρα και αναπληρώθηκε φρέσκο ​​RPMI μέσο χωρίς ορό για 6 ώρες. Περαιτέρω τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, μετρήθηκαν και επιστρώθηκαν στα transwells περιέχει 1 × 10

6 κύτταρα /ml. Το κιτ δοκιμασίας θάλαμος εισβολή χρησιμοποιήθηκε ήταν Εισβολή Δοκιμασία QCMTM ECMatrix Cell, 24 φρεατίων (8 & lt? Mu & gt? M) (Millipore Corporation, Denvers, ΜΑ, Cat # ECM550) με βάση την αρχή του θαλάμου Boyden. Το στρώμα του κολλαγόνου αποφράσσει τους πόρους της μεμβράνης, εμποδίζοντας μη επεμβατική κύτταρα από μετανάστευση διαμέσου της μεμβράνης. Μεταστατικών κυττάρων, από την άλλη πλευρά, μεταναστεύουν μέσω του πολυμερισμένου στρώματος κολλαγόνου και προσκολλώνται στο κάτω μέρος της μεμβράνης πολυανθρακικού. Εισβολή κύτταρα στο κάτω μέρος του ένθετου μεμβράνης επωάστηκαν με διάλυμα κυττάρων Stain, εν συνεχεία εκχυλίζεται και ανιχνεύονται σε ένα πρότυπο αναγνώστη μικροπλάκας (560 nm). Η όλη διαδικασία ακολουθήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Κυττάρων Η μετανάστευση Δοκιμασία

δοκιμασία μετανάστευση πραγματοποιήθηκε σε PZ-HPV-7 (SATB1over κύτταρα που εκφράζουν) και PC-3M μολυνθεί (SATB1 knockdown κύτταρα) κύτταρα με τη χρήση QCMTM, 24 και κιτ προσδιορισμού χρωματομετρική κυτταρικής μετανάστευσης (Millipore Corporation, Denvers, ΜΑ, Cat # ECM508) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του πωλητή.

αντίστροφης μεταγραφής-πολυμεράσης

αλυσιδωτή αντίδραση

Ημι -ποσοτική αλύσου πολυμεράσης μεταγραφής αντίδραση αντίστροφης (RT-PCR) πραγματοποιήθηκε για να προσδιοριστούν τα επίπεδα μεταγραφής των SATB1 σε ανθρώπινα δείγματα ιστού του προστάτη των διαφόρων βαθμών Gleason και την ενίσχυση των μεταγραφών GAPDH χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος για την κανονικοποίηση των επιπέδων μεταγραφής του SATB1. Οι ιστοί κόπηκαν σε μικρά κομμάτια και τοποθετήθηκε σε Melt, ένα συνολικό σύστημα απομόνωσης νουκλεϊκού οξέος (Ambion, Austin, ΤΧ), σύμφωνα με το πρωτόκολλο των κατασκευαστών. RT διεξήχθη με τη χρήση του εκκινητή ολιγο-άΤ (Invitrogen), και 0.5 & lt? Mu & gt? G ολικού RNA σε ένα lt 25 &? Mu & gt? Μείγμα της αντίδρασης l, που περιέχει 50 mM Tris-HCl (ρΗ 8.3), 75 mM KCl, 10 mM DTT, 5 mM MgCl

2, 2,5 ml dNTP (10 mM), 10 U RNAsin, και 200 ​​U MMLV αντίστροφης μεταγραφάσης (Invitrogen). Η αντίδραση RT διεξάγεται στους 39 ° C για 1 ώρα για να συνθέσει cDNA. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε PCR για την ενίσχυση cDNAs σε lt 25 &? Mu & gt? Μείγμα αντίδρασης l που περιέχει 50 nmol του κάθε γονιδίου ειδικό εναρκτήρα, 3 ml RT προϊόν, 2.5 mM dNTP, ρυθμιστικό διάλυμα 1Χ PCR (5 mM Tris-HCI ρΗ 8.3, 42.5 mM ΚΟΙ , 0,1% Triton Χ-100), 0,5 ml Taq πολυμεράσης (Promega, Madison, WI) 2 mM MgCl

2 μαζί με εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν στην αντίδραση PCR. Οι αλληλουχίες του γονιδίου-ειδικούς εκκινητές για την SATB1 εμπρός: 5′-GTGGAAGCCTTGGGAATCC-3 ‘και αντίστροφος: 5′-CTGACAGCTCTTCTTCTAGTT-3′? GAPDH προς τα εμπρός: 5’-ATGACC CCTTCATTGACCTCA-3 ‘και να αντιστραφεί: 5′-GAGATGATGA CCCTTTTGGCT-3’. SATB1 μεταγραφές ενισχύθηκε για 30 κύκλους (1 λεπτό στους 94 ° C, 1 λεπτό στους 59 ° C, και 1 λεπτό στους 72 ° C), και η cDNAs των αντιγράφων GAPDH ενισχύθηκαν για 25 κύκλους (1 λεπτό στους 94 ° C, 1 λεπτό στους 55 ° C, και 1 λεπτό στους 72 ° C). Οι αριθμοί των κύκλων PCR είχε βελτιστοποιηθεί για να αποφευχθεί ο κορεσμός ενίσχυση. Δέκα μικρο-λίτρα του RT-PCR προϊόντος διαχωρίστηκε σε πηκτές αγαρόζης 2%, οι οποίες στη συνέχεια χρωματίστηκαν με βρωμιούχο αιθίδιο. Τα πηκτώματα οπτικοποιήθηκαν και εντάσεις ζωνών μετρήθηκαν κάτω από το σταθμό εικόνας Kodak 2000R.

SATB1 Knockdown

κύτταρα PC-3M μετήχθησαν με SATB1 shRNA λεντοϊού σωματίδια, τα οποία είναι μια πισίνα του ιικού σωματιδίου που περιέχει 3 στον στόχο ειδικές κατασκευές που κωδικοποιούν 19-25 nt (συν φουρκέτα) shRNA σχεδιαστεί για να χτυπήσει κάτω της γονιδιακής έκφρασης (Santa Cruz Biotechnology, CA? sc36460-v). κύτταρα PC-3M απλώθηκαν σε μια 12 φρεατίων 24 ώρες πριν από την ιογενή λοίμωξη. Οι διαμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν σε RPMI που περιέχει 10% πλήρες μέσο (με ορό και αντιβιοτικά) και επώαση των κυττάρων όλη τη νύκτα. RPMI πλήρες μέσο απομακρύνθηκε και συμπληρώθηκε με πολυβρένιο (5 & lt? Mu & gt? G /ml) πλήρους μέσου RPMI. κύτταρα PC-3M μολύνθηκαν με με την προσθήκη των shRNA λεντοϊού σωματιδίων στα κύτταρα μέσο που περιέχει. Όλα διαδικασία διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Colony Δοκιμασία Σχηματισμού

Περίπου 400 κύτταρα PC-3M και PC-3M (SATB1 γκρεμίζω) κύτταρα ελήφθησαν σε 100 mm τρυβλίο Petri ( Falcon? Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) και καλλιεργήθηκε στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO2 και 95% αέρα. Μετά από 12 ημέρες τα κύτταρα πλύθηκαν με ρυθμιστικό φωσφορικό και στη συνέχεια χρωματίζονται με Coomassie blue. Τα κύτταρα αποικίες μετρήθηκαν και φωτογραφήθηκαν.

ξενομοσχεύματος όγκου Μελέτες

Γυμνά ποντίκια αγοράστηκαν από την υπόθεση Comprehensive Κέντρο Καρκίνου, αθυμικά γυμνά ποντίκια εγκατάσταση και διατηρήθηκαν σε κλωβούς μικροαπομονωτικά. Όλα τα ζώα χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με τις θεσμικές κατευθυντήριες γραμμές και τα τρέχοντα πειράματα εγκρίθηκαν από την επιτροπή Χρήση για φροντίδα των ζώων στο Πανεπιστήμιο Case Western Reserve. Τα καρκινικά κύτταρα, PC-3M και PC-3M (SATB1 knockout) εναιωρήθηκαν σε RPMI 1640 μέσο πλήρης καλλιέργειας με 25% Matrigel (BD Biosciences) και εμβολιάζονται 1 × 10

6 κύτταρα υποδορίως στην δεξιά και αριστερά πλευρά των 6 έως 7-εβδομάδων γυμνούς ποντικούς. Οι ποντικοί παρακολουθήθηκαν ημερησίως για το σχηματισμό ψηλαφητών όγκων και όγκοι μετρήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα χρησιμοποιώντας ένα παχυμέτρου, ζυγίστηκαν και φωτογραφήθηκαν.

Στατιστική Ανάλυση

Τα στοιχεία πυρηνική έκφραση SATB1 συνοψίστηκαν με μέση τιμή (εύρος ), καθώς και Θηκόγραμμα. Αλλαγές στον όγκο του όγκου και του σωματικού βάρους κατά τη διάρκεια των πειραμάτων έγιναν ορατές με διάγραμμα διασποράς. Διαφορές από πυρηνική έκφραση SATB1 (ανά 1000 πυρήνες), όγκος (mm3) των όγκων και το σωματικό βάρος κατά τον τερματισμό του πειράματος μεταξύ διαφόρων ομάδων εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) που ακολουθείται από διαδικασία πολλαπλής σύγκρισης του Tukey. Η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών μεταξύ της ομάδας ελέγχου και της θεραπείας προσδιορίστηκε με T-test για δεδομένα από ανεξάρτητα δείγματα ή paired t-test για δεδομένα από συσχετισμένη δείγματα. Όλες οι δοκιμασίες ήταν αμφίδρομες και p-τιμές μικρότερες από 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές.

Αποτελέσματα

Η έκφραση της πρωτεΐνης SATB1 σε καλοήθεις και όγκου δείγματα

Η έκφραση το προφίλ του SATB1 προσδιορίστηκε στα κλινικά δείγματα αφαιρούνται χειρουργικά. Πραγματοποιήσαμε ανάλυση Western blot για SATB1 και CK18 ως έλεγχος φόρτωσης επιθηλιακά σε 14 καλοήθεις, 14 χαμηλού βαθμού με καρκίνο του προστάτη (σκορ Gleason ≤7), και 6 δείγματα όγκων υψηλής ποιότητας (Gleason σκορ & gt? 8-10). Ένα τυπικό κηλίδα δείχνεται στο σχήμα 1Α, SATB1 βρέθηκε να εκφράζεται σε καλοήθεις και καρκινικούς ιστούς καρκίνου του προστάτη. Επίπεδα SATB1 ήταν σημαντικά υψηλότερα στα δείγματα του καρκίνου σε σύγκριση με τον καλοήθη ιστό. Η πυκνομετρική ανάλυση κατέδειξε 1,6-φορές αύξηση στην έκφραση SATB1 σε δείγματα όγκων χαμηλής ποιότητας και 2,62-φορές σε δείγματα όγκων υψηλής ποιότητας, σε σύγκριση με καλοήθη ιστό. Στη συνέχεια θα εξεταστεί αν SATB1 ρυθμίζεται αυξητικά στο επίπεδο του μηνύματος. Πραγματοποιήσαμε RT-PCR για την έκφραση mRNA για SATB1 και GAPDH ως έλεγχος φόρτωσης. Όπως φαίνεται στο σχήμα 1Β, η μεταγραφή του mRNA για SATB1 ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε όγκους υψηλής ποιότητας σε σύγκριση με χαμηλού βαθμού όγκους και καλοήθη ιστό. Η πυκνομετρική ανάλυση έδειξε 1.64 φορές αύξηση στην έκφραση του mRNA SATB1 σε δείγματα όγκων χαμηλής ποιότητας και 1,51-φορές σε όγκους υψηλής ποιότητας, σε σύγκριση με καλοήθη ιστό. Δεδομένου SATB1 είναι μια πυρηνική πρωτεΐνη και προωθεί ένα μεταγραφικά ενεργή δομή χρωματίνης με αλληλεπίδραση με ΑΤ-πλούσιες ακολουθίες DNA, ρυθμίζεται προς τα πάνω σε καρκίνο, επομένως προσδιορίσαμε τα επίπεδα αυτής της πρωτεΐνης σε κυτοσόλιο και πυρηνικό κλάσμα σε καλοήθεις και όγκων δειγμάτων που λαμβάνονται από ίδιο άτομο. Πράγματι, τα υψηλότερα επίπεδα του SATB1 πρωτεΐνης ήταν παρούσα στο πυρηνικό κλάσμα σε σύγκριση με κυτοσόλιο στον ιστό του όγκου σε σύγκριση με τον καλοήθη ιστό (Εικόνα 1C).

(Α) Protein έκφραση SATB1 σε διάφορες ποιότητες των όγκων του προστάτη και καλοήθης ιστός αναλύθηκε με κηλίδωση Western? cytokeratin18 έκφραση υπηρέτησε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) έκφραση SATB1 mRNA σε διάφορες ποιότητες των όγκων του προστάτη και καλοήθη ιστό? έκφραση GAPDH mRNA χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης. έκφραση της πρωτεΐνης (C) SATB1 σε ζεύγη καλοήθη και τον καρκίνο δείγματα από ίδιο άτομο αναλύθηκε για κυτταροπλασματική και πυρηνική διανομή. Η πυκνομετρική ανάλυση για κάθε στύπωμα δεικνύεται στο δεξί πάνελ. Τα στοιχεία που περιγράφονται στο «Υλικά και Μέθοδοι» το τμήμα.

Η

Στη συνέχεια αναλύσαμε την έκφραση SATB1 με ανοσοϊστοχημική χρώση των τμημάτων ιστών σε παραφίνη ενσωματωμένο αποτελείται από 19 καλοήθεις, 5 χαμηλού βαθμού όγκου (Gleason σκορ 5- 6), 10 διάμεσο-grade όγκου (Gleason στείλει 7-8) και 5 όγκους υψηλού βαθμού (Gleason στείλει 9-10) στην μικροσυστοιχία ιστού (Σχήμα 2). έκφραση SATB1 παρατηρήθηκε είτε στον πυρήνα ή στο κυτταρόπλασμα ή και τα δύο, αλλά κυρίως φαίνεται στον πυρήνα των καρκινικών κυττάρων. Σε σύγκριση με την καλοήθη ιστό, μια προοδευτική αύξηση στην έκφραση SATB1 παρατηρήθηκε στον πυρήνα με την αύξηση της ποιότητας του όγκου. Τα χαμηλά επίπεδα της έκφρασης SATB1 παρατηρήθηκε σε μετρίως διαφοροποιημένα όγκους. Αντιπροσωπευτικά ανοσοχρώσης εικόνες της έκφρασης SATB1 σε καλοήθεις και διάφορες ποιότητες του όγκου που παρουσιάζεται στο σχήμα 2Α. Αξιολογήσαμε επίσης τις πυρηνικές επίπεδα SATB1 σε διάφορα ιστολογικά συστατικά των δειγμάτων ιστού μετρώντας τον αριθμό των πυρήνων που δείχνουν θετική έκφραση SATB1 σε μεγέθυνση Χ40, και ανέλυσε τα αριθμήσεις στατιστικά με μέση τιμή και την τυπική απόκλιση, καθώς boxplot ανάλυση (Σχήμα 2Β). Οι διαφορές των πυρηνικών έκφρασης SATB1 (ανά 1000 πυρήνες) μεταξύ καλοήθων και άλλα δείγματα βαθμού του όγκου εξετάστηκαν με ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) που ακολουθείται από διαδικασία ζεύγη πολλαπλή σύγκριση κατά Tukey. Καλοήθης δείγματος (n = 15) παρουσίασαν μια μέση τιμή 56,93 βάφονται πυρήνων (εύρος 37 έως 79), οι όγκοι χαμηλού βαθμού με σκορ Gleason 5-6 (n = 13) έδειξε μια μέση τιμή 90,54 βάφονται πυρήνων (εύρος 56 έως 115) ? μετρίως διαφοροποιημένων όγκων με σκορ Gleason 7-8 (n = 12) παρουσίασαν μια μέση τιμή 146,33 βάφονται πυρήνων (εύρος 93 – 198)? και υψηλής ποιότητας όγκου με Gleason στείλει 9-10 (n = 11) έδειξε μία μέση τιμή 205,27 (158-298) χρωματίστηκαν πυρήνες για SATB1. Η έκφραση της πυρηνικής SATB1 μεταξύ των 4 ομάδων ήταν ιδιαίτερα στατιστικά σημαντική (P & lt? 0,0001). Επιπλέον, διαδικασία κατά ζεύγη πολλαπλής σύγκρισης Tukey έδειξε ότι η έκφραση SATB1 σε δείγματα όγκων υψηλή βαθμολογία ήταν σημαντικά υψηλότερη από ό, τι στα δείγματα χαμηλής βαθμολογίας (P & lt? 0,05).

(Α) παραφίνη-ενσωματωμένες (4.0 μm) τμήματα από καλοήθεις και καρκίνο του προστάτη διαφόρων βαθμολογίες Gleason χρησιμοποιήθηκαν για έκφραση SATB1 με ανοσοϊστοχημεία. Μια ισχυρή χρώση πυρηνικά και κυτταροπλασματικά παρατηρήθηκε σε Gleason βαθμολογία 3 + 3, ενώ αυξημένη χρώση πυρηνικής SATB1 παρατηρήθηκε σε καρκίνο υψηλής ποιότητας (Gleason βαθμολογία 3 + 4 και 4 + 5, αντίστοιχα). Μεγεθύνονται σε x20 και x40 (Β) στατιστική ανάλυση των SATB1 πυρηνικών παρουσία έγινε με τη σύγκριση SATB1 θετική πυρηνική χρώση κυττάρων από διάφορες τοποθεσίες από καλοήθεις, σκορ 5-6, σκορ 7-8 και το σκορ 9-10 δείγματα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SE. *

P

& lt? 0,05

έναντι

αντίστοιχο έλεγχο. P & lt? 0,05, οι λεπτομέρειες που περιγράφονται στο «Υλικά και Μέθοδοι» το τμήμα

Η

SATB1 Έκφραση σε Ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου προστάτη

Εξετάσαμε την έκφραση SATB1 σε επιθηλιακά κυτταρικές σειρές 8 του προστάτη, συμπεριλαμβανομένων των μη. -tumorigenic ιικώς μετασχηματισμένα κύτταρα ανθρώπινου προστάτη επιθηλιακά (ΡΖ-HPV-7) και του ομολόγου του καρκίνου του (CA-HPV-10), 3 πρωτογενούς καρκίνου προστάτη κυτταρικές γραμμές δηλαδή. DU145, LNCaP και PC-3 και βιολογικά επιθετική υποκλώνοι τους: DuPRO, C4-2B και PC-3M, αντίστοιχα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, τα επίπεδα πρωτεΐνης SATB1 ήταν υψηλότερα σε όλες τις κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη σε σύγκριση με τα κύτταρα μη ογκογόνα PZ-HPV-7. Οι πρωτογενείς κυτταρικές γραμμές καρκίνου δηλαδή. CA-HPV-10, DU145, LNCaP και PC-3 κύτταρα εκφράζουν 7.94- να 16,82-πλάσια αύξηση στην έκφραση SATB1 σύγκριση με κύτταρα PZ-HPV-7. Το έκθεμα επιθετική υποκλώνους 17.0- να 20,53-πλάσια αύξηση στην έκφραση SATB1, σε σύγκριση με μη ογκογόνα κύτταρα. Συγκρίναμε επίσης την κυτοσολική και πυρηνική έκφραση του SATB1 σε LNCaP και PC-3 αντιστοίχων υποκλώνων τους C4-2B, και τα κύτταρα PC-3M. Όπως φαίνεται στο σχήμα 3Β, η έκφραση του SATB1 σε LNCaP και PC-3 κύτταρα ήταν σχετικά παρόμοια σε κυτοσολικά και πυρηνικά κλάσματα. Σε αντίθεση, τα υψηλά επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης SATB1 παρατηρήθηκε στο πυρηνικό κλάσμα της επιθετικής C4-2B υποκλώνο και τα κύτταρα PC-3M. Τα αποτελέσματα αυτά είναι σε συμφωνία με τα δείγματα ιστού, όπου η έκφραση σημαντικά υψηλή πυρηνική SATB1 συσχετίζονται με την επιθετικότητα της νόσου

(Α) κηλίδωση Western για έκφραση της πρωτεΐνης SATB1 σε διάφορα κύτταρα καρκίνου του προστάτη.? CA-HPV-10, DuPRO, DU145, PC-3, PC-3M, LNCaP και C4-2B συμπεριλαμβανομένων των μετασχηματισμένων επιθηλιακών (ΡΖ-HPV-7), κύτταρα. (Β) Κυτταροπλασματικά και η έκφραση πρωτεΐνης πυρηνικής SATB1 αναλύθηκε σε καρκίνο προστάτη γονική κυτταρική γραμμή και επιθετικό υποκλώνοι τους LNCaP και C4-2B? PC-3 και PC-3M που αντιπροσώπευε υψηλότερο πυρηνική παρουσία SATB1 στην επιθετική υποκλώνους. Ιστόνης Η4 υπηρέτησε ως έλεγχος φόρτωσης. Η πυκνομετρική ανάλυση για κάθε στύπωμα δεικνύεται στο δεξί πάνελ. Τα στοιχεία που περιγράφονται στο «Υλικά και Μέθοδοι» το τμήμα.

Η

SATB1 Νοκ ντάουν Μειώνει την επιθετικότητα των καρκινικών κυττάρων του προστάτη

Ερευνήσαμε αν SATB1 απαιτείται για την επεμβατική φαινοτύπου των κυττάρων καρκίνου του προστάτη. Στο πείραμα, PC-3M κύτταρα τα οποία εκφράζουν υψηλά επίπεδα του συστατική SATB1 χρησιμοποιήθηκαν και σύντομες RNAs φουρκέτα (shRNA) προς knockdown έκφραση SATB1. Χρησιμοποιήσαμε shRNA από δύο διαφορετικές ακολουθίες SATB1 (shRNA1 και shRNA2) και τον έλεγχο shRNA στα ιδιαίτερα επιθετικά κύτταρα PC-3M. Όπως φαίνεται στο σχήμα 4Α, η έκφραση SATB1 μειώθηκε σημαντικά κατά 85,5% και 77,5% και στις δύο SATB1 shRNA1 και shRNA2, αντίστοιχα, ενώ δεν υπάρχουν σημαντικές αλλαγές στην έκφραση SATB1 σημειώθηκε σε κύτταρα PC-3M αγωγή με έλεγχο shRNA. Επιπλέον, SATB1 knockdown ελάττωσε τις μετανάστευση και εισβολή των δυνατοτήτων των κυττάρων PC-3M σε σύγκριση με την γονική κυτταρική γραμμή και τον έλεγχο των κυττάρων shRNA. Η μετανάστευση και επεμβατική ικανότητα in vitro των κυττάρων SATB1 mRNA μειώθηκε κατά 68-80%, η οποία συσχετίζεται με την αυξημένη έκφραση Ε-καδερίνης και μειωμένα επίπεδα της ΜΜΡ-9 μετά shRNA knockdown (Σχήμα 4Β). Μείωση των επιπέδων SATB1 σε κύτταρα PC-3M μειωμένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αποκατέστησε αύξηση εξαρτώμενη από προσκόλληση και επανήλθε των κυττάρων σε ένα πολωμένο μορφολογία όπως παρατηρείται υπό μικροσκόπιο φωτός (Σχήμα 4C).

κύτταρα καρκίνου του προστάτη PC-3M επιμολύνθηκαν με και χωρίς DNA (mock), ή η στόχευση SATB1 διάνυσμα shRNA 1 και 2 και συνεχίστηκε σε καλλιέργεια για 24 ώρες. (Α) SATB1, Ε-καδερίνη, ΜΜΡ9 και & lt? Βήτα & gt? Β-ακτίνης συνολικής πρωτεΐνης εκφράσεις αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. (Β) SATB1 σίγηση σε κύτταρα PC-3M σχετίστηκε με χαμηλή επεμβατικές και μετανάστευση δυναμικό. Μπαρ αντιπροσωπεύει το μέσο ± SE των τριών διαφορετικών προσδιορισμών. **

P

& lt? 0.001

σε σχέση με τον έλεγχο

. (γ) Εκπρόσωπος PC-3M κύτταρα εικόνες εμφανίζονται με και χωρίς SATB1 shRNA επιμόλυνση. Τα στοιχεία που περιγράφονται στο «Υλικά και Μέθοδοι» το τμήμα.

Η

SATB1 Προωθεί Επιθετική φαινότυπο σε επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη

επόμενο εξέτασε κατά πόσον έκτοπη έκφραση της SATB1 είναι αρκετή για να προκαλέσει επεμβατική δραστηριότητα σε ιούς μετασχηματισμένα μη ογκογόνα ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα προστάτη. Τα κύτταρα ελέγχου PZ-HPV-7 επιμολύνθηκαν παροδικά με pCMV6-A6 True κλώνου ανθρώπινου DNA πλασμιδίου που περιέχει SATB1 και με SATB1 πλαστή RNA. Επιμόλυνση με το πλασμίδιο έκφρασης SATB1 αύξησε την έκφραση του SATB1 στην PZ-HPV-7 κύτταρα και αυξημένη μετανάστευση και την εισβολή των δυνατοτήτων

in vitro

από 50-67%. SATB1 υπερέκφραση σε PZ-HPV-7 κύτταρα είχε ως αποτέλεσμα την μειωμένη έκφραση Ε-καδερίνης και αύξηση ΜΜΡ-9 επιπέδων σε αυτά τα κύτταρα (Σχήμα 5Α-C).

PZ-HPV-7 κύτταρα επιμολύνθηκαν με και χωρίς DNA (mock), ή η στόχευση SATB1 φορέα 1 και συνεχίστηκε σε καλλιέργεια για 24 ώρες. (Α) SATB1, Ε-καδερίνη, ΜΜΡ9 και ιστόνης Η4 εκφράσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν στο κυτοσολικό και πυρηνικό κλάσμα με κηλίδωση Western. SATB1 υπερέκφραση οδήγησε σε μείωση της έκφρασης Ε-καδερίνης και υπερέκφραση ΜΜΡ9. (Β) Η υπερέκφραση του SATB1 σε κύτταρα PZ-HPV-7 σχετίζεται με αυξημένη επιθετική πιθανότητα. Μπαρ αντιπροσωπεύει το μέσο ± SE των τριών διαφορετικών προσδιορισμών. **

P

& lt? 0.001

σε σχέση με τον έλεγχο

. (C) Εκπρόσωπος PZ-HPV-7 εικόνες με και χωρίς SATB1 φορέα υπερέκφραση trasfection. Τα στοιχεία που περιγράφονται στο «Υλικά και Μέθοδοι» το τμήμα.

Η

SATB1 εξάντληση αναστέλλει την ανάπτυξη των όγκων σε αθυμικούς γυμνούς ποντικούς ξενομοσχεύματος

Εξετάσαμε αν η εξάντληση SATB1 από τα κύτταρα PC-3M ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου. Για τις μελέτες αυτές αναπτύξαμε κυτταρικές σειρές που είχαν σταθερά σιγήσει για έκφραση SATB1 χρησιμοποιώντας ένα σύστημα παράδοσης shRNA-βραδέος. Τα κύτταρα επελέγησαν έως 10 διελεύσεις και τα κύτταρα άνω δίοδο 11 χρησιμοποιήθηκαν για τις μελέτες. Μια σημαντική μείωση της έκφρασης SATB1 παρατηρήθηκε σε κύτταρα PC-3M-KO. Εξόντωση SATB1 ήταν πιο εμφανή στον πυρηνικό κλάσμα σε αυτά τα κύτταρα. κύτταρα SATB1-KO παρουσίασαν αύξηση του χρόνου διπλασιασμού από 26.86 ± 4.89 ώρες, σε σύγκριση με τα κύτταρα PC-3M με 20,04 ± 4,34 ώρες, αντίστοιχα. Έχουμε καθορίζεται επίσης την επεμβατική ικανότητα

in vitro

των κυττάρων SATB1-KO. Συνεπής εξάντληση του SATB1 μείωσε το σχηματισμό αποικιών αυτών των κυττάρων σε μαλακό άγαρ, υποδεικνύοντας ότι η απώλεια του SATB1 αποκατασταθεί αύξηση εξαρτώμενη από προσκόλληση τους (Σχήμα S1 Α-Ο).

δίπλα προχώρησε σε

in vivo

μελέτες. Τα κύτταρα ελέγχου PC-3M και τα κύτταρα SATB1 ΚΟ εγχύθηκαν στα πλευρά γυμνών ποντικών για να σχηματίσουν όγκους. Ο όγκος του όγκου καταγράφηκε σε εναλλασσόμενες ημέρες και τερματίστηκε το πείραμα επί 31 ημέρα με το μέγεθος του όγκου των όγκων PC-3M ήταν μεγάλο, ενώ οι ποντικοί που ενέθηκαν με SATB1 KO κλώνο οδήγησε σε μειωμένη ανάπτυξη του όγκου με μείωση στο βάρος του όγκου και του όγκου (Ρ & lt ? 0.003) (Σχήμα 6 Α-Ο). Μετρήσαμε επίσης την πρωτεΐνη έκφραση του πυρηνικού αντιγόνου πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων (PCNA), Ε-καδερίνη, ΜΜΡ9 και SATB1 σε αυτούς τους όγκους. Όπως φαίνεται στο σχήμα 6 D? SATB1 knockdown είχε ως αποτέλεσμα σημαντική μείωση στην πρωτεΐνη έκφραση PCNA στα ξενομοσχεύματα όγκου. Μια αύξηση στην έκφραση Ε-καδερίνης παρατηρήθηκε σε όγκους SATB1-ΚΟ σε σύγκριση με τους όγκους PC-3M. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η έκφραση SATB1 σε κύτταρα PC-3M μπορεί να είναι μια απαραίτητη προϋπόθεση για την ανάπτυξη των όγκων και την επιθετικότητα των κυττάρων αυτών.

(Α) SATB1 νοκ-άουτ σε κύτταρα PC-3M είχε σαν αποτέλεσμα μείωση στον όγκο του όγκου. (Β) Η φωτογραφία του ξενομοσχεύματος όγκου σε PC-3M και όγκους SATB1-KO. (Γ) Οι όγκοι αποκόπηκαν, ζυγίστηκαν και μετρήθηκαν στο τέλος της μελέτης. Το βάρος του όγκου ήταν σημαντικά μειωμένη σε SATB1-ΚΟ όγκων σε αθυμικούς γυμνούς ποντικούς. Περίπου 1 χ 10

6 κύτταρα ενέθηκαν στα πλευρά εκάστου ποντικού να κινήσει έκτοπη όγκου του προστάτη, όπως περιγράφεται στο «Υλικά και Μέθοδοι». Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα σε δύο διαστάσεις σε όλη τη μελέτη. όγκος (mm3) Tumor και υγρό βάρος των όγκων αντιπροσωπεύονται ως μέσος όρος 8-10 όγκων σε έλεγχο PC-3M και όγκων SATB1-KO PC-3M. **

P

& lt? 0,003? μπαρ? Μέση τιμή ± SE.