Αφηρημένο

Έχουμε δείξει πρόσφατα ότι η FKBP5 ανοσοφιλίνης (επίσης γνωστή ως FKBP51) είναι μια πρωτεΐνη σκαλωσιές που μπορεί να ενισχύσει PHLPP -Akt αλληλεπίδραση και διευκολύνουν PHLPP μεσολάβηση αποφωσφορυλίωση Akt Ser473, ρυθμίζει αρνητικά την ενεργοποίηση Akt

in vitro

. Ως εκ τούτου, FKBP5 μπορούσε να λειτουργήσει ως καταστολέας όγκου, και τα επίπεδα του FKBP5 θα επηρέαζε κυτταρική απόκριση στη χημειοθεραπεία. Στην παρούσα μελέτη, έχουμε λάβει ένα βήμα προς τα εμπρός με τη χρήση ενός παγκρεατικού ποντίκια μοντέλο ξενομοσχεύματος καρκίνου για να δείξει ότι κάτω ρύθμιση του FKBP5 σε shFKBP5 ξενομοσχεύματος ποντίκια προάγει την ανάπτυξη του όγκου και την αντίσταση σε γεμσιταβίνη, ένα φαινόμενο συνεπές με προηγούμενα ευρήματα μας σε παγκρεατικά κυτταρικές σειρές. Επιπλέον, βρήκαμε επίσης ότι οι αναστολείς που στοχεύουν το μονοπάτι Akt, συμπεριλαμβανομένων αναστολέας ΡΙ3Κ, Akt αναστολέα και mTOR αναστολέας είχε μια διαφορετική επίδραση στην ευαισθητοποίηση σε γεμσιταβίνη και άλλους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες σε κυτταρικές σειρές, με ένα ειδικό αναστολέα της Akt, triciribine, έχοντας τη μεγαλύτερη ευαισθητοποίηση αποτέλεσμα. Στη συνέχεια δοκίμασε την υπόθεση ότι η προσθήκη triciribine μπορεί να ευαισθητοποιήσει θεραπεία γεμσιταμπίνη, ειδικά σε shFKBP5 ποντίκια παγκρέατος ξενομόσχευμα καρκίνου. Βρήκαμε ότι η συνδυασμένη θεραπεία με γεμσιταβίνη και triciribine έχει μια καλύτερη επίδραση στην αναστολή του όγκου από ό, τι είτε φάρμακο μόνο (ρ & lt? 0.005) και ότι η επίδραση της αναστολής είναι πιο σημαντική σε shFKBP5 ποντικούς ξενομοσχεύματος από wt ποντίκια (ρ & lt? 0,05). Αυτές οι επιδράσεις συσχετίστηκαν με επίπεδο της Akt φωσφορυλίωση 473, καθώς και συντελεστή πολλαπλασιασμού, όπως υποδεικνύεται από χρώση Ki67 σε ξενομοσχεύματος καρκινικών ιστών. Τα αποτελέσματα αυτά παρέχουν ενδείξεις για την υποστήριξη των μελλοντικών κλινικών δοκιμών που αποσκοπούν στην προσαρμογή της θεραπείας με βάση τις παρατηρήσεις μας

Παράθεση:. Χου J, Wang L (2012) FKBP5 ως επιλογή βιοδεικτών για Αναστολείς Γεμσιταβίνη και Akt στη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος . PLoS ONE 7 (5): e36252. doi: 10.1371 /journal.pone.0036252

Επιμέλεια: Hana Algul, Τεχνικό Πανεπιστήμιο του Μονάχου, Γερμανία

Ελήφθη: 28 του Οκτωβρίου του 2011? Αποδεκτές: 3, Απριλίου 2012? Δημοσιεύθηκε: May 9, 2012 |

Copyright: © 2012 Χου, ο Wang. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από αμερικανικό Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας χορηγεί Κ22 CA130828, R01 CA138461, Ρ50 CA102701 και U19 GM61388 (Το Δίκτυο Έρευνας Φαρμακογονιδιωματική). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή οι

αναλόγων κυτιδίνης όπως είναι η γεμσιταβίνη χρησιμοποιούνται ευρέως για τη θεραπεία μιας ποικιλίας καρκίνων. Η γεμσιταβίνη παραμένει καθιερωμένη θεραπεία για τον καρκίνο του παγκρέατος στο ανοσοενισχυτικό και ανακουφιστικής ρυθμίσεις [1], [2], [3]. Ωστόσο, το ποσοστό ανταπόκρισης gemcitabine είναι πολύ χαμηλή σε καρκίνο του παγκρέατος, με μόνο ένα ποσοστό επιβίωσης 1 έτος 18% [4]. Αυτή η φτωχή ποσοστό επιβίωσης είναι κατά κύριο λόγο εξαιτίας της έλλειψης της έγκαιρης ανίχνευσης και συχνή μετάσταση των πρωτογενών όγκων σε λεμφαδένες και τα γύρω όργανα, όπως το ήπαρ και το στομάχι [5], [6], [7]. Ως ένα βήμα προς την εξατομικευμένη θεραπεία γεμσιταβίνη προκειμένου να επιτευχθούν καλύτερα αποτελέσματα, έχουμε ήδη πραγματοποιηθεί μια μελέτη ευρεία ένωση γονιδίωμα χρησιμοποιώντας 197 μεμονωμένες λεμφοβλαστοειδείς κυτταρικές σειρές [8], [9], και εντόπισε μια πρωτεΐνη, FKBP5, που έδειξε σημαντική επίδραση στην απόκριση γεμσιταβίνη σε καρκινικά κύτταρα με τη ρύθμιση αρνητικά φωσφορυλίωσης Akt στην σερίνη 473 [10], [11]. Η φωσφορυλίωση της Akt ενεργοποιεί το Akt μονοπάτι, η οποία παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην ογκογένεση και χημειοαντίσταση [12], [13], [14], [15]. Ως εκ τούτου, η χαμηλή έκφραση FKBP5 καθιστά τα καρκινικά κύτταρα ανθεκτικά σε πολλά χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων των gemcitabine [8]. Επιπλέον, FKBP5 έκφραση είναι χαμηλή ή χάνεται σε πολλές παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές και δείγματα του παγκρέατος ασθενής με καρκίνο, συσχετίζοντας με αυξημένη φωσφορυλίωση της Akt Ser473 [10].

Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι FKBP5 θα μπορούσε να είναι ένας καταστολέας όγκων και ότι τα επίπεδα της FKBP5 μπορεί να προσδιορίσει την ανταπόκριση των ασθενών σε χημειοθεραπεία. Αν αυτό είναι σωστό, οι ασθενείς με χαμηλά επίπεδα FKBP5 και Akt hyperactivation μπορούν να επωφεληθούν από την προσθήκη αναστολέων που στοχεύουν το μονοπάτι Akt. Στην παρούσα μελέτη, ελέγξαμε την υπόθεση αυτή με τη χρήση ενός FKBP5 νοκ ντάουν μοντέλο του παγκρέατος ξενομοσχεύματος καρκίνου του ποντικιού (shFKBP5) και τα αποτελέσματα αυτών των πειραμάτων μπορεί να σχηματίσει μια βάση για τις μελλοντικές κλινικές μελέτες μεταφραστικής. Βρήκαμε ότι shFKBP5 ξενομόσχευμα ποντικούς έδειξε μία σημαντική αύξηση σε φορτίο του όγκου σε σύγκριση με wtFKBP5, και ότι αυτοί οι όγκοι ήταν πιο ανθεκτικά στην θεραπεία γεμσιταβίνης. Ενώ και οι δύο βάρος και shFKBP5 ποντίκια ξενομόσχευμα ήταν σε θέση να επωφεληθούν από τη θεραπεία συνδυασμού με γεμσιταβίνη και ο αναστολέας Akt, triciribine (TCN), shFKBP5 ποντίκια έδειξαν μεγαλύτερη επίδραση μετά τη θεραπεία συνδυασμού.

Υλικά και Μέθοδοι

τηλέφωνα γραμμές

Τα ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές SU86, ASPC1 και BxPC3 ήταν δώρα από τον Δρ Ντάνιελ Δ Billadeau, Mayo Clinic. κυτταρικές γραμμές καρκίνου του μαστού Ανθρώπινη Hs578T (ΗΤΒ-126 ™) και MCF7 (ΗΤΒ-22 ™) ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC). Τα παγκρεατικά κυτταρικές σειρές καρκίνου καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, και διατηρήθηκαν σε έναν επωαστήρα με υγρή ατμόσφαιρα με 5% CO

2 στους 37 ° C. Τα ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού καλλιεργήθηκαν με DMEM συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός υπό τις συνθήκες που περιγράφονται παραπάνω.

πλασμίδια και σύντομης παρεμβολής RNA

Η FKBP5 shRNA και siRNA που χρησιμοποιούνται στις γκρεμίζω μελέτες αγοράστηκαν από την QIAGEN Inc. (Valencia, CA). . Η επιμόλυνση πραγματοποιήθηκε δύο φορές, 24 ώρες, με 200 ηΜ siRNA με τη χρήση του αντιδραστηρίου Lipofectamine ™ RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή

Ακολουθίες για shRNA έναντι FKBP5 ήταν:

Πρώτη FKBP5 shRNA

Sense σκέλος:. GGG ΧΓΕ ACA GAU UGA GCA UdTdT

Antisense σκέλος:… Αύγουστος CUC AAU CUG UUU ACC CdGdT

Δεύτερη FKBP5 shRNA

Sense σκέλος:. AAU AUC CCU CUC CUU UCC GdTdT

Antisense σκέλος:. CGG ΑΑΑ GGA GAG GGA υΑυ UdGdT

Τόσο FKBP5 shRNA δίπολα κλωνοποιήθηκαν σε φορείς pSuper, και συγκεντρώνονται για επιμόλυνση. Η κυτταρική σειρά συσκευασίας 293Τ μολύνθηκε με ρετροϊό pSuper-shRNA [16]. Το μέσο αλλάχθηκε 24 ώρες αργότερα και συλλέγονται 48 ή 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. Το μέσο στη συνέχεια διηθείται μέσω στείρου φίλτρα (φίλτρο 0.45 μπι) και χρησιμοποιήθηκε για να μολύνει κύτταρα SU86. Μολυσμένα κύτταρα επιλέχθηκαν με 2 μg /ml πουρομυκίνη (Sigma-Aldrich). . Δεκαέξι πουρομυκίνη ανθεκτικών αποικιών που ελέγχθηκαν από RT-PCR στη συνέχεια ομαδοποιήθηκαν και σταθερή μορφομετατροπείς διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS και 2 μg /ml πουρομυκίνη

Ακολουθίες για siRNA κατά FKBP5 ήταν:

Sense σκέλος:. GGG ΧΓΕ ACA GAU UGA GCA UdTdT

Τα αντιπαράλληλα σκέλος: Αύγουστος CUC AAU CUG UUU ACC CdGdT

Ακολουθίες για αρνητική siRNA ελέγχου ήταν:.

Sense σκέλος:. UUC UCC GAA CGU GUC ACG UdTdT

Τα αντιπαράλληλα σκέλος: ACG UGA CAC Ουυ CGG AGA AdTdT

Ναρκωτικών και του κυτταρικού πολλαπλασιασμού Δοκιμασίες

η γεμσιταβίνη δόθηκε από Eli Lilly (Indianapolis, ΙΝ). Triciribine (TCN), ραπαμυκίνη και LY 294002 αγοράστηκαν από την EMD Biosciences (San Diego, CA). Η ετοποσίδη και πακλιταξέλη αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ). δοκιμασίες κυτταροτοξικότητας με τις κυτταρικές γραμμές όγκου διεξήχθησαν με το CellTiter 96® Υδατικό μη ραδιενεργού Κυττάρου Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού (Promega Corporation, Madison, WI) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Η κυτταροτοξικότητα εκτιμήθηκε με τη γραφική αναπαράσταση της κυτταρικής επιβίωσης έναντι της συγκέντρωσης του φαρμάκου (σε λογαριθμική κλίμακα). Ο φαινότυπος IC50 (αποτελεσματική δόση που σκοτώνει το 50% των κυττάρων) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας ένα λογιστικό μοντέλο τεσσάρων παραμέτρων και χρησιμοποιήθηκε για στατιστική σύγκριση μεταξύ διαφορετικών θεραπειών.

Οι ανασταλτικές της ανάπτυξης επιδράσεις της γεμσιταβίνης, ετοποσίδη και πακλιταξέλη ως καθώς και τα αποτελέσματα της θεραπείας συνδυασμού με TCN, ραπαμυκίνη και LY 294002 σε BxPC3, ASPC1, SU86, MCF7 και Hs578T κύτταρα προσδιορίζεται επίσης με χρήση της ανάλυσης MTS. Αποτελέσματα αναφέρονται αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους τριών ανεξάρτητων επαναλήψεων.

παροδική επιμόλυνση και παρεμβολή RNA

Ανθρώπινο BxPC3 και κυτταρικές σειρές καρκίνου του παγκρέατος ASPC1 καθώς MCF7 και ο καρκίνος του μαστού Hs578T χρησιμοποιήθηκαν κυτταρικές σειρές για την εκτέλεση της μελέτες siRNA. Το αντιδραστήριο επιμόλυνσης Hiperfect (QIAGEN) χρησιμοποιήθηκε για ανάστροφη επιμόλυνση siRNA. Συγκεκριμένα, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων και αναμείχθηκαν με siRNA-συγκρότημα, που αποτελείται από 10 ηΜ ειδικών ή αρνητικό μάρτυρα siRNA (QIAGEN) και 0,1 μΙ λιποφεκταμίνης ™ αντιδραστήριο RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA).

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR αντίστροφης μεταγραφής

Ολικό RNA απομονώθηκε από καλλιεργημένα κύτταρα με το κιτ Qiagen RNeasy (QIAGEN Inc. Valencia, CA), που ακολουθείται από QRT-PCR πραγματοποιήθηκε με το 1-βήμα, Brilliant SYBR Green QRT-PCR kit κύριο μείγμα (Stratagene, La Jolla, CA). Συγκεκριμένα, εκκινητές αγοράστηκαν από την Qiagen χρησιμοποιήθηκαν για να εκτελέσει QRT-PCR χρησιμοποιώντας το σύστημα ανίχνευσης Stratagene Mx3005P ™ Real-Time PCR (Stratagene). Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν με β-ακτίνη ως ένας εσωτερικός έλεγχος. Αντίστροφη μεταγραφή RNA αναφοράς καθολικής Ανθρώπου (Stratagene) χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργηθεί μία πρότυπη καμπύλη. Αντιδράσεις ελέγχου στερούνταν εκμαγείο RNA.

Western Blot Αναλύσεις

SDS-PAGE και ανάλυση κηλίδος Western διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10]. FKBP5 αντισώματα εγείρονται έναντι των πρωτεϊνών σύντηξης GST που περιέχουν αμινο-τερματικά υπολείμματα 1-100 του FKBP5. Αντισώματα έναντι Akt (# 9272), φωσφο-Akt (Ser473) (# 9271), φωσφο-Akt (Thr308), FOXO1 (# 9454), φωσφο-FOXO1 (Thr 24) (# 9464), ΟδΚ3β (# 9315) και φωσφο-ΟδΚ3β (# 9316) αγοράστηκαν από την Cell Signaling Inc (Boston, ΜΑ). δείγματα όγκου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για κηλίδωση Western, όπως περιγράφεται προηγουμένως χρησιμοποιώντας ένα Triton Χ-100 που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα λύσης [10]. Οι κηλίδες αναπτύχθηκαν με αντιδραστήριο σήμα υπέρ χημειοφωταύγειας (Pierce, Rockford, IL).

αθυμικού ποντικού όγκου Δοκιμασία Σχηματισμού

Όλα τα ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη αυτή διατηρήθηκαν στην εκτροφή Facility Mayo Clinic ζώων. Όλα τα πειραματικά πρωτόκολλα εξετάστηκαν και εγκρίθηκαν από τη Φροντίδα των Ζώων και Χρήση Επιτροπή Mayo Clinic Θεσμικών (αρ.πρωτ. A14008), και όλες οι μελέτες πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις μεθόδους που έχουν εγκριθεί από το πρωτόκολλο.

SU86 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά FKBP5 shRNA και mock κύτταρα εγχύθηκαν υποδορίως στην αριστερή βουβωνική περιοχή του 4-εβδομάδων θηλυκούς αθυμικούς υπολειπόμενο γυμνούς /γυμνά ποντίκια (αθυμικά Ncr ηυ-/ηυ: National Cancer Institute-Frederick) χρησιμοποιώντας βελόνες 19-gauge [18], [19] . Κάθε ποντικός έλαβε μία ένεση 5 × 10

6 κύτταρα σε 200 μl DMEM χωρίς ορό. Τα ζώα παρακολουθήθηκαν για δραστηριότητα και τη φυσική κατάσταση κάθε μέρα, και οι προσδιορισμοί του σωματικού βάρους και τη μέτρηση των μάζας του όγκου διεξήχθησαν κάθε 3 ημέρες. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε για 6 εβδομάδες, και ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε ως 1 /2a × b

2, όπου «α» αντιπροσωπεύει την μεγάλη διάμετρο και το «b» είναι η μικρή διάμετρος [18], [19]. Οι όγκοι τότε αφαιρεθεί χειρουργικά και επεξεργασία.

Θεραπεία Αξιολόγηση

Ποντίκια που φέρει υποδόρια wtFKBP5 SU86 και shFKBP5 SU86 όγκους συμμετείχαν στη μελέτη, όταν έφθασαν οι όγκοι -100 mm

3 (ημέρα 0) και τυχαιοποιήθηκαν σε ομάδες θεραπείας, με 5 ποντίκια σε κάθε ομάδα. Γεμσιταβίνη χορηγήθηκε ε.π. κάθε 3 ημέρες σε συγκεντρώσεις των 25, 50 ή 100 mg /kg. Για τη μελέτη γεμσιταμπίνη /TCN, συμπεριλήφθηκαν τέσσερις ομάδες θεραπείας: (α) όχημα, (β) TCN, σε δόση 0,5 mg /kg /d σε 1,5% όξινο ανθρακικό νάτριο (Thermo Fisher) β /ο σε νερό, ρΗ 8,0 , χορηγείται σε 100 mL ενδοπεριτοναϊκές ενέσεις μία φορά την ημέρα από Δευτέρα έως Παρασκευή για 4 εβδομάδες, (γ) γεμσιταβίνη, σε δόση 50 mg /kg σε φυσιολογικό ορό, χορηγήθηκαν ip κάθε 3 ημέρες για 4 εβδομάδες, ή (δ) ένα συνδυασμό των δύο θεραπειών. Δεν υπήρξε καμία ένδειξη του ακαθάριστου τοξικότητα στα ζώα που χορηγήθηκε φάρμακο, όπως μετράται με την απώλεια βάρους. Ο ρυθμός ανάπτυξης όγκου υπολογίσθηκε με το μέγεθος που μετράται σε κάθε χρονικό σημείο κανονικοποιήθηκε ως προς τον αρχικό όγκο του όγκου την ημέρα 0, όταν οι όγκοι των shFBKP5 και wtFKBP5 ποντικούς ξενομοσχεύματος έφθασε 100 mm

3. Τα αποτελέσματα της επίδρασης της θεραπείας εκπροσωπήθηκε από αναλογία αναστολής όγκου, που ορίζεται ως ποσοστό αύξησης του όγκου του shFKPB5 ποντικών διορθώνεται για εκείνη του wt FKBP5 ποντικών. Μέγιστη καταστολή της ανάπτυξης του όγκου χρησιμοποιήθηκε για την στατιστική σύγκριση μεταξύ των διαφόρων ομάδων θεραπείας.

ανοσοϊστοχημική χρώση

Οι τομές ιστού αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο, βουτηγμένα σε μειούμενες συγκεντρώσεις αιθυλικής αλκοόλης, και στη συνέχεια επανυδατώθηκαν σε αποσταγμένο νερό. ανάκτησης αντιγόνου για Ki67 (Abcam, Cambridge, ΜΑ) πραγματοποιήθηκε με την τοποθέτηση διαφανειών σε προθερμασμένο EDTA ως λύση ανάκτησης σε ατμιστή στους 98 ° C για 30 λεπτά. Η διαδικασία χρώσης εκτελέστηκε σε Dako Autostainer Plus. Συγκεκριμένα, τα τμήματα ιστού κατεργάστηκαν με Υπεροξειδάση Blocking Reagent (Dako, Carpinteria, CA) για 5 λεπτά και στη συνέχεια πλύθηκαν με ρυθμιστικό 1χ Wash (Dako, Carpinteria, CA), που ακολουθείται από κατεργασία με Protein Block Serum-Free (Dako, Carpinteria , CA) για 5 λεπτά. Οι τομές του ιστού στη συνέχεια επωάστηκαν με το πρωτογενές αντίσωμα Κί67 για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, που ακολουθείται από επώαση με το δευτερεύον αντίσωμα (Dako, Carpinteria, CA) για 15 λεπτά. διαμινοβενζιδίνη υψηλής ευαισθησίας (DAB +) σύστημα χρωμογόνου υποστρώματος (Dako, Carpinteria, CA) χρησιμοποιήθηκε για την οπτικοποίηση χρωματομετρική.

Στατιστική Ανάλυση

Τα πειραματικά δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων ελέγχου και θεραπείας προσδιορίστηκαν με τη χρήση ζευγών

t

τεστ ή ANOVA, και η P & lt?. 0.01 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Νοκ ντάουν της FKBP5 Αποτελέσματα σε αυξημένη ανάπτυξη του παγκρέατος όγκου και γεμσιταβίνη Αντίσταση

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η έκφραση FKBP5 ρυθμίζεται προς τα κάτω σε καρκίνο του παγκρέατος και έχουν προτείνει ότι FKBP5 μπορεί να εμπλέκεται στην ογκογένεση του καρκίνου του παγκρέατος. Η παγκρεατική καρκινική κυτταρική γραμμή SU86 ήταν σταθερά επιμολυσμένα με ομαδοποιήθηκαν FKBP5 shRNA. Στη συνέχεια προσδιορίζεται η επίδραση του FKBP5 επί του σχηματισμού όγκων ξενομοσχεύματος. Υπήρχε μια δραματική αύξηση του μεγέθους του όγκου σε ποντικούς FKBP5 knockdown σε σύγκριση με τα ποντίκια ελέγχου, υποδεικνύοντας ότι FKBP5 είναι ένας δυνητικός καταστολέας όγκου (Σχήμα 1Α). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, ο όγκος του όγκου ήταν σημαντικά μεγαλύτερη σε ποντικούς shFKBP5 ό, τι σε ποντικούς ελέγχου. Την ημέρα 18, ο μέσος όγκος ήταν 200 ± 101 mm

3 σε ζώα ελέγχου (η = 5 ποντικοί /ομάδα), και 937 ± 103 mm

3 σε shFKBP5 ποντίκια (η = 5? Ρ & lt? 0.001). Αυτή η τάση ήταν σταθερή μέχρι την ημέρα 30, όταν οι ποντικοί θυσιάστηκαν (ποντίκια shFKBP5: 2999 ± 298 mm

3, και τα ποντίκια wtFKBP5: 1190 ± 243 mm

3? Η = 5? Ρ & lt? 0.001). Από προηγούμενες μελέτες μας έδειξαν ότι το επίπεδο έκφρασης της FKBP5 συσχετίστηκε με την ευαισθησία των παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα [10], μπορούμε επόμενο καθοριστεί αν νοκ ντάουν της FKBP5 θα μπορούσε να επηρεάσει την χημειοευαισθησία της SU86 ξενομοσχευμάτων να γεμσιταβίνης

in vivo

. Δοκιμάσαμε πρώτα το φαινόμενο δόσης της γεμσιταβίνης τόσο με wt και shFKBP5 SU86 ξενομοσχεύματα κάποτε όγκοι έφθασαν το ίδιο μέγεθος, 100 mm

3. Μία δοσοεξαρτώμενη αναστολή της αύξησης του όγκου παρατηρήθηκε με γεμσιταβίνη για όλα τα ξενομοσχεύματα SU86 (Εικόνα 1Β και Γ). FKBP5 ξενομοσχεύματα SU86 άγριου τύπου έδειξε στατιστικά σημαντική απόκριση έως 100 mg /kg της αγωγής gemcitabine σε σύγκριση με shFKBP5 SU86 ξενομοσχεύματα αγωγή με την ίδια δόση gemcitabine (Σχήμα 1 D, ρ & lt? 0,05), υποδηλώνοντας ότι η χαμηλή έκφραση του FKBP5 μπορεί να προκαλέσει αντίσταση στην gemcitabine . Βρήκαμε επίσης ότι στις χαμηλότερες συγκεντρώσεις της γεμσιταβίνης, ο wtFKBP5 παρουσίασαν επίσης μια τάση προς την καλύτερη απόκριση από ό, τι τα ποντίκια ξενομόσχευμα shFKBP5, αν και δεν είναι στατιστικά σημαντική (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Όλες οι θεραπείες ήταν καλά ανεκτή, χωρίς σημαντική απώλεια σωματικού βάρους (Σχήμα 1 Ε και F).

Ποντίκια που φέρει υποδόρια wtFKBP5 SU86 και shFKBP5 SU86 όγκους συμμετείχαν στη μελέτη, όταν έφθασαν οι όγκοι -100 mm

3 (ημέρα 0 ). Όλοι οι ποντικοί τυχαιοποιήθηκαν για τον έλεγχο ή τη θεραπεία ομάδες και υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα ή γεμσιταβίνη σε δόσεις των 25, 50, και 100 mg /kg ενδοπεριτοναϊκώς δύο φορές την εβδομάδα. (Α) Σχηματισμός υποδόρια (s.c.) όγκων σε βάρος και shFKBP5 SU86 εγχύθηκε γυμνούς ποντικούς. Τα αποτελέσματα που αντιπροσωπεύονται από τον όγκο του όγκου μετρήθηκε σε κάθε χρονικό σημείο. ** Ρ & lt? 0.001 (5 ποντικοί /ομάδα) σε σύγκριση μεταξύ wtFKBP5 και shFKBP5 ξενομοσχεύματα αγωγή με φυσιολογικό ορό. (Β και Γ) απόκριση γεμσιταβίνη σε βάρος ή shFKBP5 ποντικούς ξενομοσχεύματος. Τα αποτελέσματα που αντιπροσωπεύονται από τον όγκο του όγκου μετρήθηκε σε κάθε χρονικό σημείο διορθώθηκε σε ημέρα 0 όταν τα ποντίκια εισήλθαν στην μελέτη. (D) ξενομοσχεύματα shFKBP5 είναι ανθεκτικά σε γεμσιταβίνη

in vivo

. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύονται από αναλογία αναστολής όγκου, που ορίζεται ως μετρήσεις του όγκου του όγκου σε κάθε χρονικό σημείο κανονικοποιήθηκε ως προς την ημέρα 0 για τα ποντίκια shFKPB5, διορθωμένο για εκείνη του wt FKBP5 ποντικών. ** P & lt? 0.001? * Ρ & lt? 0,05 (5 ποντικοί /ομάδα) ως μια σύγκριση του δείκτη αναστολής της ανάπτυξης του όγκου μεταξύ wtFKBP5 και shFKBP5 αγωγή με 100 mg /kg γεμσιταβίνης. (Ε και ΣΤ) Μετρήσεις σωματικού βάρους για wt και shFKBP5 ξενομοσχεύματα. Το σωματικό βάρος καταγράφηκε για κάθε ποντικό κάθε 3 ημέρες σε όλο το πείραμα. Η στατιστική σημαντικότητα αξιολογήθηκε με αμφίδρομη ΑΝΟνΑ.

Η

Έχουμε προηγουμένως δείξει ότι τα ενεργοποιημένα Akt σηματοδότηση συσχετίζεται με χαμηλά επίπεδα FKBP5 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα [10]. Επομένως, εξετάσαμε την δραστηριότητα της πορείας Akt σε δείγματα όγκων για κάθε κυτταρική γραμμή. Σε shFKBP5 ξενομοσχεύματα, φωσφορυλιωμένο Akt-Ser473, FOXO1and ΟδΚ3β ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με τον έλεγχο (Εικόνα 2, ρ & lt? 0,01). Η προσθήκη της γεμσιταβίνης δεν είχε καμία επίδραση στα επίπεδα φωσφορυλίωσης αυτών των πρωτεϊνών. Αυτά τα αποτελέσματα ήταν σύμφωνα με προηγούμενα ευρήματα μας χρησιμοποιώντας παγκρεατικών κυτταρικών σειρών [10]. Συλλογικά, αυτή η σειρά πειραμάτων δείχνει ότι FKBP5 λειτουργεί ως ογκοκατασταλτικά ρυθμίζοντας αρνητικά την οδό Akt

in vivo

. Επιπλέον, το επίπεδο των FKBP5 επηρεάζει την ευαισθησία στην θεραπεία γεμσιταβίνης που σχετίζονται με την επίδρασή της επί της φωσφορυλίωσης Akt στο μοντέλο παγκρεατικού ξενομοσχεύματος.

δείγματα όγκων από wtFKBP5 SU86 ή shFKBP5 SU86 ξενομοσχεύματα παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν για φωσφορυλίωση της Akt και κατάντη μόρια σηματοδότησης με ανάλυση κηλίδος Western.

Η

Akt Inhibitor ευαισθητοποιεί καρκινικά κύτταρα με χαμηλό FKBP5 σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες

in vitro

Η

Ο φωσφατιδυλινοσιτόλη 3-κινάση (ΡΙ3Κ) /Akt μονοπάτι είναι ένα μονοπάτι κυτταρικής επιβίωσης που είναι σημαντική για τη φυσιολογική ανάπτυξη των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό [20], [21], [22], [23]. Αυτή η οδός είναι επίσης ένας σημαντικός στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του στόχου της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (αναστολείς mTOR), αναστολείς της ΡΙ3Κ και αναστολείς της Akt που έχουν ήδη επιδείξει κλινική αποτελεσματικότητα για διαφορετικούς όγκους [24]. Από FKBP5 ρυθμίζει αρνητικά την δραστηριότητα Akt, θα περιμέναμε ότι η προσθήκη αναστολέων που στοχεύουν στην Akt μονοπατιού μπορεί να αντιστρέψει την αντίσταση σε γεμσιταβίνη. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, πραγματοποιήσαμε μια σειρά

in vitro

πειράματα χρησιμοποιώντας τρεις παγκρεατικού κυτταρικές γραμμές όγκου (ASPC1, BxPC3 και SU86) και δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού (MCF7 και Hs578T). Έχουμε επιλέξει τρεις διαφορετικές Akt αναστολείς οδού, συμπεριλαμβανομένης ανάντη αναστολέας της ΡΙ3Κ, LY294002, ένας ειδικός αναστολέας Akt, triciribine (TCN) που αναστέλλει τη φωσφορυλίωση και των τριών ισομορφών του Akt, και ενός αναστολέα mTOR, ραπαμυκίνη. Στη συνέχεια αξιολογήθηκε το αποτέλεσμα κυτταροτοξικότητα της γεμσιταβίνης σε συνδυασμό με LY294002, TCN, και ραπαμυκίνη, αντίστοιχα. Ο Πίνακας 1 συνοψίζει τις τιμές IC50 για κάθε θεραπεία για αυτές τις πέντε κυτταρικές σειρές. Τα δεδομένα μας επιβεβαίωσε, για μια ακόμη φορά, ότι το νοκ ντάουν της απευαισθητοποιημένα κυττάρων FKBP5 να γεμσιταβίνης θεραπεία σε όλες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν (Πίνακας 1 και Σχήμα S1). LY294002, TCN και η ραπαμυκίνη είχε πολύ μέτρια αποτελέσματα όταν χρησιμοποιούνται μόνα τους είτε σε FKBP5 κύτταρα knockdown ή κύτταρα ελέγχου, ειδικά στις συγκεντρώσεις (10 μΜ TCN, 1.4 μΜ LY294002, και 1 ηΜ rapamysin) που χρησιμοποιήσαμε για θεραπείες συνδυασμού (Σχήμα S2) . TCN ευαισθητοποιηθεί τόσο FKBP5 νοκ ντάουν κύτταρα με γεμσιταβίνη (Πίνακας 1, και, σ & lt? 0.005) ελέγχου και διαχείρισης. Ωστόσο, η ευαισθητοποίηση επίδραση TCN ήταν μεγαλύτερη σε κύτταρα FKBP5 knockdown παρά σε κύτταρα wtFKBP5 (ρ & lt? 0.001) (Πίνακας 1 και Σχήμα S1). Τα αποτελέσματα ευαισθητοποίηση της LY294002 και ραπαμυκίνη ήταν πολύ μικρότερη από εκείνη των TCN (Πίνακας 1 LY294002, p = 0.0023~0.3412? Ραπαμυκίνη, p = 0.0171~0.931).

Η

Είχαμε προηγουμένως διαπίστωσε ότι το επίπεδο των FKBP5 επηρεάζει επίσης απόκριση σε άλλους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, περιλαμβανομένων ετοποσίδη και ταξάνια [10]. Ως εκ τούτου, ελέγξαμε εάν υπήκοος τρίτης χώρας θα μπορούσε επίσης να ευαισθητοποιήσει αυτούς τους παράγοντες στις τέσσερις κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν. Και στις τέσσερις κυτταρικές γραμμές, FKBP5 knockdown έκανε τα κύτταρα πιο ανθεκτικά στην θεραπεία ετοποσίδη μόνη της, η οποία είναι συνεπής με τα προηγούμενα ευρήματα. Βρήκαμε ότι οι υπήκοοι τρίτων χωρών θα μπορούσε να ευαισθητοποιήσει σημαντικά ετοποσίδη στα κύτταρα BxPC3, ASPC1, Hs578T και MCF7 σε σύγκριση με τιμές IC50 για τη θεραπεία ετοποσίδη μόνη της εναντίον διαφορετικές θεραπείες συνδυασμού (Πίνακας S1). Το αποτέλεσμα ευαισθητοποίηση ήταν πιο εμφανή σε κύτταρα με FKBP5 νοκ ντάουν. LY294002 θα μπορούσε επίσης να ευαισθητοποιήσει ετοποσίδη στα κύτταρα BxPC3 και MCF7 τόσο με τον έλεγχο και την siFKBP5 επιμόλυνση, ενώ η ραπαμυκίνη είχε μια πολύ λιγότερο σημαντική επίδραση στον έλεγχο ή FKBP5 γκρεμίζω κύτταρα (Πίνακας S1). Εκτός από τους υπηκόους τρίτων χωρών θα μπορούσε επίσης να ευαισθητοποιήσει το paclitaxel σε όλες τις τέσσερις κυτταρικές σειρές (Πίνακας S2). Ωστόσο, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο βαθμό της επίδρασης ευαισθητοποίησης μεταξύ FKBP5 knockdown κυτταρικών γραμμών ελέγχου και. LY294002 και η ραπαμυκίνη είχε περιορισμένη επίδραση στην πακλιταξέλη ευαισθητοποίηση.

Τα αποτελέσματα της LY294002, TCN και ραπαμυκίνη σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη επί της οδού σηματοδότησης Akt αξιολογήθηκαν επίσης σε SU86 κύτταρα. FKBP5 χτυπήθηκε κάτω χρησιμοποιώντας siRNA που στοχεύει FKBP5 (Εικόνα 3Α). Akt 473 φωσφορυλίωση αυξήθηκε σε FKBP5 γκρεμίζω κυττάρων σε σύγκριση με τον έλεγχο (Εικόνα 3Β, στήλη 1 και για τα δύο αριστερά και δεξιά πάνελ, ρ & lt? 0.005), καθώς και οι μεταγενέστεροι μόρια σηματοδότησης, όπως φωσφορυλιωμένο ΟδΚ3β και FOXO1 (Σχήμα 3C και D, στήλη 1 για τα δύο αριστερά και δεξιά πάνελ), σύμφωνα με τα προηγούμενα αποτελέσματα μας [10]. TCN μόνο ήταν αρκετή για να αναστέλλει την οδό Akt όπως φαίνεται από τα μειωμένα επίπεδα φωσφορυλίωσης της Akt σε σύγκριση με τον έλεγχο (Εικόνα 3Β, στήλη 3 για δύο αριστερά και δεξιά πάνελ, ρ & lt? 0.005), ΟδΚ3β και FOXO1 (Σχήμα 3C και D, στήλη 3 για δύο αριστερά και δεξιά πάνελ). LY294002 είχε επίσης επιπτώσεις για την PI3K-Akt μονοπατιού σηματοδότησης (Σχήμα 3C και D, στήλη 5, τόσο για το αριστερό και το δεξί πάνελ). Ωστόσο, η ραπαμυκίνη μόνη είχε λιγότερο από ένα ανασταλτικό αποτέλεσμα επί της ΡΙ3Κ-Akt μονοπατιού σε σύγκριση με TCN και LY294002 (Σχήμα 3Β, Γ και Δ, στήλη 7 και τα δύο αριστερά και δεξιά πάνελ). TCN σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη (Σχήμα 3Β, C και D, στήλη 4 και για τα δύο αριστερά και δεξιά πάνελ,) μειώθηκε περαιτέρω τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της Akt 473, ΟδΚ3β και FOXO1 σε σύγκριση είτε με gemcitabine (Σχήμα 3Β, C και D, στήλη 2 τόσο για το αριστερό και το δεξί πάνελ) ή TCN (Σχήμα 3Β, C και D, στήλη 3 και για τα δύο αριστερά και δεξιά πάνελ) μόνο (p & lt? 0.005) και αυτό το αποτέλεσμα ήταν πολύ πιο σημαντική για τους υπηκόους τρίτων χωρών συν γεμσιταβίνη ό, τι για LY294002 ή ραπαμυκίνη συν γεμσιταβίνη (Σχήμα 3Β, C και D, στήλη 6 και 8 για δύο αριστερά και δεξιά πάνελ). Από knockdown του FKBP5 αυξήθηκε σημαντικά Akt 473 επίπεδα φωσφορυλίωσης, η μείωση που παρατηρείται με TCN συν gemcitabine ήταν πολύ πιο σημαντική σε FKBP5 knockdown κυττάρων (Σχήμα 3Β, C και D, στήλη 4 και για τα δύο αριστερά και δεξιά πάνελ), επιβεβαιώνοντας την υπόθεσή μας ότι τα κύτταρα με χαμηλή FKBP5 μπορεί να εξαρτώνται περισσότερο από την ενεργοποίηση της Akt και, ως εκ τούτου, να επωφεληθούν περισσότερο από την προσθήκη του αναστολέα της Akt.

(Α) FKBP5 γκρεμίζω αποτελεσματικότητα προσδιορίστηκε με RT-PCR και Western blot. (Β) κύτταρα SU86 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO (φορέας), 10 ηΜ γεμκιταβίνης και μόνο, ή 10 μΜ TCN, 1.4 μΜ LY294002, και 1 ηΜ μόνα τους ή σε συνδυασμό ραπαμυκίνη. Δόση εξαρτώμενη αποτελέσματα διαφορετικών θεραπειών επί της κυτταρικής βιωσιμότητας ελέγχθηκαν με δοκιμασία MTS στις 48 ώρες. Μόνο συνδυασμένη θεραπεία με υπηκόους τρίτων χωρών και γεμσιταμπίνη αναστέλλεται Akt

in vitro

. *** P & lt? 0.005. (Γ και Δ) Ο συνδυασμός των υπηκόων τρίτων χωρών που και γεμσιταβίνης έδειξε την πιο αναστολή της pGSK3β και pFOXO1 σε σύγκριση με άλλες θεραπείες. Η στατιστική σημαντικότητα αξιολογήθηκε από

t

τεστ και ρ & lt? 0.005 θεωρήθηκε σημαντική, όπως φαίνεται από τους αστερίσκους (***)

Η

Ενισχυμένη Ανάπτυξη Όγκου Αναστολή με τους υπηκόους τρίτων χωρών συν γεμσιταβίνη

in vivo

η

στη συνέχεια, χρησιμοποιήσαμε ποντίκια ξενομόσχευμα μας είτε με βάρος ή shFKBP5 SU86 κύτταρα για να ελέγξετε αν FKBP5 νοκ ντάουν ποντίκια θα μπορούσαν να επωφεληθούν περισσότερο από την προσθήκη του αναστολέα της Akt, TCN. Άγριου τύπου και FKBP5 όγκων ξενομοσχεύματος knockdown SU86 αναπτύχθηκαν σε γυμνούς ποντικούς. Μόλις σχηματιστεί όγκους ξενομοσχεύματος, TCN και γεμσιταμπίνη ενέθηκαν ε.π. Μια πιο ταχύς ρυθμός ανάπτυξης όγκου, για άλλη μία φορά, παρατηρήθηκε σε ποντικούς ξενομοσχεύματος shFKBP5 (Σχήμα 4Α και Β). Για να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα κατά του όγκου, τα ποντίκια που φέρουν όγκο υπέστησαν αγωγή με TCN (0,5 mg /kg /ημέρα) ε.π. για 4 εβδομάδες ή γεμσιταβίνη (50 mg /kg) ε.π. τρεις φορές την εβδομάδα για 4 εβδομάδες με την παρουσία ή απουσία TCN στα 0,5 mg /kg, ε.π. μία φορά την ημέρα για 5 ημέρες. Μονοθεραπεία με TCN από μόνη της δεν ήταν αποτελεσματική στην κ.β. ή FKBP5 ξενομοσχεύματα knockdown, και δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μέγιστη καταστολή της ανάπτυξης του όγκου σε βάρος και shFKBP5 ξενομοσχεύματα όταν έλαβαν θεραπεία με 50 mg /kg γεμκιταβίνη μόνο (Σχήμα 4C). Ωστόσο, της ταυτόχρονης θεραπείας με TCN ενισχυθεί σημαντικά γεμσιταβίνη αντικαρκινική δράση σε σύγκριση είτε με gemcitabine ή TCN μόνη της σε τόσο κβ και shFKBP5 ποντικούς ξενομοσχεύματος (ρ & lt? 0,005 και για τις δύο wt και shFKBP5) (Σχήμα 4D και Ε). Μεγαλύτερη επίδραση αναστολής της TCN συν gemcitabine παρατηρήθηκε σε ποντικούς ξενομοσχεύματος shFBKP5 σύγκριση με wtFKBP5 (ρ & lt? 0.005) (Σχήμα 4F). Όλες οι θεραπείες ήταν καλά ανεκτές, και κανένα ζώο πέθανε κατά τη διάρκεια της πορείας της θεραπείας. Ως εκ τούτου, ο συνδυασμός γεμσιταβίνης και TCN έδειξε ένα καλό προφίλ ασφάλειας σε ποντίκια χωρίς απώλεια θνησιμότητα ή το σωματικό βάρος (Σχήμα 4G και Η). Έτσι, ο συνδυασμός των TCN και gemcitabine που ασκείται σημαντικά μεγαλύτερη

in vivo

επιδράσεις κατά του όγκου από τον κάθε παράγοντα μόνο του, ειδικά όταν το επίπεδο του FKBP5 μειώθηκε.

Συνδυασμός TCN με γεμσιταβίνη αποτελεσματικά ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

. Τα ποντίκια με υποδορίως καθιερωμένους όγκους από wtFKBP5 SU86 ή κύτταρα shFKBP5 SU86 εισήλθαν στην μελέτη όταν οι όγκοι έφθασαν περίπου 100 mm

3 (ημέρα 0), και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TCN στα 0,5 mg /kg ημερησίως ή /και γεμσιταβίνη στα 50 mg /kg κάθε 3 ημέρες για 30 ημέρες. (Α) ποντικοί wtFKBP5 και (Β) shFKBP5 ποντίκια ρυθμό ανάπτυξης του όγκου. *** P & lt? 0.005. (Γ) σύγκριση των μέγιστη καταστολή όγκου μεταξύ WT και shFKBP5 ξενομοσχεύματα. Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στη μέγιστη καταστολή της ανάπτυξης του όγκου παρατηρήθηκε για wt και shFKBP5 ξενομοσχεύματα όταν έλαβαν θεραπεία με 50 mg /kg γεμκιταβίνη μόνο. (Δ και Ε) της ταυτόχρονης θεραπείας με TCN ενισχυθεί σημαντικά gemcitabine αντικαρκινική δράση τόσο κατά βάρος και shFKBP5 ποντικούς ξενομοσχεύματος. ** P & lt? 0.001? * Ρ & lt? 0,05 (5 ποντικοί /ομάδα) ως μια σύγκριση του δείκτη αναστολής της ανάπτυξης του όγκου μεταξύ TCN συν gemcitabine και gemcitabine μόνη της σε wtFKBP5 και shFKBP5 ομάδες, αντίστοιχα. (Στ) Απώλεια FKBP5 αποτελέσματα έκφρασης σε αυξημένη ισχύ ευαισθητοποίηση για τους υπηκόους τρίτων χωρών για την αντιμετώπιση της γεμσιταβίνης. *** Ρ & lt? 0.005 ως μια σύγκριση του δείκτη αναστολής της ανάπτυξης του όγκου μεταξύ wtFKBP5 και shFKBP5 ποντίκια. Η μέση ± SEM για πέντε όγκους σε κάθε σημείο δεδομένων. (G και H) Μετρήσεις της απώλειας βάρους σε βάρος και shFKBP5 ξενομοσχευμάτων. Οι τοξικές επιδράσεις της χορήγησης της γεμσιταβίνης και gemcitabine συν TCN προσδιορίστηκαν με καταγραφή του σωματικού βάρους για κάθε ποντικό κάθε 3 ημέρες σε όλο το πείραμα. ανάλυση ΑΝΟνΑ και ρ & lt? 0.005 θεωρήθηκε σημαντική, όπως φαίνεται από τους αστερίσκους (***)

Η

Στη συνέχεια εξετάσαμε σχετική Akt φωσφορυλίωση 473 εντός των όγκων ξενομοσχεύματος μετά από διαφορετικές επεξεργασίες.. Βρήκαμε ότι γεμσιταβίνης ανθεκτικά ξενομοσχεύματα shFKBP5 είχαν αυξημένα επίπεδα φωσφορυλιωμένου Akt 473 σε σύγκριση με wtFKBP5 (Σχήμα 5Α, στήλη 1 και για τα δύο αριστερά και δεξιά πάνελ, ρ & lt? 0.005) όπως αναμένεται. Υπήκοοι τρίτων χωρών και μόνο μέτρια ανέστειλε φωσφο-Akt (53,1 ± 6,2% του ελέγχου) (Εικόνα 5Α). Η γεμσιταβίνη μόνη μόνο ελαφρώς ανέστειλε φωσφο-Akt σε όγκο (Σχήμα 5Α). Με την προσθήκη του TCN, τα επίπεδα φωσφορυλιωμένης Akt 473 ήταν σημαντικά μειωμένες σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Σχήμα 5Α, ρ & lt? 0.005). Για την περαιτέρω αντιμετώπιση του υποκείμενου μηχανισμού για την αναστολή της εξέλιξης του όγκου, ο πολλαπλασιασμός προσδιορίστηκε με ανοσοχρώση στους όγκους ξενομοσχεύματος. Ανοσοκηλίδωση του δείκτη πολλαπλασιασμού Ki67 αποκάλυψε περισσότερα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα του όγκου σε ξενομοσχεύματα shFKBP5 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Σχήμα 5Β και C). Η πολλαπλασιαστική δραστηριότητα ήταν χαμηλότερη σε δείγματα που έλαβαν θεραπεία με gemcitabine συν τους υπηκόους τρίτων χωρών από ό, τι με γεμσιταβίνη μόνη της σε τόσο βάρος και shFKBP5 ξενομοσχεύματα (Σχήμα 5D, σ & lt? 0,01). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα ότι ο συνδυασμός TCN και gemcitabine ενισχυμένη αναστολή της οδού Akt.

(α) Επίπεδα pAkt 473 προσδιορίστηκαν σε αμφότερους τους ιστούς όγκων wtFKBP5 και shFKBP5. *** P & lt? 0.005. (Β και Γ) τα δείγματα όγκων από wtFKBP5 SU86 και shFKBP5 SU86 ξενομοσχεύματα παρασκευάστηκαν και χρωματίστηκαν για Κί67. (Δ) Ποσοτικοποίηση της χρώσης Κί67 εκφράστηκε ως ποσοστό των θετικών κυττάρων (5 τυχαία πεδία για κάθε δείγμα, *** Ρ & lt? 0,05). Η στατιστική εκτίμηση έγινε με

t

τεστ.

Η

Συζήτηση

Πρόσφατα αναφέρθηκε ότι FKBP5 είναι μια πρωτεΐνη σκαλωσιές που μπορεί να ενισχύσει PHLPP-Akt αλληλεπίδρασης [10]. Η λειτουργική συνέπεια αυτής της αλληλεπίδρασης έχει ως αποτέλεσμα αρνητική ρύθμιση της Akt δραστηριότητας. Down ρύθμιση των αποτελεσμάτων FKBP5 σε μειωμένη PHLPP-Ακί αλληλεπίδραση και αυξημένη φωσφορυλίωση της Akt στη θέση Ser473 [10], υποδηλώνοντας ότι FKBP5 μπορεί να λειτουργήσει ως καταστολέας όγκου, ένα σημαντικό γεγονός που συμβάλλουν στην χημειοαντίσταση. Με βάση την προηγούμενη ευρήματά μας με FKBP5 και το ρόλο της στην χημειοαντίσταση [9], [10], θα δοκιμαστεί αυτή η υπόθεση

in vivo

χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο ποντικών ξενομοσχεύματος.

Βρήκαμε ότι οι όγκοι σε shFKBP5 ποντίκια ήταν πιο ανθεκτικά στην θεραπεία γεμσιταβίνης και επέδειξαν επίσης έναν ταχύτερο ρυθμό ανάπτυξης του όγκου (Σχήμα 1Α-D). Αυτό το φαινόμενο φαίνεται να περιλαμβάνει τη ρύθμιση της ενεργοποίησης της Akt, όπως καθορίζεται από φωσφορυλιωμένη Akt και μεταγενέστερα μόρια σηματοδότησης (Σχήμα 2). Από Akt ενεργοποιείται όταν FKBP5 καταρριφθεί, υποθέσαμε ότι η προσθήκη αναστολέων που στοχεύουν σε αυτή οδός θα μπορούσε να αντιστρέψει το φαινότυπο ανθεκτικότητας στα φάρμακα. Η PI3K-Akt μονοπατιού έχει πολλαπλές drugable στόχους [25], [26], [27], [28], [29], [30], [31], έτσι ώστε να δοκιμαστεί μια σειρά αναστολέων που στοχεύουν PI3K, Akt και mTOR . Παρατηρήσαμε διαφορετική θεραπευτική επίδραση σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές (Πίνακες 1, S1 και S2), η οποία μπορεί να οφείλεται στην κύτταρο ή ιστό ειδικότητα.