Αφηρημένο

Ιστορικό

Συσσωρευμένα στοιχεία υποστηρίζουν την ιδέα ότι το μελάνωμα είναι εξαιρετικά ετερογενής και υπέστη ένα μικρό υποπληθυσμό μελανώματος βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν. Αυτά τα κύτταρα θεωρούνται ως υπεύθυνα για την ανθεκτικότητα των όγκων σε θεραπείες. Επιπλέον, τα κύτταρα μελανώματος που χαρακτηρίζεται από υψηλή φαινοτυπική πλαστικότητα τους. Κατά συνέπεια, οι δύο μελάνωμα βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν και πιο διαφοροποιημένη απογόνους τους πρέπει να εξαλειφθεί για να επιτευχθεί διαρκής θεραπεία. Με reevaluating ενώσεις σε ετερογενείς πληθυσμοί μελάνωμα, μπορεί να είναι δυνατόν για την επιλογή ενώσεων με δραστικότητα όχι μόνο κατά των κυττάρων ταχέως ποδηλασία, αλλά και κατά του καρκίνου βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν. Φυσικές ενώσεις ήταν το επίκεντρο της παρούσας μελέτης.

Μέθοδοι

Αναλύσαμε 120 ενώσεις από την Natural Products Set II για να διαπιστώσετε ενώσεις δραστικές εναντίον πληθυσμών μελανώματος που καλλιεργούνται σε αγκυροβόλιο-ανεξάρτητο τρόπο και εμπλουτισμένο με κύτταρα ασκώντας αυτο-ανανέωση ικανότητας. Η βιωσιμότητα των κυττάρων, διακοπή του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση, γονιδιακή έκφραση, κλωνογονική επιβίωση και την ετικέτα διατήρησης αναλύθηκαν.

Ευρήματα

Πολλές ενώσεις αποτελεσματικά εξαλειφθεί κύτταρα με κλωνογόνο ικανότητα και nanaomycin Α, στρεπτονιγρίνη και toyocamycin ήταν αποτελεσματικές στα 0.1 μΜ. Άλλα αντι-κλωνογονικού αλλά όχι εξαιρετικά κυτταροτοξικές ενώσεις όπως βρυοστατίνη 1, siomycin Α, Ιλλουδίνη Μ, μιχελαμίνης Β και πεντοξιφυλλίνη μείωσε σημαντικά τη συχνότητα των ABCB5 (ATP-δεσμευτική κασέτα, υπο-οικογένεια B, μέλος 5) -θετικό κύτταρα. Αντίθετα, η θεραπεία με κολχικίνη μεϋτανσίνη και επιλέγονται για κύτταρα που εκφράζουν το μεταφορέα αυτό. Μεϋτανσίνη, στρεπτονιγρίνη, toyocamycin και κολχικίνη, ακόμη και αν πολύ κυτταροτοξικά, άφησε ένα μικρό υποπληθυσμό βραδείας διαιρούμενα κύτταρα ανεπηρέαστο. Ενώσεις που επιλέγονται στην παρούσα μελέτη μεταβάλλονται διαφορικά την έκφραση των μελανοκυττάρων /μελάνωμα ειδικός συντελεστής μικροφθαλμίας που σχετίζονται με τη μεταγραφή (MITF) και πρωτο-ογκογονιδίου c-myc.

Συμπέρασμα

Επιλεγμένα αντι-κλωνογονικού ενώσεις θα μπορούσε να διερευνηθούν περαιτέρω ως πιθανοί ανοσοενισχυτικά στόχευση μελανώματος βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν στη συνδυασμένη θεραπεία αντι-μελανώματος, ενώ επιλεγμένα κυτταροτοξικά αλλά όχι αντι-κλωνογόνο ενώσεις, οι οποίες αύξησε τη συχνότητα του ABCB5-θετικών κυττάρων και παρέμεινε αργή ποδηλασία κύτταρα ανεπηρέαστη, θα μπορούσε να θεωρηθεί ως εργαλείο για τον εμπλουτισμό καλλιέργειες με κύτταρα που εμφανίζουν τα χαρακτηριστικά του μελανώματος βλαστικών κυττάρων

Παράθεση:. Sztiller-Sikorska Μ, Koprowska Κ, Majchrzak Κ, Hartman Μ, Czyz Μ (2014) Δραστηριότητα φυσικές ενώσεις »κατά του καρκίνου Stem-Like ή Fast-Ποδηλασία μελάνωμα κύτταρα. PLoS ONE 9 (3): e90783. doi: 10.1371 /journal.pone.0090783

Επιμέλεια: Χριστόφορος Heeschen, ισπανικό Εθνικό Κέντρο Καρκίνου (CNIO), Ισπανία

Ελήφθη: 9η Δεκεμβρίου του 2013? Αποδεκτές: 4 του Φλεβάρη του 2014? Δημοσιεύθηκε: 3 Μαρτίου 2014

Copyright: © 2014 Sztiller-Sikorska et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Χρηματοδότηση: το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε από μια επιχορήγηση 2011/01 /Β /ΝΖ4 /04921 από το Εθνικό Κέντρο Επιστημών. Το Φυσικά Προϊόντα Σετ ΙΙ παρέχονται χωρίς κόστος από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου των ΗΠΑ (NCI, https://www.dtp.nci.nih.gov. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, απόφαση για τη δημοσίευση ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Οι εντός του όγκου φαινοτυπική ετερογένεια αποτελέσματα από τη γενετική παραλλαγή, αλλά επίσης. από την πλαστικότητα του όγκου των κυττάρων που παρατηρείται σε απόκριση προς μικροπεριβάλλοντος ερεθίσματα. Μεταξύ διάφορες λειτουργικές φαινοτύπους εντός ενός όγκου, ένας υποπληθυσμός καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με (ΚΕΠ) ικανή αυτο-ανανέωση και το μεγαλύτερο μέρος του όγκου που αποτελείται από fast-ποδηλασίας κύτταρα και περισσότερο διαφοροποιημένα κύτταρα θα μπορούσαν να διακριθούν [1] – [3] Δεδομένου ότι η φαινοτυπική ετερογένεια δείχθηκε ότι είναι ιδιαίτερα δυναμική σε πολλούς όγκους συμπεριλαμβανομένου του μελανώματος [4] -. [7] και η θεραπευτική εξάλειψη της CSC υποπληθυσμού μπορεί να ακολουθείται από του αναγέννηση από μη ΚΕΠ, τα δύο ΚΕΠ και το μεγαλύτερο μέρος του πληθυσμού θα πρέπει να θεωρηθεί στην ανάπτυξη του αντικαρκινική θεραπεία [8] – [14]. Ως εκ τούτου, ένας συνδυασμός φαρμάκων που προκαλεί μια πλήρη εξάλειψη όλων των ειδών των κυττάρων εντός ενός όγκου μπορεί να είναι αναγκαία για να επιτευχθεί διαρκής θεραπείες. Κατά τη διαδικασία επιλογής εξαιρετικά ισχυρών υποψηφίων φαρμάκων, υπάρχει ένα σημαντικό πρόβλημα για τη δημιουργία πειραματικών

in vitro

μοντέλα που προβλέπει αξιόπιστα δραστικότητα του φαρμάκου σε ασθενείς. Στην παρούσα μελέτη, τα κύτταρα μελανώματος που παράγεται απευθείας από παθολογικά διακριτά δείγματα, οζώδες μελάνωμα και επιφανειακό μελάνωμα εξαπλώνεται, αναπτύχθηκαν σε αγκυροβόλιο τρόπο ανεξάρτητο σε μέσο βλαστοκυττάρων και εμπλουτίσθηκαν με κύτταρα ασκώντας αυτο-ανανέωση ικανότητα σε σύγκριση με μονοστοιβάδες ορό με γνώμονα [15]. Αυτή η

in vitro

τρισδιάστατο μοντέλο έχει επίσης αποδειχθεί να διατηρηθεί η ετερογένεια του αρχικού όγκου με μεγαλύτερη ακρίβεια από δισδιάστατη μονοστρωματικές καλλιέργειες [16] – [18] και ήταν ένα σημαντικό στοιχείο του νεωτερισμού στην παρούσα

in vitro

διαλογή της βιβλιοθήκης ενώσεων φυσικών

οι φυσικές ενώσεις χρησιμοποιούνται ευρέως στην αντικαρκινική θεραπεία και μπορούν να ασκήσουν σημαντική βιολογική δραστηριότητα [19] – [21].. Αν και οι μηχανισμοί δράσης τους είναι συχνά δεν είναι καλά καθορισμένη, τα περισσότερα των θεραπευτικών παραγόντων που προέρχονται από φυσικά προϊόντα είναι κυρίως αποτελεσματικές στην εξάλειψη των καρκινικών κυττάρων με υψηλό ρυθμό πολλαπλασιασμού. Ενώσεις που επηρεάζουν την κυτταρική διαίρεση μπορεί να αποτύχει, ωστόσο, για την εξάλειψη της υποπληθυσμό του καρκίνου αργή ποδηλασία βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν, οδηγώντας τελικά σε υποτροπή του όγκου. Στην παρούσα μελέτη, αν και έχουν πολλές προσεγγίσεις έχουν χρησιμοποιηθεί στη διαδικασία επιλογής, δόθηκε προτεραιότητα σε εκείνες τις ενώσεις που ήταν ικανά να μειώσουν τον αριθμό των κλωνογόνων κυττάρων. Η μείωση της ικανότητας κλωνισμού ερμηνεύτηκε ως άμεση επίδραση στην αυτο-ανανέωση δυναμικό των καρκινικών βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν. Επιπλέον, απόπτωση, ετικέτα συγκράτησης, η συχνότητα του ABCB5-θετικών κυττάρων και την έκφραση του /σηματοδότησης β-κατενίνης γονιδίων στόχων Wnt,

MITF

και

c-MYC

, αξιολογήθηκαν σε μελάνωμα πληθυσμούς σε επεξεργασία με ενώσεις που επιλέγονται είτε ως άκρως αντι-κλωνογόνων ή εξαιρετικά κυτταροτοξικά. Διερευνήθηκε η επίδραση επιλεγμένων ενώσεων επί βλαστική ικανότητα που σχετίζεται με μόρια και μονοπάτια. Αργή ποδηλασία κύτταρα θεωρούνται ως καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με (ΚΕΠ) μπορούν να χαρακτηρίζονται ως κύτταρα ετικέτα συγκράτησης [12]. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε μια φθορίζουσα χρωστική CFSE για την αναγνώριση ενώσεων που άφησε την ετικέτα που συγκρατεί τα κύτταρα του μελανώματος δεν επηρεάζεται. ABCB5 πρωτεΐνη μεταφορέα, ένας μεσολαβητής του χημειοαντίσταση σε μελάνωμα, αναγνωρίζεται επίσης ως δυνητικό δείκτη για μελάνωμα βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν [2], [22]. Κύτταρα μελανώματος που εκφράζουν πρωτεΐνη ABCB5 μπορούσε επιλεκτικά να επιβιώσουν όταν εκτίθεται σε δακαρβαζίνη, vemurafenib και άλλα φάρμακα [22]. Απεδείχθη ότι το αντι-ABCB5 αντίσωμα ή γονιδιακή σίγηση siRNA αντιστραφεί αντίσταση μελανώματος σε αντικαρκινικά φάρμακα [23], [24]. Ερευνήσαμε αν η αναλογία των κυττάρων που φέρουν αυτό το μεταφορέα μεταβλήθηκε κατά την θεραπεία με επιλεγμένες φυσικές ενώσεις. Σηματοδότηση Wnt παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη διατήρηση του πλειοδυναμία των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων και την ανάπτυξη καρκίνου [25]. Πρόσφατη έκθεση προτείνει ένα ρόλο για τον /β-κατενίνης σηματοδοτικό μονοπάτι Wnt στη διατήρηση της βιωσιμότητας και /ή τη διατήρηση της αυτο-ανανέωσης των όγκων του μαστού κύτταρα έναρξης

in vitro

[26]. Στο μελάνωμα, β-κατενίνης αυξάνει σηματοδότηση κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου και προωθεί χημειοαντίσταση [27]. πρόσφατη μελέτη μας έδειξε ότι ο /β-κατενίνης μονοπάτι σηματοδότησης Wnt καταστέλλεται σε πληθυσμούς μελανώματος με τη χαμηλή συχνότητα των κλωνογόνων κυττάρων (Hartman et al., υποβληθέν). Η επίδραση των επιλεγμένων φυσικών ενώσεων για δύο /β-κατενίνης γονιδίων στόχων Wnt,

MITF

και

c-myc

διερευνήθηκε. παράγοντας μεταγραφής MITF δρα ως ένα ροοστάτη προσδιορισμό της φαινοτυπικής ταυτότητας μεταξύ των διαφόρων υποπληθυσμών των κυττάρων μελανώματος [28]. Παρά το γεγονός ότι ενισχύεται μόνο σε περίπου 20% των μελανωμάτων, MITF έχει προταθεί ως ένα ογκογονίδιο εθισμός γράμμωσης που συμβάλλουν στην χημειοαντίσταση μελάνωμα [29], [30]. Το πρωτο-ογκογονίδιο c-MYC παίζει κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη ενός μεγάλου αριθμού ανθρώπινων όγκων [31]. Πιο πρόσφατα, έχει δειχθεί ότι υπερ-έκφραση του c-myc εντός του όγκου μπορεί να στοχεύεται με ειδικές Τ-κυττάρων [32]. Ενώσεις επαγωγή απόπτωσης και /ή την αναστολή του πολλαπλασιασμού σε ένα C-MYC-ειδικό τρόπο πράξη σε διακριτές κυτταρικών στόχων [33], [34]. c-MYC αναστολή σε κύτταρα μελανώματος οδηγεί σε μειωμένη πολλαπλασιασμού μέσω μηχανισμών που περιλαμβάνουν διάφορα ένζυμα της βιοσύνθεσης νουκλεοτιδίου [35].

Για τις γνώσεις μας, δεν υπάρχουν προηγούμενες μελέτες που εξετάζουν τόσοι πολλοί παράγοντες παράλληλα στην αρχική διαδικασία επιλογής για δραστικές ουσίες από την Natural Products Set II (NCI). Με βάση τα δημιουργημένα προφίλ δραστηριότητας, κάθε μία από τις επιλεγμένες ενώσεις μπορούν να διερευνηθούν περαιτέρω για πιθανές εφαρμογής της ως μέρος της αντικαρκινικής θεραπείας ή ως εργαλείο για την εργαστηριακή εργασία. Τα φυσικά προϊόντα που επιλέγονται ως δραστικές ενώσεις κατά του μελανώματος κύτταρα μπορούν επίσης να παρέχουν νέες οδηγεί για τη μετατροπή σε κλινικά χρήσιμους παράγοντες.

Υλικά και Μέθοδοι

Ενώσεις

Το Φυσικά Προϊόντα Σετ ΙΙ λαμβάνεται από το αμερικανικό Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου (NCI, https://www.dtp.nci.nih.gov). Οι ενώσεις ήταν σε πλάκες 96 φρεατίων με 60 ενώσεις ανά πλάκα. Οι πλάκες φυλάχθηκαν ξηρά σε -20 ° C. Κάθε φρεάτιο περιείχε 0.02 μπιοί ένωσης σε 1 μΙ γλυκερόλης. 10 mM διάλυμα (20 μΙ) του κάθε ένωση ελήφθη με την προσθήκη 19 μΙ DMSO σε κάθε φρεάτιο. Αμέσως μετά την διαλυτοποίηση τα διαλύματα φαρμάκου διαμοιράσθηκε σε αρκετά τρυβλία δοκιμών για να αποφευχθεί πιθανή καταβύθιση της ένωσης. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ενώσεων που παρέχονται από NCI.

καρκινικούς ιστούς και Δήλωση Ηθικής

κύτταρα

DMBC ελήφθησαν στο τμήμα Μοριακής Βιολογίας του Καρκίνου από χειρουργικά δείγματα μελανώματος σε προχωρημένα στάδια. χαρακτηριστικά των ασθενών των δειγμάτων μελανώματος έχουν δημοσιευθεί στο παρελθόν [15], [36], [37]. Η μελέτη εγκρίθηκε από την Ηθική Επιτροπή του Ιατρικού Πανεπιστημίου του Lodz και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς.

Κυτταροκαλλιεργειών

Τα κύτταρα διατηρούνται σε βλαστικά κύτταρα μέσο (SCM) σε ένα αγκύρωση-ανεξάρτητο τρόπο όπως περιγράφηκε προηγουμένως [36].

Μέτρηση του αριθμού βιώσιμων κυττάρων

κύτταρα μελανώματος μετρήθηκαν μετά από χρώση με Trypan blue (Sigma-Aldrich) και επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 4 × 10

3 βιώσιμα κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 45 ώρες με όχημα (0,05% DMSO) ή τις ενώσεις από την Natural Products Set II σε 5 μΜ. Μια δοκιμασία δραστικότητας όξινης φωσφατάσης (ΑΡΑ) χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση αριθμού βιώσιμων κυττάρων. Εν συντομία, οι πλάκες φυγοκεντρήθηκαν, το μέσο απορρίφθηκε και αντικαταστάθηκε με ρυθμιστικό δοκιμασίας 100 μΐ που περιέχει 0.1 Μ οξικό νάτριο (ρΗ = 5), 0.1% Triton Χ-100 και 5 mM φωσφορικό ρ-νιτροφαινύλιο, ρΝΡΡ (Sigma-Aldrich) και επωάστηκαν για επιπλέον 2 ώρες στους 37 ° C. Η αντίδραση σταμάτησε με 10 μΙ /φρεάτιο 1 Μ ΝαΟΗ, και οι τιμές απορρόφησης μετρήθηκαν σε μήκος κύματος 405 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλακός (άπειρη M200Pro, Tecan, Austria). κύτταρα του μελανώματος δεν ανταποκρίνονται σε 0,05% DMSO με μειωμένη βιωσιμότητα.

Βιωσιμότητα Δοκιμασία

ναρκωτικά που προκαλείται από αλλαγές στη βιωσιμότητα των κυττάρων μετά από θεραπεία 45 ώρες αξιολογήθηκαν επίσης με κυτταρομετρία ροής μετά ιωδιούχου προπιδίου (PI) χρώση ή με τη χρήση ενός αυτοματοποιημένου αναλυτή κυτταρικής βιωσιμότητας σύμφωνα με πρότυπες διαδικασίες. Σε αμφότερες τις δοκιμασίες, τα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα FACSVerse κυτταρόμετρο ροής (Becton Dickinson, San Jose, California, USA), και τα αποτελέσματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τη χρήση λογισμικού FACSuite (Becton Dickinson).

Κύκλου Κυττάρου Ανάλυση

κύτταρα μελανώματος υπέστησαν κατεργασία με το όχημα ή τις ενώσεις στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 30 ώρες ή 45 ώρες, στη συνέχεια συλλέγεται και σταθεροποιήθηκαν με 70% (w /v) αιθανόλη στους -20 ° C. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και επαναιωρήθηκαν σε ΡΙ Χρώση ρυθμιστικό που περιέχει ΚΝΑάση (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Μετά την επώαση για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι, τα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα FACSVerse κυτταρόμετρο ροής (Becton Dickinson). ModFit LT 3,0 λογισμικού (Επαλήθευση λογισμικό, Topsham, ΜΝ, USA) χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό των ποσοστών των κυττάρων σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου, και το λογισμικό FACSuit (Becton Dickinson) χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό των ποσοστών των νεκρών κυττάρων σε subG

1 .

κλωνογονική δοκιμασία

κύτταρα μελανώματος επωάστηκαν πρώτα με ενώσεις στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις επί 4 ώρες. Στη συνέχεια, η βιωσιμότητα προσδιορίστηκε με χρώση trypan blue και 1.000 μονά, βιώσιμα κύτταρα μελανώματος μεταφέρθηκαν σε 700 μΐ άγαρ κορυφής μέσου μίγμα (SCM, 0,35% (β /ο) άγαρ) και τα ληφθέντα κυτταρικά εναιωρήματα επιστρώθηκαν πάνω σε πλάκες καλλιέργειας 12 φρεατίων επικαλυμμένα με 700 μΙ στερεοποιήθηκε πυθμένα μίγμα άγαρ (SCM, 0,5% (w /v) άγαρ). Οι πλάκες στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή για 2 εβδομάδες, και σε ορισμένες περιπτώσεις και για 3 εβδομάδες. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με 500 μΙ 0,005% κρυσταλλικού ιώδους για 2 ώρες, και οι αποικίες τουλάχιστον 50 μm σε διάμετρο μετρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο. Η επίδραση των ενώσεων επί της ικανότητας κλωνισμού εκφράστηκε ως επί τοις εκατό του ελέγχου σύμφωνα με τον τύπο: αποικίες αριθμός που παράγεται μετά την επεξεργασία με τις ενώσεις /αριθμός αποικιών σε έλεγχο με το όχημα × 100.

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της Απόπτωσης

Ανίχνευση κυτταρικού θανάτου εκτελέστηκε με διπλή χρώση με Annexin V-FITC και ΡΙ (Roche Diagnostics, Manheim, Germany). κύτταρα μελανώματος σπάρθηκαν σε πλάκες 12-φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία για 45 ώρες με τις ενώσεις στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις. Μετά την αγωγή, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, φυγοκεντρήθηκαν στα 400 χ g για 5 λεπτά και χρωματίστηκαν με Αννεξίνη V-FITC και ΡΙ για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. 15.000 γεγονότα αναλύθηκαν για κάθε δείγμα με κυτταρόμετρο ροής FACSVerse (Becton Dickinson), και τα αποτελέσματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τη χρήση FACSuite λογισμικό (Becton Dickinson).

Αξιολόγηση της ABCB5-θετικών κυττάρων

Η συχνότητα της κύτταρα που εκφράζουν ABCB5 εκτιμήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Μη συζευγμένο αντι-ABCB5 πρωτογενές αντίσωμα από την Sigma-Aldrich και δευτερογενές αντίσωμα αντι-κουνελιού συζευγμένο με FITC κατσίκας (BD Pharmingen) χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Τυπικά, 30.000 κύτταρα αναλύθηκαν ανά δείγμα. έλεγχοι ισοτύπου συμπεριελήφθησαν σε κάθε πείραμα. Για να αποκλείουν τα νεκρά κύτταρα από την ανάλυση, η 7-αμινοακτινομυκίνης χρώση D (7-AAD? EBiosciences) χρησιμοποιήθηκε. απόκτηση κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός FACSVerse κυτταρόμετρο ροής (Becton Dickinson) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό FACSuite. Αλλαγές στην συχνότητα των ABCB5-θετικών κυττάρων μετά την επεξεργασία φαρμάκου για 45 ώρες εκφράστηκαν ως ποσοστά του ελέγχου με όχημα.

CFSE χρώσης

Για την ανάλυση CFSE, κύτταρα μελανώματος βάφτηκαν με 1,5 μΜ CFSE (το προφάρμακο καρβοξυφλουοροσκεϊνης ηλεκτριμιδυλεστέρας διοξικής εστέρας) για 30 λεπτά στους 37 ° C, πλύθηκαν δύο φορές, εμβολιάστηκαν σε πλάκες δώδεκα-φρεατίων σε 1.25 × 10

5 /φρεάτιο, και εκτέθηκαν στις ενώσεις επί 5 ημέρες σε υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις. Στη συνέχεια, μέσο αλλάχθηκε και τα κύτταρα επωάστηκαν σε μέσο ελεύθερο φαρμάκου για άλλες 6 ημέρες, και αξιολογούνται με κυτταρομετρία ροής. Πράσινο εκπομπή φθορισμού μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής FACSVerse (Becton Dickinson) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό FACSuite.

Απομόνωση RNA, cDNA Σύνθεση και Real-Time PCR

RNA απομονώθηκε και καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας ολικό RNA κιτ απομόνωσης με μίνι σύστημα στήλης (amp A &? Ένα Βιοτεχνολογίας, Gdynia, Πολωνία). Η συγκέντρωση RNA και η καθαρότητα μετρήθηκαν με αναγνώστη πλακός Tecan NanoQuant (Tecan, Αυστρία). cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας 300 ng τυχαίων εκκινητών και SuperScript II της αντίστροφης μεταγραφάσης (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Το σύστημα ανάλυσης DNA Rotor-Gene 3000 Real-Time (Corbett Research, Morklake, Αυστραλία) χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η έκφραση γονιδίου μέσω ποσοτικής σε πραγματικό χρόνο αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (qRT-PCR). Η ενίσχυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ΚΑΠΑ SYBR FAST qPCR Kit Οικουμενική 2X qPCR Master Mix (Κάπα Biosystems, Κέιπ Τάουν, Νότια Αφρική), 200 nM του κάθε εκκινητή και 25 ng μήτρας cDNA ανά αντίδραση. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για το Real-Time PCR ήταν ως εξής: ΜΙΤΡ: 5′-ACC GTC TCT CAC ΤΟΟ ΑΤΤ GG-3 ‘και 5′-TAC TTG ΟΤΟ GGG ΤΤΤ TCG AG-3′? C-MYC: 5’-ΑΑΤ GAA ΑΑΟ GCC CCC ΑΑΟ GTA Γ.Ο.Σ. ATC C-3 ‘και 5′-GTC Γ.Ο.Σ. TCC GCA ACA AGT ΚΔ CTT C-3′? SOX2: 5’-GCT AGT CTC CAA GCG ACG-3 ‘και 5′-GCA AGA AGC CTC TCC TTG-3’. Η θερμοκρασία ανόπτησης για όλα τα γονίδια ήταν 56 ° C. Η σχετική έκφραση των γονιδίων-στόχων υπολογίστηκε σε σχέση με ένα γονίδιο αναφοράς RPS17 (με εκκινητές: 5′-ΑΑΤ CTC CTG ATC CAA GGC TG-3 ‘και 5′-CAA GAT AGC ΑΓΓ TTA TGT CAC G-3’), και μια μαθηματική χρησιμοποιήθηκε το μοντέλο συμπεριλαμβανομένης μιας διόρθωσης απόδοσης για το Real-Time PCR.

Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± SD από τρία ξεχωριστά πειράματα εκτός αν ορίζεται διαφορετικά. Η σημασία μιας προφανούς διαφορά στις μέσες τιμές για κάθε παράμετρο δοκιμάστηκε ελέγχθηκε με ζεύγη δοκιμή t του Student. P & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική

Αποτελέσματα

Στρατηγική επιλογή φυσικών ενώσεων σε μελάνωμα κύτταρα που αναπτύσσονται σε Anchorage-ανεξάρτητο τρόπο

Το Φυσικά Προϊόντα Set II, που αποτελείται από 120. ενώσεις (Πίνακας S1 στο αρχείο SI) που προέρχονται από τη συλλογή του DTP Open Repository 140.000 ενώσεων, προβλήθηκε για την αναγνώριση ενώσεων αποτελεσματικών έναντι των κυττάρων μελανώματος. Στην προ-οθόνη των ενώσεων, χρησιμοποιήθηκαν δύο κυτταρικές σειρές που προέρχονται από προχωρημένο μελάνωμα, ένας από οζώδες μελάνωμα (DMBC12) [15] και ένα από επιφανειακό μελάνωμα διασποράς (DMBC11) [37]. Και οι δύο πληθυσμοί αναπτύχθηκαν σε SCM σε αγκυροβόλιο ανεξάρτητο τρόπο όπως πολυκύτταρους 3-διαστάσεων σφαιροειδή. Στην πρωτογενή διαλογή, τα κύτταρα μελανώματος από διαχωρισμένο σφαιροειδή εκτέθηκαν σε κάθε ένωση σε μία μόνη συγκέντρωση από 5 μΜ. Και οι δύο, μη κλωνογόνο και κλωνογόνων προσδιορισμοί χρησιμοποιούνται παράλληλα (Εικ. 1).

Αρχικά, ενώσεις από την Natural Products Set II ελέγχθηκαν σε δύο κυτταρικές γραμμές μελανώματος που λαμβάνονται από παθολογικά διακριτά δείγματα, DMBC11 και DMBC12, σε μία μόνη συγκέντρωση από 5 μΜ. Αλλαγές στη βιωσιμότητα (APA δοκιμασία, ογκομετρική ανάλυση, χρώση ΡΙ και subG

1 δοκιμασία) μετρήθηκαν ως βραχυπρόθεσμες επιπτώσεις και αλλαγές σε κλωνογενείς δυναμικό ως μακροπρόθεσμες επιπτώσεις των δοκιμαζόμενων ενώσεων. Όλες οι δοκιμές βιωσιμότητας συγκρίθηκαν για πιθανές ασυνέπειες. Δύο κριτήρια χρησιμοποιήθηκαν για την επιλογή ενώσεων για περαιτέρω ανάλυση: ένωση θα πρέπει να μειώσει κυτταρικής βιωσιμότητας (ΡΙ-χρώση) έως ≤ 50% του ελέγχου και της ικανότητας κλωνισμού έως ≤ 20% του ελέγχου. Στη συνέχεια, οι επιλεγμένες ενώσεις χρησιμοποιήθηκαν σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις για τις καμπύλες δόσης-απόκρισης. Οι πιο δραστικές ενώσεις στη συνέχεια διερευνήθηκαν για την ικανότητά τους να επάγουν την απόπτωση, να επηρεάσει τη συχνότητα των ABCB5-θετικών κυττάρων και την ετικέτα που συγκρατεί τα κύτταρα βραδείας ποδηλασία, και να αλλάξει την έκφραση του γονιδίου.

Η

Short-Term κυτταροτοξικές και κυτταροστατικές επιπτώσεις των φυσικών ενώσεων σε Κυττάρων μελανώματος

Τέσσερις μη κλωνογόνων μέθοδοι επιλέχθηκαν για την αρχική διαλογή. Αλλαγές στις αριθμοί των βιώσιμων κυττάρων προσδιορίστηκαν βάσει ποσοτικοποίηση της δραστηριότητας κυτοσολικού όξινης φωσφατάσης (APA δοκιμασία) (Εικ. S1 Α σε File SI) και με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας έναν αναλυτή αυτοματοποιημένο βιωσιμότητα των κυττάρων (ογκομετρική προσδιορισμού) (Σχ. S1B σε File SI ). Η κυτταροτοξικότητα των ενώσεων μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής μετά από χρώση ΡΙ, είτε ως η συχνότητα του ΡΙ-θετικών κυττάρων (Εικ. 2 και το Σχ. S2 σε File SI) ή ως ποσοστό των κυττάρων σε subG

1 κλάσμα. Τα ιστογράμματα για εκείνες τις ενώσεις οι οποίες συσσωρεύσει πάνω από το 40% των κυττάρων μελανώματος σε subG

1 κλάσμα που περιλαμβάνονται στο Σχ. 3 και το Σχ. S3A στο αρχείο SI. Όλες αυτές οι δοκιμασίες χρησιμοποιήθηκαν για να εκτιμηθεί η δραστικότητα του φαρμάκου μετά σύντομο επώαση, είτε μετά από 45 ώρες για την ποσοτικοποίηση των κλασμάτων του βιώσιμου και ΡΙ-θετικών κυττάρων, ή μετά από 30 ώρες για τα ποσοστά των κυττάρων σε subG

1 κλασμάτων. Παράλληλα, φυσικές ενώσεις σε 5 μΜ αξιολογήθηκαν σε ανθεκτικά στα φάρμακα, ρ53 ανεπάρκεια λευχαιμική κυτταρική σειρά Κ562 (Σχ. 2, Σχ. S1-S2 κατά αρχείου SI). Η σύγκριση της κυτταροτοξικότητας των φυσικών προϊόντων έναντι μελανώματος και κύτταρα λευχαιμίας (Σχ. 2) αποκάλυψε ότι αρκετές ενώσεις δραστικές έναντι κυττάρων μελανώματος δεν ήταν δραστικές σε κύτταρα Κ562. Για παράδειγμα, στρεπτονιγρίνη (32), crassin (68) και γκελνταναμυκίνη ανάλογο (72) μείωσε τη βιωσιμότητα των κυττάρων μελανώματος σε λιγότερο από 3% του ελέγχου, αλλά η μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων Κ562 δεν έφθασαν το 50% του ελέγχου. κύτταρα μελανώματος ήταν επίσης πολύ πιο ευαίσθητα σε fastigilin Β (63), bactobolin (84), διδεμνίνης Β (104), siomycin Α (107), toyocamycin (108), γκελνταναμυκίνη (110) και tubulosine (119), μεταξύ άλλων (Σχ. 2). Κ562 κύτταρα, με τη σειρά του, ήταν πολύ πιο ευαίσθητα σε lapachone (20) από τα κύτταρα του μελανώματος.

Η βιωσιμότητα μετρήθηκε μετά από 45% του φορέα (0,05% DMSO) κατεργασμένους ελέγχου. Για σύγκριση, η λευχαιμική κυτταρική σειρά Κ562 χρησιμοποιήθηκε. Κάθε τετράγωνο αντιπροσωπεύει την απόκριση του μελανώματος ή λευχαιμία κυττάρων σε ένα από τα 120 ενώσεων. Χρώματα δείχνουν το επίπεδο της κυτταρικής απόκρισης. Για λόγους σαφήνειας οι αριθμοί που ορίζονται στην παρούσα μελέτη για τις δοκιμαζόμενες ενώσεις (Πίνακας S1 στο File SI) τίθενται στην πρώτη ακατέργαστη και την πρώτη στήλη. Βλέπε Εικόνα S2 στο αρχείο SI για ποσοτικά δεδομένα.

Η

Εκπρόσωπος ιστογράμματα των κυττάρων DMBC11 αντιμετωπίζονται με φυσικές ενώσεις για 30

1 δεν υπερβαίνει το 40%, ιστογράμματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ModFit για τον υπολογισμό των ποσοστών των κυττάρων σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου. Ιστογράμματα δείχνουν διακοπή του κυτταρικού κύκλου G

0 /G

1 φάσης σημειώνονται με πράσινο πλαίσιο, στη φάση S με μπλε πλαίσιο και το G

2 /M στο κόκκινο πλαίσιο, καθώς και τα ποσοστά των κυττάρων μελανώματος συνελήφθη στην οι εν λόγω φάσεις υποδεικνύονται. Όταν η συσσώρευση των κυττάρων μελανώματος σε subG

1 υπερέβη το 40%, το λογισμικό FACSuit χρησιμοποιήθηκε και τα ποσοστά των νεκρών κυττάρων ενδείκνυται. Τα αποτελέσματα που λαμβάνονται για τα κύτταρα DMBC12 φαίνεται στο Σχήμα S3A στο αρχείο SI. Οι Επιδράσεις χαμηλότερες συγκεντρώσεις για τις πιο κυτταροτοξικές ενώσεις ή μεγαλύτερης έκθεσης για τις ενώσεις αναποτελεσματική σε 30 h περιλαμβάνεται στο Σχήμα S3b σε File SI.

Η

Κατά την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου, αρκετές ενώσεις σε συγκέντρωση 5 μΜ συσσωρευμένα κύτταρα μελανώματος είτε σε διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου ή δημιουργούνται κατεστραμμένα κύτταρα συλλέγονται σε subG

1 (Εικ. 3 για DMBC11 κύτταρα και Σχ. S3A στο αρχείο SI για DMBC12 κύτταρα). Η κολχικίνη (1), ροτενόνη (19), βινκριστίνη (39), μεϋτανσίνη (60) και ριζοξίνης (86) συνέλαβε την πλειονότητα των κυττάρων μελανώματος σε G

2 /M φάση. Ρεζορουφίνη (12), μιχελαμίνη Β (101) και φουμαγιλλίνη (120), μεταξύ άλλων συνελήφθησαν κυττάρων σε φάση S, ενώ Brefeldin Α (47) και καμπτοθεκίνη (48) συσσωρευμένα κύτταρα σε G

0 /G

1 ή subG

1, ανάλογα με τη γραμμή του φαρμάκου και των κυττάρων. Αρκετές ενώσεις, οι οποίες στα 5 μΜ δεν προκάλεσε αποτελέσματα επί του κυτταρικού κύκλου μετά την αγωγή για 30 ώρες, χρησιμοποιήθηκαν στη μετέπειτα πείραμα για 45 ώρες, ενώ οι ενώσεις που προκαλούν συσσώρευση κυττάρων σε subG

1 δοκιμάστηκαν σε συγκέντρωση 1 μΜ, και σε περίπτωση από τα πιο ισχυρά ενώσεις σε 0,1 μΜ (Σχ. S3b σε File SI). Στρεπτονιγρίνη (32) που παράγει ένα μεγάλο μέρος του πληθυσμού των κυττάρων σε subG

1 στα 5 μΜ, συσσωρευμένη DMBC12 κυττάρων στη φάση S, όταν χρησιμοποιείται σε 0.1 μΜ.

Pre-οθόνη Κλωνογόνος Χωρητικότητα ως μακροπρόθεσμη επίδραση φυσικών ενώσεων για κυττάρων μελανώματος

Μια δοκιμασία κλωνοποίησης χρησιμοποιήθηκε για τη διερεύνηση επιπτώσεων των φυσικών ενώσεων για την αυτο-ανανέωση ικανότητας των κυττάρων μελανώματος. Τα κύτταρα επωάστηκαν με τις ενώσεις μόνο για 4 ώρες, και μακροπρόθεσμες επιπτώσεις αυτής της επώασης αξιολογήθηκαν ως ικανότητα σχηματισμού σφαιρών σε μαλακό άγαρ μετά από 2 εβδομάδες. Σαράντα οκτώ και σαράντα έξι ενώσεις σε 5 μΜ μείωσε τους αριθμούς κλώνων που σχηματίζονται σε άγαρ σε ≤1% του ελέγχου σε DMBC11 και DMBC12 πληθυσμούς, αντίστοιχα (Εικ. 4 και το Σχ. S4 στο File SI). Όπως κλωνογόνων κυττάρων θα μπορούσε να διαιρούνται περισσότερο αργά, και η αποικία δεν θα μπορούσε να φθάσει στο κατάλληλο μέγεθος μέσα σε 2 εβδομάδες, για μερικές ενώσεις η καταμέτρηση των αποικιών έγινε μία εβδομάδα αργότερα. Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ του αριθμού των κλώνων που ελήφθησαν μετά από δύο και τρεις εβδομάδες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Τα κύτταρα επωάστηκαν σε μέσο που περιείχε την ένωση για 4 ώρες και στη συνέχεια αναπτύχθηκαν σε μαλακό άγαρ για 14 ημέρες με την παρουσία μέσου χωρίς φάρμακο. αποικίες κυττάρων κηλιδώνονται με κρύσταλλο ιώδες και μετρώνται. Οι ενώσεις ομαδοποιήθηκαν με βάση αντι-κλωνογόνων δράση τους εκφράζεται ως ποσοστό ελέγχου σε αγωγή με φορέα (0,05% DMSO). Τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα εις διπλούν. Δείτε το Σχήμα S4 στο αρχείο SI για ποσοτικά δεδομένα.

Η

Σύγκριση των βραχυπρόθεσμων και μακροπρόθεσμες επιδράσεις των δραστικών φυσικών ενώσεων για Κυττάρων Μελανώματος

Μετά την αρχική διαλογή πραγματοποιείται σε 5 μΜ, κάθε ένωση από την Natural Products Set II θα μπορούσε να ανατεθεί σε μία από τις πέντε κατηγορίες (Εικ. 5). Σαράντα έξι ενώσεις σε 5 μΜ δεν ήταν ενεργά σε οποιαδήποτε από τις απασχολούνται δοκιμασίες και στις δύο δοκιμαστεί πληθυσμούς. Είχαν εξαιρεθεί από περαιτέρω αναλύσεις. Ορισμένες από αυτές τις μη-δραστικές ενώσεις όπως κουρκουμίνη (27) ή ραπαμυκίνη (69) είναι καλώς χαρακτηρισμένα για αντικαρκινική δράση τους, αλλά προφανώς στα 5 μΜ δεν ήταν δραστικό έναντι κυττάρων μελανώματος αγκύρωση-ανεξάρτητη. Αρκετές ενώσεις ήταν ικανά να επάγουν κυτταρικό θάνατο μέσα στις πρώτες δύο ημέρες, και επιπλέον αποτελεσματικά εξαλειφθεί κυττάρων με κλωνογόνο δυναμικό. Οι ενώσεις αυτές θεωρήθηκαν ως πολύ ισχυροί, και οι δραστηριότητές τους, τόσο μη κλωνογόνο και κλωνογονική, μετρήθηκαν σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις στα ακόλουθα πειράματα. Δύο φάρμακα, ακτινομυκίνη D (105) και κυκλοφωσφαμίδη (117), αποκλείστηκαν από περαιτέρω ανάλυση, καθώς είναι πολύ καλά χαρακτηρισμένα για τους

in vitro

και

in vivo

αντικαρκινική δράση. Επιπλέον, παρθενολίδη (61) επίσης αποκλείεται, όπως λεπτομερή έκθεσή μας περιγράφει τις επιπτώσεις της στα κύτταρα μελανώματος αγκύρωση-ανεξάρτητη, δημοσιεύθηκε πρόσφατα [36]. Όπως δόθηκε προτεραιότητα σε ενώσεις που μείωσε τον αριθμό των κυττάρων του μελανώματος δείχνει αυτο-ανανέωση ικανότητας, επιλέγονται ενώσεις από την ομάδα των αντι-κλωνογονικού αλλά όχι ιδιαίτερα κυτταροτοξική επίσης αναλύθηκαν περαιτέρω.

Μετά την αρχική διαλογή, ενώσεις ομαδοποιήθηκαν βάση για τις δραστηριότητές τους. Μια ένωση ορίσθηκε ως αντι-κλωνογόνων όταν μειώνεται το ποσοστό των κλώνων που σχηματίζονται σε μαλακό άγαρ σε λιγότερο από 20% του ελέγχου σε αγωγή με φορέα (0,05% DMSO). Μία ένωση ονομάστηκε κυτταροστατική όταν μείωσε τον αριθμό βιώσιμων κυττάρων σε λιγότερο από 50% του ελέγχου χρησιμοποιώντας αριθμού βιώσιμων κυττάρων καταμέτρηση, και κυτταροτοξικών χρησιμοποιώντας την κυτταρομετρία ροής μετά ΡΙ-χρώση. Αριθμοί που αντιστοιχούν σε ενώσεις που συσσωρευμένα κύτταρα μελανώματος σε subG

1 είναι υπογραμμισμένες. Οι ενώσεις που προκάλεσε διακοπή του κυτταρικού κύκλου επισημαίνεται με πράσινο χρώμα για το G

0 /G

1 φάση, μπλε για τη φάση S και κόκκινο για το G

2 /M φάση. Αρκετές ενώσεις (46) δεν ήταν ενεργά σε κάθε δοκιμασία. Λίγοι ενώσεις ήταν κυτταροτοξική αλλά δεν επηρεάζεται σημαντικά τον αριθμό των αποικιών που σχηματίστηκαν σε άγαρ. Λίγες άλλες ενώσεις που ασκείται αποτελέσματά τους μόνο σε κλωνογόνων κυττάρων ή μειωμένη κλωνογενοποιήσεως κάτω από το 20% του ελέγχου, προκάλεσε κυτταροστατικά /κυτταροστατική δράση χωρίς να προκαλεί σημαντική κυτταρικό θάνατο. Αρκετές ενώσεις ήταν κυτταροστατικά και κυτταροτοξικά και επιπλέον αποτελεσματικά εξαλειφθεί κυττάρων με κλωνογόνο δυναμικό. Ήταν στο επίκεντρο της περαιτέρω μελέτη. Βλέπε Πίνακα S1 στο File SI για τα ονόματα των ενώσεων που αντιστοιχούν στους αριθμούς που φαίνεται στο σχήμα.

Η

Πρώτον, τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα των ισχυρών φυσικών ενώσεων επιβεβαιώθηκαν σε έξι κυτταρικές γραμμές που λαμβάνονται από ασθενή, συμπεριλαμβανομένων τεσσάρων επιπλέον κυτταρικές σειρές που προέρχονται από χειρουργικά δείγματα του οζώδες μελάνωμα, DMBC2, DMBC8, DMBC10 [15] και DMBC9 [36]. Συγκεντρώσεις των ενώσεων μειώθηκαν σε 1 μΜ και 0,1 μΜ, και σε ορισμένες περιπτώσεις σε 0.01 μΜ ή ακόμα και 0.001 μΜ, μέχρι IC

50 αποτέλεσμα επετεύχθη (Πίνακας S2 σε File SI). Σε γενικές γραμμές, μόνο μικρές διαφορές μεταξύ των αποκρίσεων των κυττάρων μελανώματος από διαφορετικούς πληθυσμούς DMBC ήταν ορατές σε συγκεντρώσεις φαρμάκου 1 μΜ και 0,1 μΜ. κύτταρα DMBC8 φάνηκε να είναι λιγότερο ευαίσθητη σε αρκετές ενώσεις από άλλους πληθυσμούς.

Στη συνέχεια, οι καμπύλες δόσης-απόκρισης παρασκευάστηκαν για 45 ενώσεις που ασκούν ισχυρή αντι-κλωνογόνων ή /και κυτταροτοξικά δυναμικά (Εικ. 6 και Σχ. S5 σε SI αρχείου). Με βάση τις καμπύλες δόσης-απόκρισης, η κατάταξη κατάλογος των πιο ισχυρών ενώσεων από την Natural Products Set II παρασκευάστηκε (Πίνακας 1). Αντι-κλωνογονικού δραστηριότητα κατατάσσονται πάνω από κυτταροτοξική δράση. IC

50 τιμές των επτά ενώσεων ήταν κάτω από 0,1 μΜ όταν αξιολογήθηκε η επίδραση του φαρμάκου στην ικανότητα σχηματισμού κλώνων σε μαλακό άγαρ. Μεταξύ αυτών των ενώσεων, μεϋτανσίνη (60) που ασκείται μια ισχυρότερη συνολική κυτταροτοξική επίδραση από αντι-κλωνογόνο αποτέλεσμα, στρεπτονιγρίνη (32), toyocamycin (108), κολχικίνη (1) και echinomycin Α (102) είχαν παρόμοια ισχύ και στις δύο δραστηριότητες, ενώ nanaomycin A (74) και ιλλουδίνη Μ (114) ήταν περισσότερο ισχυρά στην εξάλειψη κύτταρα με το κλωνογόνο δυναμικό από ό, τι η μείωση της βιωσιμότητας κατά την βραχυπρόθεσμη επώαση. Παρόμοια φαινόμενα παρατηρήθηκαν για αρκετές ενώσεις οι οποίες ήταν αποτελεσματικές σε υψηλότερες συγκεντρώσεις. Για παράδειγμα, το IC

50 τιμές για αντι-κλωνογόνο ενώσεις, βρυοστατίνη 1 (112), siomycin Α (107), fumitremorgin C (118), fumagallin (120) μιχελαμίνη Β (101) και πεντοξιφυλλίνη (100) ήταν σε το εύρος 0,1 – 1 μΜ στην κλωνογονική δοκιμασία αλλά στην κλίμακα 1 -. 5 μΜ στην δοκιμασία βιωσιμότητας

οι καμπύλες δόσης-απόκρισης παρασκευάστηκαν για ενώσεις που εμφανίζουν υψηλή αντι-κλωνογόνων ή /και κυτταροτοξικά δυναμικό. Μπλε καμπύλες, αντι-κλωνογόνο δραστηριότητα? μαύρο καμπύλες, κυτταροτοξική δράση. Τα γραφήματα συνόψισε τα αποτελέσματα τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν με τη χρήση DMBC11 (γεμάτο τετράγωνο) και DMBC12 (ανοικτό τετράγωνο) κυτταρικές σειρές. Οι χημικοί τύποι των δοκιμαζόμενων ενώσεων συμπεριλαμβάνεται. Οι καμπύλες δόσης-απόκρισης για λιγότερο ισχυρές ενώσεις φαίνονται στην Εικόνα S5 στο File SI.

Η

επαγωγή απόπτωσης σε μελάνωμα κύτταρα που εκτίθενται σε Επιλεγμένες ενώσεις

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής αννεξίνης V /ΡΙ-χρώση κυττάρων αποκάλυψε ότι υψηλά κυτταροτοξικές ενώσεις απόπτωση που επάγεται σε κύτταρα του μελανώματος, ενώ οι ενώσεις εξάλειψη κυρίως κύτταρα με την ικανότητα να σχηματίζουν κλώνους (πίνακας 1) δεν ενεργοποιούν την απόπτωση σε συγκεντρώσεις αποτελεσματικές για την αντι-κλωνογόνο τους δραστηριότητα (Εικ. 7) . Για παράδειγμα, μεϋτανσίνη (60) επήγαγε απόπτωση στην πλειονότητα των κυττάρων στην συγκέντρωση τόσο χαμηλή όσο 0.01 μΜ. Αντιθέτως, nanaomycin Α (74), η οποία στο 0,1 μΜ εξαλειφθεί σχεδόν πλήρως κυττάρων με κλωνογόνο δυναμικό δεν προκάλεσε απόπτωση σε αυτή τη συγκέντρωση.

Διέγερση απόπτωσης προσδιορίσθηκε με κυτταρομετρία ροής μετά χρώση αννεξίνης V /ιωδιούχο προπίδιο . Τυπικές γραφικές παραστάσεις περιγράμματος των κυττάρων μελανώματος σε επεξεργασία με ενώσεις σε συγκεντρώσεις που δείχνονται υποδεικνύεται. Εικόνα S2. Εικόνα S3. Πίνακας S2. Πίνακας S3.