Αφηρημένο

Ορισμένες ογκολυτικούς ιοί εκμεταλλεύονται ενεργοποιημένη Ras σηματοδότησης με σκοπό την αναπαραγωγή των καρκινικών κυττάρων. Συστατική ενεργοποίηση της οδού της Ras /MEK είναι γνωστό ότι καταστέλλει την αποτελεσματικότητα της αντι-ιική απόκριση ιντερφερόνης (IFN), η οποία μπορεί να συμβάλει στην ιική ογκόλυσης Ras-εξαρτώμενη. Εδώ, ταυτοποιήσαμε 10 ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών (από τα 16) με αυξημένη ευαισθησία σε αντι-ιικές επιδράσεις της ΙΡΝ-α μετά τη θεραπεία με τον αναστολέα U0126 ΜΕΚ, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο /ΜΕΚ οδού Ras κρύβεται μειωμένη ευαισθησία τους σε IFN. Για να προσδιοριστεί πως Ras /ΜΕΚ καταστέλλει την απόκριση IFN στα κύτταρα αυτά, χρησιμοποιήσαμε μικροσυστοιχίες DNA για σύγκριση ΙΡΝ-επαγόμενη μεταγραφή σε IFN-ευαίσθητα κύτταρα SKOV3, μετρίως ανθεκτικών κυττάρων ΗΤ1080 και των κυττάρων ΗΤ1080 σε επεξεργασία με U0126. Βρήκαμε ότι 267 γονίδια που επάγονται από IFN στα κύτταρα SKOV3, ενώ μόνο 98 γονίδια επάγονται σε κύτταρα ΗΤ1080 στο ίδιο χρονικό σημείο. Επιπλέον, η έκφραση ενός ξεχωριστού υποσύνολο IFN επαγώγιμων γονιδίων, που περιλάμβανε RIGI, GBP2, IFIT2, BTN3A3, ΜΑΡ2, ΜΜΡ7 και STAT2, αποκαταστάθηκε ή αυξημένη σε κύτταρα ΗΤ1080 όταν τα κύτταρα συν-θεραπεία με U0126 και IFN. Βιοπληροφορική ανάλυση των βιολογικών διεργασιών που αντιπροσωπεύεται από αυτά τα γονίδια αποκάλυψε αυξημένη εκπροσώπηση των γονιδίων που εμπλέκονται στην αντι-ιική απόκριση, ρύθμιση της απόπτωσης, τη διαφοροποίηση των κυττάρων και το μεταβολισμό. Επιπλέον, η εισαγωγή μόνιμα ενεργών Ras σε IFN κύτταρα ευαίσθητα SKOV3 μειωμένη ευαισθησία IFN τους και την ικανότητα να ενεργοποιούν IFN-προκαλούμενη μεταγραφή. Αυτή η εργασία αποδεικνύει για πρώτη φορά ότι ενεργοποιημένο Ras /ΜΕΚ σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα επάγει αρνητική ρύθμιση ενός συγκεκριμένου υποσυνόλου των γονιδίων ΙΡΝ-επαγώγιμων

Παράθεση:. Christian SL, Zu D, Licursi Μ, Komatsu Υ, Pongnopparat T , Codner DA, et al. (2012) Καταστολή της IFN-Induced Μεταγραφή κρύβεται πίσω από IFN Ελαττώματα που δημιουργούνται από τα ενεργοποιημένα Ras /ΜΕΚ σε ανθρώπινα κύτταρα του καρκίνου. PLoS ONE 7 (9): e44267. doi: 10.1371 /journal.pone.0044267

Επιμέλεια: Elankumaran Subbiah, Virginia Polytechnic Institute και το State University, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 18, 2012? Αποδεκτές: 31 Ιούλη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 7 του Σεπτεμβρίου του 2012

Copyright: © Christian et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την καναδική Ινστιτούτα Ερευνών Υγείας (www.cihr-irsc.gc.ca), αριθμοί επιχορήγηση MOP74429 και ROP99020. SLC υποστηρίχθηκε από ένα βραβείο εκπαιδευόμενου από την Beatrice Hunter Cancer Research Institute με κεφάλαια που παρέχονται από τον Καρκίνο Ερευνητικό Πρόγραμμα Εκπαίδευση ως μέρος του Terry Fox Foundation Στρατηγικό Πρόγραμμα Ερευνών Υγείας Εκπαίδευσης στο Cancer Research στο CIHR (www.bhcri.ca). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Oncolytic ιός αντιγράφεται ειδικά σε καρκινικά κύτταρα, αλλά όχι σε φυσιολογικά κύτταρα, με την αξιοποίηση των διαφορών στην ενδοκυτταρικό περιβάλλον του κυττάρου όγκου που προάγει ανώμαλη κυτταρική ανάπτυξη [1], [2], [3], [4] . Συστατική ενεργοποίηση της Ras σηματοδότησης αρχικά αναφέρθηκε ότι πρέπει να χρησιμοποιείται από ογκολυτικού ρεοϊό να αυξήσει ικανότητα αντιγραφής του [5]. Μετά την ανακάλυψη του ρεοϊού ογκόλυσης, άλλους ιούς, όπως ο ιός του απλού έρπητα άγριου τύπου (HSV) [6], ιός φυσαλιδώδους στοματίτιδας (VSV) [4], τον ιό της γρίπης (στέλεχος delNS 1) [7], αδενοϊό (VAI μεταλλαγμένο) [ ,,,0],8], ιού πολιομυελίτιδας [9], και τον ιό της νόσου του Newcastle [10] βρέθηκαν να παρομοίως εκμεταλλεύονται ενεργοποιημένο Ras οδού σηματοδότησης για ογκόλυσης. Ras είναι μία πρωτεΐνη σύνδεσης GTP δεσμεύονται μεμβράνη που λειτουργεί ως μοριακός διακόπτης για την ενεργοποίηση καθοδικών πορειών για να ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και τον μετασχηματισμό [11]. Στην κανονική οδό Ras, GTP-δεσμεύεται Ras ενεργοποιεί κατάντη μεσολαβητή του, την κινάση Raf. Η ενεργοποιημένη Raf στη συνέχεια φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί τις ΜΕΚ1 /2 κινάσες, οι οποίες φωσφορυλιώνουν και ενεργοποιούν το εξωκυτταρικό σήμα ρυθμίζεται κινάσης (ERK) 1 και 2. ERK1 /2, τότε μπορούν να ενεργοποιήσουν ή να αναστέλλουν παράγοντες μεταγραφής για να προάγουν την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό κυττάρων [12]. Οι μεταλλάξεις Ενεργοποίηση του Ras έχουν βρεθεί σε περίπου 30% όλων των ανθρώπινων όγκων [13]. Επιπλέον, εν απουσία του δραστικού μετάλλαξης της Ras, Ras οδός συχνά ενεργοποιείται με ακατάλληλο τρόπο ενεργοποίηση των ανάντη συστατικών σηματοδότησης του, όπως ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα, HER2 /neu και Src [14].

Πολλαπλές κυτταρική οι μηχανισμοί που βρίσκονται πίσω από την εξαρτώμενη από ιογενή ογκόλυσης Ras έχουν εντοπιστεί. Η αναστολή της αντιικής διπλής δέσμης RNA ενεργοποιημένης πρωτεΐνης κινάσης (PKR) από Ras περιγράφηκε αρχικά ως ένα σημαντικό μηχανισμό για την αντιγραφή του ιού ογκολυτική σε κύτταρα όγκου [5], [6]. Έχει επίσης δειχθεί ότι ενεργοποιημένα Ras προάγει την απόδυση και την απελευθέρωση του ογκολυτικού ρεοϊού η οποία αυξάνει την παραγωγή ιών απογόνων [15]. ενεργοποίηση του Ras ενισχύει επίσης την αποτελεσματικότητα του καλύμματος-ανεξάρτητη μετάφραση ογκολυτικού ιού της πολιομυελίτιδας [9]. Επιπλέον, έχουμε και μια άλλη ομάδα έχουν αναφέρει ότι η ενεργοποίηση του μονοπατιού Ras μπορεί να αποτρέψει αποτελεσματικά την ενεργοποίηση του ιντερφερόνης τύπου Ι (IFN) αντι-ιική απόκριση σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα και κύτταρα ινοβλαστών ποντικού [16], [17], [18], υποδηλώνοντας ότι το ελάττωμα του απόκριση IFN επάγεται από ενεργοποιημένο Ras είναι ένας από τους κοινούς μηχανισμούς της ιογενούς ογκόλυσης.

IFNs εκκρίνονται κυτοκίνες που έχουν πολλαπλές επιδράσεις στο σώμα συμπεριλαμβανομένων των αντι-ιικές, αντι-πολλαπλασιαστικές και ανοσορρυθμιστικές ρόλους. Ως εκ τούτου, οι IFNs χρησιμοποιούνται στη θεραπεία των ιογενών ασθενειών όπως η λοίμωξη από τον ιό της ηπατίτιδας C, θεραπεία του καρκίνου και της πολλαπλής σκλήρυνσης. IFN δεσμεύεται στον υποδοχέα της IFN-α (IFNAR) [19] που οδηγεί στην ενεργοποίηση των δύο κινασών τυροσίνης, Janus κινάση 1 (Jak1) και κινάσης τυροσίνης 2 (Tyk2) που συνδέονται με την IFNAR [20], [21]. Jak1 και Tyk2 συνέχεια φωσφορυλιώνει μετατροπέα σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής (STAT) 1 και STAT2, η οποία στη συνέχεια συνδέουν με την πρωτεΐνη δέσμευσης DNA ΙΡΝ ρυθμιστικό παράγοντα 9 (IRF9), για να σχηματίσει ένα heterotrimeric παράγοντα μεταγραφής που ονομάζεται ΙΡΝ-διεγερμένα παράγοντας γονιδίου 3 (ISGF3) [22], [23]. Η δέσμευση του ISGF3 προς το στοιχείο απόκρισης ΙΡΝ-διεγερμένα (ISRE) στις υποκινητές της IFN-επαγώγιμων γονιδίων επάγει την έκφραση εκατοντάδων γονιδίων συλλογικά γνωστά ως IFN-διεγερμένα γονίδια (ISG), πολλά από αυτά με αντι-ιική, αντι-πολλαπλασιαστικές και ανοσορρυθμιστικές λειτουργίες [24]. Ωστόσο, η αποτελεσματικότητα της IFN μπορεί να περιοριστεί με αντι-ΙΡΝ πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από ιικά γονιδιώματα ή από ενδογενή κυτταρικά καταστολείς ρυθμίζουν IFN σηματοδότηση [21].

Προηγουμένως, δείξαμε ότι ένας ευαίσθητος ιός IFN, VSV, ήταν ικανός να ανατυπώνεται σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 με ενεργοποιημένο Ras /ΜΕΚ ενώ IFN απέτρεψε μόλυνση ελέγχου ΝΙΗ3Τ3 κυττάρων [16]. Noser et. al. [25] ανέφεραν επίσης ότι η αναστολή της Ras /ΜΕΚ σε ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές καρκίνου αποκατασταθεί αντιϊκή αποκρίσεις που επάγονται από IFN. Αυτές οι μελέτες αποδεικνύουν σαφώς ότι η ενεργοποίηση Ras /MEK διέπει IFN δυσλειτουργία σε καρκινικά κύτταρα. Σε μια μελέτη παρακολούθησης, βρήκαμε ότι ενεργοποιημένο Ras /ΜΕΚ κατέστειλε την μεταγραφή του STAT2, η οποία είναι μία από τις βασικές συνιστώσες IFN σηματοδότησης [17]. IFN-μεσολάβηση προστασία έναντι της λοίμωξης από τον ιό ήταν μόνο εν μέρει αποκαταστάθηκε το RasV12 μετασχηματισμένα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 με υπερέκφραση του STAT2. Ωστόσο, όταν η οδού Ras /MEK ανεστάλη από τον αναστολέα U0126 ΜΕΚ σε κύτταρα RasV12, IFN ήταν εξίσου αποτελεσματικό στην επαγωγή αντι-ιική απόκριση όπως σε κύτταρα ελέγχου φορέα. Ως εκ τούτου, είναι απίθανο ότι η προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης STAT2 είναι ο μοναδικός μηχανισμός που εμπλέκεται στην καταστολή διαμεσολαβείται IFN Ras /MEK. Εδώ, για τον εντοπισμό περαιτέρω ο μηχανισμός της Ras-διαμεσολαβούμενη αναστολή της απόκρισης IFN, αναλύσαμε την εμπλοκή του Ras /ΜΕΚ οδού στη ρύθμιση IFN-επαγόμενη μεταγραφή σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές.

Αποτελέσματα

Ευαισθησία ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών γραμμών με την IFN-επαγόμενης αντιική ανταπόκριση

Αρχικά, επιλέξαμε 16 καρκινικές κυτταρικές σειρές που προέρχονται από διαφορετικούς τύπους όγκων (3 μαστού, του τραχήλου της μήτρας 1, 4 κόλον, 1 ινοσάρκωμα, μελάνωμα 2 , 3 ωοθηκών και του προστάτη 2 κυτταρικές σειρές) και μετράται ανταπόκρισής τους στις αντι-ιική δράση που προκαλείται από IFN. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με IFN (0, 10, 50, 100, 500, 1000 και 5000 U /ml) για 16 ώρες και στη συνέχεια προκλήθηκαν με VSV σε μία πολλαπλότητα μόλυνσης (ΜΟΙ) 1 για 24 ώρες. Το συνολικό επίπεδο των ογκόλυσης εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας χρώση κρυσταλλικό ιώδες. Με βάση την αποτελεσματική δόση (κυτοπαθικό αποτέλεσμα (CPE) 50) του IFN, η οποία ορίζεται ως η αποτελεσματική συγκέντρωση IFN που προκαλεί μια 50% προστασία έναντι της μόλυνσης VSV, οι κυτταρικές γραμμές χωρίζονται στις ακόλουθες τρεις ομάδες: IFN ευαίσθητος: κυτταρικές γραμμές με CPE50 μικρότερη από 10 U /ml, ΙΡΝ μέτρια ανθεκτικό: κυτταρικές γραμμές με CPE50 μεταξύ 10 έως 5000 U /ml, και IFN πλήρως ανθεκτικά: κυτταρικές σειρές με CPE50 πάνω από τη μέγιστη συγκέντρωση της IFN που εξετάσαμε (5000 U /ml) (Εικ . 1). Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, τρεις κυτταρικές γραμμές (HeLa, SKBR3 και SKOV3) ήταν ευαίσθητα στην IFN, ενώ 9 κυτταρικές σειρές (Α375, DLD-1, ΗΤ29, HTB129, ΗΤ1080, MCF-7, MDAH, MDA-ΜΒ468 και SW48) έδειξε μέτρια αντίσταση στη θεραπεία IFN. Σε αντίθεση, 4 κυτταρικές σειρές (DU145, HCT116, LNCaP και PA-1) δεν ανταποκρίθηκε στην IFN εντός του εύρους συγκέντρωσης IFN εξετάστηκε.

IFN ευαίσθητα (Α), μέτρια ανθεκτικό (Β) και πλήρως ανθεκτική κυτταρικές γραμμές (C) ταυτοποιήθηκαν με προκατεργασία κυττάρων με IFN (0, 10, 50, 100, 500, 1000 και 5000 U /ml) για 16 ώρες και στη συνέχεια προκλήθηκαν με VSV σε ΜΟΙ 1 για 24 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας χρώση κρυσταλλικού ιώδους και εκφράζονται ως μέσο ποσοστό σε σύγκριση με μη μολυσμένα φρεάτια ελέγχου (n = 3 φρεάτια). Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα παρουσιάζεται.

Η

Αποκατάσταση της IFN ευαισθησίας από ΜΕΚ Αναστολή στην IFN Μέτρια ή είναι εντελώς ανθεκτικές γραμμές Cancer Cell

επόμενο καθοριστεί αν η ενεργοποίηση των Ras /ΜΕΚ μονοπάτι μειώνει IFN-επαγόμενης αντιιική απόκριση στην IFN μέτρια ή πλήρως ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές καρκίνου. IFN ευαισθησίες των κυτταρικών γραμμών εξετάστηκαν με την παρουσία ενός αναστολέα ΜΕΚ U0126. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με IFN (0, 12.5, 25, 50, 200, 500 και 2000 U /ml) και U0126 (0, 2,5, 5, 10 και 20 μΜ) για 16 ώρες και στη συνέχεια προκλήθηκαν με VSV σε ΜΟΙ 1 για 24 ώρες. Η μόλυνση ήταν ποιοτικά αξιολογήθηκε με ανάλυση Western blot της ιικής πρωτεΐνης VSV-G. Η αποτελεσματικότητα των U0126 στην αναστολή της ΜΕΚ επαληθεύτηκε με ανάλυση της φωσφορυλίωσης ERK, ο πρωταρχικός στόχος της ΜΕΚ [13]. αναστολή ΜΕΚ αύξησε την ευαισθησία των 10 καρκινικών κυτταρικών σειρών σε IFN (Α375, DLD-1, DU145, HCT116, ΗΤ1080, ΗΤ29, HTB129, MDA468, MDAH και ΡΑ-1) (αποκρίνεται κυτταρικές U0126 γραμμές), αλλά δεν είχε καμία επίδραση σε 3 καρκινικές κυτταρικές σειρές (LnCap, MCF7 και SW48) (U0126 δεν αποκρίνονται κυτταρικές γραμμές) (Εικ. 2 και το Σχ. S1). Για παράδειγμα, VSV αντιγραφεί σε κύτταρα ΗΤ1080 παρουσία IFN (50 και 200 ​​U /ml), ενώ αντιγραφή VSV αναστάλθηκε σε κύτταρα επεξεργασμένα με την ίδια ποσότητα της IFN σε συνδυασμό με θεραπεία U0126 (Εικ. 2Α). κύτταρα ΗΤ1080 επίσης είχε ελαφρώς μειωμένη μόλυνση VSV με την παρουσία και μόνο 20 μΜ U0126. Ομοίως, IFN-που προκαλείται από την αντιική ανταπόκριση αποκαταστάθηκε το ΗΤ29, HCT116 και MDAH κύτταρα όταν ο /οδός ΜΕΚ Ras αναστέλλεται από U0126. Σε αντίθεση, δεν παρατηρήσαμε την αποκατάσταση της IFN-επαγόμενης αντιιική απόκριση σε οποιοδήποτε συνδυασμό των συγκεντρώσεων της U0126 και IFN στα κύτταρα LnCap και MCF7 γεγονός που υποδηλώνει ότι η αντίσταση IFN τους ρυθμίζεται από κυτταρικούς παράγοντες εκτός από ενεργοποιημένο Ras /ΜΕΚ οδό. Η ίδια ανάλυση πραγματοποιήθηκε για να εξεταστεί η προώθηση της IFN-επαγόμενης αντιιική απόκριση στις άλλες κυτταρικές γραμμές (Α375, DLD-1, DU145, HTB129, MDA468, ΡΑ-1 και SW48) (Σχ. S1).

(Α) οι κυτταρικές σειρές μολύνθηκαν με VSV (ΜΟΙ = 1) για 24 ώρες μετά τη θεραπεία με IFN (0-5000 U /ml) με ή χωρίς U0126 (0-20 μΜ) για 16 ώρες. Η ανάλυση στυπώματος Western χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει ιική πρωτεΐνη (VSV-G) επίπεδα, το επίπεδο της φωσφορυλιωμένης ERK (ρ-ERK) με GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα δείγματα αναλύθηκαν σε δύο μεμβρανών ταυτόχρονα χρησιμοποιώντας τις ίδιες συνθήκες για την επώαση και την ανίχνευση. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από 3 φαίνεται. (Β) Viral παραγωγή απογόνων προσδιορίστηκε μετά από μόλυνση με VSV (ΜΟΙ = 1) για 24 ώρες μετά την αγωγή με IFN (50 ή 2000 U /ml) και με U0126 (0, 5, 10 ή 20 μΜ) για 16 ώρες.

Η αποκατάσταση των αντι-ιική απόκριση με αναστολή ΜΕΚ στις τέσσερις κυτταρικές σειρές U0126 αποκρίνονται επιβεβαιώθηκε με δοκιμασία απογόνους του ιού (Σχ. 2Β). κύτταρα ΗΤ1080, μολύνθηκαν με VSV, έδειξαν μια σημαντική μείωση της παραγωγής απογόνων ιών με συνδυασμένη θεραπεία με IFN (50 U /ml) και όλα συγκέντρωση U0126 (5, 10 και 20 μΜ). Επιπλέον, U0126 (20 μΜ) μόνο έδειξε μια μικρή αλλά στατιστικά σημαντική μείωση στο ιικό απογόνους. Στις άλλες κυτταρικές γραμμές (ΗΤ29, HCT116 και MDAH), η συνδυασμένη θεραπεία IFN και U0126 παρουσίασαν σημαντική και στατιστικά σημαντική μείωση της παραγωγής ιικών απογόνων σε σύγκριση με IFN μόνο ή U0126 μόνο θεραπεία υποδεικνύοντας αυξημένη αποκρισιμότητα σε ΙΡΝ κατόπιν αναστολή ΜΕΚ.

Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η ενεργοποίηση του μονοπατιού Ras /MEK καταστέλλει δραστηριότητες ΙΡΝ-επαγόμενη κατά ιών σε ορισμένες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Εμείς δεν βρήκε καμία συσχέτιση μεταξύ είτε IFN ανταπόκρισης ή U0126 ανταπόκριση και τύπους καρκινικών κυττάρων.

Επίδραση των Ras /ΜΕΚ Αναστολή για IFN-επαγόμενη μεταγραφή

Για να μελετήσουν πώς ενεργοποιείται Ras /ΜΕΚ καταστέλλει την IFN απόκριση σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα, πραγματοποιήσαμε ανάλυση παγκόσμια έκφραση γονιδίων και ταυτοποιημένα γονίδια με στατιστικά αυξημένη έκφραση σε σύγκριση με το μη επεξεργασμένο ώρα αντιστοίχιση ελέγχου (βλέπε πληροφορίες υποστήριξης [File S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7] για πλήρεις κατάλογοι διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων). Πρώτον, συγκρίναμε την έκφραση της IFN επαγώγιμων γονιδίων σε IFN κύτταρα ευαίσθητα SKOV3 και μετρίως ανθεκτικών κυττάρων ΗΤ1080 (Εικ. 3Α). Κατά τη διέγερση IFN για 6 ώρες, 267 γονίδια αυξορρυθμίζεται SKOV3 κυττάρων, ενώ μόνο 98 γονίδια επάγονται σε κύτταρα ΗΤ1080. Εβδομήντα γονίδια επάγονται συνήθως σε τόσο SKOV3 και τα κύτταρα ΗΤ1080 ενώ 197 IFN επαγώγιμων γονιδίων ρυθμίζεται αυξητικά μόνο σε κύτταρα SKOV3 και 28 IFN επαγώγιμων γονιδίων μόνο σε κύτταρα ΗΤ1080. Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι η ΙΡΝ-επαγόμενη μεταγραφή καταστέλλεται σε IFN μετρίως ανθεκτικά κύτταρα ΗΤ1080 σε σύγκριση με IFN κύτταρα ευαίσθητα SKOV3.

(Α) διαγράμματα Venn από ανάλυση μικροσυστοιχιών DNA που δείχνει την παγκόσμια καταστολή της IFN-ρυθμιζόμενα γονίδια σε κύτταρα ΗΤ1080 σε σύγκριση να SKOV3 κύτταρα. Ορατή είναι ο αριθμός των γονιδίων σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω (FDR & lt? 0.01) στις 6 ώρες μετά την αγωγή IFN στις κυτταρικές γραμμές SKOV3 έναντι ΗΤ1080. (Β) διαγράμματα Venn δείχνει τον αριθμό των γονιδίων σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω (FDR & lt? 0,01) σε κύτταρα ΗΤ1080 μετά από θεραπεία με IFN, U0126 ή και τα δύο IFN και U0126 για 6 ώρες ή 12 ώρες όπως υποδεικνύεται. (C) διαγράμματα Venn σύγκριση των γονιδίων απορυθμίζεται από το «προστατευτικό» θεραπείες σε κάθε κυτταρικό τύπο (IFN για τα κύτταρα SKOV3 και IFN /U0126 για τα κύτταρα ΗΤ1080).

Η

Στη συνέχεια, προσδιορίζεται κατά πόσον η αναστολή της Ras /ΜΕΚ θα μπορούσε αλλάξει την μεταγραφική απόκριση των κυττάρων ΗΤ1080 σε IFN. IFN μόνο θεραπεία ενεργοποιείται μεταγραφή του 98 γονιδίων στις 6 ώρες και 167 γονίδια σε 12 ώρες, ενώ U0126 μόνο θεραπεία επαγόμενη έκφραση των γονιδίων 636 στις 6 ώρες και 97 γονίδια σε 12 ώρες (Εικ. 3Β). Συνδυασμένη θεραπεία της IFN και U0126 επαγόμενη μεταγραφή γονιδίων 652 στις 6 ώρες και 354 γονίδια σε 12 ώρες. Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι ενεργοποιημένα ΜΕΚ καταστέλλει IFN-επαγόμενη μεταγραφή σε IFN μέτρια ανθεκτικό ΗΤ1080 κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε 111 γονίδια στις 6 ώρες (Πίνακας S1) και 135 γονίδια σε 12 ώρες (Πίνακας S2) ήταν σημαντικά προκαλείται από τη συνδυασμένη θεραπεία με IFN και U0126 ενώ είτε μόνη θεραπεία δεν προκαλεί την έκφραση, αποδεικνύοντας αληθινή συνεργιστική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης από IFN και Ras /ΜΕΚ καταστολή. Αυτά τα γονίδια περιλαμβάνουν μεσολαβητές της αντι-ιικής λειτουργία (π.χ.. Apobec3 [26], IFIT2 [27], [28], [29], RSAD2 (viperin) [30], GBP2 [31] και ΜΑΡ2 [32], [33 ], [34]), ενεργοποιητές της αντι-ιική μεταγωγή σήματος, (π.χ.. RIGI [35]), ρυθμιστές της επεξεργασίας και παρουσίασης αντιγόνων (π.χ.. IFI30 (GILT) [36], BTN3A3 [37] και PSME1 [38] ), και ρυθμιστές της ογκογένεσης (π.χ.. ΜΜΡ7 [39]). Από VSV αναπαραχθεί περισσότερο από 30 φορές λιγότερο αποτελεσματικά σε κύτταρα ΗΤ1080 σε επεξεργασία με IFN και U0126 σε σύγκριση με εκείνους που έλαβαν θεραπεία με IFN μόνο ή U0126 μόνο (Σχ. 2Β), πιστεύουμε ότι κάποια από τα γονίδια που ρυθμίζονται από τα συνδυασμένης θεραπείας σε κύτταρα ΗΤ1080 (111 γονίδια στις 6 ώρες 135 γονίδια σε 12 ώρες) έχει μια σημαντική λειτουργία αντι-ιικό. Στη συνέχεια συνέκριναν τα γονίδια που επάγεται σε ΗΤ1080 από τη συνδυασμένη θεραπεία της IFN και U0126 σε εκείνους που επάγεται σε κύτταρα SKOV3 με IFN αγωγή μόνο να μειωθεί περαιτέρω κάτω ποια γονίδια μπορεί να είναι οι βασικές γονίδια αναγκαία για μία προστατευτική αντι-ιική απόκριση IFN (Σχ. 3C ). Βρήκαμε ότι 36 γονίδια συνήθως επάγονται στις 6 ώρες, και 26 γονιδίων στις 12 ώρες, στις δύο πειραματικές ομάδες (Πίνακας S3).

Gene οντολογία (GO) ανάλυση διεξήχθη για να προσδιοριστεί η βιολογική διεργασία που σχετίζεται με τα γονίδια που ταυτοποιούνται ως αλλάξει σημαντικά σε κύτταρα ΗΤ1080 σε επεξεργασία με IFN μόνο, U0126 μόνο, και τα δύο IFN και U0126 (Πίνακας 2 και Σχ. 4). Η θεραπεία με μόνο U0126 ή και τα δύο IFN και U0126 για 6 ώρες συγκεντρωμένα υποδεικνύοντας ότι αυτές οι θεραπείες άλλαξε την έκφραση των γονιδίων με παρόμοιες λειτουργίες (GO υπερ-εκπροσώπηση). Ομοίως, οι θεραπείες 12 ώρα με μόνη U0126 ή τη συνδυασμένη θεραπεία οδήγησε σε πιο παρόμοιες GO υπερεκπροσώπηση ομάδες. IFN-μόνο ομάδες θεραπείας (6 και 12 ώρες) συγκεντρωμένοι πιθανόν επειδή ένας σχετικά μικρός αριθμός των κατηγοριών GO άλλαξε σε σύγκριση με τις άλλες ομάδες θεραπείας. Συνολικά, τα γονίδια έπεσε σε 312 κατηγορίες GO που συνδέθηκαν με 3 GO υπερ-εκπροσώπηση συστάδες όπου σύμπλεγμα 3 θα μπορούσαν να διαιρεθούν περαιτέρω σε 11 υπο-ομάδες. Clusters 1, 3Α, 3Β, 3D και 3I έδειξαν αυξημένη πάει πάνω-εκπροσώπηση σε απάντηση σε συνδυασμό U0126 και θεραπεία IFN σε σύγκριση με οποιαδήποτε μόνη θεραπεία. Αυτά τα συμπλέγματα περιλαμβάνεται GO κατηγορίες που σχετίζονται με ΝΡ-κΒ σηματοδότηση, αντι-ιική απόκριση, ανοσοαπόκριση, ρύθμιση της απόπτωσης, σηματοδότηση χημειοκίνης, κυτταρική ανάπτυξη, και τον μεταβολισμό. Αντίθετα, συμπλέγματα 3C, 3Ε, 3F, 3Η και 3Κ είχε μειώσει τις κατηγορίες GO-over-αντιπροσώπευση κατόπιν συνδυασμένη θεραπεία, υποδεικνύοντας ότι η προσθήκη της διέγερσης IFN ως αποτέλεσμα την απώλεια της γονιδιακής ρύθμισης των γονιδίων που ανήκουν σε GO κατηγορίες που σχετίζονται με κινητικότητα κυττάρου, επιδιόρθωση του DNA και την κυτταρική διαίρεση. Ως εκ τούτου, η αναστολή της ΜΕΚ αλλάζει τους τύπους των γονιδίων που μπορεί να επαχθεί με αγωγή IFN εκτός από την αύξηση του συνολικού αριθμού των γονιδίων που προκαλείται.

Η

Γονίδια με σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω ή προς τα κάτω ρυθμισμένη επίπεδα έκφρασης σε σύγκριση με τον έλεγχο αναλύθηκαν για υπερ-αντιπροσώπευση της κατηγορίας GO σε σύγκριση με αυτή που παρατηρείται στο γονιδίωμα. Σημαντικά υπερεκπροσωπούνται κατηγορίες GO (FDR & lt? 0,05) εμφανίζονται με την υψηλότερη FDR = 0 φαίνεται στο κόκκινο και κατηγορίες με FDR ≥0.05 ή απουσιάζει εμφανίζεται σε μπλε χρώμα

Η

Μαζί, αυτές οι αναλύσεις δείχνουν ότι. ο οδού Ras /MEK καταστέλλει την έκφραση του ISGs εμπλέκονται στην αντι-ιική απόκριση σε πολλαπλά επίπεδα συμπεριλαμβανομένης της ανίχνευσης των προτύπων που σχετίζονται παθογόνου, η ενεργοποίηση του καταρράκτη αντι-ιικό σηματοδότησης και άμεση γονίδια τελεστή αντι-ιικά.

Επικύρωση Αποκατάσταση IFN επαγόμενη Gene Expression με ΜΕΚ Αναστολή

Ποσοτική RT-PCR (RT-qPCR) διεξήχθη για να επιβεβαιώσει τις αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση που παρατηρείται στην ανάλυση μικροσυστοιχιών χρησιμοποιώντας κύτταρα ΗΤ1080 σε επεξεργασία με IFN και /ή U0126 (Εικ. 5 ). επέλεξε οκτώ γονίδια (IFIT2, GBP2, ΜΑΡ2, RIGI, STAT2, BTN3A3, ΜΜΡ7 και ID2) βασίστηκαν σε βιολογικές λειτουργίες τους και τις μεταβολές της γονιδιακής έκφρασης σε απόκριση IFN ή /και τη θεραπεία U0126. IFIT2, GBP2, ΜΑΡ2 και ΜΜΡ7 ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω μόνο σε κύτταρα ΗΤ1080 σε επεξεργασία με αμφότερα U0126 και ΙΡΝ στις 6 ώρες, ενώ η επαγωγή του γονιδίου παρατηρήθηκε σε IFN μόνο και μόνο U0126 ομάδες στο μεταγενέστερο χρονικό σημείο (12 ώρες). BTN3A3 προκλήθηκε από τη συνδυασμένη θεραπεία και στα δύο χρονικά σημεία, αλλά όχι από U0126 μόνο ή IFN μόνο θεραπεία. Επιπλέον, Ras /MEK αναστολή από U0126 ήταν ικανό να προάγει την έκφραση του γονιδίου RIGI και STAT2 στις 12 ώρες εν απουσία IFN, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17], [40]. Βρήκαμε ότι ID2, το οποίο δεν είναι ένα γονίδιο IFN-επαγώγιμο, ρυθμίζεται αυξητικά μόνο με επεξεργασία U0126 και τη συνδυασμένη θεραπεία, αλλά όχι με κατεργασία IFN. Οι περισσότερες από τις αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση επιβεβαιώθηκαν με RT-qPCR, αλλά λόγω της διαφοράς στην ευαισθησία και στατιστική δύναμη των δύο διαφορετικές τεχνικές, δεν ταυτοποιήθηκαν ως στατιστικά σημαντικές σε αμφότερες τις αναλύσεις όλες οι αλλαγές γονιδίου. Για παράδειγμα, RIGI βρέθηκε να επάγεται σε κύτταρα ΗΤ1080 με IFN αγωγή μόνο με χρήση RT-qPCR, αλλά όχι στην ανάλυση μικροσυστοιχιών.

Το επίπεδο της γονιδιακής έκφρασης σε κύτταρα ΗΤ1080 αφεθεί χωρίς θεραπεία, θεραπεία με IFN (50 U /ml), με U0126 (20μΜ) ή με IFN και U0126 για 6 ώρες ή 12 ώρες προσδιορίστηκε με ποσοτική RT-PCR. Το σχετικό επίπεδο έκφρασης υπολογίστηκε σε σύγκριση με το 6 ώρα χωρίς θεραπεία ελέγχου μετά από κανονικοποίηση κατά επίπεδα έκφρασης GAPDH. (N = 3, * Ρ & lt? 0,01 σε σύγκριση με το χρόνο αντιστοίχισης ελέγχου, ** Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με όλες τις άλλες ομάδες).

Η

Επιδράσεις της ενεργοποίησης Ras επί ΙΡΝ-επαγόμενη μεταγραφή σε IFN Sensitive SKOV3 κύτταρα

Για να εξεταστεί περαιτέρω η καταστολή της μεταγραφής IFN από ενεργοποιημένα Ras, δημιουργήσαμε SKOV3 κυττάρων (ΙΡΝ-ευαίσθητο) που εκφράζουν την ουσιαστικά δραστική μεταλλαγμένη Ras (SKOV3-RasV12? κλώνοι 10 και 15). Ras /ΜΕΚ ενεργοποίησης στα μεταλλαγμένα κύτταρα επιβεβαιώθηκε με ανάλυση κηλίδος western χρησιμοποιώντας αντι-φωσφορυλιωμένο ERK, και το Ras αντισώματα (Σχ. 6Α). έλεγχος Vector SKOV3 και SKOV3-RasV12 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με IFN (0, 12.5, 25, 50 και 100 U /ml) για 16 ώρες και στη συνέχεια προκλήθηκαν με VSV σε ΜΟΙ 1. Η ανάλυση στυπώματος Western των VSV-G πρωτεΐνης στους 24 ώρες μετά τη μόλυνση έδειξε ότι VSV αναπαραχθεί σαφώς πιο αποτελεσματικά σε Ras-μετασχηματισμένα SKOV3 μεταλλάκτες (κλώνος 10 και 15) από ό, τι στα κύτταρα SKOV3 ελέγχου με την παρουσία IFN (Εικ. 6Β). Επίσης μετρήθηκαν τα επίπεδα ιικού απόγονοι 48 ώρες μετά τη μόλυνση για την ποσοτικοποίηση του βαθμού ιογενούς λοίμωξης (Εικ. 6C). Σε συμφωνία με την ανάλυση κηλίδος western, διαπιστώσαμε ότι η παραγωγή απογόνων ιών ήταν σημαντικά υψηλότερη στην Ras-μετασχηματισμένα SKOV3 μεταλλαγμένο από τον έλεγχο SKOV3 κύτταρα επεξεργασμένα με IFN (50 και 100 U /ml). Για να καθοριστεί περαιτέρω εάν η μείωση στην ευαισθησία IFN από την εισαγωγή του δραστικού Ras επάγεται από την ρύθμιση προς τα κάτω της IFN-επαγόμενης μεταγραφής, εξετάσαμε οι αλλαγές ΙΡΝ-επαγόμενη μεταγραφή 5 γονίδια (GBP2, IFIT2, ΜΑΡ2, STAT2 και RIGI), η οποία εμείς προηγουμένως εντοπιστεί να ρυθμίζεται προς τα κάτω από Ras /ΜΕΚ σε κύτταρα ΗΤ1080 (Σχήμα 5). Η επαγωγή του GBP2, IFIT2, ΜΑΡ2 και RIGI ανεστάλη στις Ras-μετασχηματισμένα κύτταρα SKOV3 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου SKOV3 σε 12 ώρες μετά τη διέγερση της ΙΡΝ ενώ επαγωγή STAT2 δεν επηρεάστηκε σημαντικά (Εικ. 7). Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι ενεργοποιημένα σηματοδότηση Ras καταστέλλει τη μεταγραφή ορισμένων γονιδίων IFN επαγόμενο που οδηγεί στην μείωση της κυτταρικής ευαισθησίας στην IFN.

(Α) ανάλυση κηλίδας Western χρησιμοποιώντας αντι-Ras, φωσφορυλιωμένο ERK ή GAPDH αντίσωμα για να προσδιοριστεί ενεργοποίηση Ras /ΜΕΚ στον έλεγχο SKOV3 και Ras μετασχηματισμένα SKOV3 (κλώνος 10 και 15). Έλεγχος SKOV3 και Ras μετασχηματισμένα κύτταρα SKOV3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με IFN (0, 12.5, 25, 50 και 100 U /ml), και στη συνέχεια προκλήθηκαν με προκλήθηκαν με VSV (ΜΟΙ 1). Η μόλυνση εκτιμήθηκε με (Β) Ανάλυση στυπώματος western για VSV-G πρωτεΐνης και GAPDH σε μόλυνση 24 ώρες και με δοκιμασία (C) του ιού απογόνου, σε 48 ώρες μετά τη μόλυνση.

Η

Η έκφραση του GBP2, IFIT2 , ΜΑΡ2, RIGI και STAT2 στον έλεγχο SKOV3 και Ras-μετασχηματισμένα κύτταρα SKOV3 (κλώνος 15) σε 12 ώρες μετά τη διέγερση IFN (0, 12,5, 50 και 100 U /ml) προσδιορίστηκε με ποσοτική RT-PCR. Το σχετικό επίπεδο έκφρασης υπολογίστηκε σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα SKOV3 ελέγχου μετά από κανονικοποίηση κατά επίπεδα έκφρασης GAPDH. (N = 3, * P & lt? 0.05 και ** Ρ & lt? 0,01 σε σύγκριση με IFN συγκέντρωση-συμφωνημένα ελέγχου).

Η

Συζήτηση

Όπως καταδεικνύεται προηγουμένως, η απομείωση της απόκρισης IFN σε καρκινικά κύτταρα θεωρείται ένας από τους κοινούς μηχανισμούς για την ιογενή ογκόλυσης [3], [10]. Η ενεργοποίηση της οδού της Ras /ΜΕΚ έχει αναφερθεί ότι καταστέλλει αντιική αποκρίσεις που επάγονται από IFN [4], [16], [17], [25], [40]. Σε αυτή τη μελέτη, ερευνήσαμε πρώτα μια ομάδα ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών και προσδιορίστηκε 1) ανταπόκρισής τους στις IFN στην παραγωγή ενός αντι-ιικό κατάσταση και 2) την ικανότητα του αναστολέα ΜΕΚ, U0126, για την αποκατάσταση της ευαισθησίας IFN. Βρήκαμε ότι 13 από τις 16 κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν ήταν μετρίως ή πλήρως ανθεκτικά σε αντι-ιική ανταπόκριση του ΙΡΝ. Σε 10 από αυτά τα 13 κυτταρικές γραμμές, η ευαισθησία σε IFN αποκαταστάθηκε κατά την κατεργασία με τον αναστολέα ΜΕΚ. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η ενεργοποιημένη οδό Ras /ΜΕΚ κρύβεται αντίσταση των καρκινικών κυττάρων σε αντι-ιικές επιδράσεις που προκαλούνται από IFN. Για να διερευνηθεί περαιτέρω η υποκείμενος μηχανισμός για την κατασταλτική επίδραση της Ras /ΜΕΚ οδού με την ανταπόκριση IFN, πραγματοποιήσαμε ανάλυση γονιδιακής έκφρασης παγκόσμια για τον προσδιορισμό ΙΡΝ-επαγόμενη μεταγραφική δραστηριότητα σε IFN ευαίσθητες SKOV3 και IFN μετρίως ανθεκτικά κύτταρα ΗΤ1080. Βρήκαμε ότι υπήρχε σημαντική μείωση του αριθμού των γονιδίων που προκαλείται από IFN σε κύτταρα ΗΤ1080 σε σύγκριση με εκείνη σε κύτταρα SKOV3 (276 γονίδια σε SKOV3, 98 γονίδια σε κύτταρα ΗΤ1080? Εικ. 3Α). Επιπλέον, ΜΕΚ αναστολή αποκατέστησε την ικανότητα IFN να ενεργοποιεί τη μεταγραφή του σε κύτταρα ΗΤ1080, καθώς βρήκαμε ότι επιπλέον 111 γονίδια στις 6 ώρες και 135 γονιδίων στις 12 ώρες εκφράστηκαν σε κύτταρα ΗΤ1080 σε επεξεργασία τόσο με IFN και U0126 (Σχ. 3Β), δείχνοντας ότι ενεργοποιημένο Ras /ΜΕΚ καταστέλλει μεταγραφή μιας ομάδας ΙΡΝ-επαγόμενης γονίδια. Τέλος, ήμασταν σε θέση να αποδείξουν ότι η έκφραση ιδιοσυστατικά ενεργό Ras σε IFN κύτταρα ευαίσθητα SKOV3 μειωμένη ικανότητα τους να ενεργοποιούν ΙΡΝ-επαγόμενη μεταγραφή και να καθιερώσει IFN-επαγόμενης αντιιική απόκριση. Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν σαφώς ότι ενεργοποιημένο Ras /ΜΕΚ μονοπάτι καταστέλλει μεταγραφή ορισμένων IFN επαγώγιμων γονιδίων για τη δημιουργία IFN δυσλειτουργία σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα.

Μπορούμε να υποθέσουμε πολλές πιθανές υποκείμενους μηχανισμούς για την ευρεία καταστολή της μεταγραφής IFN-επάγεται από ο οδού Ras /MEK. 1) Ras /ΜΕΚ ρυθμίζει τη δραστηριότητα ενός μεταγραφικού συν-ρυθμιστή για ISGF3, όπως τα θετικά συν-ρυθμιστές IRF1 [41], [42], και Sp3 [43] ή το αρνητικό συν-ρυθμιστές ΝΡ-κΒ [44] , και πρωτεΐνη [45] δέσμευσης ΙΡΝ-συναινετική αλληλουχία. Σε αυτήν την περίπτωση, τα γονίδια ΙΡΝ-επαγώγιμων που απαιτούν το ανάντη ή προς τα κάτω ρύθμιση ενός συν-ρυθμιστής για την έκφραση τους θα καταστέλλεται σε κύτταρα με ενεργοποιημένο Ras /ΜΕΚ. 2) Ras /MEK καταστέλλει τα βασικά επίπεδα έκφρασης των βασικών συστατικών του μονοπατιού σηματοδότησης IFN. Ανεπαρκή επίπεδα έκφρασης αυτών των συστατικών οδηγεί στην παγκόσμια απομείωση των IFN επάγεται αντι-ιική απόκριση παρόμοια με την αρνητική ρύθμιση της έκφρασης STAT2 που παρατηρούμε σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 που υπερεκφράζουν ιδιοσυστατικά ενεργό Ras [17]. 3) Η έκφραση των γονιδίων ΙΡΝ-διεγέρσιμο μπορεί να κατασταλεί με επιγενετικές μηχανισμούς. Για παράδειγμα, η αλληλεπίδραση της με STAT2 BRG1 [46], ένα βασικό συστατικό του συμπλόκου ΑΤΡ-εξαρτώμενη χρωματίνης αναδιαμόρφωση SWI1-SnF2 [46], μπορεί να μεταβάλλει την έκφραση ενός υποσυνόλου IFN-ρυθμιζόμενων γονιδίων. Αν και δεν έχει αποδειχθεί ρύθμιση του BRG1 με Ras, προς τα κάτω ρύθμιση της σχετικής πρωτεΐνης, BRM1, έχει αναφερθεί [47]. Παρομοίως, Ras-διαμεσολαβούμενη ρύθμιση της μεθυλίωσης του DNA [48] ή την τροποποίηση ιστόνης [49], αν απευθύνονται σε ΙΡΝ-ρυθμιζόμενα γονίδια, θα μπορούσαν συνολικά να καταστείλει την έκφραση τους. 4) Τέλος, η οδός Ras /MEK μπορούν να ενεργοποιήσουν ή να ρυθμίζουν προς τα πάνω αρνητικοί ρυθμιστές της οδού IFN όπως SOCS [50] ή PIAS [51]. Αυτές οι αρνητικοί ρυθμιστές μπορούν να καταστείλουν μεταγραφή των IFN επαγώγιμων γονιδίων που ταυτοποιούνται να ρυθμίζεται προς τα κάτω από Ras /ΜΕΚ σε αυτή τη μελέτη.

Ανάλυση των βιολογικών διεργασιών που αντιπροσωπεύονται στα σύνολα γονίδιο αποκάλυψε ότι ο αριθμός των βιολογικών διεργασιών που επηρεάζονται από IFN και U0126 ήταν υψηλότερη από ό, τι είτε U0126 ή ΙΡΝ μόνη της. Επιπλέον, ο αριθμός των διαφορετικών κατηγοριών GO εκπροσωπούνται ήταν υψηλότερη στις 6 ώρες σε σύγκριση με 12 ώρες είτε μόνες U0126 ή τη συνδυασμένη θεραπεία υποδηλώνοντας ότι η μακροπρόθεσμη διέγερση περιορίζει τον αριθμό των βιολογικών διαδικασιών που μπορούν να πραγματοποιηθούν από τα γονίδια που εκφράζονται . Όπως ήταν αναμενόμενο, IFN ήταν σε θέση να ρυθμίζουν γονίδια που είναι γνωστό για την απόκριση στον ιό και σηματοδότηση ΝΡ-κΒ, ωστόσο, η συνδυασμένη θεραπεία αύξησε την εκπροσώπηση των περισσότερων αντι-ιικών κατηγορίες GO καθώς και γονίδια σημαντικά για ρύθμιση κυτοκίνης. Επιπλέον, σε σύγκριση με U0126 μόνη θεραπεία, σε συνδυασμό U0126 και θεραπεία IFN μείωσε την αντιπροσώπευση των γονιδίων που είναι υπεύθυνα για την αντιγραφή του DNA και την επισκευή, ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και την κυτταρική κινητικότητα. Συνολικά, η συνδυασμένη θεραπεία αύξησε την αντι-ιική /φλεγμονώδη απόκριση γονιδιακής έκφρασης σε συνεννόηση με μειωμένη αναπαράσταση γονιδίων προώθηση επιτυχούς κυτταρική διαίρεση.

Είναι ενδιαφέρον, ένα υποσύνολο των γονιδίων επάγεται συνήθως από τα δύο προστατευτικά θεραπείες, θεραπεία ΙΡΝ σε SKOV3 κύτταρα και συνδυασμένη θεραπεία IFN και U0126 στα κύτταρα ΗΤ1080 (Πίνακας S3). Αυτά τα γονίδια περιλαμβάνονται το γονίδιο C14orf159 που έχει πρόσφατα δειχθεί ότι έχει ευρεία λειτουργία αντι-ιικές, και το MOV10 και τα γονίδια IFI44 αποδειχθεί ότι έχουν πιο περιορισμένη αντι-ιική δράση [52]. Ομοίως, τα μέλη της αντιρετροϊκής APOBEC3 [53] και τελειώματα [53] γονίδιο οικογένειες που προκαλείται από τα δύο προστατευτικά θεραπείες. IFIT2 έχει πρόσφατα αποδειχθεί ότι έχουν αντι-ιική λειτουργία [27], [28], [29] και αντι-πολλαπλασιαστική λειτουργία [54]. Επιπλέον, IFIT2 αλληλεπιδρά με μικροσωληνίσκους [27] γεγονός που υποδηλώνει ότι IFIT2 μπορεί να συνδέσει με IFN-απορυθμίζεται ΜΑΡ2 να παρεμβαίνει με τη συναρμολόγηση του λοιμογόνου παράγοντα ή /και των μεταφορών με τη ρύθμιση της δυναμικής μικροσωληνίσκων [32], [33], [34]. Επιπλέον, προσδιορίσαμε επίσης κρίσιμη αντιικό γονίδια, όπως πρωτεΐνη γουανυλικής δέσμευσης (GBP) -2 [31] και RIGI [35], τα οποία είναι συνεργικά επάγεται σε κύτταρα ΗΤ1080 σε επεξεργασία με U0126 και IFN. Ως εκ τούτου, αυτά τα δεδομένα παρέχουν περαιτέρω απόδειξη της σημασίας αυτών των γονιδίων για τη δημιουργία μιας επιτυχούς αντι-ιική απόκριση. Μελλοντικές μελέτες θα επιδιώξει να προσδιορίσει τις ακριβείς ρόλους αυτών των γονιδίων, είτε μεμονωμένα είτε σε συνδυασμό, για τη διαμεσολάβηση στην αντι-ιική ανταπόκριση του προστατευτικού IFN και ρυθμίζουν την ιογενή ογκόλυσης.

Δεν υπήρχε συσχέτιση μεταξύ της προέλευσης των ιστών του ανθρώπινου καρκίνου κύτταρα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη και την ευαισθησία στην IFN ή την ικανότητα του να αποκαταστήσει U0126 IFN ανταπόκριση.