Αφηρημένο

Bezielle είναι ένα φυτικό εκχύλισμα που έχει εκλεκτική δράση κατά των όγκων, και έχει δείξει μια πολλά υποσχόμενη αποτελεσματικότητα στα πρώτα στάδια των κλινικών δοκιμών. Bezielle αναστέλλει μιτοχονδριακή αναπνοή και προκαλεί αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) στα μιτοχόνδρια των κυττάρων των όγκων αλλά όχι σε μη μετασχηματισμένα κύτταρα. Η παραγωγή υψηλής ROS στα κύτταρα όγκου οδηγεί σε βαριά βλάβη του DNA και υπερ-ενεργοποίηση του PARP, που ακολουθείται από την αναστολή της γλυκόλυσης. Ως εκ τούτου, Bezielle ανήκει σε μια ομάδα φαρμάκων που στοχεύουν τα μιτοχόνδρια των κυττάρων του όγκου, αλλά κυτταροτοξικότητα του συνεπάγεται αναστολή της δύο κυτταρικά μονοπάτια παραγωγής ενέργειας. Βρήκαμε ότι η κυτταροτοξική δράση του Bezielle εκχύλισμα

in vitro

συν-καθαρίζεται με ένα καθορισμένο κλάσμα που περιέχει πολλαπλά φλαβονοειδή. Έχουμε απομονώσει αρκετά από αυτά τα φλαβονοειδή Bezielle, και εξέτασε πιθανούς ρόλους τους στην εκλεκτική κυτταροτοξικότητα κατά των όγκων του Bezielle. Τα αποτελέσματα μας υποστηρίζουν την υπόθεση ότι ένα σημαντικό Scutellaria φλαβονοειδές, scutellarein, κατέχει πολλές, αν όχι όλα τα βιολογικά σχετικών ιδιοτήτων του συνολικού εκχυλίσματος. Όπως Bezielle, scutellarein προκαλούμενη αύξηση των επιπέδων του ROS μιτοχονδριακής προέλευσης, προοδευτική βλάβη του DNA, οξείδωση πρωτεϊνών, εξάντληση των ανηγμένης γλουταθειόνης και ΑΤΡ, και η καταστολή των δύο OXPHOS και γλυκόλυσης. Όπως Bezielle, scutellarein ήταν επιλεκτικά κυτταροτοξική προς τα καρκινικά κύτταρα. Carthamidin, ένα flavonone βρέθηκαν σε Bezielle, προκάλεσε επίσης βλάβες στο DNA και το οξειδωτικό θάνατο των κυττάρων. Δύο πολύ γνωστά φυτικά φλαβονοειδή, απιγενίνη και luteolin, είχε περιορισμένη και δεν επιλεκτική κυτταροτοξικότητα που δεν εξαρτάται από την προ-οξειδωτικό τις δραστηριότητές τους. Πρέπει επίσης να παρέχουν αποδείξεις ότι η κυτταροτοξικότητα της scutellarein αυξήθηκε κατά άλλα φλαβονοειδή Bezielle, δεν είναι απαραίτητα ιδιαίτερα κυτταροτοξική ή επιλεκτική στις δικές τους, ήταν παρόντες. Αυτό δείχνει ότι η δραστηριότητα του ολικού εκχυλίσματος Bezielle μπορεί να εξαρτάται από ένα συνδυασμό πολλών διαφορετικών ενώσεων που υπάρχουν μέσα σε αυτό

Παράθεση:. Chen V, Staub RE, Baggett S, Chimmani R, Tagliaferri M, Cohen Ι, κ.ά. . (2012) Εντοπισμός και ανάλυση των Active φυτοχημικά από το Αντικαρκινικό Βοτανικός Απόσπασμα Bezielle. PLoS ONE 7 (1): e30107. doi: 10.1371 /journal.pone.0030107

Επιμέλεια: Marianne Koritzinsky, Πανεπιστήμιο Δίκτυο Υγείας, Καναδάς

Ελήφθη: 21 του Ιούλη, 2011? Αποδεκτές: 12 Δεκ 2011? Δημοσιεύθηκε: 17 Ιανουαρίου 2012

Copyright: © 2012 Chen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε πλήρως από BioNovo, Inc. Η χρηματοδότη έπαιξε ρόλο στην απόφαση για την έρευνα Bezielle ως αντικαρκινικού παράγοντα, αλλά δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου.

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς δηλώνουν οικονομικό ανταγωνιστικών συμφερόντων. Οι συγγραφείς αναγνωρίζουν ότι είναι έμμισθους υπαλλήλους και τους κατόχους μετοχών της BioNovo, Inc, και ότι αυτή η μελέτη, στο σύνολό της, υποστηρίχθηκε από κεφάλαια από BioNovo. Bezielle (BZL101) είναι ιδιόκτητο βοτανικό υποψήφιο φάρμακο Bionovo (FDA-IND: 59521) για τη θεραπεία του μεταστατικού καρκίνου του μαστού. Bionovo των Ηνωμένων Πολιτειών Δίπλωμα Ευρεσιτεχνίας Νο 7.700.136 καλύπτει μία μέθοδο θεραπείας του καρκίνου του μαστού χρησιμοποιώντας ένα εκχύλισμα Scutellaria barbata. Αυτό το δίπλωμα ευρεσιτεχνίας καλύπτει επίσης τη χρήση του ιδιόκτητο διατύπωση BezielleR Bionovo ως μονοθεραπεία για τη θεραπεία του καρκίνου του μαστού. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Bezielle (BZL101) είναι ένα υδατικό εκχύλισμα των εναέριων μερών του φυτού Scutellaria barbata μακρά χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία του καρκίνου του πυρετούς και στην παραδοσιακή κινεζική ιατρική. Bezielle είναι επιλεκτικά κυτταροτοξική σε κύτταρα όγκου ενώ διαφυλάσσει την κανονική και μη μετασχηματισμένα κύτταρα

in vitro

[1]. εκχύλισμα Bezielle είχε έδειξε μια πολλά υποσχόμενη αντικαρκινική δράση σε πρώιμες κλινικές δοκιμές [2], [3], αλλά περαιτέρω την κλινική ανάπτυξη των Bezielle θα προχωρήσει από τη χημική ταυτοποίηση της ένωσης (ες) σε Bezielle που είναι άμεσα υπεύθυνες για την καταπολέμηση της -cancer δραστηριότητα. Η στρατηγική αυτή είναι η κατευθυντήρια αρχή της έρευνας κατά του καρκίνου διεξάγεται σε BioNovo που έχει ως στόχο να φέρει στην πρακτική της δυτικής ιατρικής ορισμένα από τα βότανα γνώσεις που έχουν συγκεντρωθεί στην κινεζική παραδοσιακή ιατρική. Ο στόχος είναι να γεφυρώσει μεταξύ της βοτανικής με βάση την παραδοσιακή ιατρική και την ένωση με βάση δυτική ιατρική η οποία, κατ ‘ανάγκη, περιλαμβάνει ταυτοποίηση των δραστικών φυτοχημικά στις συνολικές φυτικά εκχυλίσματα. Στην εργασία αυτή περιγράφουμε την ταυτοποίηση και την ανάλυση του ενεργού φυτοχημικές (ες) σε Bezielle. Δραστηριότητα καθοδηγούμενη κλασμάτωση Bezielle οδήγησε στην ταυτοποίηση ενός ξεχωριστού κλάσματος που ήταν επιλεκτικά κυτταροτοξική

in vitro

. Περαιτέρω χημική ανάλυση αυτού του κλάσματος αποκάλυψε ότι περιέχει μια σειρά σχετικών ενώσεων που ανήκουν σε μια οικογένεια των φλαβονοειδών. Τα φλαβονοειδή είναι φυτοχημικά που βρέθηκαν σε μία ευρεία ποικιλία φυτών, συμπεριλαμβανομένων εκείνων κοινή σε κανονική δίαιτα. Τα φλαβονοειδή, σε γενικές γραμμές, θεωρείται ότι έχουν αντι-φλεγμονώδη, αντι-οξειδωτικό και ο καρκίνος-προληπτικές ιδιότητες (ανασκόπηση μεταξύ άλλων στο [4], [5], [6]).

Το συνοδευτικό χαρτί σε αυτό ζήτημα και τα αποτελέσματά μας που δημοσιεύτηκαν προηγουμένως [1] δείχνουν ότι Bezielle θανατώνει κύτταρα όγκου μέσω επαγωγής αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS), βλάβη του DNA, κατάρρευση της οξειδοαναγωγικής κατάστασης και μεταβολικών καταστολή, που περιλαμβάνει αναστολή τόσο μιτοχονδριακή αναπνοή και γλυκόλυση, καθώς και εξάντληση του μιτοχονδριακού εφεδρικής δυναμικότητας. Όλες αυτές οι δραστηριότητες Bezielle καταργηθεί σε καρκινικά κύτταρα με αναπηρία μιτοχονδριακή αναπνοή. Ως εκ τούτου, έχουμε εξετάσει τις Bezielle που προέρχονται από φλαβονοειδή για τις δραστηριότητες χαρακτηριστικό του Bezielle. Συγκεκριμένα, τέσσερις σημαντικές φλαβονοειδή Bezielle προσδιορίζονται μέσω δραστικότητα κατευθυνόμενων απομόνωση αναλύθηκαν για (α) εκλεκτική κυτταροτοξικότητα σε καρκινικά κύτταρα? (Β) την ικανότητα να επάγει προοδευτική αύξηση των επιπέδων του ROS? (Γ) την εξάρτηση της επαγωγής ROS και κυτταροτοξικότητα στην παρουσία αναπνοής μιτοχόνδρια? (Δ) πρόκληση βλάβης του DNA? (Ε) οι συνέπειες για την κατάσταση της κυτταρικής οξειδοαναγωγής? (Στ) μεταβολική καταστολή.

Σας αναφέρουμε ότι κάποιοι φλαβονοειδή, μακριά από το να έχουν αντι-οξειδωτικές ιδιότητες, επάγουν ROS και βλάβη του DNA κατά προτίμηση στα κύτταρα του όγκου. Ειδικότερα, scutellarein ήταν επιλεκτικά κυτταροτοξική σε νεοπλασματικά κύτταρα αλλά όχι σε μη μετασχηματισμένα κύτταρα. Scutellarein επαγόμενη προοδευτικά υψηλότερα επίπεδα των ROS και βλάβης του DNA σε έναν χρόνο εξαρτώμενο τρόπο, παρόμοιο με συνολική Bezielle. Scutellarein επίσης προκάλεσε μεταβολική καταστολή, αναστέλλοντας τόσο OXPHOS και γλυκόλυση. Οι τελευταίες δραστηριότητες της scutellarein καθώς και την κυτταροτοξικότητα της ενισχύθηκαν όταν συνδυάζεται με άλλα φλαβονοειδή που από μόνα τους δεν είναι ιδιαίτερα κυτταροτοξική και δεν προκαλεί βλάβη στο DNA.

Υλικά και Μέθοδοι

Δραστηριότητα Καθοδηγούμενη απομόνωση των αντι-καρκινικές ενώσεις από Bezielle

Συσκευή που μοιάζει με εκχυλίσματα

Scutellaria barbata

για την απομόνωση δραστηριότητα καθοδηγείται παρασκευάστηκαν με προσθήκη νερού στο έδαφος, αποξηραμένων βοτάνων (10:01, ο όγκος : μάζα), κατόπιν φέρνοντας το μίγμα σε σημείο βρασμού. Η βοτανική διάλυμα αφέθηκε να σιγοβράσει για 45-60 λεπτά σε περίπου 70 ° C, κατόπιν διηθήθηκε με αναρρόφηση (Whatman φίλτρο 1 χαρτί) για να παραχθεί το ακατέργαστο τσάι. Ένας ίσος όγκος ακετόνης προστέθηκε στο εκχύλισμα για να δημιουργήσει ένα ίζημα. Η ακετόνη: νερό διάλυμα διηθήθηκε με αναρρόφηση (φίλτρο Whatman 1 χαρτί), στη συνέχεια συμπυκνώθηκε με περιστροφική εξάτμιση

σε κενό

για να απομακρυνθεί η ακετόνη και να μειώσει περαιτέρω το υδατικό όγκο κατά 60-70%. Το συμπυκνωμένο τσάι διηθήθηκε ξανά (0,45 μm).

Το συμπυκνωμένο εκχύλισμα υποβλήθηκε σε χρωματογραφία στήλης ανοίξει επί Diaion ΗΡ-20 ρητίνη (Supelco, Bellefonte, ΡΑ). Το δείγμα φορτώθηκε στην στήλη σε 20% μεθανόλη σε νερό και εκλούεται με 20%, 50%, 75% και 100% μεθανόλη (τρεις όγκους στήλης για κάθε βήμα). Τα κλάσματα ελέγχθηκαν για κυτταροτοξικότητα χρησιμοποιώντας δοκιμασία CCK8, καθώς και για την καταστροφική δραστηριότητα DNA χρησιμοποιώντας δοκιμασία Comet. Και οι δύο δραστηριότητες βρέθηκαν να συνδέονται με τα κλάσματα 75% και 100% μεθανόλη.

Ενεργά κλάσματα από την στήλη ΗΡ-20 συνδυάστηκαν, συμπυκνώθηκαν και υποβλήθηκαν σε χρωματογραφία στήλης ανοίξει επί Sephadex LH20 ρητίνη (Sigma-Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI). Το δείγμα φορτώθηκε σε 1:01 μεθανόλη-νερό και εκλούστηκε σε τέσσερα στάδια κατά 50%, 60%, 75% και 100% μεθανόλη σε νερό. δεδομένα προσδιορισμού κυτταροτοξικότητας καθορίστηκε ότι η μεγαλύτερη δραστηριότητα ήταν στα κλάσματα που εκλούονται από την στήλη σε 75-100% μεθανόλη. Ένα κλάσμα παρόμοια σε σύνθεση και δραστικότητα παρασκευάστηκε επίσης με παραπετάσματα Bezielle με οξικό αιθυλεστέρα (Σχήμα 1).

Αυτό το κλάσμα απομονώθηκε όπως περιγράφεται στις Πειραματικές Διαδικασίες. Οι δομές μερικών από τις ενώσεις που αναλύθηκαν περαιτέρω απεικονίζεται.

Η

Παρασκευαστική HPLC πραγματοποιήθηκε επί των δραστικών κλασμάτων που ανακτήθηκαν από τη στήλη LH20 ή το ισοδύναμο χώρισμα οξικό αιθυλεστέρα της Bezielle. Προπαρασκευαστικό HPLC χρησιμοποιείται μια γραμμική κλίση από 10% έως 60% ακετονιτρίλιο σε 0.1% υδατικό τριφθοροξικό οξύ σε διάστημα 30 λεπτών σε ένα Phenomenex Luna C18 (2) στήλη (150 χ 21,1 mm, 5 μm) με ρυθμό ροής 20 κ.εκ. /λεπτό. Αρκετές ενώσεις καθαρίστηκαν με παρασκευαστική HPLC και διαλευκάνθηκαν δομές τους. Scutellarein, luteolin και απιγενίνη προσδιορίστηκαν με βάση LC /MS και NMR σύγκριση με τα εμπορικά πρότυπα αναφοράς. Isoscutellarein και carthamidin προσδιορίστηκαν με βάση LC /MS, 1D και 2D NMR και η σύγκριση με τα δεδομένα της βιβλιογραφίας. Απιγενίνη και luteolin αγοράστηκαν από Indofine Chemical Company, Inc. (Hillsborough, NJ). Scutellarein αγοράστηκε από ΑΡΙΝ Chemical Company (Abingdon, Oxfordshire του Ηνωμένου Βασιλείου). Scutellarein, isoscutellarein και carthamidin συντέθηκαν επίσης σε BioNovo. Δεδομένα για δομική διασαφήνιση των ενώσεων και συνθετικών διαδικασιών μπορεί να βρεθεί στο Methods S1.

Αντιδραστήρια και αντισώματα

Όλα τα αντιδραστήρια και οι αναστολείς αγοράστηκαν από την Sigma. Φθορισμού δείκτες των ROS, μιτοχονδριακή υπεροξειδίου και το μονοξείδιο του αζώτου, CM-H

2DCFDA, MitoSox και CM-H

2DAFDA και ήταν από την Molecular Probes /InVitrogen. Αντισώματα προς νιτροτυροσίνης ήταν από Millipore, αντίσωμα προς PAR ήταν από την Becton-Dickinson.

Κυτταρική καλλιέργεια και θεραπείες

Όλες οι κυτταρικές σειρές ελήφθησαν από την ATCC, και πολλαπλασιάστηκαν σε RPMI με 10% FCS ( MDAMB231), DME με 10% FCS (Hs578T, SKBR3) και DME /F12 με 5% FCS και τα συμπληρώματα (ΜΟΡ10Α και 184A1). Το μέσο για ΜΟΡ10Α και 184A1 περιείχε επίσης 50 μg /ml εκχυλίσματος υποφύσεως, 10 μg /ml ινσουλίνη, 0.5 μg /ml υδροκορτιζόνη και 0,02 μg /ml EGF (Sigma). Όλα τα μέσα μαζικής ενημέρωσης ήταν πυροσταφυλικού-free. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με BZL101 σε συγκέντρωση 250 μg /ml (ξηρό βάρος ανά όγκο) ή με νερό (επισημασμένο ως «μη επεξεργασμένο» σε όλο το χαρτί). Τα φλαβονοειδή διαλύθηκαν σε DMSO, και καλλιέργειες ελέγχου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία μόνο με DMSO.

Μετρήσεις της κυτταρικής βιωσιμότητας, μιτοχονδριακή δυναμικό, ΑΤΡ και GSH

Κυτταρική βιωσιμότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας CCK-8 kit (Dojindo) . δυναμικό μιτοχονδριακής διαμεμβράνης (ΔΨm) σε ζωντανά κύτταρα αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το δυναμικό ευαίσθητη κατιονική χρωστική JC-1 (Molecular Probes) με επώαση κυττάρων με 2 μΜ JC-1 για 30 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν, και ερυθρό φθορισμό (ενδεικτική των υγιών μιτοχονδρίων), καθώς και πράσινου φθορισμού (ενδεικτική των μιτοχονδρίων με χαμηλή ΔΨm) προσδιορίστηκε επί FACScan. επίπεδα ΑΤΡ ήταν ποσοτικά με τη χρήση ΑΤΡ βιοφωταύγεια κιτ δοκιμασίας ΕΣ II (Roche Applied Science). Για τον προσδιορισμό των επιπέδων της ανηγμένης γλουταθειόνης, τα κύτταρα σε πλάκες 96 φρεατίων επωάστηκαν σε μέσα που περιέχουν 8 μΜ monobromobimane (ΜΒΒ). Σε διαφορετικούς χρόνους μετά την προσθήκη του φθορισμού ΜΒΒ αναγνώσθηκε σε αναγνώστη πλακός με φίλτρα καθορίστηκε σε διέγερση 360 nm και εκπομπή 460 nm.

Ανάλυση της πρωτεΐνης τροποποιήσεις οξειδωτικής

τροποποίηση καρβονυλικές των πρωτεϊνών σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με Bezielle και φλαβονοειδή προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας το κιτ άγχος FlowSellect οξειδωτικό από Millipore. Το κιτ περιέχει 2,4-dinitrophenylhydrazin (DNP), τα χημικά που δεσμεύεται ομοιοπολικά στο καρβονυλικό τροποποίηση επί των πρωτεϊνών. Μετά παραγοντοποίηση καρβονυλομάδες, οι δεσμεύονται DNP πρωτεΐνες ανιχνεύθηκε με ένα συζευγμένο με FITC αντίσωμα αντι-DPN.

Western ανάλυση κηλίδος

λύματα ολόκληρων κυττάρων ηλεκτροφορήθηκαν σε SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε νιτροκυτταρίνη μεμβράνες. Οι μεμβράνες κηλιδώθηκαν με αντισώματα σε συνιστώμενες συγκεντρώσεις όλη τη νύκτα στους 4 ° C και τα δεσμευμένα πρωτεύοντα αντισώματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας συζευγμένο με υπεροξειδάση δευτερογενή αντισώματα. Οι κηλίδες αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας SuperSignal κιτ ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (Pierce) και απεικονίστηκε σε Kodak Imager ISR2000.

Comet Δοκιμασία

δοκιμασίες Αλκαλικές κομήτη διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας Comet από Trevigen σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά την ηλεκτροφόρηση οι πυρήνες χρωματίστηκαν με SYBR πράσινο και παρατηρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού. Τα ποσοστά των κυττάρων με κομήτες προσδιορίστηκαν ποσοτικά από έναν παρατηρητή τυφλωμένο στην ταυτότητα των διαφανειών. Olive ουρά στιγμή, ορίζεται ως το προϊόν του ποσοστού DNA στην ουρά και μετατόπιση μεταξύ της θέσης των μέσων κέντρα μάζας στα κεφάλια και τις ουρές, προσδιορίστηκε για τουλάχιστον 40 κύτταρα ανά δείγμα. Τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν και αναλύθηκαν με το λογισμικό ανάλυσης εικόνας TriTek CometScore.

Μεταβολικό αναλύει με Seahorse XF96 Εξωκυττάρια Flux Αναλυτής

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν τη διάρκεια της νύχτας σε XF96 PET φρεατίων 96 σε πειραματικά προκαθορισμένο αριθμό (10 × 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο για MDAMB231 και 12 × 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο για ΜΟΡ10Α). Μεταβολική ροές αναλύθηκαν σε αναλυτή ιππόκαμπος XF96 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, όπως περιγράφεται προηγουμένως [7]. Οι τιμές ECAR βασική (σε mph /min), PPR (σε pmolH + /min) και OCR τιμές (σε pMoles O

2 /λεπτό) μετρήθηκαν για 4 κύκλους. Μετά τη μέτρηση των βασικών επιπέδων, μιτοχονδριακό αποσυζεύκτη FCCP σε 1 μΜ αυτομάτως εγχύεται τα πειραματικά φρεάτια για τον προσδιορισμό της μέγιστης μιτοχονδριακή αναπνοή, ή εφεδρική ισχύ. Μετά από έναν κύκλο μετρήσεων αναστολέας της μιτοχονδριακής συμπλόκου III αντιμυκίνη Α σε 5 μΜ εγχύθηκε μέσα στα πειραματικά φρεάτια, και ένας άλλος κύκλος μέτρηση διεξήχθη. Κάθε πειραματικό σημείο ήταν κατά μέσο όρο 6 έως 10 φρεάτια αντιγράφου, και τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον 4 φορές. Κανονικοποίηση του ECAR, οι τιμές PPR OCR που λαμβάνονται σε δοκιμασίες XF96 διεξήχθη χρησιμοποιώντας τον ποσοτικό προσδιορισμό των κυτταρικών DNA με τη δοκιμασία CyQuant (Promega) για την πειραματική πλακών. Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως XF96 ECAR ή OCR τιμές κανονικοποιούνται προς το περιεχόμενο DNA, ή ως επί τοις εκατό των δραστηριοτήτων σε σχέση με αυτά που μετράται στο ίδιο πείραμα σε κύτταρα που φυλάσσονται σε πλήρη μέσα (μετά από κανονικοποίηση όλων των συνόλων δεδομένων).

Αποτελέσματα

απομόνωση και καθαρισμός των δραστικών κλασμάτων και ενώσεων από Bezielle εκχύλισμα

Η δραστηριότητα καθοδηγούμενη απομόνωση των δραστικών κλασμάτων και ενώσεων εντός των δραστικών κλασμάτων περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Ένα κλάσμα με υψηλή και εκλεκτική κυτταροτοξική δραστικότητα απομονώθηκε (Εικόνα 1). Αυτό το κλάσμα, παρόμοια με ολικό εκχύλισμα Bezielle, ήταν ιδιαίτερα κυτταροτοξική προς κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού MDAMB231 και SKBR3 αλλά δεν παράγουν σημαντική κυτταρικό θάνατο στην αθανατοποιημένη μη μετασχηματισμένη κυτταρική γραμμή ΜΟΡ10Α ή πρωτογενών ανθρώπινων ινοβλαστών IMR90 (δεν φαίνεται). Όπως περιγράφεται στα Πειραματικές Διαδικασίες, οι ενώσεις στο κλάσμα υψηλού εμπλουτισμού για την κυτταροτοξική δραστικότητα προσδιορίστηκαν ως φλαβονοειδή. Αρκετοί από αυτούς καθαρίστηκαν προς ομοιογένεια, που προσδιορίζονται όπως περιγράφεται στις Μεθόδους S1 και αναλύθηκαν σε κυτταρικές δοκιμασίες.

Κυτταροτοξική δραστικότητα των επιλεγμένων φλαβονοειδών Bezielle

Πρώτον, η κυτταροτοξικότητα πολλών φλαβονοειδών που απομονώθηκε από Bezielle ελέγχθηκε με σειρές καρκίνου του μαστού MDAMB231 και μη μετασχηματισμένα μαστικού κυτταρική γραμμή ΜΟΡ10Α. Το Σχήμα 2Α δείχνει κυτταροτοξικότητα της απιγενίνη δύο στενά συνδεδεμένα φλαβόνες (Α) και λουτεολίνη (L) που χαρακτηρίζεται από εκτεταμένα στη δημοσιευμένη βιβλιογραφία, με τις περισσότερες αναφορές που περιγράφουν αντι-οξειδωτικές ιδιότητες αυτών των ενώσεων. Προφανώς, αυτές οι φλαβόνες είχε περιορισμένο κυτταροτοξικότητα σε MDAMB231 κύτταρα και μια κάπως μεγαλύτερη δραστικότητα έναντι κυττάρων ΜΟΡ10Α, το οποίο είναι ακριβώς το αντίθετο της επιλεκτικότητας δει με Bezielle. Επιπλέον, η απόκριση του λαγοκοιμάμαι ΜΟΡ10Α και MDAMB231 κυττάρων σε ένα και το L ήταν σχετικά επίπεδη όλο το εύρος των συγκεντρώσεων από 5 έως 20 μg /ml (Σχήμα 2Α), υποδεικνύοντας έλλειψη δόσης-απόκρισης. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ούτε η απιγενίνη, ούτε luteolin ξεχωριστά να συμβάλει σημαντικά στην επιλεκτική κυτταροτοξική δράση της Bezielle.

Α. Η κυτταροτοξική δραστηριότητα των απιγενίνη (Α), λουτεολίνη (L) και Bezielle σε κύτταρα καρκίνου του μαστού MDAMB231 και μη μετασχηματισμένα επιθηλιακά μαστού κυτταρική γραμμή ΜΟΡ10Α. Τα κύτταρα κατεργάστηκαν για 24 ώρες πριν από την ανάλυση με τις συγκεντρώσεις των φλαβονοειδών υποδεικνύονται στα δεξιά των διαγραμμάτων (5, 10 και 20 μg /ml), ή με Bezielle (Bzl) στα 250 μg /ml. B. Η κυτταροτοξική δραστηριότητα των scutellarein (S), isoscutellarein (IS) και carthamidin (C), όπως στο Α Όλα τα αποτελέσματα είναι μέσες ± S.E. (N = 4).

Η

Το Σχήμα 2Β δείχνει την επαγωγή του κυτταρικού θανάτου από τις στενά συνδεδεμένες φλαβόνες scutellarein (S) και isoscutellarein (IS), καθώς και την carthamidin flavonone (C). Scutellarein είχαν περιορισμένη επίδραση στην βιωσιμότητα των κυττάρων ΜΟΡ10Α, αλλά ήταν πολύ κυτταροτοξική προς MDAMB231 (και άλλες καρκινικές κυτταρικές σειρές, που δεν φαίνεται) σε έναν δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 2Β). Isoscutellarein ήταν σημαντικά λιγότερο κυτταροτοξική σε κύτταρα MDAMB231 από scutellarein, και δεν σκοτώνουν τα κύτταρα ΜΟΡ10Α, ενδεικτική μιας περιορισμένης αλλά εκλεκτική κυτταροτοξικότητα. Carthamidin ήταν πιο δραστική έναντι MDAMB231 κυττάρων από κύτταρα ΜΟΡ10Α στις δύο χαμηλότερες συγκεντρώσεις. Ωστόσο, η θάνατο κυττάρου σε καλλιέργειες που κατεργάζονται με 20 μg /ml του carthamidin ήταν πολύ σημαντική και εμφανής ήδη στο 4 έως 5 ώρες μετά την έναρξη της θεραπείας, υποδεικνύοντας μια σοβαρή τοξικότητα του carthamidin σε υψηλότερη συγκέντρωση.

Δύο πρόσθετες κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού, Hs578T και SKBR3 έδειξε το ίδιο μοτίβο της ευαισθησίας των φλαβονοειδών ως MDAMB231 (Σχήμα S1 και δεν παρουσιάζονται). Έχουμε επίσης δοκιμαστεί άλλα αθανατοποιημένα μη μετασχηματισμένη κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται από μαστικό επιθήλιο, 184A1 και MCF12A, που ανταποκρίθηκαν στη θεραπεία με φλαβονοειδή παρομοίως προς ΜΟΡ10Α (δεν φαίνεται).

Τα αποτελέσματα αυτά προσδιορίζουν scutellarein ως η πιο κυτταροτοξική και, σημαντικότερο, επιλεκτικά κυτταροτοξικά, Bezielle φλαβονοειδή έξω από τις ενώσεις που αναλύθηκαν εδώ. Isoscutellarein έδειξε εκλεκτικότητα προς τα καρκινικά κύτταρα, αλλά δεν μελετήθηκε περαιτέρω λόγω της οριακής κυτταροτοξικότητα της. Carthamidin ήταν επίσης επιλεκτικό προς τα καρκινικά κύτταρα σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις, ενώ η απιγενίνη και luteolin δεν ήταν καθόλου επιλεκτική.

Δημιουργία ROS από Bezielle φλαβονοειδή

Η διαδικασία της Bezielle που προκαλείται από το θάνατο στα καρκινικά κύτταρα αρχίζει από την παραγωγή υψηλών επιπέδων των ROS. Επιπλέον, τα επίπεδα των ROS, τόσο υπεροξείδιο τύπου και μιτοχονδριακή υπεροξειδίου προκαλείται από Bezielle αυξάνει σημαντικά την πάροδο του χρόνου σε καρκινικά κύτταρα αλλά όχι σε κύτταρα ΜΟΡ10Α (Chen et al., Υποβληθέν). Κατά συνέπεια, εξετάσαμε αν η ατομική φλαβονοειδών από Bezielle δημιουργούν ROS και υπεροξειδίου σε καρκινικά κύτταρα αλλά όχι σε μη μετασχηματισμένα κύτταρα, και εάν η επαγωγή του ROS αυξάνει την πάροδο του χρόνου, όπως φαίνεται με Bezielle. Επίπεδα υπεροξείδιο τύπου ROS (ανιχνεύσιμη με H

2DCFDA) εξετάστηκαν σε κατεργασμένα κύτταρα σε διαφορετικούς χρόνους, και δύο από τα χρονικά σημεία παρουσιάζονται στο Σχήμα 3Α. Δύο διακριτά χαρακτηριστικά είναι σαφείς: α) όλα τα φλαβονοειδή επάγουν πολύ υψηλότερα επίπεδα από υπεροξείδιο τύπου ROS σε MDAMB231 παρά σε κύτταρα ΜΟΡ10Α, και β) μόνο scutellarein δείχνει μια εξαρτώμενη από το χρόνο αύξηση των επιπέδων του ROS, παρόμοια με Bezielle. Η επαγωγή υπεροξείδιο τύπου ROS από απιγενίνη, carthamidin και luteolin δεν αυξάνεται με την πάροδο του χρόνου, αλλά παρέμεινε αμετάβλητη, είτε, είτε ήταν κάπως μειωμένη, παρόλο που αρχικά απιγενίνη που προκαλείται από τα υψηλότερα επίπεδα των ROS. Τα αυξανόμενα επίπεδα του DNA βλάπτουν το υπεροξείδιο τύπου ROS προκαλείται από scutellarein με τρόπο που εξαρτάται από το χρόνο περαιτέρω υποστηρίζει τη δυνατότητα που scutellarein εμπλέκεται στην επιλεκτική κυτταροτοξικότητα κατά των όγκων των Bezielle.

Α. Επαγωγή υπεροξείδιο τύπου ROS από τα φλαβονοειδή στα κύτταρα MDAMB231 και ΜΟΡ10Α. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 30 λεπτά ή 6 ώρες με τους υποδεικνυόμενους φλαβονοειδή στα 10 μg /ml και αναλύθηκαν για πράσινου φθορισμού (FL 1) επί FACScan μετά τη φόρτωση με H

2DCF-DA. Τα αποτελέσματα δείχνονται ως πλάσια αύξηση της FL1 παρατηρήθηκε σε μη επεξεργασμένα κύτταρα αναλύονται στην ίδια πειράματα (επίπεδα FL1 σε μη επεξεργασμένα κύτταρα σημειώνονται με διακεκομμένη γραμμή). B. Η επαγωγή της μιτοχονδριακής υπεροξειδίου από Bezielle φλαβονοειδή. Μετά την επεξεργασία όπως στο Α, τα κύτταρα φορτώθηκαν με MitoSox Κόκκινο και αναλύθηκαν ως προς τα επίπεδα του κόκκινου φθορισμού (FL2). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται με τον ίδιο τρόπο όπως στο Α, και είναι μέσες ± S.E. τριών έως πέντε πειραμάτων C. Η επιβίωση των MDAMB231 κύτταρα κατεργασμένα με φλαβονοειδή στα 10 μg /ml για 24 ώρες απουσία ή παρουσία 10 mM πυροσταφυλικό ή NAC. Τα αποτελέσματα είναι μέσες ± S.E. (N = 3). Σημαντικές διαφορές (** Ρ & lt? 0,01, * Ρ & lt? 0,05) μεταξύ των κυττάρων σε επεξεργασία με φλαβονοειδή ή Bezielle μόνα ή σε παρουσία αντιοξειδωτικών είναι τα e απεικονίζεται. D. Ομοίως όπως στο C, με κύτταρα ΜΟΡ10Α.

Η

Η επαγωγή της μιτοχονδριακής σουπεροξειδίου εξετάστηκε χρησιμοποιώντας το δείκτη MitoSox Red έδειξαν ότι τα φλαβονοειδή αποσπάσει μια χρονο-εξαρτώμενη αύξηση στη μιτοχονδριακή σουπεροξειδίου σε MDAMB231 κύτταρα (Σχήμα 3Β). Η αύξηση ήταν πολύ σημαντική (τουλάχιστον 5 φορές) για τρία φλαβονοειδή, αλλά όχι για carthamidin, η οποία έδειξε μόνο μία αύξηση κατά 30% μετά από 6 ώρες. Παραδόξως, απιγενίνη και luteolin, που ήταν λιγότερο κυτταροτοξικά σε MDAMB231 κύτταρα, που προκαλείται από τα υψηλότερα επίπεδα των μιτοχονδριακών υπεροξειδίου που αυξήθηκε περαιτέρω σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 3Β). Αυτό ήταν σε αντίθεση με την έλλειψη αύξησης των επιπέδων του υπεροξειδίου τύπου ROS την πάροδο του χρόνου σε κύτταρα επεξεργασμένα με αυτά τα φλαβονοειδή (Σχήμα 3Α). Scutellarein, παρόμοια με Bezielle, είχε μία μέτρια επίδραση στην μιτοχονδριακή υπεροξειδίου στην αρχή της επώασης, αλλά αύξησε τα επίπεδα του υπεροξειδίου περίπου επτά φορές μετά από 6 ώρες (Σχήμα 3Β).

Διέγερση ROS από Bezielle είναι κρίσιμη για την κυτταροτοξικότητα της, η οποία καταργήθηκε σε παρουσία οξειδωτικού καθαριστών όπως Ν-ακετυλοκυστεϊνη (NAC) και πυροσταφυλικό [1]. Έχουμε εξετάσει κατά πόσον NAC ή πυροσταφυλικού θα μπορούσε να αναστείλει κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από ατομική φλαβονοειδή. Τόσο πυροσταφυλικό και NAC ατομικά ανέστειλε κυτταρικό θάνατο που επάγεται από carthamidin και scutellarein σε MDAMB231 κύτταρα (Σχήμα 3C), υποδηλώνοντας ότι αυτές οι ενώσεις επάγουν κυτταρικό θάνατο μέσω οξειδωτικού στρες, παρόμοια με Bezielle. Ωστόσο, ούτε πυρουβικό ούτε NAC θα μπορούσε να προστατεύσει τα κύτταρα από MDAMB231 την επαγωγή κυτταρικού θανάτου περιορισμένο από απιγενίνη και luteolin (Σχήμα 3C), υποδεικνύοντας ότι ο θάνατος που προκαλείται από αυτές τις ενώσεις δεν ήταν συνέπεια της οξειδωτικής βλάβης.

Παρόμοια πειράματα διεξάγεται με ΜΟΡ10Α κύτταρα τα οποία είναι κάπως πιο ευαίσθητα στην θανάτωση από απιγενίνη και luteolin. Όπως και με MDAMB231 κύτταρα, υπήρχε ελάχιστη προστασία από πυροσταφυλικό και NAC από το θάνατο που επάγεται από απιγενίνη και luteolin, αλλά μια καλή προστασία παρατηρήθηκε με scutellarein και Bezielle επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 3D). Τα πειράματα με NAC και πυροσταφυλικό πραγματοποιήθηκαν επίσης με μια υψηλότερη συγκέντρωση φλαβονοειδών (20 μg /ml), και σε αυτή τη συγκέντρωση κύτταρα προστατεύονται επίσης από θανάτωση από carthamidin και scutellarein, αλλά όχι απιγενίνη και luteolin (δεν φαίνεται). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα ότι scutellarein και carthamidin προκαλεί κυτταρικό θάνατο μέσω των μηχανισμών που αφορούν το οξειδωτικό στρες, ενώ η απιγενίνη και luteolin, αν και προκαλούν κυτταρική ROS, να προκαλέσει περιορισμένη κυτταρικό θάνατο που δεν είναι οξειδωτική στη φύση.

Scutellarein προκαλεί κυρίως μιτοχονδριακό ROS που είναι κρίσιμες για την κυτταροτοξικότητα του

Bezielle επάγει ROS κυρίως στα μιτοχόνδρια, επειδή η θεραπεία της παραλλαγής Rho-0 του MDAMB231 που στερείται αναπνοή-ικανά μιτοχόνδρια, αποτυγχάνει να προκαλέσει είτε μιτοχονδριακή υπεροξειδίου ή υπεροξείδιο του τύπου ROS. Το πιο σημαντικό, MDAMB231 Rho-0 κύτταρα είναι αξιοσημείωτα ανθεκτικά στο θάνατο που προκαλείται Bezielle (Chen et al., Υποβληθέν). Ως εκ τούτου, εξετάσαμε αν η απουσία της αναπνοής μιτοχονδρίων επηρεάζει την επαγωγή ROS από τα επιμέρους φλαβονοειδή. Το Σχήμα 4Α δείχνει ότι η επαγωγή της μιτοχονδριακής υπεροξειδίου από όλα τα φλαβονοειδή είναι πολύ έντονα εξασθενημένος σε MDAMB231Rho-0 κύτταρα. Ειδικότερα, δημιουργία υπεροξειδίου από scutellarein και carthamidin ανεστάλη πλήρως. Ομοίως, η επαγωγή της DCF-DA τύπου ανιχνεύσιμο υπεροξείδιο ROS από carthamidin, scutellarein και Bezielle ήταν επίσης σχεδόν εντελώς αδρανές. Αυτό υποδεικνύουν έντονα ότι τα μιτοχόνδρια είναι η κύρια πηγή των ROS προκαλούνται από αυτά τα φλαβονοειδή Ωστόσο, απιγενίνη και luteolin ακόμη επάγεται σημαντικά επίπεδα DCF-DA ανιχνεύσιμη ROS σε Rho-0 κύτταρα. Αυτό δείχνει ότι η απιγενίνη και luteolin θα μπορούσε να στοχεύσει κυτταρική ROS άλλες πηγές, εκτός των μιτοχονδρίων.

Α. κύτταρα MDAMB231 και MDAMB231Rho-0 υπέστησαν κατεργασία με φλαβονοειδή για 6 ώρες, και τα επίπεδα των ROS και μιτοχονδριακή υπεροξειδίου προσδιορίστηκαν ποσοτικά όπως στο Σχήμα 2. Τα αποτελέσματα είναι μέσες ± S.E. (N = 3). Β MDAMB231 Rho-0 κύτταρα και MDAMB231 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Bezielle, scutellarein ή απιγενίνη για 24 ώρες, και τα ποσοστά επιβίωσης ποσοτικοποιηθεί κυττάρου. Τα δεδομένα είναι μέσος όρος τριών πειραμάτων. Γ απαγωγής της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικό από φλαβονοειδή. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 2 ώρες, φορτωμένο με δυναμικό ευαίσθητη χρωστική JC-1 και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Ο φθορισμός FL2 ανάγεται σε κύτταρα με χαμηλωμένη ΔΨm? FL2 των μη επεξεργασμένων κυττάρων ανατέθηκε ένα επίπεδο 100%. Όλες οι αγωγές είχαν ως αποτέλεσμα στατιστικά σημαντική διάχυση ΔΨm σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Σημαντικές διαφορές παρατηρήθηκαν επίσης μεταξύ των κυττάρων σε επεξεργασία με scutellarein και άλλες ομάδες, και υποδεικνύονται (** Ρ & lt? 0,01, * Ρ & lt? 0,05). D. Ανίχνευση καρβονυλιώνεται πρωτεϊνών σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με τις υποδεικνυόμενες φλαβονοειδή ή Bezielle για 4 ώρες. Μετά μονιμοποιήθηκαν κύτταρα θεραπεία, θεραπεία με DNP, πλύθηκαν και επωάστηκαν με ένα συζευγμένο με FITC αντίσωμα για DNP, και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Όλα τα αποτελέσματα είναι μέσες ± S.E. (N = 3). Σημαντικές διαφορές (** Ρ & lt? 0,01, * Ρ & lt? 0,05) συγκρίνονται με τα μη επεξεργασμένα φαίνεται

Η

Εμείς και άλλοι έχουν δείξει ότι το ευρέως χρησιμοποιούμενο αναστολέα NOX DPI έχει μια ισχυρή ανασταλτική επίδραση στην μιτοχονδριακή αναπνοή.. DPI αναστέλλει ισχυρά Bezielle επαγόμενη παραγωγή ROS και κυτταρικό θάνατο (Chen et al., Υποβληθέν). Εχουμε εξετάσει κατά πόσο DPI είναι ικανό να εξασθενεί επαγωγή ROS από φλαβονοειδή, και παρατηρείται έντονη αναστολή της ROS, πολύ παρόμοια με αυτή που παρατηρήθηκε σε Rho-0 κύτταρα (Σχήμα S2). Ως εκ τούτου, αναστολή της αναπνοής στο Rho-0 κύτταρα και σε κύτταρα με οξεία αγωγή με DPI είχαν πολύ παρόμοια ανασταλτικά αποτελέσματα στην επαγωγή του μιτοχονδριακού ROS από φλαβονοειδή (Εικόνα S2).

επόμενο εξετάστηκε αν η αναστολή της μιτοχονδριακής αναπνοής προστατεύει τα κύτταρα από φλαβονοειδή που προκαλείται από το θάνατο. Scutellarein, παρόμοια με Bezielle (Chen et al., Υποβληθέν), απέτυχε να διεγείρει θάνατο κυττάρου σε Rho-0 κύτταρα (Σχήμα 4Β). Ωστόσο, η επαγωγή κυτταρικού θανάτου από απιγενίνη (Σχήμα 4Β) και luteolin (δεν φαίνεται) δεν επηρεάστηκε από την έλλειψη λειτουργικών μιτοχονδρίων.

Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα ότι η απιγενίνη και luteolin δεν είναι πιθανό να συμβάλλουν στην οξειδωτική ικανότητα της Bezielle. Ακόμα κι αν οι δύο φλαβόνες προκάλεσε υψηλά επίπεδα μιτοχονδριακής υπεροξειδίου, ούτε η θεραπεία με αντιοξειδωτικά ούτε απενεργοποίηση μιτοχονδριακή αναπνοή επηρεάζεται περιορισμένη κυτταροτοξικότητα τους. Ως εκ τούτου, η συμβολή των απιγενίνη και luteolin την κυτταροτοξικότητα του Bezielle δεν θα μπορούσε να περιλαμβάνει ROS. Αντίθετα, η κυτταροτοξικότητα της scutellarein και carthamidin έντονα αναστέλλεται, είτε από επεξεργασία με ROS οδοκαθαριστές ή στο Rho-0 κύτταρα, παρόμοια με Bezielle.

Τα φλαβονοειδή προκαλέσει μείωση της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικό

Έχουμε προηγουμένως δείξει ότι Bezielle επάγει μία ισχυρή διάχυση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΔΨ) σε κύτταρα όγκου [3]. Ως εκ τούτου, εξέτασε τις πιθανές επιπτώσεις των φλαβονοειδών σε ΔΨm. Όπως φαίνεται στο σχήμα 4C, από τα τέσσερα φλαβονοειδή που ελέγχθηκαν, scutellarein που προκαλείται από την ισχυρότερη απώλεια ΔΨm, ενώ carthamidin δεν ήταν ιδιαίτερα ενεργός, σε συμφωνία με τα χαμηλά επίπεδα των μιτοχονδρίων ROS προκαλεί. Απιγενίνη και luteolin που προκαλείται διάχυση της ΔΨm? Ωστόσο, δεν ήταν τόσο δραματική όσο η απώλεια που προκαλείται είτε από scutellarein ή Bezielle. Εξετάσαμε, επίσης, αν η διάχυση του μιτοχονδριακού διαμεμβρανικού δυναμικού με φλαβονοειδή θα μπορούσαν να εξασθενήσουν με αντιοξειδωτικά. Το σχήμα δείχνει ότι η S3 NAC εμπόδισε μερικώς την απώλεια ΔΨm που προκαλείται από scutellarein αλλά όχι από απιγενίνη (και λουτεολίνη, που δεν φαίνεται). Πυροσταφυλικό είχε μια παρόμοια επηρεάζουν (δεν φαίνεται). Μαζί με τα αποτελέσματα που περιγράφονται παραπάνω, αυτό αποτελεί ισχυρή ένδειξη ότι scutellarein (και Bezielle) προκαλούν άμεση οξειδωτική βλάβη στα μιτοχόνδρια των κυττάρων του όγκου. Απιγενίνη και luteolin ίσως προκαλούν κυτταρικές αποκρίσεις που περιλαμβάνουν τα μιτοχόνδρια, αλλά δεν θα μπορούσε να εξαρτάται επί μιας άμεσης οξειδωτική βλάβη στα μιτοχόνδρια.

Επαγωγή της οξείδωσης πρωτεΐνης

Το οξειδωτικό στρες προκαλεί βλάβη των βιομορίων, εκτός από το DNA. Εχουμε εξετάσει κατά πόσο Bezielle και φλαβονοειδή του επάγουν μία κοινή οξειδωτική τροποποίηση των πρωτεϊνών, καρβονυλίωση. Η Εικόνα 4D δείχνει ότι Bezielle και scutellarein σημαντική αύξησε την κυτταρική περιεκτικότητα του καρβονυλιώνεται πρωτεΐνες, και μια μικρή αύξηση παρατηρήθηκε με απιγενίνη. Carthamidin και luteolin δεν προκάλεσε οξειδωτική βλάβη σε κυτταρικές πρωτεΐνες. Η επαγωγή της πρωτεΐνης καρβονυλίωσης με Bezielle και scutellarein παρέχει ένα επιπλέον επιβεβαίωση για την υπόθεση ότι scutellarein είναι ο κύριος κυτοτοξικός παράγων σε Bezielle.

Διέγερση της βλάβης του DNA από φλαβονοειδή από Bezielle

Bezielle προκαλεί οξειδωτική DNA ζημιά που είναι κρίσιμη για την ικανότητά της να σκοτώσει επιλεκτικά τα καρκινικά κύτταρα [1]. Έχουμε εξετάσει ποια από μεμονωμένες φλαβονοειδή Bezielle προκαλεί βλάβη στο DNA. MDAMB231 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με φλαβονοειδή και να ποσοτικοποιηθούν για δύο παραμέτρους βλάβης DNA χρησιμοποιώντας δοκιμασία κομήτη: ποσοστό των κυττάρων με κατεστραμμένα DNA, και τη στιγμή της ελιάς (η τελευταία αντανακλά την έκταση της βλάβης του DNA ανά κύτταρο). Τα φλαβονοειδή δοκιμάστηκαν σε συγκεντρώσεις Comet δοκιμασία χρησιμοποιώντας από ml και η επώαση φορές /5 έως 20 μg από 30 λεπτά έως 6 ώρες. Ακόμη και στην υψηλότερη συγκέντρωση που δοκιμάστηκε, 20 μg /ml, απιγενίνη και luteolin δεν προκαλεί βλάβη στο DNA ανιχνεύσιμο σε Comet προσδιορισμό (δεν παρουσιάζεται).

Scutellarein και carthamidin βλάβη προκαλούμενη σημαντική DNA σε συγκεντρώσεις 5 μg /ml και πάνω από. Isoscutellarein επάγεται επίσης βλάβες στο DNA, αλλά μόνο σε υψηλότερες συγκεντρώσεις (δεν φαίνεται). Το Σχήμα 5Α δείχνει ότι το ποσοστό των κυττάρων που σχηματίζουν κομήτες παρουσία scutellarein αυξήθηκε βαθμιαία την πάροδο του χρόνου.