Αφηρημένο

συντριπτικά στοιχεία απέδειξε ότι η παρεκκλίνουσα έκφραση του ανθρώπινου τροφοβλάστη αντιγόνο κυτταρικής επιφάνειας (TROP2) συνδέθηκε με την επιθετικότητα του όγκου και κακή πρόγνωση σε ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων, ωστόσο οι ρόλοι των TROP2 σε καρκίνο του τραχήλου δεν έχουν διερευνηθεί. Ο σκοπός της μελέτης μας ήταν να διευκρινιστεί η προγνωστική σημασία της έκφρασης TROP2 σε ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας και καθοριστούν οι επιπτώσεις της στην εξέλιξη των όγκων. προσδιορισμός ανοσοϊστοχημείας έδειξε ότι το 88,7% (94/106 περιπτώσεις) των κολπικών δειγμάτων καρκίνου θετικά βάφονται με TROP2, και η υπερέκφραση της TROP2 ήταν στενά συνδεδεμένη με το στάδιο της νόσου, την ιστολογική τους βαθμούς, λεμφικό μετάσταση, επεμβατική διάμεση βάθος και υψηλή έκφραση του Ki-67 . Ασθενείς με TROP2-θετική χρώση παρουσίασαν σημαντικά μειωμένη συνολική επιβίωση και την επιβίωση χωρίς εξέλιξη? ήταν επίσης ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης για την πρόγνωση σύμφωνα με πολυπαραγοντική ανάλυση. Επιπλέον, προς τα κάτω ρύθμιση των TROP2 διαμεσολαβείται από siRNA σε κύτταρα Siha και CaSki οδήγησε σε ισχυρή αναστολή του πολλαπλασιασμού και της εισβολής, TROP2 κατάργηση αυξημένα επίσης την αποπτωτική αναλογία και προκάλεσε G1 σύλληψης. Αντιστρόφως, εκτελούνται έκφραση TROP2 σε HeLa και κύτταρα C33A αξιοσημείωτα προωθείται κυτταρική ανάπτυξη, τη μετανάστευση και εισβολή. Επιπλέον, η ογκογονική λειτουργία των TROP2 συνδέθηκε με τις αυξημένες εκφράσεις της κυκλίνης D1, κυκλίνη Ε, CDK2 και CDK4 αλλά μειωμένη έκφραση του ρ27 και Ε-καδερίνης μέσω της ενεργοποίησης του Erk1 /2 μονοπάτι σηματοδότησης. Περαιτέρω, η αναστολή της έκφρασης TROP2 σε καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές ενισχύει την ευαισθησία στη σισπλατίνη. Η παρούσα μελέτη υποδεικνύουν ότι η υπερέκφραση του TROP2 μπορεί να παίζουν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη και παθογένεση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας του ανθρώπου, ως εκ τούτου, TROP2 μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα υποψήφιο προγνωστικός δείκτης και ένα δυνητικό θεραπευτικό στόχο του καρκίνου του τραχήλου

Παράθεση:. Liu Τ , Liu Υ, Bao Χ, Tian J, Liu Υ, Yang Χ (2013) η υπερέκφραση του TROP2 Προβλέπει κακή πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας και προωθεί τον πολλαπλασιασμό και τη διείσδυση των κυττάρων του καρκίνου του τραχήλου με τη ρύθμιση ERK μονοπάτι σηματοδότησης. PLoS ONE 8 (9): e75864. doi: 10.1371 /journal.pone.0075864

Επιμέλεια: Irina U. Agoulnik, Διεθνές Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 10, 2013? Αποδεκτές: 22 Αυγ, 2013? Δημοσιεύθηκε: 27η Σεπτεμβρίου του 2013

Copyright: © 2013 Liu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας και της Επιστήμης (Νο 81372809) και Τεχνολογικής Ανάπτυξης Σχεδιασμού της επαρχίας Shandong (Νο 2011GSF12121). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του τραχήλου της μήτρας είναι ο τρίτος πιο διαδεδομένη κακοήθεια στις γυναίκες σε όλο τον κόσμο [1], με εκτιμώμενη περίπου 530.000 νέα περιστατικά και 275.000 γυναίκες θάνατο κάθε χρόνο.

ασθενών πρωτόπειροι (Ι-ΙΙΑ) μπορεί να πάρει ένα ικανοποιητικό αποτέλεσμα μέσω ριζική χειρουργική επέμβαση ή ακτινοθεραπεία, με συνολική επιβίωση 5 ετών & gt? 65%. Παρ ‘όλα αυτά, οι ασθενείς με προχωρημένο στάδιο (ΙΙΒ-IV) μπορεί να αντιμετωπιστεί μόνο με την ακτινοθεραπεία ή και χημειοθεραπεία, το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών για ασθενείς με σταδίου ΙΙΙ είναι 25 έως 35%, αλλά για το στάδιο IV είναι 15% ή λιγότερο [2] , [3]. Υπάρχουν αρκετοί παράγοντες υψηλού κινδύνου πιστεύεται ότι συνδέονται στενά με δυσμενή κλινική έκβαση, συμπεριλαμβανομένων των προηγμένων Διεθνής Ομοσπονδία Μαιευτικής και Γυναικολογίας στάδιο (FIGO), το μεγάλο μέγεθος του όγκου, μετάσταση στους λεμφαδένες, βαθιά του τραχήλου της μήτρας εισβολή στρωματικά και lymphovascular χώρο εισβολή. Ασθενείς με τους παράγοντες υψηλού κινδύνου να αναπτύξουν πάντα αντίσταση στη χημειοθεραπεία και την ακτινοθεραπεία, τελικά πέθανε τοπικής υποτροπής ή μακρινή μετάσταση. Ως εκ τούτου, υπάρχει επείγουσα ανάγκη να ψάξουν για νέες βιοδεικτών ως συμπληρωματική προγνωστική ένδειξη για την έγκαιρη διάγνωση και την ακριβή εκτίμηση της πρόγνωσης, η οποία θα ήταν χρήσιμη στην στόχευση θεραπείες του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας.

τροφοβλάστης αντιγόνο επιφανείας του κυττάρου 2 (TROP2) είναι ένας 36 kDa διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη που ανήκει σε συνδεόμενη με όγκο μετατροπέα σήματος ασβέστιο οικογένεια γονιδίων (TACSTD). Αρχικά ταυτοποιηθεί στο ανθρώπινο τροφοβλάστης κυτταρικές σειρές, και αυξημένη έκφραση βρέθηκε σε διαφόρων τύπων επιθηλιακών καρκινωμάτων ενώ οι χαμηλές ή περιορισμένη έκφραση βρέθηκε σε φυσιολογικούς ιστούς [4]. Εκτός TROP2, επιθηλιακά μόριο κυτταρικής προσκόλλησης (EpCAM) γονίδιο είναι το άλλο εξαιρετικά διατηρημένη μέλος της οικογένειας γονιδίου TACSTD, μοιράζονται 49% ομολογία αλληλουχίας με τόσο τύπου Ι και θυρεοσφαιρίνη ιντερλευκίνης-2 υποδοχείς [5]. Αν και η ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου TROP2 δεν είναι πλήρως κατανοητή, οι θέσεις φωσφορυλίωσης της κυτταροπλασματικής περιοχής ουρά και μια διατηρημένη τυροσίνης και σερίνης θέση φωσφορυλίωσης θεωρείται ότι παίζει ένα σημαντικό ρόλο στη μεταγωγή σημάτων. Οι πρώτες μελέτες διαπίστωσαν ότι εγκάρσιας σύνδεσης TROP2 με αντισώματα οδηγήσει στην κυτταροπλασματική του ασβεστίου [Ca

2+] αυξήθηκε κατά τρεις φορές από το βασικό επίπεδο, το οποίο πρότεινε την κινητοποίηση των Ca

2 + από εσωτερικές αποθήκες [6]. Όταν φωσφατιδυλινοσιτόλη 4, φωσφορικό 5-δις (ΡΙΡ2) σύνδεση με την κυτταροπλασματική ουρά του TROP2, θα μπορούσε ενδεχομένως να οδηγήσει σε αύξηση του 1,4,5-τριφωσφορική ινοσιτόλη (ΙΡ3), η οποία είναι απαραίτητη για το Ca

2+ κινητοποίηση . Με περισσότερα Ca

2+ απελευθερώνεται από το ενδοπλασματικό δίκτυο, την πρωτεϊνική κινάση C (PKC) θα μπορούσε να ενεργοποιηθεί σε ένα θετικό μηχανισμό ανάδρασης που θα μπορούσε να σε σειρά τους οδηγούν σε φωσφορυλίωση της πιο TROP2, αυτή η διαδικασία θα μπορούσε να έχει σημαντική επίδραση στην ενεργοποίηση των μονοπατιών Raf, ΜΑΡΚ και NF-κΒ και ούτω καθεξής [7].

Πρόσφατες εργασίες έδειξαν ότι TROP2 συμπεριφέρθηκε ως μια πραγματική ογκογονίδιο που οδηγεί στην ογκογένεση και διεισδυτικότητα σε ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές [8], και η υπερέκφραση του TROP2 ήταν στενά συνδεδεμένη με την εξέλιξη του καρκίνου και κακή πρόγνωση. Οι ερευνητές έχουν βρει ότι δισιστρονική κυκλίνη D1-TROP2 mRNA ήταν συχνά εκφράζεται σε ωοθηκών, του παχέος και του ενδομητρίου, και τόσο οι TROP2 και κυκλίνη D1 χαρακτηριστικές ομάδες στην χίμαιρα θα μπορούσε να επάγει κυτταρική κακοήθη μετασχηματισμό [9]. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι όλες οι TROP2 δεν είναι μόνο μια πιθανή πρόγνωση βιοδεικτών, αλλά επίσης υποψήφιος ως θεραπευτικός στόχος η οποία θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί στην ανάπτυξη καινοτόμων θεραπευτικών στρατηγικών. Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε την έκφραση της πρωτεΐνης TROP2 και συσχέτιση με κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά και τα κλινικά αποτελέσματα σε δείγματα καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Επιπλέον, αξιολογήσαμε τις επιδράσεις της έκφρασης TROP2 επί του πολλαπλασιασμού, κυτταρικό κύκλο και εισβολή σε τέσσερις τραχήλου καρκινικές κυτταρικές σειρές, προσδιορίσαμε επίσης αν TROP2 παίζει ένα ρόλο στη χημειοθεραπεία του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Τα δεδομένα αυτά θα μπορούσαν να παρέχουν πληροφορίες για την πρόγνωση του τραχήλου της μήτρας πρόγνωση του καρκίνου και τη δημιουργία στοχευμένων θεραπειών.

Μέθοδοι

κλινικοπαθολογική Πληροφορίες του τραχήλου της μήτρας Καρκινοπαθών

Ένα σύνολο 160 δειγμάτων που λαμβάνονται με βιοψία γροθιά, κωνοειδής βιοψία ή υστερεκτομή ανακτήθηκαν από το Τμήμα Παθολογίας, Qilu Νοσοκομείο του Πανεπιστημίου της Shandong μεταξύ Απρίλιος 2005 – Οκτώβριος 2007 (Πίνακας 1). Η μελέτη συμπεριέλαβε 106 ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας (μέση ηλικία 43,6 ± 11,5 χρόνια), 34 ασθενείς με τραχηλική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (CIN) (μέση ηλικία 40,2 ± 8,1 χρόνια) και 20 ασθενείς με φυσιολογική αυχενική ιστούς (μέση ηλικία 46,4 ± 4,8 έτη). Φυσιολογικά δείγματα τραχηλικού ιστού ελήφθησαν από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε υστερεκτομή για καλοήθη ινομυωμάτων. Όλοι οι εγγεγραμμένοι συμμετέχοντες είχαν άθικτο πληροφορίες παρακολούθησης και δεν είχαν εκτεθεί σε ακτινοθεραπεία ή χημειοθεραπεία πριν από την χειρουργική εκτομή. Τα δείγματα επιβεβαιώθηκαν ιστοπαθολογικά από τρεις παθολόγους σύμφωνα με τα διαγνωστικά κριτήρια. Κλινικό στάδιο του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας ταξινομήθηκε σύμφωνα με τη Διεθνή Ομοσπονδία Γυναικολογίας και τα κριτήρια (FIGO) Μαιευτική. Κατά τη διάρκεια της περιόδου παρακολούθησης (διάμεση παρακολούθηση 60 μηνών? Εύρος 9,6 έως 82,5 μήνες), 68 ασθενείς (64.15%) ήταν ζωντανοί και 38 ασθενείς (35,85%) ήταν νεκρά. Η μελέτη αυτή εξετάστηκε και εγκρίθηκε από την Θεσμική υγειονομική επιτροπή Δεοντολογίας της Qilu Νοσοκομείο, Πανεπιστήμιο Shandong. Όλοι οι συμμετέχοντες έδωσαν γραπτή συγκατάθεση τους να συμμετέχουν σε αυτό το έργο.

Η

Η ανοσοϊστοχημεία

Η ανοσοϊστοχημική χρώση πραγματοποιήθηκε στις 4-μm πάχους τμήματα των ιστούς παραφίνης, και η διαδικασία χρώσης ήταν αυστηρά πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο συμπλόκου στρεπταβιδίνης-βιοτίνης-υπεροξειδάσης. Μετά deparaffinisation και επανυδάτωση, τα τμήματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% για να εμποδίσει ενδογενούς υπεροξειδάσης. Η μη ειδική δέσμευση παρεμποδίστηκε με φυσιολογικό ορό κατσίκας για 30 λεπτά στους 37 ° C, στη συνέχεια οι τομές επωάστηκαν με αντι-TROP2 (Santa Cruz, USA, 1:500 αραίωση) ή αντι Ki-67-μονοκλωνικό αντίσωμα (Dako, lostrup , Δανία, 1:100 αραίωση) επί μία νύκτα στους 4 ° C. Μετά από πλύση με PBS, οι τομές επωάστηκαν με ένα χρένο πολυμερές δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο αντι-ποντικού σημασμένο με υπεροξειδάση (Πεκίνο Zhong Shan Biotech Co. Ltd, Πεκίνο, Κίνα) στους 37 ° C για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, οι τομές χρωματίστηκαν με 3,3-διαμινοβενζιδίνη τετραϋδροχλωρική για 5 λεπτά και πυρήνες με αιματοξυλίνη για 3 λεπτά, και στη συνέχεια τοποθετείται με ουδέτερο βάλσαμο. PBS χρησιμοποιήθηκε για να αντικαταστήσει το αντίσωμα ως αρνητικός έλεγχος.

Αξιολόγηση και Ποσοτικοποίηση των ανοσοχρώση

Τα αποτελέσματα ανοσοχρώση αξιολογήθηκαν από τρεις παθολόγους που δεν γνώριζαν τις κλινικές λεπτομέρειες των ασθενών. έκφραση TROP2 ορίστηκε ως η παρουσία του κίτρινου-καφέ χρώση μεμβράνη των καρκινικών κυττάρων. Κάθε δείγμα πρέπει να εκτιμηθεί συμπεριλαμβανομένης της έντασης χρώσης και το ποσοστό των θετικών κυττάρων όγκου με όχι λιγότερο από 1000 κύτταρα και 5 πεδία υψηλής ισχύος. Η ένταση της χρώσης βαθμολογήθηκε ως 0 (αρνητική), 1 (ασθενής), 2 (μέτρια) και 3 (ισχυρή), ενώ το ποσοστό των θετικών κυττάρων βαθμολογήθηκε ως 0 (0%), 1 (1-10%), 2 (11-50%) και 3 (51-100%). Τα συνολικά ανοσοϊστοχημική χρώση αποτελέσματα βασίστηκαν στο σκορ ένταση × ποσοστό βαθμολογίας χρώση ως εξής: – (βαθμολογία 0)? + (Βαθμός 1, 2, 3)? ++ (Βαθμολογία 4, 6)? +++ (Σκοράρει 9) [10]. Για Ki-67, ο δείκτης σήμανσης (LI) εκτιμήθηκε ως το ποσοστό των κυττάρων με πυρηνική χρώση μεταξύ 1000 μεταστατικών κυττάρων όγκου σε τυχαία επιλεγμένα, το τελικό σκορ του Ki-67 έκφραση κατηγοριοποιήθηκε σε τέσσερις ομάδες με βάση το δείκτη σήμανσης και την τοποθεσία της πυρηνικής χρώσης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11]. Η κατάταξη ήταν η εξής: -, (& lt? 10%, περιορίζεται στα στρώματα παραβασικών κυττάρων)? +, (10% σε & lt? 30%, περιορίζεται στο κατώτερο τρίτο του επιθηλίου)? ++, (30 & lt? 70%, φθάνοντας το ανώτερο τρίτο του επιθηλίου)? +++, (70% ή περισσότερο των επιθηλιακών κυττάρων συμπεριλαμβανομένης της πλήρους πάχους ρητή ιόντων Ki-67).

Cell Culture

Τέσσερις ανθρώπινου κολπικού καρκινικές κυτταρικές σειρές CaSki, Siha, HeLa και C33A κύτταρα αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA), καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco-τροποποιημένο μέσο Eagle (DMEM? Gibco Inc., Carlsbad, CA, USA) που περιέχει 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (Invitrogen, Carlsbad, CA , USA) και 1% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (Invitrogen) σε υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C και 5% CO

2 ατμόσφαιρα.

ανοσοφθορισμού χρώσης

Siha και CaSki κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε γυάλινες πλάκες σε μια πλάκα 6 φρεατίων και επωάστηκαν για 24 ώρες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και αποκλείστηκαν με φυσιολογικό ορό αίγας για 30 λεπτά στους 37 ° C. Μετά από διεξοδική πλύση με αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris (TBS), τα κύτταρα επωάστηκαν με πρωτογενές μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-TROP2 (Santa Cruz, USA, 1:500 αραίωση) επί μία νύκτα στους 4 ° C και χρωματίστηκαν με FITC συζευγμένο αντι-ποντικού IgG (Πεκίνο Zhong Shan Biotech Co., Ltd, Πεκίνο, Κίνα, 1:200 αραίωση) για 30 λεπτά. Ο φθορισμός-επισημασμένο TROP2 παρατηρήθηκε κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού και λήφθηκε φωτογραφία.

Cells Οι επιμολύνσεις

Για να γκρεμίσουμε ενδογενούς έκφρασης TROP2, δύο ζεύγη των siRNA αλληλουχίες που στοχεύουν TROP2 σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν από Genepharma Co., Ltd (Σαγκάη, Κίνα). Αυτές οι αλληλουχίες ήταν: siRNA-1100, 5′-GCACGCUCAUCUAUUACCUTT-3 ‘, 5′-AGGUAAUAGAUGAGCGUGCTT-3? siRNA-550, 5’-CCAAGUGUCUGCUGCUCAATT-3 ‘, 5′-UUGAGCAGCAGACACUUGGTT-3’. Αρνητικός αλληλουχίες ελέγχου σκαρφάλωμα ήταν: 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘, 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’. Για τη μελέτη των επιπτώσεων της TROP2 επιβληθεί έκφρασης, η TROP2 ισομορφή που εκφράζει το πλασμίδιο που απασχολούνται σε κύτταρα HeLa και C33A. Το ανθρώπινο TROP2 cDNA πλήρους μήκους ενισχύθηκε και εισάγεται στον φορέα pcDNA 3.1 (Genepharma Co., Ltd Σαγκάη, Κίνα) για να ληφθεί pcDNA3.1-TROP2. Για την επιμόλυνση, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και αναμένεται να είναι 50% συρροή την επόμενη ημέρα. Μετά την προσκόλληση των κυττάρων, TROP2 siRNA ή το ανασυνδυασμένο pcDNA3.1-TROP2 διαμολύνθηκαν σε κύτταρα σε Ορίί-ΜΕΜ (Invitrogen) χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο διαμόλυνσης Lipofectamime 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, το μέσο καλλιέργειας αντικαταστάθηκε μετά από 6 ώρες επώασης. Μετά από 48 ώρες διαμόλυνσης, τα κύτταρα μετρήθηκαν και υποβλήθηκαν σε δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας και ανάλυση στυπώματος western. Τα μη μετεμβολιασμένα κύτταρα πιστεύεται ότι είναι τυφλός μάρτυρας, κύτταρα επιμολυσμένα με περιπλεγμένο siRNA ή pcDNA3.1 (κενός φορέας) θεωρήθηκαν ως αρνητικός έλεγχος.

Βιωσιμότητας Κυττάρων Δοκιμασία

Κυτταρική βιωσιμότητα προσδιορίσθηκε χρησιμοποιώντας ένα κύτταρο μετρώντας kit-8 (CCK-8), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Jingmei βιοτεχνολογίας, Σαγκάη, Κίνα). Εν συντομία, ο έλεγχος και επιμολυσμένα κύτταρα σπάρθηκαν στα 5000 ανά φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων μετά από αγωγή με σισπλατίνη (Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA) ή ΜΕΚ αναστολέα U0126 (Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ, USA) σε υποδεικνύεται χρονικά σημεία, 10 ul του CCK-8 προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο, στη συνέχεια επωάστηκαν για επιπλέον 2 ώρες στους 37 ° C. Η οπτική πυκνότητα (OD) μετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλάκας (Bio-Rad Model 680, Richmond, CA, USA) σε μήκος κύματος 450 nm. Οι ανασταλτικές συγκεντρώσεις 50% του πολλαπλασιασμού (IC50) της σισπλατίνης υπολογίστηκαν με λογισμικό GraphPad Prism. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές.

Προσδιορισμός απόπτωσης

Στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό PBS, επαναιωρήθηκαν σε 400 ρυθμιστικό σύνδεσης uL αννεξίνης V-FITC σε ένα πυκνότητα 1 × 10

6 κύτταρα /ml. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με 5 μΙ αννεξίνης V-FITC και το ιωδιούχο προπίδιο 10 ul (ΡΙ), σύμφωνα με την απόπτωση Detection Kit (Jingmei βιοτεχνολογίας, Σαγκάη, Κίνα) οδηγίες. Στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε κυτταρομετρία ροής (BD, San Jose, CA, USA) για την ανίχνευση κυτταρικής απόπτωσης. Αυτό το πείραμα διεξήχθη τρεις φορές.

Κύκλου Κυττάρου Ανάλυση

Κύτταρα μετεμβολιασμένα με TROP2 siRNA ή pcDNA3.1-TROP2 συλλέχθηκαν στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση και σταθεροποιήθηκαν σε 75% κρύο αιθανόλης για 1 ώρα στους -20 ° C. Μετά από πλύση με PBS, τα κύτταρα επωάστηκαν με 100 μΙ RNase Α (100 μg /ml) και 400 μΙ ιωδιούχου προπιδίου, αντίστοιχα, για 30 λεπτά στους 37 ° C. Τέλος, το κυτταρικό κύκλο μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής ΡΑΟδοβη (BD, San Jose, CA, USA) στα 488 nm, και οι σχετικές αναλογίες των G1, S, G2 και φάσεις αναλύθηκε με FlowJo 2.8 λογισμικό. Το πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν.

Επούλωση Δοκιμασία

Η μονοστιβάδα επούλωσης τραυμάτων δοκιμασία χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει την ικανότητα κυτταρικής μετανάστευσης. Κύτταρα (5 × 10

5) σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων, επωάστηκαν όλη τη νύκτα, στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με TROP2 siRNA ή pcDNA3.1-TROP2. Μετά την επίτευξη του 90% συρροή, η κυτταρική μονοστιβάδα γδαρμένο με ένα στείρο ρύγχος πιπέτας, επιπλέοντα κύτταρα αφαιρέθηκαν με PBS και καλλιεργήθηκαν ξανά σε RPMI 1640 που περιέχει 1% FBS. Φωτογραφικές εικόνες ελήφθησαν στις 0, 24 και 48 ώρες κατά μήκος της γραμμής απόξεσης με μικροσκόπιο. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως σχετική πλάτος μηδέν, με βάση την απόσταση μετανάστευσαν σε σχέση με το αρχικό γδαρμένο απόσταση. Το πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν.

Δοκιμασία Κυττάρων Invasion

Η επεμβατική ικανότητα του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας ένα φρεατίων 24 transwell θάλαμο (κιτ δοκιμασίας εισβολή κυττάρων), υπολογίζοντας τα κύτταρα πέρασαν μέσω μιας μεμβράνης πολυανθρακικού (8-μm μέγεθος πόρου) (Corning Costar, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ). Η επιφάνεια πολυανθρακικό κάθε θαλάμου ήταν καλυμμένο με 20 μι Matrigel (BD Biosciences, USA? 1:04 αραίωση) για να δημιουργήσει μια τεχνητή βασική μεμβράνη. Κύτταρα (1 χ 10

5 κύτταρα) επιμολύνθηκαν με TROP2 siRNA ή pcDNA3.1-TROP2 εναιωρήθηκαν σε 200 υΙ 1640 χωρίς ορό και καλλιεργήθηκαν σε άνω θάλαμο transwell επί 24 ώρες στους 37 ° C, ο κατώτερος θάλαμος ήταν γεμίζουν με 600 μι 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS. Τα μη εισβάλλοντα κύτταρα που συνδέονται με την άνω επιφάνεια της μεμβράνης αφαιρέθηκαν με ένα αποστειρωμένο μάκτρο βάμβακος, και τα κύτταρα εισβολή διεισδύσει μέσω της μεμβράνης βάφτηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες επί 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι αριθμοί των κυττάρων υπολογίστηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο Leica σε οκτώ τυχαία πεδία. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές για κάθε ομάδα.

Hoechst 33258 χρώσης

Στις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα επιμολυσμένα κύτταρα και τα κύτταρα ελέγχου εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις σισπλατίνης για 48 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 15 λεπτά ακολουθούμενη από χρώση με 100 μg /ml του Hoechst 33258 (Beyotime, Σαγκάη, Κίνα) σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι για 30 λεπτά, τα αποπτωτικά χαρακτηριστικά αξιολογήθηκαν με παρατήρηση συμπύκνωση χρωματίνης ή θραύσματα κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού με μήκος κύματος διέγερσης 340 να 360 nm.

Ανάλυση Western Blot

ισοδύναμη ποσότητα των δειγμάτων κυτταρικής πρωτεΐνης φορτώθηκαν σε ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου δωδεκύλ θειικού νατρίου 10% (SDS -PAGE) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF χρησιμοποιώντας το σύστημα Bio-Rad ηλεκτρομεταφορά. Μετά μπλοκαριστεί από 5% w /v άπαχο ξηρό γάλα για 1 ώρα, οι μεμβράνες επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα ειδικά για TROP2 (Santa Cruz Biotechnolog, CA, USA? 1:1000 αραίωση), Ε-καδερίνης, κυκλίνη D1, κυκλίνη Ε, CDK2, CDK4, Erk1 /2, π-Erk1 /2, P27, bcl-2 και bax (Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ, USA? 1:1000 αραίωση) επί μία νύκτα στους 4 ° C. Στη συνέχεια, επωάζονται με υπεροξειδάση αρμορακίας δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο αντι-ποντικού κουνελιού (Πεκίνο Zhong Shan Biotech Co. Ltd, Beijing, China? 1:4000 αραίωση) για 1 ώρα, οι ζώνες πρωτεΐνης έγιναν ορατές με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (Millipore) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας πυκνομετρικώς Ποσότητα Ένα λογισμικό Image (Bio-Rad, USA). β-ακτίνης (Beijing Zhong Shan Biotech Co., Ltd, Πεκίνο, Κίνα? 1:1000 αραίωση) χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος για την πρωτεΐνη φόρτωση και ανάλυση

Στατιστικές Αναλύσεις

SPSS (SPSS Inc. , Chicago, IL, USA) 18,0 λογισμικό χρησιμοποιήθηκε για να εκτελέσει τη στατιστική ανάλυση.

Ποσοτικά δεδομένα εκφράστηκαν ως μέσες τιμές ± τυπική απόκλιση (SD). Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων εκτιμήθηκαν με t δοκιμασία unpaired Student ή μονόδρομη ANOVA. Pearson chi-square test ή ακριβές τεστ του Fisher χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση μεταξύ του βαθμού χρώσης και κλινικές παραμέτρους, ανάλυση συσχέτισης διεξήχθη με συντελεστή Spearman rank συσχέτισης. Καμπύλες κατά Kaplan-Meier χαράχθηκαν για να περιγράψει τα στοιχεία επιβίωσης από τη δοκιμασία log-rank. Η πολυπαραγοντική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το μοντέλο αναλογικού κινδύνου παλινδρόμησης ενός Cox. P & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

TROP2 υπερεκφράζεται σε εξαιρετικά υπερπλαστική καρκίνων του τραχήλου

Συνολικά, 160 δείγματα προσδιορίστηκαν με ανοσοϊστοχημεία, συμπεριλαμβανομένων των 20 της κανονικής. του τραχήλου της μήτρας ιστούς, 34 CIN ιστούς και 106 του τραχήλου της μήτρας καρκινικούς ιστούς. Τα δημογραφικά δεδομένα και τα χαρακτηριστικά του όγκου που περιγράφονται στον Πίνακα 1. Κανένας από τους ασθενείς είχαν λάβει ακτινοθεραπεία ή χημειοθεραπεία πριν από τη χειρουργική επέμβαση. Σύμφωνα με τα κριτήρια που ορίζονται προηγουμένως, το 55% των φυσιολογικών τραχηλικών δειγμάτων έδειξε μη ανιχνεύσιμη έκφραση TROP2, 40% και 5% των δειγμάτων που εμφανίζεται αδύναμη και μέτρια χρώση, ανιχνεύθηκε κυρίως σε εξωτραχηλικά πλακώδες επιθήλιο (Εικόνα 1Α και Β). Περιέργως, η έκφραση του TROP2 αυξήθηκε βαθμιαία από CINI (50%) για να CINII (66,7%) και CINIII (76,9%? Σχήμα 1 C) (ρ = 0,037), υποδεικνύοντας έκφραση TROP2 συσχετίστηκε σημαντικά με την ανάπτυξη και την εξέλιξη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας . Επιπλέον, έντονη μεμβρανώδη χρώση TROP2 ανιχνεύθηκε σε πλειονότητα (88,7%) του τραχήλου της μήτρας περιπτώσεων καρκίνου ενώ τα στρωματικά κύτταρα ήταν αρνητικά τακτικά (Εικόνα 1 D, Ε και F). Η στατιστική ανάλυση έδειξε ότι το επίπεδο έκφρασης TROP2 σε τραχήλου της μήτρας περιπτώσεων καρκίνου ήταν σημαντικά υψηλότερη από ότι στην κανονική του τραχήλου της μήτρας ιστούς και τους ιστούς CIN (p & lt? 0.001).

Α-Β. Αρνητικό και ασθενή έκφραση TROP2 στην κανονική του τραχήλου της μήτρας ιστούς. Γ CIN III με ισχυρή χρώση μεμβράνης TROP2 (σκορ +++). D-E. Ισχυρά και ασθενή έκφραση TROP2 στο καρκίνωμα του τραχήλου sqamous κυττάρων (σκορ +++, +). ΣΤ έκφραση Ισχυρή TROP2 στο αδενοκαρκίνωμα του τραχήλου της μήτρας (σκορ +++). G-H. έκφραση Ki-67 σε CINIII και του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας (βαθμολογία ++, +++). Μεγεθύνσεις: × 200 (A, B, C, D, E) και × 400 (F, G, H)

Η

Για λόγους επαλήθευσης της σύνδεσης μεταξύ της έκφρασης TROP2 και εξέλιξη του καρκίνου, εμείς. Αναλύσαμε επίσης την έκφραση του Ki-67 στις ίδιες σειρές δειγμάτων τραχήλου με δοκιμασία ανοσοϊστοχημεία (Σχήμα 1 G και η). Ki-67 έχει αποδειχθεί ότι είναι ένα κοινό πολλαπλασιαστική δείκτη και χρησιμοποιούνται για την αξιολόγηση πολλών κακοήθεις αλλοιώσεις των καρκίνων. Η στατιστική ανάλυση έδειξε ότι υπήρξε σημαντική συσχέτιση μεταξύ της αυξημένης χρώσης TROP2 και Ki67-θετικά πολλαπλασιαστικά κύτταρα του τραχήλου της μήτρας δείγματα καρκίνου (ρ & lt? 0,001? Πίνακας 2)., Η οποία έδειξε ότι TROP2 ήταν υπερ-εκφράζεται σε υψηλά πολλαπλασιαστικές ανθρώπινου τραχηλικού καρκινικά κύτταρα

Συσχέτιση μεταξύ TROP2 έκφραση και κλινικής παθολογικά χαρακτηριστικά

Οι κλινικές σημασίες του TROP2 υπερέκφραση σε ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας συνοψίζονται στον πίνακα 1. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα επίπεδα έκφρασης TROP2 ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των ομάδων σε σχέση με την ιστολογική βαθμό (p & lt? 0.001), λεμφική μετάσταση (p = 0,001), επεμβατική διάμεση βάθος (p & lt? 0.001), το στάδιο της νόσου (p & lt? 0.001) και ιστολογική-υποτύπου (p = 0,023). Ωστόσο, δεν υπήρξε σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης TROP2 και την ηλικία (p = 0,100), το μέγεθος του όγκου (p = 0,255).

υψηλή έκφραση του TROP2 συσχετίζεται με κακή πρόγνωση σε καρκίνο του τραχήλου

Για να αξιολογήσει τον αντίκτυπο της έκφρασης TROP2 και κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά στην κλινική έκβαση των ασθενών, χρησιμοποιήσαμε την ανάλυση Kaplan -Meier και τη δοκιμασία log-rank για λογοκρισία δεδομένα επιβίωσης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, οι καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier έδειξε ότι οι ασθενείς με την έκφραση θετικής TROP2 είχε φτωχότερες συνολική επιβίωση (OS) συγκριτικά με εκείνους που δεν έχουν έκφραση TROP2 (p & lt? 0.01), η επιβίωση χωρίς εξέλιξη (PFS) και σταδιακά μειώθηκε με την αύξηση της TROP2 βαθμολογίες έκφραση (p & lt? 0,01). Με μονοπαραγοντική ανάλυση διαπιστώσαμε ότι κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά συμπεριλαμβανομένων προχωρημένα στάδια ΦΥΓΩ, κακώς ιστολογική βαθμό, θετικά λεμφικού μετάσταση και βαθύτερη επεμβατική διάμεση βάθος είχαν σημαντικά κατώτερη κλινικό αποτέλεσμα (Πίνακας 3). Στη συνέχεια, η έκφραση της TROP2, καθώς και όλα τα στατιστικά σημαντικές μεταβλητές που αξιολογήθηκαν στα μονομεταβλητών αναλύσεις εξετάστηκαν από πολυπαραγοντική ανάλυση μοντέλου παλινδρόμησης Cox. TROP2 υπερέκφραση πρωτεΐνης, μαζί με ιστολογικές βαθμού και του λεμφικού μετάσταση ταυτοποιήθηκαν να είναι ανεξάρτητοι προγνωστικοί παράγοντες για κακή OS (ρ = 0.022, ρ = 0.023 και ρ = 0.002, αντίστοιχα) και PFS (p = 0,016, ρ = 0,04 και ρ = 0,005 , αντίστοιχα).

η

TROP2 προωθεί τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα του τραχήλου του καρκίνου

με δεδομένη την απόδειξη ότι TROP2 αυξημένα έκφραση στενά συνδεδεμένη με την επιθετικότητα του όγκου και την κακή κλινική πρόγνωση, έχουμε περαιτέρω διερεύνησε τις λειτουργικές συνέπειες της εκφράσεως TROP2 σε καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές. Πρώτα απ ‘όλα, εξετάσαμε την έκφραση TROP2 σε τέσσερις τραχήλου καρκινικές κυτταρικές σειρές Siha, HeLa και CaSki και C33A με κηλίδα Western (Σχήμα 3Α). Σύμφωνα με την δοκιμασία ανοσοϊστοχημείας, TROP2 πρωτεΐνη προφανώς ανιχνεύθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές σε περίπου 36 kDa, Siha και CaSki κύτταρα έδειξαν σχετικά υψηλότερη έκφραση TROP2, ενώ η έκφραση του ήταν αδύναμη σε κύτταρα HeLa και C33A. Με ανάλυση ανοσοφθορισμού διαπιστώσαμε ότι υπήρχε ένα στρώμα της πράσινης φθορίζουσας χρώσης του cytomembrane του Siha και CaSki κύτταρα (Σχήμα 3Β). Για να διερευνήσουν περαιτέρω τις βιολογικές λειτουργίες του TROP2, εντοπίσαμε και επικυρώνονται δύο ακολουθίες ανεξάρτητων και μη επικαλυπτόμενες siRNA να καταστρέφουν τα ενδογενή έκφραση TROP2 στα SiHa κύτταρα και CaSki, HeLa και C33A κύτταρα επιμολυσμένα με pcDNA3.1-TROP2 για την ενίσχυση της έκφρασης TROP2. Κύτταρα επιμολυσμένα με περιπλεγμένο siRNA ή pcDNA3.1 θεωρήθηκαν ως αρνητικός έλεγχος, μη επιμολυσμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως τυφλό έλεγχο. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα του στυπώματος Western στις 48 ώρες μετά τη διαμόλυνση (Σχήμα 3C), το επίπεδο πρωτεΐνης TROP2 εμφανίζεται μια σημαντική παραλλαγή, οι δύο αλληλουχίες siRNA όλα οδηγούν σε μειωμένη έκφραση TROP2 κατά 50% -80% των κυττάρων Siha και CaSki, και pcDNA3.1-TROP2 ήταν σε θέση να παράγει τουλάχιστον το 30% προς τα πάνω ρύθμιση της TROP2 έκφρασης των HeLa και κύτταρα C33A.

Α. Η έκφραση του TROP2 βρέθηκε σε τέσσερα τραχήλου καρκινικές κυτταρικές σειρές με κηλίδα western, Siha και CaSki κύτταρα έδειξαν υψηλότερη έκφραση σε σύγκριση με τα κύτταρα HeLa και C33A, β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. B. ανοσοφθορισμού δοκιμασία κατέδειξε υπήρχε ένα στρώμα από πράσινη φθορίζουσα χρώση του cytomembrane σε SiHa κύτταρα και CaSki. ανάλυση κηλίδος Γ Western για να επιβεβαιώσετε την siRNA μεσολαβεί νοκ ντάουν και pcDNA3.1-TROP2 μεσολάβηση υπερέκφραση του TROP2 σε διάφορες καρκίνου του τραχήλου κυτταρικές σειρές. D. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με TROP2 siRNA ή pcDNA3.1-TROP2, η βιωσιμότητα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία CCK-8 σε πέντε χρονικά σημεία (0, 1, 2, 3, 4 ημέρες, αντίστοιχα). Σε 2 ημέρες μετά την επιμόλυνση, knockdown του TROP2 προκάλεσε μια σημαντική επίδραση αναστολή στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα Siha και CaSki, ενώ τις βίαιες έκφραση TROP2 αυξημένη κυτταρική βιωσιμότητα των κυττάρων HeLa και C33A. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων, * ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt?. 0.01

Η

CCK-8 δοκιμασία χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η επίδραση της έκφρασης TROP2 επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Τα αποτελέσματα μας αποκάλυψαν ότι knockdown του TROP2 προκάλεσε μία σημαντικά επίδραση αναστολής επί του πολλαπλασιασμού μετά από επιμόλυνση σε κύτταρα Siha και CaSki (ρ & lt? 0,05), ενώ η βιωσιμότητα των κυττάρων στην ομάδα διαμόλυνσης pcDNA3.1-TROP2 βελτιώθηκε σημαντικά (ρ & lt? 0,05? Εικόνα 3D). Σε συνδυασμό με τα αποτελέσματα ανοσοϊστοχημείας μας έδειξαν ότι TROP2 ήταν ιδιαίτερα εκφράζεται σε Ki67 θετικά πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα, αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι η έκφραση της TROP2 αύξησε την κυτταρική βιωσιμότητα του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων.

Επίδραση της έκφρασης TROP2 για την κυτταρική απόπτωση και κυτταρικού κύκλου

έχει αποδειχθεί ότι η απόπτωση των κυττάρων παίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη και την ανάπτυξη των όγκων, μπορούμε περαιτέρω διερευνηθεί εάν η αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, λόγω της λειτουργίας της απόπτωσης που προκαλείται. Η κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό κυτταρικής απόπτωσης στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι συνολικές τιμές των κυττάρων απόπτωσης της ομάδας διαμόλυνσης TROP2 siRNA (siRNA-1100 και siRNA-550) ήταν σημαντικά υψηλότερη σε σύγκριση με ομάδα αρνητικού ελέγχου και στις δύο SiHa κύτταρα και CaSki (ρ & lt? 0,05? Σχήμα 4Α). Εν τω μεταξύ, η τάση της πρόωρης απόπτωσης των κυττάρων και αργά ποσοστά απόπτωσης των κυττάρων ήταν σύμφωνο με αυτό του συνόλου των ποσοστών κυτταρικής απόπτωσης. Αντιθέτως, επιβάλλεται η έκφραση του TROP2 αναστέλλει σημαντικά την κυτταρική απόπτωση, οι αναλογίες των θετικών κυττάρων για αννεξίνη V και ιωδιούχο προπίδιο είχαν προφανώς μειώθηκαν σε κύτταρα HeLa και C33A, σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα και pcDNA3.1 επιμολυσμένα κύτταρα (Ρ & lt? 0,01, αντίστοιχα? Σχήμα 4Β). Για να διερευνήσουν περαιτέρω τις υποκείμενες μοριακούς μηχανισμούς με τους οποίους TROP2 νοκ ντάουν επάγει την απόπτωση, διερευνήσαμε τις εκφράσεις του bcl-2 και bax με κηλίδα Western (Σχήμα 4C). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση της πρωτεΐνης bcl-2 προφανώς μειώθηκε, ενώ bax ήταν σημαντικά αυξημένη στις δύο επιμολυσμένα κύτταρα Siha και CaSki σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (κωδικοποιημένο siRNA). Σε αντίθεση, HeLa και C33A κύτταρα επιμολύνθηκαν με pcDNA3. 1-TROP2 εμφάνισε το αντίθετο αποτέλεσμα (Εικόνα 4D). Αυτά τα ευρήματα έδειξαν ότι αντι-αποπτωτικό αποτέλεσμα του TROP2 επιτυγχάνεται με απ ‘ευθείας προς τα πάνω ρύθμιση bcl-2 έκφρασης και αναστέλλοντας Bax ενεργοποίηση.

A. Κάτω ρύθμιση των επαγόμενων TROP2 κυτταρικής απόπτωσης σε κύτταρα Siha και CaSki. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, ακολουθούμενη από δοκιμασία απόπτωσης χρησιμοποιώντας το κιτ ανίχνευσης απόπτωσης αννεξίνη V-FITC. Τα κύτταρα στα δεξιά άνω και κάτω τεταρτημόρια θεωρούν ως πρώιμη και όψιμη απόπτωση, αντίστοιχα, σε τα άνω αριστερό τεταρτημόριο θεωρούνται νεκρά κύτταρα. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με το λογισμικό FlowJo. B. Η αναγκαστική έκφραση TROP2 ανάλυση αναστέλλει σημαντικά την κυτταρική απόπτωση C. Western blot έδειξε ότι η ρύθμιση προς τα κάτω της TROP2 μείωσε την έκφραση του bcl-2 και αύξησε την έκφραση Bax σε SiHa κύτταρα και CaSki. D. Η αναγκαστική έκφραση TROP2 σε κύτταρα HeLa και C33A αύξησε την έκφραση του bcl-2 και μείωσε την έκφραση bax. Αυτά τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD τριών ανεξάρτητων πειραμάτων, * ρ & lt? 0.05, ** P & lt?. 0.01

Η

Για να αποκτήσετε μια πιο ολοκληρωμένη κατανόηση της λειτουργίας των γονιδίων TROP2, ερευνήσαμε περαιτέρω τις επιπτώσεις της έκφραση TROP2 επί του κυτταρικού κύκλου με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η εξάντληση των αποτελεσμάτων έκφρασης TROP2 στη συσσώρευση των κυττάρων στη φάση G1 και τη μείωση των κυττάρων στη φάση S στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση (ρ & lt? 0,05). Αντίθετα, επιβάλλεται έκφραση TROP2 στα HeLa και κύτταρα C33A έδειξαν σημαντική μείωση των κυττάρων στην G1 φάση αλλά μία αύξηση των κυττάρων στη φάση S και τη φάση G2-M (ρ & lt? 0,05? Σχήμα 5Β). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι TROP2 ήταν ικανή να ενισχύει τραχήλου καρκινικών κυττάρων πολλαπλασιασμός με την προώθηση G1-S και G2-M μεταβάσεις.

A. Νοκ ντάουν της επαγόμενης TROP2 G1 σύλληψη στη SiHa κύτταρα και CaSki. Siha και CaSki κύτταρα επιμολύνθηκαν με TROP2 siRNA ή ομελέτα siRNA. 48-ρύθμιση της επαγόμενης TROP2 σύλληψη του κυτταρικού κύκλου στην G1 φάση. B. Η υπερέκφραση του TROP2 προωθείται G1-S και G2-M μεταβάσεις σε HeLa και κύτταρα C33A. Γ, Δ TROP2 ρυθμίζονται παράγοντες του κυτταρικού κύκλου μέσω της ERK1 /2 σηματοδότηση και του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα. Siha και CaSki κύτταρα (C) διαμολύνθηκαν με TROP2 siRNA ή ομελέτα siRNA.