Αφηρημένο

επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών (EOC) είναι η πιο θανατηφόρα όλων των γυναικολογικών καρκίνων, και περιλαμβάνει ξεχωριστή ιστολογική υποτύπους που έχουν συγκεκριμένες γενετικές και τους ιστούς της προέλευσης διαφορές. Ωοθηκών σαφές καρκίνωμα (OCCC) αντιπροσωπεύει περίπου το 10% των περιπτώσεων και έχει ονομαστεί το άγχος του καρκίνου ανταποκρίνεται. OCCC χαρακτηρίζεται από αυξημένη έκφραση του οξειδωτικού στρες και τα γονίδια γλυκόλυση σχετίζονται. Στην παρούσα μελέτη, υποθέσαμε ότι βιοενεργειακό προφίλ θα μπορούσε μοναδικά διακρίνει OCCC από άλλες ιστολογικές υποτύπους του ΕΓΚ. Χρησιμοποιώντας ένα εξωκυτταρικό αναλυτή ροής, OCCC γραμμές (ES-2, TOV-21-G) έχουν αποδειχθεί ότι είναι εξαιρετικά μεταβολικά ενεργός, με υψηλό ποσοστό οξυγόνου κατανάλωση (OCR) και υψηλό εξωκυτταρικά ρυθμού οξίνισης (ECAR), ενδεικτικό της ενισχυμένης μιτοχονδριακή οξειδωτική φωσφορυλίωση και γλυκολυτικό ρυθμό, αντίστοιχα. Ένα υψηλό προφίλ βιοενεργητική συσχετίστηκε με την ικανότητα των κυτταρικών γραμμών να σχηματίσει αγκύρωση ανεξάρτητες σφαιροειδή. Δεδομένης της υψηλής γλυκολυτική και μιτοχονδριακή δραστηριότητα τους, τα κύτταρα OCCC εμφανίζεται ισχυρή ευαισθησία σε 2-δεοξυ-D-γλυκόζη και Ροτενόνη αναστολή της ανάπτυξης, αν και αυτό το προφίλ χημειοευαισθησία δεν ήταν ειδική για μόνο κύτταρα OCCC. Βιοενεργειακό προφίλ εντόπισαν επίσης ένα μη-OCCC κυτταρική γραμμή, OVCA420, να έχουν παραβιαστεί σοβαρά μιτοχονδριακή λειτουργία, με βάση την χαμηλή OCR και η έλλειψη της διέγερσης της μέγιστης αναπνοής μετά την εφαρμογή του αποζεύκτης FCCP. Αυτό συνοδεύτηκε από μιτοχονδριακές μεταβολές μορφολογία ενδεικτικό της ενισχυμένης σχάσης, αυξημένη έκφραση της μιτοχονδριακής πρωτεΐνης σχάσης Drp1, μια απώλεια του δυναμικού μιτοχονδριακής μεμβράνης και της εξάρτησης από τη γλυκόλυση. Σημαντικά, αυτή η απώλεια μιτοχονδριακής λειτουργίας συνοδεύτηκε από την ανικανότητα των κυττάρων OVCA420 να αντιμετωπίσουν υποξικό στρες, και μια συμβιβασμένη ικανότητα να σταθεροποιούν HIF-1α σε απόκριση σε 1% O

2 υποξία. Αυτή η γνώση μπορεί να είναι επιτακτική ανάγκη για τους ερευνητές σχεδιάζουν να χρησιμοποιήσουν αυτήν την κυτταρική γραμμή για περαιτέρω μελέτες του μεταβολισμού και της υποξίας, και προτείνει ότι η τροποποιημένη μιτοχονδριακή δυναμική σχάση αντιπροσωπεύει ένα φαινότυπο ενός υποπληθυσμό EOCs

Παράθεση:. Dier U, Shin DH , Hemachandra LPMP, Uusitalo LM, Hempel Ν (2014) Βιοενεργειακό Ανάλυση του καρκίνου των ωοθηκών γραμμές κυττάρων: προφίλ των ιστολογική υποτύπων και ταυτοποίηση ενός μιτοχόνδρια-ελαττωματική γραμμή κυττάρων. PLoS ONE 9 (5): e98479. doi: 10.1371 /journal.pone.0098479

Επιμέλεια: Jianhua Zhang, του Πανεπιστημίου της Αλαμπάμα στο Μπέρμιγχαμ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 7η Ιανουαρίου του 2014? Αποδεκτές: 2 Μαΐου του 2014? Δημοσιεύθηκε: May 23, 2014

Copyright: © 2014 Dier et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (NIH) χορηγεί R00CA143229 από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος των ωοθηκών παραμένει μία από τις πλέον θανατηφόρες των καρκίνων στις γυναίκες, με μικρή βελτίωση στη συνολική επιβίωση αναφέρθηκε κατά τις τρεις τελευταίες δεκαετίες. Έχει γίνει προφανές ότι ο καρκίνος των ωοθηκών είναι ένας ευρύς όρος που χρησιμοποιείται για έναν αριθμό διακριτών ασθενειών, μοιράζονται την ίδια ανατομική θέση εντός της ενδοπεριτοναϊκής (ΙΡ) κοιλότητα. Οι πέντε υπότυποι του επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών (EOC) διαφέρουν σημαντικά σε ιστό προέλευσής τους, γονιδιωματικό δείκτες και την εξάρτηση από διαφορετικούς προ-ογκογόνο κύτταρο μονοπατιών σηματοδότησης [1] – [3]. Υψηλής ποιότητας ορώδης καρκίνο των ωοθηκών (SOC) είναι η πιο κοινή ιστολογική υποτύπου και χαρακτηρίζονται από υψηλή συχνότητα σε ΤΡ53 μεταλλάξεις, γονιδιακή αστάθεια και ως του σάλπιγγας προέλευσης [3], [4]. Ωοθηκών σαφές καρκινώματα κυττάρων (OCCC) αντιπροσωπεύουν περίπου το 10% των περιπτώσεων ΕΓΚ στη δυτική πληθυσμούς (μέχρι 25% σε πληθυσμούς Ασιατικής καταγωγής) [5]. OCCCs φαίνεται να αποτελούνται από ετερογενή υποπληθυσμών που εμφανίζουν διάφορους βαθμούς γενωμικού εκτροπών [6]. Η πιο κοινή είναι συνδεδεμένες με το πλούσιο σε ΑΤ αλληλεπιδρούν πεδίο που περιέχει πρωτεΐνη 1Α (ARID1A μετάλλαξη -50%) [7], [8] και η οδός ΡΙ3Κ (απώλεια του ΡΤΕΝ -40% [9], PIK3CA μετάλλαξη [10]? ΑΚΤ2 ενίσχυση [5]). μεταλλάξεις ARID1A επέτρεψαν στους ερευνητές να συνδέσει πρώιμες βλάβες OCCC με ενδομητριοειδές ιστούς και κύστες ενδομητρίωσης [8], [11].

Αν και υπάρχουν σημαντικές διαφορές στη γονιδιωματική εκτροπές μεταξύ των επιμέρους δείγμα OCCC, Yamaguchi και οι συνεργάτες του έχουν αναφερθεί πρόσφατα μια γονιδιακή υπογραφή έκφραση που συνδέεται αποκλειστικά με OCCC [12]. Συγκεκριμένα, η μελέτη αυτή επιβεβαίωσε άλλες εκθέσεις ότι OCCC χαρακτηρίζεται ως στρες αποκρίνονται καρκίνο [12] – [14]. Υψηλή έκφραση των αντιοξειδωτικών ενζύμων και γονιδίων που σχετίζονται με το μεταβολισμό της γλυκόζης είναι επίσης διαδεδομένη [12], [15]. Αυτό το προφίλ έκφρασης πιστεύεται ότι αντιπροσωπεύουν προσαρμογές OCCC κατά στρεσογόνους παράγοντες της μικροπεριβάλλον του όγκου, όπως δωρεάν-σιδήρου που προκαλείται από το στρες οξειδοαναγωγής και φλεγμονή [16]. Ορισμένες από αυτές τις αλλαγές έκφρασης παρομοίως παρατηρηθεί σε ενδομητρίου κύστεις, υποδηλώνοντας περαιτέρω ότι αυτό αντιπροσωπεύει την πρόδρομη ιστού OCCC [12].

Ενώ οι ασθενείς πρώιμο στάδιο OCCC γενικά έχουν καλύτερο ποσοστό επιβίωσης από τους ασθενείς πρώιμο στάδιο SOC, στάδιο III και IV OCCC συνδέεται με κακή επιβίωση. Επιπλέον, λιγότερο από το 10% των επαναλαμβανόμενων OCCC ανταποκρίνονται στη θεραπεία και αυτό ιστολογική υπότυπος έχει συσχετιστεί με την υψηλή σισπλατίνη αντοχής [5]. Δεδομένου ότι υπάρχουν σημαντικές διαφορές στο γονιδίωμα και την έκφραση του προφίλ OCCC σύγκριση με SOC, υπάρχει ανάγκη για την περαιτέρω κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που οδηγούν OCCC ογκογένεσης και της εξέλιξης για να προσαρμόσει θεραπευτικά για αυτό το συγκεκριμένο ιστολογική υπότυπο. Δεδομένου ότι οι OCCCs χαρακτηρίζονται από υψηλή έκφραση των μεσολαβητών της γλυκολυτικής οδού, ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθεί εάν κυτταρικές σειρές OCCC επίσης διαφέρουν σημαντικά στο προφίλ βιοενεργητική τους σε σύγκριση με άλλα κύτταρα EOC σε καλλιέργεια. Χρησιμοποιώντας μετρήσεις ζωντανό κύτταρο της κατανάλωσης οξυγόνου και εξωκυττάριο οξίνισης, ήμασταν σε θέση να αποδείξει ότι κυτταρικές σειρές OCCC είναι ιδιαίτερα μεταβολισμού. Επιπλέον, η ανάλυση αυτή αποκάλυψε μια SOC κυτταρική γραμμή με ελαττωματική λειτουργία των μιτοχονδρίων, η οποία εκδηλώνεται σε μια απώλεια στην υποξική απόκριση αυτών των κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

τηλέφωνα Γραμμές

OVCA420, OVCA429, OVCA433, DOV-13 και NOSE007 κύτταρα γενναιόδωρα από τον Dr. Susan K. Murphy (Πανεπιστήμιο Duke) και καλλιεργήθηκαν σε RPMI1640 που περιείχε 10% ορό εμβρύου βοός (FBS). OVCA420, OVCA429, OVCA433, DOV-13 κύτταρα που αρχικά απομονώθηκε από ασκίτη ωοθηκών ασθενή με καρκίνο [17], [18]. κύτταρα NIHOVCAR3 (αναφέρεται εδώ ως OVCAR3) και σαφής καρκινώματος κυτταρικές γραμμές ωοθήκης ES-2 και TOV-21-G αγοράσθηκαν από την ATCC. ES κύτταρα-2 καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο 5a του McCoy με 10% FBS. κύτταρα TOV-21-G καλλιεργήθηκαν σε ένα 1:01 μείγμα MCDB 105 που περιέχει 1,5 g /L διττανθρακικό νάτριο και Medium 199 που περιέχει 2.2 g /L διττανθρακικό νάτριο, με 15% ορό εμβρύου μόσχου. κύτταρα OVCAR3 διατηρήθηκαν σε RPMI1640, που περιέχει 0,01 mg /ml βόεια ινσουλίνη και 20% FBS. Γλουταμίνη και γλυκόζη στέρηση διεξήχθη χρησιμοποιώντας MP Biomedicals RPMI 1640 Medium, 1Χ Liq., W /o L-γλουταμίνη και γλυκόζη.

Βιοενεργειακό Ανάλυση του οξυγόνου Κατανάλωση (OCR) και εξωκυτταρικά Οξίνιση Rate (ECAR)

Η Seahorse XF24

3 Εξωκυττάρια Flux Analyzer (Seahorse Bioscience, Βόρεια Billerica, ΜΑ) χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση βιοενεργειακό φαινοτύπων των κυτταρικών σειρών καρκίνου των ωοθηκών. Η εξωκυττάρια Flux Αναλυτής επιτρέπει την ταυτόχρονη μέτρηση ζωντανών κυττάρων του ρυθμού κατανάλωσης οξυγόνου (OCR), ένας δείκτης της μιτοχονδριακής αναπνοής, και εξωκυτταρικό ρυθμό οξίνισης (ECAR), δείκτης καθαρή απώλεια πρωτονίων κατά τη διάρκεια της γλυκόλυσης. Πριν από την έναρξη του πειράματος, τα κύτταρα ομοιόμορφα σπάρθηκαν (40.000 κύτταρα /φρεάτιο? Ακόλουθη βελτιστοποίηση του αριθμού των κυττάρων σποράς) μέσα στην πλάκα της κυτταρικής καλλιέργειας XF24 και αφέθηκαν να προσκολληθούν για 24 ώρες. Τα μέσα κυτταρικής καλλιέργειας αντικαταστάθηκε με XF media (ιππόκαμπος Bioscience), που στερείται διττανθρακικού νατρίου και FBS, μετά από προηγούμενη πλύση με XF media. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε

2 37 ° C επώασης χωρίς CO για 1 ώρα, πριν από την έναρξη του πειράματος. OCR και ECAR μετρήθηκε κατά τη διάρκεια μιας περιόδου τριών λεπτών, που ακολουθείται από 3 λεπτά ανάμειξη και την εκ νέου οξυγόνωση των μέσων μαζικής ενημέρωσης. Τρεις μετρήσεις βασικού ρυθμού λήφθηκαν πριν από την ένεση των φαρμακολογικών χειριστές των μιτοχονδριακών πρωτεϊνών αναπνευστικής αλυσίδας, αλλιώς γνωστή ως η δοκιμή μιτοχονδριακού στρες. παράμετροι Αρκετές βιοενεργητική μπορεί να συναχθεί με παρακολούθηση OCR σε απόκριση προς αυτές τις ενώσεις [19]. Μετά την καθιέρωση της βασικής ανάγνωσης OCR, ολιγομυκίνης Α εφαρμόζεται για την αναστολή πρωτονίων (Η +) ρέει μέσω συνθάσης ATP, μπλοκάροντας ουσιαστικά όλα ATP που συνδέονται με την κατανάλωση οξυγόνου. Η μέγιστη αναπνοή μπορεί να ξεκινήσει από έκθεση των κυττάρων σε καρβονυλο κυανίδιο ptrifluoromethoxyphenyl υδραζόνη (FCCP), το οποίο είναι ένα ιονοφόρο που μεταφέρει H + διαμέσου της μιτοχονδριακής μεμβράνης που οδηγεί σε κατάρρευση του δυναμικού της μεμβράνης και ταχεία κατανάλωση O

2. Αντιμυκίνη Μια αποτρέπει την μιτοχονδριακή αναπνοή από το κλείδωμα συγκρότημα III (Ubiquinone: κυτοχρώματος συγκρότημα β-γ). ΑΤΡ αναστολή συνθάσης επιτεύχθηκε με ένεση 1 μΜ ολιγομυκίνη Α (Sigma), η οποία ακολουθήθηκε από έγχυση 750 ηΜ FCCP (Sigma) για την μέτρηση της μέγιστης OCR. Αυτό ακολουθήθηκε από προσθήκη 1 μΜ αντιμυκίνη Α (Sigma) για να κλείσει όλες τις μιτοχονδριακή αναπνοή. Τρεις μετρήσεις OCR /ECAR λήφθηκαν μετά την ένεση του κάθε συγκεντρώσεων φαρμάκου και φαρμάκου βελτιστοποιημένη σε κυτταρικές σειρές πριν από τα πειράματα. OCR και ECAR αναγνώσεις κανονικοποιήθηκαν σε επίπεδα ολικής πρωτεΐνης (δοκιμασία πρωτεΐνης BCA, Pierce) σε κάθε φρεάτιο. Κάθε κυτταρική γραμμή εκπροσωπείται σε 5 φρεάτια ανά πείραμα και αναπαράγουν τα πειράματα διεξάγονται τουλάχιστον τρεις φορές. Βασική αναπνοή προέρχεται αφαιρώντας την τρίτη ανάγνωση OCR, μετά αντιμυκίνη Ένα Επιπλέον, από την τρίτη βασική ανάγνωση OCR. Αναπνευστική μέλος εμφανής, αποτελεί ένδειξη της μιτοχονδριακής αναπνευστικής κατάσταση, υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας: 4- (Basal OCR-ολιγο OCR) /(FCCP OCR-ολιγο OCR) [20]. Πριν από την έναρξη αυτών των πειραμάτων δόσης καμπύλες απόκρισης (100 ηΜ-3 μΜ) διεξήχθησαν για να καθοριστεί η συγκέντρωση του FCCP απαιτούνται για την επίτευξη της μέγιστης OCR. Όλες οι κυτταρικές σειρές ανταποκρίθηκαν με την επίτευξη μιας μέγιστης οροπέδιο OCR στα 750 ηΜ FCCP, με αναστολή της OCR παρατηρήθηκε σε 3 μΜ σε ορισμένες κυτταρικές σειρές (OVCA429, Ovca433, Ovcar3, ES-2). OVCA420 κύτταρα δεν ανταποκρίνονται σε FCCP σε οποιαδήποτε από τις συγκεντρώσεις που δοκιμάστηκαν

σε πραγματικό χρόνο ημι ποσοτική RT-PCR

Μετά την απομόνωση του RNA. (RNeasy Mini Kit? Qiagen) και αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας iScript cDNA Σύνθεση (BioRad), σε πραγματικό χρόνο ημι-ποσοτική RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα Applied Biosystems 7500 real Time PCR κυκλοποιητή, χρησιμοποιώντας iTaq καθολική SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Τα ακόλουθα ζεύγη εκκινητών χρησιμοποιήθηκαν για ημι-ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR ανάλυση: HNF-1β νόημα: 5′-GCCCACACACCACTTACTTCG-3 ‘? HNF-1β αντινόημα, 5’-GTCCGTCAGGTAAGCAGGGAC-3 ‘[21]. GLUT-1 νόημα 5’-CATCCTTATTGCCCAGGTGTTT-3 ‘? GLUT-1 αντινόημα 5’-GAAGACGACACTGAGCAGCAGA-3 ‘[22]. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση της συγκριτικής μεθόδου CT με τιμές ομαλοποιήθηκαν σε β-ακτίνη επίπεδα και εκφράζεται σε σχέση με τα επίπεδα στα κύτταρα NOSE007.

σφαιροειδές Δοκιμασία Σχηματισμού

Ο καρκίνος των ωοθηκών κυτταρικές γραμμές σπάρθηκαν (1000 κύτταρα /καλά) σε 96 φρεατίων στρογγυλού πυθμένα εξαιρετικά χαμηλής προσκόλλησης (ULA) πλάκες (Corning) και παρακολουθήθηκαν για σφαιροειδούς συσσωματώματος σχηματισμό μέχρι και την Ημέρα 9, υπό κανονικές συνθήκες καλλιέργειας (πλήρως συμπληρωμένα μέσα, 37 ° C, 21% O

2, 5 % CO

2).

προσδιορισμούς κυτταρικής βιωσιμότητας

ίσοι αριθμοί κυττάρων σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων και η βιωσιμότητα των κυττάρων σε απόκριση σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες μετρήθηκε μετά από 72 ώρες αγωγής με φάρμακο υποδεικνύεται δόσεις. Η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε με πρόσληψη κρυσταλλικό ιώδες. Εν συντομία, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες επί 10 λεπτά, ακολουθούμενη από πλύση σε PBS και H

2O. Κρυσταλλικό ιώδες χρώμα απελευθερώθηκε από τα κύτταρα χρησιμοποιώντας 30% οξικό οξύ και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 590 nm, χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών SpectraMax Paradigm Molecular Devices. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκφράστηκε ως ποσοστό βιωσιμότητας σε σχέση με μη-κατεργασμένα κύτταρα. Σισπλατίνη (cis-Diamineplatinum (II) διχλωρίδιο), Paclitaxel και 2-δεοξυ-D-γλυκόζης (2-DG) αγοράστηκαν από τη Sigma. Ροτενόνη ελήφθη από Seahorse Biosciences.

Mitotracker χρώση

Κύτταρα που καλλιεργήθηκαν σε καλυπτρίδες επωάστηκαν με 250 ηΜ Mitotracker Red CMX ROS (Life Technologies) για 15 λεπτά, ακολουθούμενη από πλύση σε PBS και στερέωση με 4% παραφορμαλδεΰδη. Τα δείγματα τοποθετήθηκαν πάνω σε διαφάνειες χρησιμοποιώντας Παρατείνει Gold /DAPI (Life Technologies) και απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα eVOSfl AMG LED με βάση το μικροσκόπιο φθορισμού (100χ αντικειμενικό φακό λαδιού).

αναλογία mtDNA /nDNA πραγματικού χρόνου RT-PCR

για την ποσοτικοποίηση μιτοχόνδρια DNA (mtDNA) και πυρηνικό DNA (nDNA) συνολικού DNA από τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας AllPrep DNA /RNA /Protein Mini Kit (Qiagen), το οποίο αραιώθηκε σε μια τελική συγκέντρωση 10 ng /μl. Για την ποσοτικοποίηση της σχετικής mtDNA: nDNA αναλογία χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθοι εκκινητές? 16S rRNA γονίδιο του μιτοχονδριακού (mt) DNA (νόημα: 5′-CCAAACCCACTCCACCTTAC-3 ‘? Αντινόημα: 5′-TCATCTTTCCCTTGCGGTA-3′)? 18S rRNA των πυρηνικών (n) DNA (νόημα: 5’-AGAAACGGCTACCACATCCA-3 ‘, αντινόημα: 5′-CACCAGACTTGCCCTCCA-3’) [23], [24]. τιμές CT για mt16S και n18S ελήφθησαν ακόλουθη Real Time PCR 50 ng ολικού DNA χρησιμοποιώντας iTaq καθολική SYBR Green Supermix (Bio-Rad), σε μία θερμοκρασία ανόπτησης των 59 ° C.

μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικό

δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας JC-1 βαφή (5 ‘, 6,6′-τετραχλωρο-1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine ιωδιούχο? Life Technologies), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα επωάστηκαν με 10 μg /ml χρωστικής JC-1 για 15 λεπτά και ο φθορισμός εικόνες που λαμβάνονται χρησιμοποιώντας ένα αντικειμενικό 20χ. Η αναλογία του ερυθρού φθορισμού JC-1 συσσωματώματα και πράσινο μονομερή JC-1 μετρήθηκε με τη χρήση της εικόνας J, μετά από διόρθωση εικόνα φόντου.

κλωνογονικότητας

Τα κύτταρα σπάρθηκαν (100 κύτταρα /φρεάτιο) σε ένα 6 φρεατίων και καλλιεργήθηκαν για 10 ημέρες υπό κανονικές συνθήκες καλλιέργειας (21% O

2) ή υποξία (1% O

2, Biospherix θάλαμο υποξική). Κλωνογονικότητας αξιολογήθηκε με χρώση αποικίες με κρυσταλλικό ιώδες και ο αριθμός των αποικιών που μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας Image J και τα δεδομένα εκφράζονται ως κλάσμα κυτταρικής επιβίωσης.

ανοσοαποτύπωσης

Οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε 10 cm δίσκους σε υπο-συρροή και λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA (+ αναστολείς πρωτεάσης), ακολουθούμενο από ηλεκτροφόρηση σε 4-12% γέλες SDS-PAGE (Bio-Rad). Μετά δυτική μεταφορά, οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με πρωτογενές αντι-αντίσωμα Drp1 (Millipore) ή GAPDH (Applied Biosystems-Life Technologies) για μια νύχτα σε 5% γάλα χωρίς λιπαρά /TBS, 0,1% Tween20. Μετά την επώαση blots δευτερεύον αντίσωμα οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Femto ή Pico υπόστρωμα χημειοφωταύγειας (Thermo Scientific). Για ανάλυση HIF-1α, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό υποξικές συνθήκες (1% O

2) επί δύο ώρες. Τα κύτταρα λύονται αμέσως σε ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος 2χ SDS και ίσες ποσότητες φορτώθηκαν σε SDS-PAGE (4-12%, Bio-Rad), ακολουθούμενη από τη δυτική μεταφορά και ανοσοκηλίδωση για HIF-1α και ελέγχου φόρτωσης β-ακτίνης. Anti-HIF-1α αντίσωμα αγοράστηκε από την BD Transduction Laboratories και το αντίσωμα β-ακτίνης από την Applied Biosystems-Life Technologies.

Δεδομένα και Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα στοιχεία που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών επαναλήψεων πειράματα. Εικόνα J χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση σχετική φθορισμού και μέτρηση σφαιροειδές μέγεθος περιοχής. Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου. στατιστική ανάλυση των δεδομένων (ANOVA με μετά τη δοκιμή του Tukey, ή T-test) διεξήχθη χρησιμοποιώντας GraphPad Prism Software (v6), και τα δεδομένα που θεωρούνται σημαντικές σε p & gt?. 0.05

Αποτελέσματα

Αναπνευστική Προφίλ του καρκίνου των ωοθηκών κυττάρων γραμμές

για να χαρακτηρίζουν το προφίλ βιοενεργειακό των κυτταρικών σειρών καρκίνου των ωοθηκών χρησιμοποιήσαμε έναν αναλυτή εξωκυττάριο ροής για τον προσδιορισμό ζωντανά ποσοστό των κυττάρων κατανάλωση οξυγόνου (OCR) και εξωκυτταρικό ρυθμό οξίνισης (ECAR? Seahorse Bioscience). Δύο κυτταρικές σειρές OCCC, ES-2 και TOV-21-G συγκρίθηκαν με μη OCCC κυτταρικές γραμμές EOC (OVCA420, OVCA429, OVCA433, DOV-13, OVCAR3) και μια κανονική επιθηλιακή κυτταρική γραμμή επιφάνεια των ωοθηκών (NOSE007).

το Σχήμα 1Α δείχνει το OCR κυτταρικών γραμμών σε απόκριση σε ενώσεις που χρησιμοποιούνται στην μιτοχονδριακή τεστ αντοχής πάροδο του χρόνου. Basal και ΑΤΡ-εξαρτώμενη αναγνώσεις OCR έδειξε ότι οι περισσότερες από τις καρκινικές κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, με την εξαίρεση των OVCA420 κυττάρων, είχαν σημαντικά υψηλότερες OCR σε σύγκριση με μια κανονική επιφάνεια επιθηλιακών κυττάρων των ωοθηκών γραμμή (NOSE007, Σχήματα 1Β & amp? C). Η κυτταρική σειρά NOSE007 δεν επιλέχθηκε ως αντιπροσωπευτικό για τον ιστό του καρκίνου των ωοθηκών προέλευσης, καθώς αυτές ποικίλλουν σε μεγάλο βαθμό μεταξύ των ιστολογικών υποτύπων, αλλά μάλλον ως εκπρόσωπος μιας κανονικής γραμμής επιθηλιακών κυττάρων. Basal μιτοχονδριακή αναγνώσεις OCR (Εικόνα 1Β) ομαλοποιήθηκαν αφαιρώντας την μη-μιτοχονδριακό OCR, η οποία ήταν χαμηλή και δεν διαφέρουν σημαντικά μεταξύ των κυτταρικών σειρών που δοκιμάστηκαν (δεν φαίνεται). Τα περισσότερα από τα Basal μιτοχονδριακού OCR ήταν αφιερωμένη στην ΑΤΡ παραγωγής, όπως υποδεικνύεται από ολιγομυκίνη Α αναστολής (Σχήμα 1Γ). Τυχόν εναπομένον OCR μπορεί να αποδοθεί κάπως σε διαρροή πρωτονίων κατά μήκος της μεμβράνης [19], η οποία ήταν παρόμοια σε όλες τις κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, εκτός TOV-21-G και ϋθν-13 κύτταρα, τα οποία εμφανίζονται ελαφρά αλλά σημαντική αύξηση σε σύγκριση με NOSE007 και OVCA420 κύτταρα (Σχήμα 1 D). Όλες οι κυτταρικές σειρές, εκτός OVCA420 κύτταρα ανταποκρίθηκαν στην FCCP αυξάνοντας OCR τους για μέγιστη ποσοστά (Σχήμα 1Ε). Ως εκ τούτου, OVCA420 κύτταρα δεν έχουν αισθητές αναπνευστική ικανότητα αποθεματικού, τη διαφορά μεταξύ της μέγιστης και της βασικής αναπνοής (Σχήμα 1 F). Υψηλή αναπνευστική απόθεμα χωρητικότητας συνδέεται επίσης με υψηλή μιτοχονδριακή πιστότητα. Υπολογισμοί του αναπνευστικού συστήματος κρατικών

Προφανής έδειξε ότι τα φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα των ωοθηκών NOSE007 λειτουργούν σε υπομέγιστη αναπνευστική ικανότητα σε σύγκριση με τις κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών (Σχήμα 1G). Πραγματική κατάσταση 4 αναπνοή χαρακτηρίζεται από την έλλειψη του μιτοχονδριακού ΑΤΡ γενιάς, όπως στην περίπτωση της εξάντλησης ADP, και μιμήθηκε στον προσδιορισμό μας με ολιγομυκίνη Α προσθήκης. Οι κρατικές 3 απομονωμένα μιτοχόνδρια χαρακτηρίζεται από μέγιστη ενεργότητα σε παρουσία απεριόριστη υποστρώματος και ADP [20]. Ενώ αυτές οι παράμετροι δεν επιτευχθούν πλήρως στο πλαίσιο ενός κυττάρου (κυτταρική μέλος

Προφανής συνέπεια, θεωρείται ότι είναι 3,5), παρατηρήσαμε ότι τα καρκινικά κύτταρα, εκτός από OVCA420s, εμφανίζεται μια κατάσταση εμφανής κάτω του 3,5, ενώ το κράτος

φαινομενική τιμές για τα κύτταρα NOSE007 πλησίασε κατάσταση 4 (Σχήμα 1G). Κανένα κράτος

θα μπορούσε να ληφθεί Προφανής για OVCA420 κύτταρα λόγω της έλλειψης σε απάντηση FCCP.

Α. Οξυγόνο Κατανάλωση (OCR) μετρήσεις λήφθηκαν την πάροδο του χρόνου (min) χρησιμοποιώντας ένα εξωκυτταρικό αναλυτή ροής (Seahorse Bioscience). Το μιτοχονδριακό τεστ αντοχής χρησιμοποιήθηκε για να ληφθεί παραμέτρους βιοενεργητική, με την προσθήκη του αναστολέα συνθάσης ΑΤΡ ολιγομυκίνη Α (Ο, 1 μΜ), για την εξαγωγή ΑΤΡ-συνδεδεμένη OCR, FCCP (F, 750 nm) για να αποσυνδέσει τα μιτοχόνδρια για μέγιστη OCR, και αντιμυκίνη Α (Α, 1 μΜ). B. Basal μιτοχονδριακή OCR κυτταρικών σειρών καρκίνου των ωοθηκών προέρχεται από την αφαίρεση μη-μιτοχονδριακό OCR (απομένουν OCR μετά αντιμυκίνη Α προσθήκης). Γ ATP που συνδέονται με OCR προήλθε ως η διαφορά μεταξύ της βασικής και αντιμυκίνη Α αναστέλλεται OCR. Δ OCR αποδίδεται σε διαρροή πρωτονίων υπολογίστηκε ως η διαφορά μεταξύ της οπτικής αναγνώρισης χαρακτήρων μετά από ολιγομυκίνη αναστολή και OCR παρακάτω αντιμυκίνη Α αναστολή. Ε Μέγιστη OCR διεγείρεται με την προσθήκη FCCP. ΣΤ Η ικανότητα του αναπνευστικού αποθεματικό υπολογίζεται ως η διαφορά μεταξύ της μέγιστης και της βασικής OCR. Γραφήματα BF αντιπροσωπεύουν δεδομένα από ένα πείραμα επανάληψη (n = 5, ANOVA, κατά Tukey μετά τη δοκιμή * p & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001, **** p & lt? 0.0001 στατιστικά σημαντική σε σύγκριση με NOSE007? # p & lt? 0,05, ## ρ & lt? 0,01, ### p & lt? 0.001, #### p & lt? 0.0001 στατιστικά σημαντική σε σύγκριση με OVCA420). Οι κυτταρικές σειρές OCCC επισημαίνονται σε μαύρο και ένα φυσιολογικά επιθηλιακά κυτταρική γραμμή σε λευκό. Γ Μέση Αναπνευστική μέλος

Προφανής ήταν υπολογίζονται 3-4 αντιγραφική πειράματα με τη χρήση:. 4- (Basal OCR-ολιγο OCR) /(FCCP OCR-ολιγο OCR)

Η

Ενώ όλα τα καρκινικά κύτταρα είχαν σαφώς υψηλή μιτοχονδριακή αναπνοή σε σύγκριση με κύτταρα NOSE007 δεν παρατηρήσαμε σημαντική διαφορά στις αναπνευστικές παραμέτρους μεταξύ των κυττάρων OCCC και άλλες κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών, γεγονός που υποδηλώνει ότι το προφίλ μιτοχονδριακό κατανάλωση οξυγόνου δεν διακρίνει τον καρκίνο των ωοθηκών ιστολογική υποτύπους. Ωστόσο, χρησιμοποιώντας αυτή την προσέγγιση θα ήταν σε θέση να προσδιορίσει OVCA420 κύτταρα ως έχουν ελαττωματική λειτουργία των μιτοχονδρίων, που υποδεικνύεται από τη χαμηλή OCR βασική και την απουσία απάντησης στην FCCP.

κύτταρα OCCC έχουν υψηλό εξωκυτταρικό ρυθμό οξίνισης

Ταυτόχρονα με τη μέτρηση της οπτικής αναγνώρισης χαρακτήρων, εξωκυττάρια ανάλυση ροής επιτρέπει την αξιολόγηση της εξωκυττάριας ρυθμός οξίνισης (ECAR) των μέσων καλλιέργειας. Αυτό θεωρείται μια έμμεση ανάλυση της γλυκολυτικής ποσοστού των κυττάρων [19]. OCCC κυτταρικές γραμμές ES-2 και TOV-21-G εμφανίζεται υψηλή ECAR βασική, ενώ άλλη κυτταρική σειρά είχαν χαμηλότερα ECAR, παρόμοια με NOSE007 (Σχήμα 2Α). Ολιγομυκίνη Α χρησιμοποιήθηκε για την τόνωση της μέγιστης ECAR, το οποίο κλείνει το ΑΤΡ-εξαρτώμενη OCR, αποτελεσματικά τη μετατόπιση του μεταβολισμού από την οξειδωτική φωσφορυλίωση σε γλυκόλυση (Σχήμα 2Β). Η διαφορά μεταξύ της μέγιστης και της βασικής ECAR θεωρείται το γλυκολυτικό απόθεμα ικανότητα των κυττάρων (Σχήμα 2C). OVCA420 κύτταρα, τα οποία εμφανίζονται ελαττωματικό μιτοχονδριακή αναπνοή (Σχήμα 1), είχε επίσης χαμηλό γλυκολυτικό εφεδρικής δυναμικότητας, αναφέροντας αυτά τα κύτταρα λειτουργούν κοντά στο μέγιστο γλυκολυτικό ρυθμό τους, ως αποζημίωση για την απώλεια της οπτικής αναγνώρισης χαρακτήρων. Αυτό υποδηλώνει μια εξάρτηση από την γλυκόλυση από OVCA420 κύτταρα. Η κανονική επιθηλιακή κυτταρική γραμμή NOSE007 εμφανίζεται το χαμηλότερο γλυκολυτικά απόθεμα, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ικανότητά τους για γλυκόλυση είναι χαμηλότερη από εκείνη των άλλων καρκινικών κυτταρικών γραμμών.

A. επίπεδα Basal ECAR μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας μία εξωκυτταρική αναλυτή ροής (Seahorse Bioscience). B. Η μέγιστη ECAR διεγείρεται με την προσθήκη 1 μΜ ολιγομυκίνη Α Γ γλυκολυτικό Reserve Capacity υπολογίστηκε ως η διαφορά μεταξύ της μέγιστης και της βασικής OCR. Δεδομένα από μία αντιγραφική πείραμα παρουσιάζεται (n = 5, ANOVA, κατά Tukey μετά τη δοκιμή * p & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001, **** p & lt? 0.0001 στατιστικά σημαντική σε σύγκριση με NOSE007? # P & lt ? 0,05, ## ρ & lt? 0,01, ### p & lt?. 0.001 στατιστικά σημαντική σε σύγκριση με OVCA420)

η

βιοενεργητική προφίλ