Αφηρημένο

Ο προσδιορισμός των μοριακών τους οδηγούς του καρκίνου με προσδιορισμό της αλληλουχίας είναι η ραχοκοκαλιά της ιατρικής ακρίβεια και η βάσει της εξατομικευμένης θεραπείας? Ωστόσο, βιοψίες των πρωτοπαθών όγκων παρέχουν μόνο ένα στιγμιότυπο της εξέλιξης της νόσου και μπορεί να χάσει πιθανούς θεραπευτικούς στόχους, ειδικά στην μεταστατική ρύθμιση. Ένα υγρό βιοψίας, με τη μορφή του DNA (cfDNA) αλληλούχιση ελεύθερο κυττάρων, έχει τη δυνατότητα να συλλάβει την δια- και ενδο-ογκική ετερογένεια που υπάρχει στο μεταστατική νόσο, και, μέσω της σειριακής αίμα αντλεί, παρακολουθείτε την εξέλιξη του γονιδιώματος του όγκου.

για να προσδιοριστεί η κλινική χρησιμότητα του προσδιορισμού αλληλουχίας cfDNA πραγματοποιήσαμε αλληλούχιση ολόκληρου exome επί cfDNA και DNA όγκων από δύο ασθενείς με μεταστατική νόσο? μόνο μικρές τροποποιήσεις αλληλουχίας και η ανάλυση των αγωγών μας ήταν απαραίτητα για την ιεράρχηση και τη μετάλλαξη κάλεσμα της cfDNA. Ο πρώτος ασθενής είχε μεταστατικό σάρκωμα και 47 από 48 μεταλλάξεις που είναι παρούσες στον πρωτογενή όγκο βρέθηκαν επίσης στο ελεύθερο κυττάρων DNA. Ο δεύτερος ασθενής είχε μεταστατικό καρκίνο του μαστού και αλληλούχιση προσδιορίσει μια

ESR1

μετάλλαξη στο cfDNA και μεταστατική θέση, αλλά όχι στην πρωτογενή όγκο. Η πιθανή αυτή εξηγεί την εξέλιξη του όγκου σε αναστροζόλη. Σημαντική ετερογένεια μεταξύ των πρωτογενών και μεταστατικών όγκων, με cfDNA αντανακλώντας τις μεταστάσεις, πρότεινε ο διαχωρισμός από την πρωτογενή αλλοίωση νωρίς στην εξέλιξη του όγκου. Αυτό φαίνεται καλύτερα από μια ενεργοποιητική

PIK3CA

μετάλλαξη (H1047R) το οποίο ήταν κλωνική στον πρωτογενή όγκο, αλλά εντελώς απούσα είτε από το μετάσταση ή cfDNA. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι οι προμήθειες αλληλουχίας cfDNA κλινικά πληροφορίες δράσης με ελάχιστους κινδύνους σε σύγκριση με μεταστατικό βιοψίες. Η μελέτη αυτή αποδεικνύει την χρησιμότητα του προσδιορισμού αλληλουχίας ολόκληρου exome του ελεύθερου κυττάρων DNA από ασθενείς με μεταστατική νόσο. cfDNA αλληλουχίας εντοπίσει ένα

ESR1

μετάλλαξη, πιθανώς εξηγεί την αντίσταση του ασθενούς σε αναστολή της αρωματάσης, και έδωσε εικόνα για το πώς μεταστατικές αλλοιώσεις διαφέρουν από τον πρωτογενή όγκο

Παράθεση:. Butler TM, Johnson-Camacho K , Peto Μ, Wang NJ, Macey ΤΑ, Korkola JE, et al. (2015) exome αλληλουχίας των κυττάρων-Free DNA από Μεταστατικό Καρκινοπαθών Αναγνωρίζει Κλινικά Πράξεις Μεταλλάξεις Ξεχωριστά από την πρωτοπαθή νόσο. PLoS ONE 10 (8): e0136407. doi: 10.1371 /journal.pone.0136407

Επιμέλεια: Kristy L. Richards, το Cornell University, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 17 Νοέμ του 2014? Αποδεκτές: 4, Αυγούστου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 28 Αυγούστου 2015

Copyright: © 2015 Butler et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα .bam αρχεία αλληλουχίας είναι διαθέσιμα σε ευρωπαϊκό νουκλεοτιδικές Αρχείο (https://www.ebi.ac.uk/ena) (αριθμοί πρόσβασης ERS700862, ERS700863, ERS700864, ​​ERS700858, ERS700859, ERS700860, ERS700861)

Χρηματοδοτήσεων.: οι συγγραφείς δεν έλαβαν καμία ειδική χρηματοδότηση για το έργο αυτό

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Chritopher Corless λάβει αμοιβές και την υποστήριξη της έρευνας από Ion Torrent /ThermoFisher. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και Υλικά |

Εισαγωγή

Το 2014 υπήρχαν να είναι πάνω από 500.000 που σχετίζονται με τον καρκίνο των θανάτων στις Ηνωμένες Πολιτείες.? 90% αυτών των θανάτων από μεταστατική νόσο. [1, 2] Ενώ ο καρκίνος χαρακτηρίζεται από κλωνική εξέλιξη, μεταστατικών βλαβών και υποτροπή της νόσου μπορεί να διαφέρει σημαντικά από τον πρωτογενή όγκο, που φιλοξενούν μοναδικά μεταλλάξεις της κλινικής σημασίας. [3] Ο εντοπισμός αυτών των διαφορών, καθώς αναδύονται απαιτεί σειριακή δειγματοληψία του γονιδιώματος του όγκου, [4] συχνά από πολλαπλές μεταστατικές θέσεις, οι οποίες μπορεί να έχουν περιορισμένη δυνατότητα, λόγω τεχνικών προκλήσεων ή οικονομική επιβάρυνση. Αλληλουχίας από το πλάσμα του αίματος, όμως, έχει τη δυνατότητα να εντοπίσει αυτές τις αλλαγές, χωρίς την διεισδυτικότητας που σχετίζεται με στερεά βιοψίες όγκων. [5-7]

Μετά την ανίχνευση των μεταλλαγμένων μορφών του

KRAS

και

NRAS

στο πλάσμα των ασθενών με καρκίνο, οι ερευνητές έχουν ακολουθήσει cfDNA ως μια μορφή «υγρού βιοψίας» του καρκίνου του ατόμου, το χρησιμοποιεί για να προσδιορίσει ογκογόνο αλλοιώσεων σε μια ποικιλία κακοηθειών. [8-14] Αλλαγές στα κυκλοφορούντα DNA όγκου (ctDNA) κατά τη διάρκεια της θεραπείας μπορεί να μετρηθεί εύκολα μέσω της σειριακής δειγματοληψίας λόγω της ελάχιστα επεμβατική φύση του αίματος αντλεί. [15-19] Προηγούμενες μελέτες έχουν εστιάσει στην ποσοτικοποίηση των επιπέδων ctDNA να μετρήσει βάρος της νόσου, [15, 19, 20] έψαξε για την εμφάνιση μεταλλάξεων σε συγκεκριμένες θεραπείες, [18, 21-23] παρακολουθούνται η εξέλιξη του όγκου, [18] και να αξιολογούνται πρόγνωση [12, 24, 25] και τον κίνδυνο υποτροπής. [16] Η ανίχνευση των ctDNA απαιτεί ιδιαίτερα ευαίσθητες μεθόδους λόγω της αραίωσης της από το DNA από μη-καρκινικά κύτταρα, με ποσοστά παραλλαγή αλληλόμορφου τόσο χαμηλά όσο 0,01% στις αρχές της νόσου. [12, 26, 27] Η μελέτη των όγκων διαφόρων τύπων και σταδίων έχει βρεθεί ότι ενώ τα επίπεδα ctDNA διαφέρουν σημαντικά μεταξύ των δειγμάτων, μεταστατικής νόσου συσχετίζεται με υψηλότερα επίπεδα cfDNA στο πλάσμα και ένα υψηλότερο κλάσμα ctDNA. [6, 28] Η σχετική αφθονία των cfDNA και ctDNA καθιστά κατάλληλη για αλληλούχιση ολόκληρου exome [18] το οποίο, σε αντίθεση με πάνελ εστιάζοντας σε hotspot ή ασθενή ειδικών μεταλλάξεων, έχει τη δυνατότητα για την ταυτοποίηση νέων μεταλλάξεων, δίνοντας μοναδική αξία στη μελέτη της θεραπευτικής αντίστασης και της εξέλιξης του όγκου. αλληλούχιση ολόκληρου-exome από το πλάσμα απέδειξε υψηλά επίπεδα αντιστοιχίας μεταξύ μεταλλάξεων στον ιστό του όγκου και cfDNA σε μεταστατική νόσο? Ωστόσο, στο παρελθόν αυτό έχουν καταδειχθεί μόνο σε δείγματα με εξαιρετικά υψηλά επίπεδα ctDNA (33-65% του cfDNA από προέλευση του όγκου), περιορίζοντας σημαντικά την κλινική χρησιμότητα της. [18]

Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την σκοπιμότητα του προσδιορισμού αλληλουχίας ολόκληρου exome από το πλάσμα δύο ασθενείς με μεταστατική νόσο. Βρήκαμε ότι με μικρές μόνο αλλαγές σε πειραματικές και αναλυτικές μέθοδοι μας θα μπορούσαμε να ανακεφαλαιώσουμε ακρίβεια το γονιδίωμα του όγκου από το πλάσμα, τον προσδιορισμό των ίδιων κλινικά σχετικές μεταλλάξεις που προσδιορίζονται από βιοψίες όγκων αλληλουχίας, και να αποκτήσουν νέες πληροφορίες σχετικά με την εξέλιξη της νόσου. Αυτές οι μέθοδοι ήταν ευαίσθητα σε ένα δείγμα με ένα μέσο ποσοστό παραλλαγή ctDNA 3,7%, υποδεικνύοντας περίπου 7,4% του cfDNA ήταν προέλευσης όγκου (ctDNA), επαρκώς χαμηλή για να διαπιστώσετε ctDNA για ένα σημαντικό τμήμα της μεταστατικής ασθενών. [6, 12, 16 ] Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι cfDNA αλληλουχίας των ασθενών με μεταστατικό καρκίνο δανείζει πολύτιμες πληροφορίες για τη μελέτη και τη θεραπεία της νόσου.

Αποτελέσματα

ασθενής # 1

Ένα 52-χρόνο- old γυναίκα διαγνώστηκε με πρωτοπαθή σάρκωμα έσω χιτώνα της πνευμονικής αρτηρίας που ήταν ανεγχείρητο στην παρουσίαση. Ο ασθενής αρχικά υποβάλλεται σε επεξεργασία με ακτινοβολία ακολουθούμενη από χημειοθεραπεία (Σχήμα 1) και αυτή τη στιγμή του όγκου της σαρώθηκε για ογκογόνους μεταλλάξεις χρησιμοποιώντας δοκιμασία που βασίζεται σε φασματοσκοπία μάζας πολυπλεξίας που αποκάλυψε την παρουσία

PIK3CA

R88Q και Q546R στην πρωτογενούς όγκου. [29] Ως αποτέλεσμα, εισήλθε σε μια φάση Ι κλινική δοκιμή ενός αναστολέα ΡΙ3 κινάσης και είχαν μία μερική απόκριση που διήρκεσε 12 μήνες. Είκοσι μήνες μετά τη διάγνωση ο πρωταρχικός DNA του όγκου ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας και πάλι μια στοχευμένη πίνακα του Ion Torrent PGM. Αυτό επιβεβαίωσε τις

PIK3CA

μεταλλάξεις, αλλά και αποκάλυψε

KRAS

G12R. Μια ισοπαλία αίματος λήφθηκε αυτή τη στιγμή, απομονώνοντας 1 ml αδρής στιβάδας και 25 κ.εκ. του πλάσματος (Πίνακας 1). Κατά το χρόνο της συλλογής αίματος ο ασθενής είχε πολλές βλάβες στους πνεύμονες, πνευμονική αρτηρία και το ήπαρ (Πίνακας 1). Λόγω της υψηλής συγκέντρωσης cfDNA στο πλάσμα (63ng /ml), αλληλούχιση ολόκληρου exome διεξήχθη. Με βάση το

KRAS

μετάλλαξη, ο ασθενής στη συνέχεια εντάχθηκαν σε μια φάση Ib κλινική δοκιμή που συνδυάζει κινάσης αναστολείς ΜΕΚ και PI3. Η θεραπεία διεκόπη μετά από οκτώ μήνες λόγω επιπλοκές που προκύπτουν από την επεξεργασία, και ο ασθενής πέθανε 30 μήνες μετά την αρχική διάγνωση.

Α) Ο ασθενής διαγνώστηκε με χιτώνα ατράκτου κύτταρο σάρκωμα της πνευμονικής αρτηρίας. Θεραπείες και τη συλλογή του δείγματος που αναφέρεται σε μήνες.

Η

όγκο του πλάσματος που συλλέγονται από την ενιαία κλήρωση του αίματος. cfDNA ποσοτικά με τη χρήση Pico Quan-iT ΕΣ πράσινο κιτ.

Η

αλληλούχιση ολόκληρου-exome του πρωτογενούς φορμόλη σταθερό εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) όγκου αποκάλυψε 48 σωματικών, εξονικό μεταλλάξεις (σχήμα 2Α, Πίνακας 2. Διενεργήσαμε τον προσδιορισμό της αλληλουχίας σε ολόκληρο το exome του (μέσο βάθος 524X) cfDNA και με ένα κατώτατο όριο του ποσοστού παραλλαγή αλληλόμορφου 1,5% εντοπίσαμε 47 από τα 48 σωματικές μεταλλάξεις που υπάρχουν στο πρωτεύον. σε αυτές τις 48 περιοχές το μέσο βάθος αλληλουχίας στο cfDNA ήταν 561X (181-1,197X). το μέσο ποσοστό παραλλαγή αλληλόμορφου σε αυτές τις 47 μεταλλάξεις ήταν 3,7%, υποδηλώνοντας ότι περίπου το 7,4% του DNA στο πλάσμα ήταν καταγωγής όγκου. Είναι σημαντικό, εντοπίσαμε από το πλάσμα της ενεργοποίησης

KRAS

G12R μετάλλαξη και οι δύο την ενεργοποίηση μεταλλάξεων στο

PIK3CA

(R88Q και Q546R). Έλεγχος για το βάθος αλληλουχίας, ο αριθμός των cfDNA μεταλλαγμένων διαβάζει, ή ποσοστό αλληλόμορφο παραλλαγής στον πρωτογενή ιστό δεν βελτίωσε σημαντικά τη συσχέτιση.

Α) Χρησιμοποιώντας μια αποκοπής του ποσοστού παραλλαγής αλληλόμορφου 1,5%, 46 από τις 47 μεταλλάξεις που είναι παρούσες στον όγκο ταυτοποιήθηκαν στο cfDNA. Υπολογίζοντας από το μέσο όρο παραλλαγή αλληλόμορφου του 3,8%, 7,5% του cfDNA προήλθε από τον όγκο. Β) Δεκαπέντε επιπλέον μεταλλάξεις κλήθηκαν στην cfDNA που δεν κλήθηκαν στο δείγμα όγκου. Τέσσερα από αυτά είναι παρόντα στον όγκο, αλλά κάτω από μας καλώντας αποκοπής του 10% για τον όγκο. Γονίδια επισημαίνονται με κόκκινο χρώμα με επιτυχία επικυρώθηκαν μέσω αλληλουχίας για το Ion Torrent PGM. Περίπου 4.000 γονιδιωμάτων των cfDNA χρησιμοποιήθηκαν ως είσοδος στις επικυρώσεις, δίνοντάς μας μια χαμηλότερη ευαισθησία δεσμεύεται από 0,025 έως 0,5%, ανάλογα με το ποσοστό σφάλματος φόντο site-specific.

Η

Σύνοψη πληροφορίες αλληλουχίας για τις δέκα αλληλουχίας τρέχει. Όλα διαβάζει αναφέρονται σε εκατομμύρια. Προσχώρηση αρχεία αριθμούς for.bam ανεβάσει στο Ευρωπαϊκό Αρχείο νουκλεοτιδίων που παρέχονται, για τον ασθενή σάρκωμα και τα 3 cfDNA τρέχει συνδυάστηκαν σε ένα αρχείο single.bam διαχωριστεί από την ομάδα ανάγνωσης.

Η

Δεκαπέντε επιπλέον μεταλλάξεις εντοπίστηκαν στην cfDNA . Μεταξύ αυτών, 11 δεν ήταν παρόντες στην πρωτογενή αριθμό και τέσσερα ήταν παρόντες στον πρωτογενή όγκο (Σχήμα 2Β), αλλά σε συχνότητες αλληλίου κάτω από το όριο του 10% μας για την κλήση τους στον πρωτογενή όγκο. Αυτές οι μεταλλάξεις επιλέχθηκαν για την επικύρωση από αλληλούχιση για το Ion Torrent PGM όπου επιβεβαιώθηκαν έξι από τους οκτώ απέτυχε να επικυρώσει, και δεν το έκανε ακολουθία (Σχήμα 2Β). Ο ρυθμός επικύρωση των 43% αναδεικνύει την αναγκαιότητα της χρήσης ορθολόγων μεθόδων προσδιορισμού αλληλουχίας για την επιβεβαίωση της παρουσίας των μεταλλάξεων χαμηλής συχνότητας σε cfDNA. cfDNA ποσοστό παραλλαγή αλληλόμορφου συσχετίζεται πτωχά με τον πρωτογενή όγκο (Σχήμα 3).

Α) cfDNA ποσοστό παραλλαγή αλληλόμορφου είναι κακώς συσχετίζεται με ποσοστό Primary όγκου παραλλαγή αλληλόμορφου.

Η

Ασθενής # 2

Ένα 41-year-old γυναίκα είχε διαγνωστεί με καρκίνο του μαστού, η οποία είχε εξαπλωθεί στους λεμφαδένες ER + HER2 +. Ο ασθενής υποβλήθηκε σε εισαγωγική χημειοθεραπεία (TAC) που ακολουθείται από μια διμερή μαστεκτομή και ωοθηκεκτομή (Σχήμα 4Α). Μετά την χειρουργική επέμβαση, ο ασθενής υποβλήθηκε σε θεραπεία με ακτινοβολία και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με trastuzumab για ένα χρόνο και αναστροζόλη για 33 μήνες, μέχρι την ανακάλυψη ενός 4 εκατοστά ήπατος βλάβης και οστικές μεταστάσεις στο 11

ου θωρακικού σπονδύλου (Τ11). Πρόσθετες χημειοθεραπεία και Herceptin χορηγήθηκαν αλλά η θεραπεία διεκόπη μετά την ταυτοποίηση μεταστάσεων ήπατος. Αυτή τη στιγμή συλλέξαμε ένα αίματος επιστήσει περίπου 30 λεπτά πριν να ληφθεί μια βιοψία ήπατος και έλαβε ένα αρχειοθετημένο δείγμα FFPE του πρωτοπαθούς όγκου. Η κλήρωση αίματος έδωσαν 15 mls πλάσμα με μέση συγκέντρωση cfDNA του 98ng /ml (Πίνακας 1). Μετά το πρώτο δείγμα πλάσματος ο ασθενής υποβλήθηκε σε θεραπεία με αντι-Her 2 TDM1 ναρκωτικών, αλλά μετά από μια αρχική μερική ανταπόκριση πέθανε 62 μήνες μετά την αρχική διάγνωση.

Α) Θεραπείες και τη συλλογή του δείγματος που αναφέρεται σε μήνες. Β) 48 στο σύνολο σωματικές μεταλλάξεις κλήθηκαν στον πρωτογενή όγκο μαστού ή /και της μετάστασης ήπατος. 38 μεταλλάξεις κλήθηκαν στην cfDNA χρησιμοποιώντας μια παραλλαγή ποσοστό αλληλόμορφο αποκοπής του 1,5%. Γονίδια στο κόκκινο επικυρώθηκαν με επιτυχία στο Ion Torrent PGM, γονίδια σε μπλε απέτυχε να επικυρώσει, τα γονίδια ήταν μαύροι δεν είχαν επικυρωθεί.

Η

αλληλούχιση ολόκληρου-exome της μετάστασης πρωτογενούς όγκου και το ήπαρ αποκάλυψε συνολικά 48 nonsynonymous σωματικές μεταλλάξεις (Εικόνα 4Β, Πίνακας 2). Αλληλούχηση cfDNA σε ένα μέσο βάθος του 309X εντοπίστηκαν 38 από αυτές τις μεταλλάξεις, με μέσο ποσοστό παραλλαγή αλληλόμορφου του 14%, υποδεικνύοντας περίπου 28% του cfDNA ήταν προέλευσης όγκου. cfDNA VAP συσχετίζεται καλά με την VAP στο ήπαρ μετάσταση (σχήμα 5Α και 5Β), αλλά συσχετίζεται φτωχά με τον πρωτογενή όγκο (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Πρόσθετες βαθιά αλληλούχιση επιβεβαίωσε ότι μια ενεργοποιητική

PIK3CA

(H1047R) μετάλλαξη ήταν παρούσα μόνο στον πρωτογενή όγκο, όχι στην μετάσταση ήπατος ή cfDNA, υποδεικνύοντας ότι είτε η μετάλλαξη προέκυψε μετά μετάσταση, ή δεν ήταν παρούσα στον υποπληθυσμό που σπέρνονται την μετάσταση. Δεκαεπτά επιπλέον σωματικές nonsynonymous μεταλλάξεις κλήθηκαν από το δείγμα πλάσματος. Προσεκτικότερη εξέταση αποκάλυψε ότι οκτώ από αυτούς (47%) ήταν το μοναδικό στο πλάσμα, πιθανώς προέρχονται από μεταστατικές θέσεις δεν συμπεριλήφθηκε στο δείγμα (Σχήμα 5C). επιλέχθηκαν δύο από αυτές τις μεταλλάξεις για την επικύρωση μέσω Ion Torrent PGM, και τα δύο με επιτυχία επικυρωθεί (Σχήμα 5C).

Α) cfDNA ποσοστό παραλλαγή αλληλόμορφου συσχετίζεται με μετάσταση στο ήπαρ παραλλαγή ποσοστό αλληλόμορφο Β) Μέγιστη δέντρο φειδούς δείχνουν συγγένεια των δειγμάτων, μήκους υποκατάστημα είναι αριθμός των σωματικών, nonsynonymous μεταλλάξεις C) Δεκαεπτά πρόσθετες μεταλλάξεις είναι μονοσήμαντα στο cfDNA, 9 εκ των οποίων έχουν ως εξής δικαιολογητικά τους στην πρωτογενή ή /και συναντήθηκαν, αλλά όπου δεν ονομάζεται λόγω της ανεπαρκούς βάθος αλληλουχίας ή παραλλαγής αλληλόμορφου τοις εκατό. Γονίδια στο κόκκινο επιτυχία επικυρωθεί από την Ion Torrent PGM, γονίδια σε μπλε απέτυχε να επικυρώσει, τα γονίδια ήταν μαύροι δεν είχαν επικυρωθεί.

Η

Με αλληλούχιση cfDNA από το πλάσμα είμαστε σε θέση να πάρετε ένα στιγμιότυπο του όγκου , πιθανόν από πολλαπλές μεταστατικές θέσεις. Εδώ, η υψηλή συσχέτιση μεταξύ της μετάστασης ήπατος και cfDNA υποδεικνύει ότι σημαντικές πληροφορίες σχετικά με την τρέχουσα γονιδίωμα του όγκου θα μπορούσε να αποκτηθεί χωρίς την ανάγκη για βιοψία. Μια μετάλλαξη στο

ESR1

(D538G), η οποία έχει αποδειχθεί να προσδίδει αντίσταση σε θεραπεία με οιστρογόνα στέρηση, βρέθηκε και στα δύο βιοψίες των μεταστάσεων και του cfDNA. [30, 31] Αυτή η μετάλλαξη δεν ήταν παρούσα στο αρχική ακολουθία exome του πρωτογενούς όγκου και απουσία του επιβεβαιώθηκε με επακόλουθη αλληλούχιση επικύρωση των

ESR1

σε βάθος 4,272X (Σχήμα 6Α). Είναι πιθανό ότι η αντίσταση του όγκου στον αναστολέα αρωματάσης αναστροζόλη μπορεί να εξηγηθεί από το μεταλλαγμένο

ESR1

. Αυτή η μετάλλαξη αυτή επιβεβαιώθηκε σε ένα εργαστήριο CLIA και θεραπείες Τα οιστρογόνα αντι-υποδοχέων θεωρήθηκαν μεταξύ αλληλουχίας cfDNA και το θάνατο του ασθενούς. Επελέγησαν συνολικά 15 μεταλλάξεις για την επικύρωση από την Ion Torrent PGM, 13 από τα οποία έχουν επικυρωθεί (Σχήματα 4Β και 5C). Ένα δεύτερο δείγμα πλάσματος που λαμβάνονται κατά ανταπόκριση στη θεραπεία TDM1 (όπως προσδιορίζεται με αξονική τομογραφία) και οκτώ μεταλλάξεις που υπάρχουν στην προ-κατεργασία δείγματος cfDNA προσδιορίστηκαν ποσοτικά στη διάρκεια της θεραπείας δείγμα (Σχήμα 6Β). Η προ-θεραπεία cfDNA δείγμα είχε μέση ποσοστιαία παραλλαγή αλληλόμορφου του 13% σε αυτές τις οκτώ θέσεις, ενώ το δείγμα κατά τη διάρκεια της θεραπείας είχαν ένα μέσο ποσοστό παραλλαγή αλληλόμορφου μόνο 0,04% στις τέσσερις θέσεις που περιέχουν μεταλλαγμένο διαβάζει και καμία ανιχνεύσιμη μεταλλαγμένο διαβάζει σε τέσσερις από οι μεταλλάξεις που εξετάστηκαν.

Α) Η

ESR1

μετάλλαξη αλληλουχία σε μεγαλύτερο βάθος σχετικά με το Ion Torrent PGM. Β) Η σύγκριση των συχνοτήτων των αλληλομόρφων μεταξύ πριν και κατά τη διάρκεια της-TDM1 δείγματα θεραπεία cfDNA για οκτώ μεταλλάξεις που υπάρχουν στο δείγμα προ-θεραπείας.

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, το έχουμε αποδείξει ότι η αλληλούχιση ολόκληρου exome των cfDNA από ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο μπορεί να προσδιορίσει με ακρίβεια κλινικά προσφυγής μεταλλάξεις, και απαιτεί μόνο ελάχιστες αλλαγές στην καθιερωμένη πρωτόκολλα αλληλουχίας. Είχαμε τη δυνατότητα να ακολουθία και να αποκτήσουν πολύτιμα δεδομένα από ένα δείγμα πλάσματος με ένα μέσο ποσοστό παραλλαγή αλληλόμορφου του 3,7%, πολύ χαμηλότερα από τις τιμές αποδειχθεί σε προηγούμενες μελέτες και αρκετά κάτω από τις συχνότητες ενός σημαντικού μέρους των ασθενών μεταστατικού καρκίνου. [12, 15, 16, 18, 19] η υιοθέτηση αυτής της προσέγγισης έχει τη δυνατότητα να επεκτείνει σημαντικά τη χρησιμότητα της αλληλουχίας έναντι των βιοψία που εξαρτώνται από τις προσεγγίσεις που είναι σήμερα το πρότυπο φροντίδας. Μεταλλάξεις που υπάρχουν στο cfDNA σφικτά συσχετίζεται με μεταλλάξεις που υπάρχουν σε ένα σύγχρονο δείγμα μετάστασης, υποδεικνύοντας ότι αλληλούχιση cfDNA μπορεί να δημιουργήσει μια πιο ακριβή εικόνα του γονιδιώματος μεταστατικού όγκου του ασθενούς να στηρίζεται σε μια βιοψία του πρωτογενούς όγκου. Η cfDNA συσχετίζεται στενά με ιστό του όγκου που λαμβάνονται κατά τη στιγμή της απόκτησης του πλάσματος και συνεπώς μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να λάβει «στιγμιότυπα» του γονιδιώματος του καρκίνου. Επιπλέον, οι μεταλλάξεις μοναδική για cfDNA βρέθηκαν σε δύο ασθενείς, πιθανώς αντιπροσωπεύοντας βλάβες δεν δειγματοληψία με βιοψία. Επικύρωση μέσω ορθόλογα μεθόδους αλληλούχισης επιβεβαίωσε ότι αυτές οι μεταλλάξεις δεν ήταν από φυσιολογικό ιστό ή το αποτέλεσμα των σφαλμάτων αλληλούχισης και ήταν πιθανό από τις περιοχές που δεν υπάρχουν στη βιοψία. Η ανικανότητα να δοκιμάσουν όλες τις μεταστατικές θέσεις μέσα σε έναν ασθενή ο καρκίνος είναι ένα σοβαρό περιορισμό των σημερινών τεχνικών προσδιορισμού αλληλουχίας, και μπορεί να επιλυθεί με ελάχιστες τροποποιήσεις στις πρότυπες διαδικασίες αλληλούχισης χρησιμοποιώντας cfDNA.

Οι δύο ασθενείς σε αυτή τη μελέτη είχαν υψηλά επίπεδα cfDNA στο πλάσμα τους (Πίνακας 1), η οποία μας επέτρεψε να χρησιμοποιήσουμε πάνω από 100 ng cfDNA να κατασκευάσει βιβλιοθήκες αλληλούχιση μας. Ωστόσο, για πολλούς ασθενείς μια συγκέντρωση 10 ng του cfDNA ανά ml πλάσματος είναι πιο τυπικό, υποδεικνύοντας ότι πολλαπλές αίμα κληρώσεων απαιτείται για να πάρει επαρκές υλικό για αλληλούχιση. Συνειδητοποιώντας αυτό, ενέκρινε τις μεθόδους που περιγράφονται στο έγγραφο Capp-Seq από το εργαστήριο Diehn [19] που επιτρέπει στις βιβλιοθήκες να γίνουν πιο αποτελεσματικά, απαιτεί λιγότερο αρχικό DNA εισόδου. Χρησιμοποιώντας αυτές τις μεθόδους μπορούμε επιτυχώς παραχθεί συγκρότημα βιβλιοθήκες από λιγότερο από 40 ng του cfDNA και αλληλουχήθηκαν επιτυχώς ~ 25% των μορίων DNA εισόδου (σε αντίθεση με την απόδοση ~ 1% που είχε επιτευχθεί στη μελέτη μας). Η βελτίωση αυτή μας επέτρεψε να ακολουθία επαρκή cfDNA για σχεδόν όλα τα θέματα μας.

Ένα άλλο πλεονέκτημα της αλληλουχίας cfDNA είναι η ικανότητα να ακολουθία δείγματα πλάσματος σειριακά, συλλέγονται και ελάχιστα επεμβατική, επιτρέποντας σχεδόν σε πραγματικό χρόνο παρακολούθηση της γονιδίωμα του όγκου κατά τη διάρκεια της θεραπείας. Η ταυτοποίηση των αναδυόμενων μεταλλάξεων μπορεί να επιτρέψει θεραπείες για να ξεκινήσει ή να σταματήσει αμέσως μόλις το περιβάλλον του όγκου καθιστά αυτή πλεονεκτική. Στην περίπτωση του ασθενή # 2, είναι πιθανό ότι σειριακός αλληλούχιση cfDNA θα έχουν εντοπίσει την εμφάνιση του

ESR1

μετάλλαξης και θεραπεία μπορεί να έχει ρυθμιστεί από τη θεραπεία με οιστρογόνα στέρηση (αναστροζόλη) σε έναν στοχεύει η ίδια τον υποδοχέα οιστρογόνου (

e

g

Fulvestrant..): αυτή η στροφή, και πιθανώς άλλοι, μπορεί να καθυστερήσει την εξέλιξη της νόσου. Εκτός από την εξέταση για γνωστούς μηχανισμούς ανθεκτικότητας, η φύση του προσδιορισμού αλληλουχίας ολόκληρου exome επιτρέπει την ταυτοποίηση νέων μηχανισμών αντοχής επαναλαμβανόμενες σε μια ομάδα ασθενών που υποβάλλονται σε θεραπεία με τον ίδιο, το οποίο δεν μπορούν να συμπεριληφθούν σε μια στοχευμένη πάνελ. Αξίζει να σημειωθεί ότι, κατά τη διάρκεια της απόκρισης του ασθενή # 2 έως TDM1 υπήρξε μια δραματική μείωση του επιπέδου του ctDNA, καθιστώντας σχεδόν μη ανιχνεύσιμη με προσέγγιση προσδιορισμού αλληλουχίας μας. Παρακολούθηση μέσω ακολουθία exome κατά τη διάρκεια αυτών των περιόδων θα απαιτήσει βάθος εξαιρετικά υψηλή αλληλουχίας, η οποία θα ήταν απαγορευτικά ακριβό με το τρέχον κόστος αλληλουχίας.

Μια σημαντική έμφαση έχει δοθεί στην αλληλουχία των πρωτογενών όγκων και των έργων μαζική αλληλουχίας (TCGA

et al

.

)

έχουν αποκαλύψει ένα σημαντικό ποσό των πληροφοριών σχετικά με τις μεταλλάξεις του οδηγού σε μια ποικιλία καρκίνων. Ωστόσο, μεταστατικούς όγκους, οι οποίες είναι υπεύθυνες για το μεγαλύτερο μέρος των θανάτων των ασθενών, είναι συγκριτικά μελετημένο. Με αλληλούχιση πρωτογενών όγκων, μαζί με τα δείγματα που συλλέγονται σειριακά πλάσματος είναι δυνατόν να παρακολουθεί τη μεταστατική εξέλιξη σε επίπεδο γονιδιώματος. Στον ασθενή # 2 παρατηρήσαμε μια ενεργοποίησης

PIK3CA

μετάλλαξη στον πρωτογενή όγκο που δεν παρατηρήθηκε ούτε στην μετάσταση ήπατος ή cfDNA. Είναι πιθανό ότι είτε ο

PIK3CA

μετάλλαξη έγινε κλωνική μετά τη μεταστατική διαδικασία ή ότι η μετάλλαξη δεν ήταν παρούσα στο μεταστατικό κλώνο? Ανεξάρτητα, η θεραπεία με έναν αναστολέα της ΡΙ3Κ μπορεί να ήταν αποτελεσματικές στην συρρίκνωση του πρωτογενούς βλάβης, αλλά θα ήταν αναποτελεσματικά εναντίον οποιουδήποτε από το μακρινό μετάσταση. Αντίθετα, ο προσδιορισμός αλληλουχίας του ασθενή # 1 έδειξε ότι ο cfDNA shared περιείχε σχεδόν όλες τις μεταλλάξεις που εντοπίστηκαν στον πρωτογενή όγκο. Ενώ ήμασταν σε θέση να πάρετε ένα δείγμα της μετάστασης, ο μικρός αριθμός των μεταλλάξεων μοναδικών στην cfDNA σημαίνει ότι δεν είναι λογικό να συμπεράνουμε ότι υπήρχαν σχετικά λίγες διαφορές μεταξύ της μετάστασης και πρωτοπαθούς όγκου. Αλληλούχιση cfDNA από μεγαλύτερα ομάδα των ασθενών μπορεί να μας βοηθήσει να κατανοήσουμε πώς μεταστατική εξέλιξη ποικίλλει σε διαφορετικούς τύπους όγκων και μπορεί να εντοπίσει θεραπευτικά σχετικών προτύπων. Η κλινική χρησιμότητα αυτής της μεθόδου θα εξαρτηθεί σε μεγάλο βαθμό από τη συστηματική ανάθεση των στοχευμένων θεραπειών για να εντοπίζονται οι μεταλλάξεις cfDNA.

Αξίζει να σημειωθεί ότι, οι υπηρεσίες για την αλληλούχιση cfDNA γίνονται διαθέσιμα στο εμπόριο, αλλά βασίζονται σε πίνακες και ως εκ τούτου έχουν περιορισμένη χρησιμότητα σε ένα ρύθμιση της έρευνας. Έχουμε αποδείξει εδώ ότι υπάρχει σημαντική αξία της αλληλουχίας ολόκληρου exome από cfDNA.

Υλικά και Μέθοδοι

εγγραφή ασθενούς

γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από δύο ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του για εγγραφή σε αυτή τη μελέτη. Οι διαδικασίες μελέτης και συγκατάθεσης εγκρίθηκαν από το Oregon Health & amp? Διοικητικό Συμβούλιο Επιστήμης του Πανεπιστημίου Institutional Review και σύμφωνα με τις ομοσπονδιακές και τις οδηγίες του ιδρύματος. Έως 40 mls αίματος συλλέχθηκαν σε σωλήνες EDTA. Πλάσμα απομονώθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16] και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C μέχρι cfDNA εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας το QIAamp Κυκλοφορούν σετ Nucleic Acid (Qiagen). Λευκή στιβάδα απομονώθηκε από το ίδιο δείγμα αίματος και DNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ DNA Blood Mini (Qiagen). Στο πλαίσιο της προαναφερθείσας διαδικασίας μελέτης και συναίνεσης, FFPE ιστού από πρωτοπαθείς όγκους του ασθενούς αποκτήθηκε από αρχειοθετημένα δείγματα παθολογία. δείγμα ασθενούς # 1 είχε αποκτήσει από το Πανεπιστήμιο του Τμήματος Παθολογίας Ουάσιγκτον στο Σιάτλ, WA (https://www.pathology.washington.edu/clinical/dermpath/contactinfo). δείγμα ασθενούς # 2 που αποκτήθηκε από την Compass Ογκολογίας στο Βανκούβερ, Ουάσιγκτον (https://compassoncology.com). FFPE ιστούς εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ Tissue DNA FFPE (Qiagen). μετάσταση ήπατος στον ίδιο ασθενή ελήφθη από ένα κατεψυγμένο βιοψία πυρήνα και εξάγεται με το DNeasy Blood & amp? Κιτ ιστού (Qiagen).

Ολόκληρο-exome αλληλουχίας

Ένα ελάχιστο των 100 ng της cfDNA και 0.3-2μg του DNA από φλεγμονώδη πλακούντα και του όγκου του ιστού χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία βιβλιοθηκών αλληλουχίας. Agilent SureSelect αντιδραστήρια XT και το πρωτόκολλο χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή βιβλιοθηκών αλληλουχίας. DNA από φλεγμονώδη πλακούντα και του όγκου του ιστού υποβλήθηκε σε υπερήχους σε μέσο μέγεθος των 150bp χρησιμοποιώντας Covaris Ε220. δείγματα DNA στο πλάσμα δεν σε υπερήχους, όπως το DNA στο πλάσμα είναι ήδη εξαιρετικά κατακερματισμένη. Υβριδικά σύλληψη διεξήχθη χρησιμοποιώντας Agilent SureSelectXT Ανθρωπίνων Όλα εξόνιο V4 + UTRs. 100bp σε συνδυασμό τέλος αλληλουχίας διεξήχθη σε Illumina HiSeq 2000. Μια ολόκληρη λωρίδα ήταν αφιερωμένη στην δείγματα DNA στο πλάσμα αλληλουχίας και όλες τις άλλες βιβλιοθήκες αλληλουχία δύο-σε-ένα-λωρίδα. Για τη μεγιστοποίηση βάθος της αλληλουχίας και την αποφυγή διπλότυπα PCR, το δείγμα πλάσματος από τον ασθενή με μεταστατικό σάρκωμα έγινε σε τρεις ξεχωριστές βιβλιοθήκες, κάθε αλληλουχία σε μία πλήρη λωρίδα κάθε, δίνοντας ένα μέσο βάθος αλληλούχιση του 1,034X. Μόνο μια ενιαία βιβλιοθήκη ήταν απαραίτητη για να επιτευχθεί επαρκής κάλυψη των cfDNA για τον ασθενή # 2.

βιοπληροφορική ανάλυση

Για την ανίχνευση μεταλλάξεων που ευθυγραμμισμένοι σε συνδυασμό τέλος HiSeq διαβάζει με γονιδίωμα hg19 ανθρώπινη αναφοράς χρησιμοποιώντας BWA. [32] Χρησιμοποιήσαμε BWA ALN να βρείτε τις συντεταγμένες της εισόδου διαβάζει και στη συνέχεια χρησιμοποιούνται BWA Mem, προκειμένου να δημιουργήσει ευθυγραμμίσεις σε μορφή Σαμ. Έχουμε μετατραπεί η μορφή Σαμ να BAM (binary) μορφή χρησιμοποιώντας Samtools εισαγωγής. Μετά τη διαλογή και την ευρετηρίαση το διαβάζει στην μπαμ διαμορφωμένο αρχείο, χρησιμοποιούμε Picard Εργαλεία [33] MarkDuplicates να καταργήσετε διπλές αναγνώσεις που δημιουργούνται κατά το στάδιο της ενίσχυσης PCR: αφαίρεση γίνεται με την εύρεση όλων αναφέρει ότι έχουν τις ίδιες συντεταγμένες 5 ‘και κρατώντας μόνο το ζεύγος ανάγνωσης με την υψηλότερη ποιότητα βάσης ποσά. . Μετά διπλούν αφαίρεσης μπορούμε ευθυγραμμισμένο διαβάζει γύρω SNVs και indels χρησιμοποιώντας τη Βιβλιοθήκη Λογισμικού GATK [34, 35] Οι τρεις βιβλιοθήκες του ασθενούς σαρκώματος συνδυάστηκαν μετά από PCR εις διπλούν αφαίρεσης: τοπικές θέσεις για να στοχεύσετε για επανευθυγράμμιση κλήθηκαν χρησιμοποιώντας RealignerTargetCreator και το διαβάζει ήταν ευθυγραμμισμένο χρησιμοποιώντας IndelRealigner. Τέλος, βαθμολογίες ποιότητας έχουν επαναρυθμιστεί. Αυτό έγινε με τη χρήση GATK BaseRecalibrator και PrintReads, η οποία ομαδοποιημένων διαβάζει με βάση την αρχική βαθμολογία ποιότητας, το δινουκλεοτίδιο, και τη θέση εντός της ανάγνωσης. Τα στατιστικά στοιχεία αλληλουχίας συνοψίζονται στον Πίνακα 2 και παρήχθησαν χρησιμοποιώντας Samtools flagstat, GAKT DepthOfCoverage και Bedtools pairToBed.

Για να καλέσετε μεταλλάξεων συγκρίναμε τα δείγματα όγκων με τα φυσιολογικά δείγματα χρησιμοποιώντας muTect v1.1.4 χρησιμοποιώντας το κιτρινωπό στρώμα ως συμφωνημένα κανονική [36] παραλλαγές θεωρήθηκαν σωματικές μεταλλάξεις, αν:. (α) δεν ήταν παρόντες στη βάση δεδομένων dbSNP (εκτός αν η παραλλαγή ήταν επίσης στην κοσμική βάση δεδομένων π.χ.

KRAS

και

PIK3CA

μεταλλάξεις), (β) δεν υπήρχε ≥30x βάθος αλληλούχιση στην θέση αυτή στον όγκο δείγματος /πλάσματος και βάθος ≥10x αλληλούχιση στην συμφωνημένα φυσιολογικό δείγμα, (γ) είχε ποσοστό παραλλαγή αλληλόμορφου του ≥10% για τα δείγματα όγκων και ≥1.5% για τα δείγματα πλάσματος, και (δ) υπήρχαν τουλάχιστον δύο διαβάζει περιέχει το αλληλόμορφο παραλλαγής. Μεταλλάξεις σε cfDNA στη συνέχεια περαιτέρω φιλτραρίστηκαν εάν η αντιστοιχισμένη κανονική είχε & gt? 1 διαβάσει υποστηρίζουν την μετάλλαξη ή η μετάλλαξη ήταν παρούσα μόνο σε έναν κλώνο του cfDNA. Επιπτώσεις των παραλλαγών ελέγχθηκε με τη χρήση Mutation Αξιολογητή v2 (www.mutationassessor.org).

επικύρωση Μετάλλαξη

Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν για να καλύψουν μια ποικιλία από μεταλλάξεις εντοπίστηκαν σε κάθε ασθενή και στη συνέχεια να χρησιμοποιηθεί για την ενίσχυση με PCR λευκής στιβάδας, πλάσμα, και το DNA του όγκου δείγματα από τους δύο ασθενείς. Για κάθε δείγμα, αμπλικόνια συνενώθηκαν σε ισομοριακές ποσότητες και 10-100 ng χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία της βιβλιοθήκης με τη χρήση της Ion Xpress Plus Θραύσμα Βιβλιοθήκη Kit. templates Sequencing παρήχθησαν χρησιμοποιώντας PCR γαλάκτωμα στο Ion OneTouch 2 χρησιμοποιώντας το κιτ Ion PGM Template OT2 200. Μέχρι έξι γραμμωτό κωδικό δείγματα πολυπλέκονται σε Ion 316 v2 μάρκες. Αλληλούχιση διεξήχθη σε Personal Genome Machine (PGM) sequencer (Ion Torrent) χρησιμοποιώντας το Ion PGM 200 v2 κιτ αλληλούχισης. Torrent Suite έκδοση λογισμικού 4.0.2 χρησιμοποιήθηκε για την ευθυγράμμιση διαβάζει hg19. Διαβάζει έγιναν ορατά χρησιμοποιώντας IGV κατά 02.02.32 (Broad Institute) και παραλλαγή συχνότητες αλληλόμορφο προσδιορίστηκαν για τις περιοχές που είχαν διαπιστωθεί μέσω της αλληλουχίας Illumina.