PLoS One: Ολιγονουκλεοτιδίου μικροσυστοιχιών Αναγνωρίζει γονίδια διαφορικά εκφρασμένα κατά τη διάρκεια Ογκογένεση του ϋΜΒΑ-Induced καρκίνο του παγκρέατος σε αρουραίους

Ιανουάριος 3rd, 2017 elhealth του καρκίνου άρθρα

Αφηρημένο

Η εξαιρετικά ζοφερή πρόγνωση του καρκίνου του παγκρέατος (PC) αποδίδεται, τουλάχιστον εν μέρει, στην έλλειψη έγκαιρης διάγνωσης. Ως εκ τούτου, ο προσδιορισμός διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων σε πολλαπλά στάδια της ογκογένεσης του PC έχει μεγάλο ενδιαφέρον. Στην παρούσα μελέτη, ένας 7,12-dimethylbenzanthraene (DMBA) επαγόμενη μοντέλο PC ιδρύθηκε σε αρσενικούς αρουραίους Sprague-Dawley. Το προφίλ γονιδιακής έκφρασης σαρώθηκε χρησιμοποιώντας ένα ολιγονουκλεοτιδικό μικροσυστοιχιών, που ακολουθείται από πραγματικού χρόνου ποσοτικής αλυσίδα αντίδρασης πολυμεράσης (qRT-PCR) και ανοσοϊστοχημική χρώση επικύρωσης. Ένα σύνολο 661 διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων ταυτοποιήθηκαν σε στάδια των παγκρεατικών καρκινογένεσης. Σύμφωνα με την GO ταξινόμηση, αυτά τα γονίδια που εμπλέκονται σε πολλαπλές μοριακές οδούς. Χρησιμοποιώντας αμφίδρομη ανάλυση ιεραρχικής συσταδοποίησης, η κανονική πάγκρεας, οξεία και χρόνια παγκρεατίτιδα, PanIN, πρώιμο και προχωρημένο καρκίνο του παγκρέατος ήταν εντελώς διακρίσεις. Επιπλέον, 11 ρυθμίζεται προς τα πάνω και προς τα κάτω ρυθμισμένη 142 γονίδια (ανιχνευτές) βρέθηκαν με τάση Mann-Kendall δοκιμή μονοχρωμία, υποδεικνύοντας ομόλογα γονίδια του αρουραίου και ανθρώπου. Η qRT-PCR και ανάλυση ανοσοϊστοχημείας του CXCR7 και UBe2c, δύο των αναγνωρισθέντων γονιδίων, επιβεβαίωσαν τα αποτελέσματα των μικροσυστοιχιών. Σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές PC, knockdown του CXCR7 οδήγησε σε μειωμένη μετανάστευση και εισβολή. Συλλογικά, τα δεδομένα μας εντόπισε αρκετά ελπιδοφόρα δεικτών και θεραπευτικών στόχων του υπολογιστή που βασίζεται σε διεξοδική εξέταση και συστηματική επικύρωση

Παράθεση:. Guo JC, Li J, Γιανγκ YC, Zhou L, Zhang TP, Zhao YP (2013) ολιγονουκλεοτίδιο μικροσυστοιχιών Προσδιορίζει γονίδια διαφορικά εκφρασμένα κατά τη διάρκεια Ογκογένεση του ϋΜΒΑ-Induced καρκίνο του παγκρέατος σε αρουραίους. PLoS ONE 8 (12): e82910. doi: 10.1371 /journal.pone.0082910

Συντάκτης: William B. Coleman, του Πανεπιστημίου της Βόρειας Καρολίνας Σχολή Ιατρικής, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: δεύτερης Αυγούστου 2013? Αποδεκτές: 29 Οκτωβρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 23 Δεκεμβρίου του 2013

Copyright: © 2013 Guo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη υποστηρίχθηκε από το ειδικό ταμείο έρευνας για τη βιομηχανία της ευημερίας των πολιτών της υγείας, της μεταφραστικής έρευνας της έγκαιρης διάγνωσης και ολοκληρωμένη θεραπεία σε καρκίνο του παγκρέατος (αριθμός 201202007). Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του παγκρέατος (PC) είναι μια ανθρώπινη σταθερή κακοήθης όγκος με πολύ κακή πρόγνωση [1]. Αρκετές κλινικές και παθολογικές παράγοντες για PC έχουν αναγνωριστεί, συμπεριλαμβανομένων στάδιο Τ, λεμφαδένα /μακρινό μετάσταση, αντιγόνο υδατάνθρακα (CA) 19-9 επίπεδο και περινευρικό /ενδονεύριας εισβολή? Ωστόσο, οι παράγοντες που επηρεάζουν την πρόγνωση του PC παραμένουν να διευκρινισθούν [2], [3], [4], [5]. Επιπλέον, μοριακών γεγονότων που εμπλέκονται στην παθογένεση και την εξέλιξη του PC, όπως μετάλλαξη Kras, έχουν ανακαλυφθεί ως hot spots [1]. Ωστόσο, απαιτείται περισσότερη έρευνα προσδιορισμό των κυτταρικών παραγόντων που επηρεάζουν την πρόγνωση.

Ένα από τα σημαντικότερα μειονεκτήματα των προηγούμενων μελετών σε ανθρώπινα δείγματα και κυτταρικές σειρές είναι η δυσκολία να συλλέγει δείγματα σε όλα τα στάδια της ογκογένεσης. Ως εκ τούτου, ζωικά μοντέλα παρουσιάζουν μοναδικά πλεονεκτήματα σε αυτή την πτυχή. Χημική επαγωγείς του PC περιλαμβάνουν Ν-nitrosobis (2-οξοπροπυλ) αμίνη, αζασερίνη, και 7,12-διμεθυλοβενζανθρακένιο (DMBA) [6], [7], [8], [9], [10]. Τα μοντέλα αυτά μπορούν να προκαλέσουν όλο το φάσμα της καρκινογένεσης, μέσω προχωρημένο στάδιο και μετάσταση. DMBA έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως στη δημιουργία μοντέλων PC αρουραίου [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. Σε προηγούμενες μελέτες μας, βρήκαμε ότι κυψελοειδή κύτταρα μπορούν να transdifferentiate πόρου κυττάρων στη διαδικασία ογκογένεση στο μοντέλο αρουραίου PC DMBA επαγόμενη [18]. Σήμερα, η έννοια και η σημασία της acinar να πόρου μεταπλασία (ADM) έχουν σταδιακά αποδεκτές [19]. Προηγούμενες μελέτες έχουν εξετάσει διάφορα χαρακτηριστικά αυτών των μοντέλων PC, περιλαμβανομένης της ιστολογικής /ιστοχημικής χαρακτηριστικά [11], [12], [14], υψηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά /υψηλή σε πρωτεΐνες διατροφή ως υποκινητή της καρκινογένεσης [13], το μεταβολισμό της γλυκόζης [15] , και μεταβολές σε διάφορες πρωτεΐνες [16]. Μια πρόσφατη έρευνα πραγματοποιήθηκε πρωτεομική ανάλυση στο μοντέλο αρουραίου PC [17]. Μέχρι στιγμής, η διαλογή των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων σε αυτό το μοντέλο δεν έχει αναφερθεί.

Στην παρούσα μελέτη, στόχος μας ήταν να διαλογή διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων σε υπολογιστή χρησιμοποιώντας το DMBA επαγόμενη μοντέλο αρουραίου PC.

Υλικά και Μέθοδοι

Ζώα

Ενήλικες Sprague-Dawley (SD) αρουραίοι που παρέχονται από το Κέντρο Πειραματικής ζώων, Ένωση Medical Hospital Κολέγιο του Πεκίνου, Πεκίνο, Κίνα. Οι αρουραίοι στεγάστηκαν υπό τυποποιημένες συνθήκες, συμπεριλαμβανομένου ενός παθογόνου-ελεύθερο περιβάλλον και ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και πόσιμο νερό. Είκοσι-τέσσερις ώρες δείγματα ούρων συλλέχθηκαν με μεταβολικά κλουβιά στα οποία χορηγήθηκε μόνο νερό, αλλά όχι τρόφιμα. Η Θεσμική Animal Care και Επιτροπής Χρήση σε επίπεδο Ένωσης Medical Hospital Κολέγιο του Πεκίνου έχουν ειδικά εγκριθεί αυτή τη μελέτη και τη χρήση των αρουραίων. Όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

Ίδρυση DMBA που προκαλείται Μοντέλο PC σε αρουραίους

Το μοντέλο PC DMBA που προκαλείται ιδρύθηκε το αρσενικούς αρουραίους SD σύμφωνα με την προηγούμενη μέθοδο μας [14]. Ένα σύνολο 75 αρουραίοι διαιρέθηκαν σε πειραματικές, τον έλεγχο και τις ομάδες φενάκη. DMBA ή κρύσταλλοι NaCl (5 mg) χρησιμοποιήθηκαν για τους αρουραίους στις πειραματικές και ελέγχου ομάδες, αντίστοιχα, ενώ δεν παράγοντας εφαρμόστηκε στην ομάδα sham. Σε πειραματικές και ελέγχου ομάδες, οι αρουραίοι θυσιάστηκαν στις 7 ημέρες, 2 εβδομάδες, 1 μήνα και 3 μήνες μετά την εμφύτευση. Πέντε αρουραίοι στην ομάδα sham θυσιάστηκαν σε 1 μήνα. Ομαδοποίηση όλων των αρουραίων παρουσιάζεται στον Πίνακα 1.

RNA Εκχύλιση και Microarray Analysis

Ολικό RNA εξήχθη από -80 ° C τα κατεψυγμένα δείγματα παγκρεατικού ιστού συλλέγονται σε όλα τα χρονικά σημεία με τη χρήση ο RNeasy μίνι κιτ (Qiagen, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η συνολική συγκέντρωση του δείγματος RNA και η καθαρότητα εξετάστηκαν και εκτιμήθηκε με μετρήσεις οπτικής πυκνότητας στα 260/280 nm χρησιμοποιώντας Φασματοφωτόμετρο NanoDrop και ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Η λεπτομερής δεδομένα των μετρήσεων και την ποιοτική αξιολόγηση παρουσιάζεται στον Πίνακα 2. Το κιτ αντίστροφη μεταγραφή SuperScript II (Invitrogen, USA), κιτ GeneChip (Affymetrix, USA) και One-Cycle Target Επισήμανση και αντιδραστήρια ελέγχου (Affymetrix) χρησιμοποιήθηκαν επίσης στις αναλύσεις . Η υβριδοποίηση εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το Expression GeneChip Rat Set 230 (Affymetrix), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. αναλύσεις γονιδιακή έκφραση διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το Affymetrix Rat Γονιδιώματος 230 A array (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA). Οι αλληλουχίες που χρησιμοποιούνται στο σχεδιασμό του πίνακα επιλέχθηκαν από GenBank, dbEST και REFSEQ. Γονίδιο τσιπ 230 Α περιέχει συνολικά 15.166 σετ ανιχνευτών που αντιπροσωπεύουν περίπου το 4700 γνωστά γονίδια αρουραίου και 10460 σχολιαζομένων εξέφρασε ετικέτες αλληλουχίας. Ο αριθμός ένταξη στο GEO είναι GPL1355.

Ποσοτική αντίστροφη μεταγραφή αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (qRT-PCR)

Το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ (Invitrogen). Αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ αντίστροφης μεταγραφής SuperScript II (Invitrogen, USA). Το κιτ TaqTM R-PCR SYBR Green Ι (Takara, Tokyo, Japan) χρησιμοποιήθηκε για την PCR. στάδια ενίσχυσης ήταν ως εξής: 95 ° C για 30 s (προ-μετουσίωση), και 40 κύκλους των 95 ° C για 5 s και 61 ° C για 31 s. Βήτα-ακτίνη ορίστηκε ως εσωτερικού ελέγχου. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές. Οι εκκινητές που παρατίθενται στον Πίνακα 3.

Η ανοσοϊστοχημεία και χρώση Αξιολόγησης

Τα αντισώματα εναντίον CXCR7 και UBe2c αγοράστηκαν εντύπου Ε & amp? Α και Abnova, αντίστοιχα, και η PowerVisionTM δύο σταδίων κιτ χρώσης (PV-9000) ήταν από το Πεκίνο Zhongshan Biotech Co., Κίνα. Εν συντομία, τομές τοποθετήθηκαν, αποπαραφινώθηκαν με ξυλόλιο και επανυδατώθηκαν με αιθανόλη. Το αντιγόνο ανάκτηση πραγματοποιήθηκε με φούρνο μικροκυμάτων δειγμάτων για 3 λεπτά. Μετά τον αποκλεισμό της ενδογενούς υπεροξειδάσης, τα πλακίδια στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με το πρωτογενές αντίσωμα σε αραίωση 1:200. Μετά την πλύση σε ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS), τα πλακίδια επωάστηκαν με υπεροξειδάση (HRP) -επισημασμένο δευτερογενές αντίσωμα για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Διαμινοβενζιδίνη χρησιμοποιήθηκε ως χρωμογόνο. Τέλος, τα πλακίδια με αιματοξυλίνη. Καφέ χρωματισμό στο κυτταρόπλασμα ή στον πυρήνα ορίστηκε ως θετικό σήμα. Το ποσοστό αναλογία χρώση θετική χρώση κυττάρων περισσότερο από το 50% είχε χαρακτηριστεί ως το ισχυρό θετικό μήνυμα.

Cell Culture και εξόντωση CXCR7

Δύο ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές (PANC-1 και SU86.86) ήταν ευγενικό δώρο από τον καθηγητή Helmut Freiss, Πανεπιστήμιο της Χαϊδελβέργης, στη Γερμανία [20], [21]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 και ϋΜΕΜ μέσο. με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Invitrogen) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2. Τα κύτταρα εμβολιάστηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων μορφομετατράπηκαν με CXCR7 ή ελέγχου (σκαρφάλωμα) μικρό παρεμβαλλόμενο RNA τόσο σε συγκέντρωση 40 ηΜ χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη RNAiMax (Invitrogen), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η CXCR7 RNAi αγοράστηκε από την Invitrogen και η αλληλουχία είναι η εξής: AGAUGUAGCAGUGCGUGUCAUAGCC

Western Blotting

Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και συλλέχθηκαν με απόξεση μέσα σε ατομικούς σωλήνες.. Οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα εκχύλιση πρωτεΐνη, και οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης Pierce BCA (Thermo Scientific, Meridian Rd, Rockford). Εκχυλίσματα πρωτεΐνης (80 μg /λωρίδα) υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε πηκτώματα 10% πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) ακολουθούμενη από μεταφορά σε μεμβράνες PVDF και αποκλεισμό με 5% άπαχο ξηρό γάλα για 2 ώρες. Οι μεμβράνες επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα έναντι CXCR7 (Abgent, San Diego, CA) επί μία νύκτα στους 4 ° C. Δευτερεύον αντίσωμα (IgG αντι-κουνελιού) επωάστηκε για 1 ώρα στους 37 ° C. Οι κηλίδες πλύθηκαν τρεις φορές με PBS, που εκτίθενται σε αντιδραστήρια χημειοφωταύγειας (Merck Millipore, Darmstadt, Γερμανία), και εκτέθηκαν σε φωτογραφικό φιλμ. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

κυτταρική μετανάστευση και εισβολή Δοκιμασίες

Transwell ενθέτων (μέγεθος 8,0 μm πόρου) (Corning, Chelmsford St) χρησιμοποιήθηκαν για δοκιμασίες μετανάστευσης και εισβολή. Η κάτω θάλαμος γέμισε με 500 μί RPMI 1640 ή ϋΜΕΜ μέσο με 10% FBS. PANC-1 και SU86.86 κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε μέσο μετανάστευση (RPMI1640 ή DMEM χωρίς ορό) και 4 χ 10

5 PANC-1 ή SU86.86 κύτταρα σε 200 μΐ μέσου προστέθηκαν στον άνω θάλαμο μετά να πλυθεί δύο φορές με PBS. Μετά από 24 ώρες επώασης στους 37 ° C, τα κύτταρα επί της άνω επιφάνειας της μεμβράνης ήταν ήπια και προσεκτικά αποξέστηκαν χρησιμοποιώντας άκρες βαμβάκι. Οι διακινούμενοι κύτταρα που ήταν προσκολλημένα στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά, και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με Η &? Ε (χρώση αιματοξυλίνης και ηωσίνης). Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας μετανάστευσης κυττάρου αξιολογήθηκαν με απαρίθμηση του αριθμού των κυττάρων στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης κάτω από ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο σε πέντε διαφορετικά πεδία σε μεγέθυνση × 200.

Για δοκιμασίες κυτταρικής εισβολής, η κάτω επιφάνεια της μεμβράνης επικαλύφθηκε με ECM γέλη (Sigma-Aldrich, Saint Louis, ΜΟ, USA) σε PBS για 5 ώρες στους 37 ° C. PANC-1 ή SU86.86 κύτταρα (8 χ 10

5 κύτταρα) σε μέσο RPMI 1640 ελεύθερο από ορό ή ϋΜΕΜ μέσο σπάρθηκαν επάνω σε ECM επιχρισμένο με γέλη άνω θαλάμους, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα που είχαν διασχίσει το ECM και πέρασε μέσα από τους πόρους του φίλτρου μετρήθηκαν σε πέντε πεδία σε × 200. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών διαφορετικών πειραμάτων.

Για τα αποτελέσματα μικροσυστοιχιών, διόρθωση υποβάθρου και την κανονικοποίηση έγιναν Στατιστικές Αναλύσεις

. Η μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) και Student-Newman-Keuls (SNK) δοκιμασίες χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση στατιστικά διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια μεταξύ των διαφόρων ομάδων. Σε βιοπληροφορική ανάλυση, διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων υποβλήθηκαν σε GO ανάλυση ιεραρχική ομαδοποίηση, ανάλυση κύριο συστατικό, SOM και έλεγχος Mann-Kendall. Ο μαθητής-t και Chi-square τεστ εφαρμόστηκαν για να δείξει τις διαφορές των μετρήσεων και κατηγορικά δεδομένα. χρησιμοποιήθηκε το στατιστικό SPSS13.0 πακέτο λογισμικού (SPSS Inc., Chicago, Ill). Μια στατιστικά σημαντική

αξία ορίστηκε ως

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Η επιτυχής Ίδρυση DMBA που προκαλείται από το PC Μοντέλο σε αρουραίους

η οξεία παγκρεατίτιδα παρατηρήθηκε σε αρουραίους (7 ημέρες μετά την εμφύτευση) σε αμφότερες τις πειραματικές και ελέγχου ομάδες. Η παγκρεατική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (PanIN) ήταν παρούσα σε 6 από 15 αρουραίους (40%) στην πειραματική ομάδα 2 εβδομάδες μετά την εμφύτευση, ενώ δεν PC βρέθηκε σε αρουραίους στην ομάδα ελέγχου. Ένα μήνα και 3 μήνες μετά την εμφύτευση, 12 από τα 15 (80%) και 14 από 14 (100%) αρουραίοι στην πειραματική ομάδα, αντιστοίχως, που αναπτύχθηκε PC (Σχ. 1Α, 1Β). Τέσσερις αρουραίοι στην ομάδα 3-μηνών που αναπτύχθηκε μικρό μετάσταση έντερο ή μετάσταση στο ήπαρ (Εικ. 1C, 1D). Ωστόσο, PC ήταν απούσα σε αρουραίους στις ομάδες ελέγχου. Ο ρυθμός σχηματισμού PC στην πειραματική ομάδα ήταν υψηλότερη από ότι στην ομάδα ελέγχου (

& lt? 0,05). Ένας αρουραίος πέθανε πριν από το τελικό σημείο (3 μήνες), προκαλώντας ένα ποσοστό θνησιμότητας 6,7% (1/15).

(Α) παγκρέατος όγκου της ομάδας 1-μήνα. (Β) παγκρεατικού όγκου της ομάδας 3-μηνών. (C) Λεπτό έντερο μετάσταση οζίδια των παγκρεατικών όγκων. (D) μετάσταση στο ήπαρ οζίδια των παγκρεατικών όγκων.

ιστολογικές μεταβολές αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας HE χρώση και οπτικό μικροσκόπιο. Κανονική πάγκρεας (Σχ. 2Α), οξεία παγκρεατίτιδα (Εικ. 2Β), χρόνια παγκρεατίτιδα (Σχ. 2C), PanIN 2α (σχ. 2D), PanIN 2 (Σχ. 2Ε), PanIN 3 (Σχ. 2F), καλά παρατηρήθηκαν διαφοροποιημένα PC (Σχ. 2G) και ελάχιστα διαφοροποιημένο PC (εικ. 2Η).

(Α) Κανονική παγκρέατος (αρχική μεγέθυνση × 60). (Β) Η οξεία παγκρεατίτιδα (αρχική μεγέθυνση χ 150). (Γ) Η χρόνια παγκρεατίτιδα (αρχική μεγέθυνση χ 150). (D) PanIN 1α (αρχική μεγέθυνση × 60). (Ε) PanIN 2 (αρχική μεγέθυνση χ 150). (F) PanIN 3 (αρχική μεγέθυνση × 60). (G) καλά διαφοροποιημένο PC (αρχική μεγέθυνση × 60). (H) ελάχιστα διαφοροποιημένο PC (αρχική μεγέθυνση × 60).

διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων σε Rat DMBA που προκαλείται Μοντέλο PC

Ένα σύνολο 661 διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων ανιχνεύθηκαν σε φυσιολογικό πάγκρεας από την ομάδα ελέγχου και οι πειραματικές ομάδες (Πίνακας 4). Σύμφωνα με την GO ταξινόμησης, τα γονίδια που εμπλέκονται σε διάφορες λειτουργικές κατηγορίες και πολλαπλές βιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της μεταφοράς φυσικού αερίου, υδατάνθρακες διαδικασία του μεταβολισμού, επεξεργασία και παρουσίαση αντιγόνων (Εικ. 3Α). Με αμφίδρομη ανάλυση ιεραρχικής συσταδοποίησης, η κανονική πάγκρεας, οξεία και χρόνια παγκρεατίτιδα, PanIN και πρώιμο και προχωρημένο καρκίνο του παγκρέατος δείγματα ήταν τελείως διακρίσεις (Σχ. 3Β). Υπήρχαν 11 ρυθμίζεται προς τα πάνω γονίδια (καθετήρα) και 142 μειωτικά γονίδια (καθετήρα) με Mann-Kendall δοκιμή μονοχρωμία τάση (

& lt? 0,05) (Εικ. 3C). Οι top 20 ρυθμίζεται προς τα πάνω και προς τα κάτω ρυθμισμένη γονίδια στην ομάδα DMBA 3 μήνας των οποίων τα επίπεδα έκφρασης μεταβλήθηκαν από δύο φορές σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (

& lt? 0,01) παρουσιάζονται στον Πίνακα 5. Επιπλέον, ομόλογα γονίδια σε αρουραίου και ανθρώπου σε διαφορετικά στάδια του μοντέλου αρουραίου επιτυχώς σε διαλογή (Πίνακας 6, Σχ. 3D).

(Α) GO ταξινόμηση δείχνει γονίδια που εμπλέκονται σε διαφορετικές κατηγορίες μοριακού λειτουργία. (Β) Αμφίδρομη ανάλυση ιεραρχικής ομαδοποίησης. (C)

τιμές στην τάση Mann-Kendall τεστ μονοχρωμία. (D) ομόλογα γονίδια στον αρουραίο και στον άνθρωπο σε διαφορετικά στάδια του μοντέλου του αρουραίου.

Εκκαθάριση των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων

Έχουμε επιλέξει τρεις από τα διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια, CXCR7, ATP6v1g2 και UBe2c, για περαιτέρω εξέταση. Πρώτον, εξετάσαμε τα προφίλ έκφρασής τους από qRT-PCR. Οι τιμές ΔCt του CXCR7 μειώθηκε σταδιακά, μαζί με παρατεταμένη θεραπεία ϋΜΒΑ (

& lt? 0,05) (Πίνακας 5), υποδεικνύοντας υπερέκφραση. Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές για ATP6v1g2 και UBe2c (

& gt? 0,05) (Πίνακας 7). Χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία, μέσω διάγνωση και επιβεβαίωση έναν παθολόγο, η σημαντικά βελτιωμένη ανιχνεύθηκαν CXCR7 και έκφραση UBe2c, μαζί με την πρόοδο της PC σε αρουραίους (

& lt? 0,05). (. Πίνακας 8, Σχ 4)

(αρχική μεγέθυνση χ 200). (Α), (C) Η κανονική πάγκρεας αρουραίου, ΗΕ χρώση. (Β), (Δ) Rat PC, χρώση HE. (Ε), (Ζ) πάγκρεας Κανονική αρουραίο, χρώση ανοσοϊστοχημεία CXCR7. (F), (H) Rat PC, χρώση ανοσοϊστοχημείας Ube2c.

Μειωμένη τη μετανάστευση και την εισβολή μετά την επιμόλυνση των CXCR7 siRNA σε PANC-1 και SU86.86 γραμμές κυττάρων

η έκφραση της CXCR7 επιτυχία μειωτικά στα δύο ανθρώπινες κυτταρικές σειρές PC, PANC-1 και Su86.86 (Εικ. 5Α), μετά από επιμόλυνση με CXCR7 siRNA, σε σύγκριση με επιμόλυνση με έλεγχο siRNA. Σημαντικές διαφορές στην κυτταρική μετανάστευση και εισβολή παρατηρήθηκαν σε CXCR7 siRNA επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Ρ & lt? 0,05). (Τα Σχ. 5Β και 5C)

(Α) εξόντωση CXCR7 με siRNA διαμόλυνση. (Β) Η μετανάστευση μετά την επιμόλυνση των CXCR7 ή siRNAs ελέγχου. (C) Εισβολή μετά την επιμόλυνση των CXCR7 ή τον έλεγχο siRNAs.

Συζήτηση

Διάφορες αλλαγές στη μοριακή μονοπάτια είναι γνωστό ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στην έναρξη και την εξέλιξη των PC [1 ]. Ωστόσο, ένα από τα επιπλοκές σε μελέτες που βασίζονται σε ανθρώπινα δείγματα είναι ότι τα χαρακτηριστικά της κάθε φάσης της νόσου δεν μπορούν να εμφανιστούν εύκολα. Σε αυτή την άποψη, ζωικά μοντέλα φέρουν ένα μοναδικό πλεονέκτημα. Στον τομέα της έρευνας PC, τα σημαντικά πρότυπα έχουν συμπεριλάβει DMBA επαγόμενη και διαγονιδιακά μοντέλα [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [22]. Σε μελέτες του μοντέλου αρουραίου DMBA επαγόμενη, έχουν διαφορετικές δόσεις DMBA και ρυθμούς ανάπτυξης PC έχουν αναφερθεί [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. Η παρούσα μελέτη, η οποία βασίστηκε σε προηγουμένως αναφερθείσα μέθοδο μας [14], επιτυγχάνει ικανοποιητικά αποτελέσματα επαγωγής PC. Ως εκ τούτου, τα ευρήματα αυτά δείχνουν την επιτυχή δημιουργία του μοντέλου.

Έχουν

μικροσυστοιχίες έχουν εφαρμοστεί ευρέως στη διαλογή των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων σε PC [23], [24], [25], [26]. Ωστόσο, αυτή η τεχνική δεν έχει χρησιμοποιηθεί στο μοντέλο PC ΟΜΒΑ επαγόμενη. Η παρούσα μελέτη εξέτασε το προφίλ γονιδιακής έκφρασης σε αυτό το μοντέλο αρουραίου PC. ανάλυση μικροσυστοιχιών Affymetrix εντόπισε συνολικά 661 γονιδίων που εκφράζονται διαφορικά σε φυσιολογικό πάγκρεας από την ομάδα ελέγχου και τις πειραματικές ομάδες. Τα γονίδια αυτά περιλαμβάνονται κρίσιμη διαμεσολαβητές των σημαντικών λειτουργιών κατά τη διάρκεια του παγκρέατος ογκογένεση [27], όπως Kras, CDKN2A, Smad4 και TP53. Τα γονίδια αυτά ρυθμίζεται αυξητικά ή μειωτικά κατά τη διάρκεια της διάρκειας σχηματισμό όγκου του παγκρέατος. GO ταξινόμηση, αμφίδρομη ιεραρχική ανάλυση ομαδοποίησης και Mann-Kendall δοκιμή μονοχρωμία τάση περαιτέρω εντοπιστεί γονίδια, συμπεριλαμβανομένων nm23, κυκλίνη Β1 και FGFR3. Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι nm23 συσχετίστηκε με μεταστατικό δυναμικό των κυττάρων PC γραμμών ανθρώπινου [28]. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι η έκφραση nm23 ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ της κανονικής παγκρέατος και της ομάδας DMBA 1 μήνα υποδηλώνοντας ότι το μόριο θα μπορούσε επίσης να συμμετέχει στην πρώιμη φάση της παθογένεσης του PC. Λίγα στοιχεία είναι διαθέσιμα σχετικά με τους ρόλους της κυκλίνης Β1 και FGFR3 σε PC [23], [29]. Έτσι εδώ, έχουμε παράσχει περαιτέρω αποδεικτικά στοιχεία που τεκμηριώνουν τη συμμετοχή τους σε αυτή την ασθένεια. Οι περαιτέρω έρευνες σχετικά με τις λεπτομέρειες των μηχανισμών που διέπουν τη συμμετοχή τους στο PC που απαιτείται.

πρότυπα έκφρασης των τριών διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων, CXCR7, ATP6v1g2 και UBe2c, αξιολογήθηκαν από qRT-PCR και ανοσοϊστοχημική χρώση. Τα αποτελέσματα έδειξαν βαθμιαία απορυθμίζεται έκφραση CXCR7 στο επίπεδο του mRNA και αυξημένη θετική έκφραση του CXCR7 και UBe2c, μαζί με παρατεταμένη θεραπεία ϋΜΒΑ. Τα ευρήματα αυτά ακολούθησε ως επί το πλείστον τα δεδομένα μικροσυστοιχιών. CXCR7 είχε προηγουμένως αποδειχθεί να έχουν αντίκτυπο στην ανάπτυξη, την απόπτωση, την εισβολή /μετάσταση και την πρόγνωση σε πολλούς καρκίνους [30], [31], [32], [33]. Μια πρόσφατη μελέτη αποκάλυψε ότι CXCR7 προώθησε την ανάπτυξη των κυττάρων στον υπολογιστή [34]. Ωστόσο, προγνωστική σημασία της στο PC παραμένει αμφιλεγόμενη [35], [36]. Στο μοντέλο αρουραίου και ανθρώπου κυτταρικές γραμμές που χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα μας, αναφέρθηκε η σύνδεση των CXCR7 και εξέλιξης καθώς και των επεμβατική ροπή του PC. Ως εκ τούτου, χρειάζονται περαιτέρω μελέτες για μηχανιστικές τους μοριακούς παράγοντες που εμπλέκονται στην PC αξίζει δικαιολογημένη.

UBe2c καθιερώθηκε να σχετίζεται με την ανάπτυξη και την αναστολή απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα, παίζοντας έτσι έναν ρόλο στην ογκογένεση και δείχνοντας δυνατότητα να είναι ένας βιοδείκτης τόσο διάγνωση και την πρόγνωση [37]. Ωστόσο, UBe2c δεν είχε διερευνηθεί προηγουμένως στον υπολογιστή. Στην παρούσα μελέτη, βρήκαμε ενισχυμένη θετική έκφραση του UBe2c μαζί με παρατεταμένη θεραπεία ϋΜΒΑ, υποδηλώνοντας εν δυνάμει ρόλο της στην πρόοδο του PC. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η έκφραση του mRNA UBe2c δεν μεταβλήθηκε σημαντικά, υποδεικνύοντας ότι η ρύθμιση μετά-μετεγγραφή μπορεί να εμπλέκεται σε αλλαγές της έκφρασης του. Λεπτομερείς μηχανιστικές στοιχεία στα οποία θεμελιώνεται αυτή η ενεργοποίηση απαιτείται.

Εν περιλήψει, τα στοιχεία μας προσδιορίσει διάφορες δυνητικές δείκτες της PC βασίζεται σε μια συνολική εξέταση και περαιτέρω έλεγχο.

Χρόνιες ασθένειες