Αφηρημένο

Μοριακή διάγνωση των ανθρώπινων καρκίνων μπορεί να αυξάνει την ακρίβεια στην πρόγνωση, διευκολύνει την επιλογή της βέλτιστης θεραπευτικής αγωγής, τη βελτίωση της έκβασης των ασθενών, τη μείωση του κόστους της θεραπείας και της ανάπτυξης υπέρ των εξατομικευμένων προσεγγίσεων για την περίθαλψη των ασθενών. Επιπλέον ευαισθησία και ειδικότητα θεμελιώδη χαρακτηριστικά οποιασδήποτε διαγνωστικής μεθόδου. Έχουμε αναπτύξει ένα εξαιρετικά ευαίσθητο μικροσυστοιχιών για την ανίχνευση κοινών KRAS και BRAF ογκογόνες μεταλλάξεις. Σε καρκίνο του παχέος εντέρου, έχουν KRAS και BRAF μεταλλάξεων έχει αποδειχθεί για να προσδιορίσει ένα σύμπλεγμα των ασθενών που δεν ανταποκρίνονται στις αντι-EGFR θεραπείες? Ο προσδιορισμός αυτών των μεταλλάξεων είναι επομένως κλινικά εξαιρετικά σημαντική. Για να επαληθεύσετε τα τεχνικά χαρακτηριστικά του συστήματος μικροσυστοιχιών για τον ορθό προσδιορισμό της κατάστασης μεταλλάξεων KRAS στα δύο κωδικόνια hotspot 12 και 13 και του BRAF

μετάλλαξη V600E στο ορθοκολικού όγκου, επιλέξαμε 75 δείγματα στο παρελθόν χαρακτηρίζεται από συμβατικές και ΟΟ ενίσχυση στην Κάτω μετουσίωση θερμοκρασία-PCR (COLD-PCR), ακολουθούμενη από High Resolution Melting ανάλυση και άμεση αλληλούχιση. Μεταξύ αυτών των δειγμάτων, 60 συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια της χειρουργικής επέμβασης και αμέσως βυθίζονται σε RNAlater ενώ τα 15 υπολείμματα ήταν φορμόλη-σταθερές και εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) ιστούς. Το όριο ανίχνευσης της προτεινόμενης μεθόδου ήταν διαφορετική για τα 7 μεταλλάξεις KRAS δοκιμαστεί και για τη μετάλλαξη V600E BRAF. Ειδικότερα, το σύστημα μικροσυστοιχιών κατόρθωσε να ανιχνεύσει ένα ελάχιστο περίπου 0,01% των μεταλλαγμένα αλληλόμορφα σε υπόβαθρο άγριου τύπου DNA. Μια τυφλή επικύρωση εμφανίζεται πλήρης σύμπτωση των αποτελεσμάτων. Η εξαιρετική συμφωνία των αποτελεσμάτων έδειξε ότι το νέο υπόστρωμα μικροσυστοιχιών είναι πολύ συγκεκριμένα στην ανάθεση το σωστό γονότυπο χωρίς καμία στρατηγική εμπλουτισμό

Παράθεση:. Galbiati S, Damin F, Pinzani P, Mancini Ι, Vinci S, M Chiari , et al. (2013) Μια νέα μικροσυστοιχιών υπόστρωμα για Ultra-Ευαίσθητα γονοτυπικός έλεγχος του KRAS και BRAF γονίδιο παραλλαγές στον καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 8 (3): e59939. doi: 10.1371 /journal.pone.0059939

Επιμέλεια: Ajay Goel, Πανεπιστήμιο Baylor Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6, Ιουλίου του 2012? Αποδεκτές: 21 Φεβρουαρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 25 Μαρ 2013

Copyright: © 2013 Galbiati et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο προσδιορισμός της μοριακής υπογραφής των ανθρώπινων καρκίνων θα μπορούσε να είναι κεντρική στην ανάπτυξη μιας εξατομικευμένης προσέγγισης για την περίθαλψη των ασθενών. Στην πραγματικότητα, ο προσδιορισμός των κατάλληλων βιοδεικτών μπορεί να αυξάνει την ακρίβεια στην πρόγνωση, διευκολύνει την επιλογή της βέλτιστης θεραπευτικής αγωγής, τη βελτίωση της έκβασης των ασθενών, καθώς και τη μείωση του κόστους της θεραπείας [1]. Έτσι, η διαστρωμάτωση της ενιαίας ασθενείς με βάση μοριακών και γενετικών χαρακτηριστικών είναι η αναμενόμενη εξέλιξη της σύγχρονης κλινικής ογκολογίας.

Πρόσφατα θεραπευτικούς παράγοντες που στοχεύουν συγκεκριμένες γενετικές παραλλαγές και καλά χαρακτηρισμένο μοριακών οδών που έχουν αναπτυχθεί. Αυτή είναι η περίπτωση του KRAS ογκογονιδίου το οποίο είναι μέρος του μονοπατιού σηματοδότησης αρκετών διαφορετικών μορίων. Κέρδος-of-λειτουργία νοηματικές μεταλλάξεις συχνά σωματικώς αποκτηθεί σε καρκίνο του παχέος εντέρου, κατά κύριο λόγο σε τρία καυτά σημεία που αντιπροσωπεύεται από κωδικόνια 12, 13, και 61. Δυστυχώς, σε αυτά τα επίπεδα, ο αριθμός των αντικαταστάσεων είναι υψηλό, κάνοντας την ανίχνευσή τους πιο πολύπλοκες με αλληλόμορφο ειδικές τεχνικές. Ιδιοσυστατικά, ενεργοποιώντας μεταλλάξεις σε αυτά τα hot spot sites μπορεί να προσδιορίσει την αντίσταση σε EGFR-στοχευμένες θεραπείες που θα βελτιώσει σημαντικά διαφορετικά το ποσοστό επιβίωσης και την ποιότητα ζωής των ασθενών [2], [3], [4], [5]. Το δυναμικό του KRAS κωδικόνιο 12/13 μεταλλάξεις ως αποτελεσματικά μοριακών δεικτών επιλογής φαρμάκου έχει λάβει σημαντική προσοχή που οδηγούν στην χρήση τους στην καθημερινή φροντίδα των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου [6]. Η Ευρωπαϊκή Αρχή για την υγεία (https://www.emea.europa.eu/pdfs/human/press/pr/27923508en.pdf.) Καθώς και η Αμερικανική Εταιρεία Κλινικής Ογκολογίας [7] και το Εθνικό Δίκτυο Comprehensive Cancer (NCCN , https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/PDF/colon.pdf.) απαιτούν μεταλλάξεων του KRAS ανάλυση για καρκίνο του παχέος εντέρου πριν από την αντι-EGFR θεραπείας.

Μια άλλη ελπιδοφόρα βιοδεικτών αντι-EGFR αντίσταση αντιπροσωπεύεται από BRAF

μετάλλαξη V600E, που εμφανίζεται σε περίπου 10% των καρκίνων του παχέος εντέρου. BRAF είναι η άμεση καθοδικός τελεστής του KRAS στο μονοπάτι σηματοδότησης Ras /Raf /MAPK και BRAF

V600E μετάλλαξη ενεργοποίησης είναι αμοιβαία αποκλειόμενες για μεταλλάξεις KRAS [6]. Παρά τις επί του παρόντος περιορίζεται δεδομένα, και της έλλειψης πλήρους συναίνεσης, είναι πιθανό ότι οι μεταλλάξεις BRAF έχουν κάποιο ρόλο στον καθορισμό της ανταπόκρισης στη θεραπεία αντι-ΕΟΡΚ mAb και συσχετίζεται με χειρότερη πρόγνωση, ανεξάρτητα από την επεξεργασία [8], [9]. Επιπλέον, οι ασθενείς με όγκους που φέρουν μετάλλαξη BRAF θα μπορούσαν επίσης να επωφεληθούν από εκλεκτικούς αναστολείς BRAF, όπως PLX-4032 [10].

Στο παρόν σενάριο των στρατηγικών ελέγχου, οι τρέχουσες μέθοδοι ανάλυσης (συμβατικά αλληλουχίας, Pyrosequencing, κ.λπ. .) είναι χρονοβόρες, δαπανηρές και στερούνται ευρωστία. Άλλο ένα αναδυόμενο ζήτημα συνδέεται με την πραγματική ευαισθησία αυτών των μεθόδων που φαίνεται να ανιχνεύουν μειονότητα μεταλλαγμένα αλληλόμορφα μόνο όταν είναι παρούσες σε συγκεντρώσεις υψηλότερες από 10-20%. Σε προηγούμενες εργασίες [11], [12], που υπογράμμισε τη σημασία της ευαισθησίας στην ανίχνευση των μειονοτικών μεταλλαγμένα αλληλόμορφα σε βιολογικά δείγματα και επιβεβαίωσε τη χρησιμότητα του κρύου-PCR για τον εμπλουτισμό τους, ιδιαίτερα σε δείγματα με χαμηλά ποσοστά των καρκινικών κυττάρων. Κατά μέσο όρο, το 15% των ασθενών που αρχικά έχουν ταξινομηθεί ως αρνητικό για KRAS ή BRAF

παραλλαγές V600E βρέθηκαν θετικά μετά ΚΡΥΟ-PCR [11], [12].

μικροσυστοιχίες αποτελούν ένα φθηνό και ακριβές εργαλείο για παράλληλη του γονότυπου των πολλαπλών δεικτών, κατάλληλα για ανάλυση ρουτίνας σε ιατρικά διαγνωστικά [13]. Εδώ, θα υποβάλει έκθεση σχετικά με την ανάπτυξη ενός εξαιρετικά ευαίσθητο μικροσυστοιχιών για την ανίχνευση KRAS και BRAF μεταλλάξεων. Η μικροσυστοιχία αναπτύσσεται χρησιμοποιώντας ένα slide κρυσταλλικού πυριτίου επικαλυμμένα με ένα θερμικά καλλιεργούνται διοξείδιο του πυριτίου (SiO

2) στρώμα και λειτουργοποιημένα με προσρόφηση από ένα συμπολυμερές διμεθυλακρυλαμίδιο (DMA), Ν-acryloyloxysucinimide (NAS) και μετα-acryloy προπυλο τριμεθοξυ σιλάνιο (MAPS), συμπολυ (DMA-NAS-MAPS), που αναπτύχθηκε αρχικά για μικροσυστοιχίες DNA γυαλί [14]. Η ραχοκοκαλιά του πολυμερούς αποτελείται από DMA, ενός μονομερούς που προσροφάται στην επιφάνεια με δεσμούς υδρογόνου? NAS είναι το χημικά αντιδραστικό μονομερές που αντιδρά ομοιοπολικά με βιο-ανιχνευτές, ενώ ΧΑΡΤΕΣ συμβάλει στην ταινία σταθερότητα από συμπύκνωση με σιλανόλες επιφάνεια. Η διαδικασία επικάλυψης είναι απλή και αναπαραγώγιμη, σε σύγκριση με οργανο-σιλανοποίηση, μια διαδικασία που απαιτεί αυστηρά ελεγχόμενες συνθήκες και υποφέρουν από κακή αναπαραγωγιμότητα. Αυτό το λειτουργικό πολυμερές έχει εφαρμοστεί ευρέως στον τομέα βιοαισθητήρα για την βιο-λειτουργοποίηση σφαιρίδια που όπως διαπιστώθηκε πολυστυρένιο [15], microcantilevers πυρίτιο [16], πολυδιμεθυλοσιλοξάνιο [17], και νιτροκυτταρίνη [18] υποστρώματα.

Η επιλογή του υπόστρωμα πυριτίου επικαλυμμένα με ένα στρώμα SiO

2 από 100 nm πάχος οδηγεί σε μια ισχυρή εντατικοποίηση του φθορισμού στην επιφάνεια που προκύπτει από την οπτική εποικοδομητική παρεμβολή μεταξύ της προσπίπτουσας και αντανακλάται φώτα του φθορίζοντος ακτινοβολίας. Η προϋπόθεση δημιουργικής παρεμβολής στην επιφάνεια του υποστρώματος πληρούται σε διάφορους τύπους γυάλινων slides επικαλυμμένα με στρώματα διηλεκτρικού ή μεταλλικές μεμβράνες [19]. Ωστόσο, η στρατηγική που εμπλέκονται στην παραγωγή τέτοιων πολύπλοκων δομών πολλαπλών στρώσεων υποφέρει συχνά χαμηλή επαναληψιμότητα και δύσκολο τον έλεγχο της διαδικασίας. Η απλούστερη διαμόρφωση για να επιτευχθεί μια φθορίζουσα ενίσχυση κοντά σε αυτή που παρέχεται από διαφάνειες πολλαπλών στρώσεων αποτελείται από την επίπεδη πυριτίου ανακλαστήρα επικαλυμμένη με ένα λεπτό φιλμ SiO

2 [20], [21] προτείνεται στην παρούσα εργασία.

για να αξιολογήσει τις τεχνικές επιδόσεις του νεοαποκτηθέντα πλατφόρμα και να ελέγχει την ικανότητά της να διορθώσει γονοτυπική του KRAS και BRAF

μεταλλάξεις V600E σε δείγματα ορθοκολικού όγκου, επιλέξαμε 60 δείγματα ιστών που έχουν ήδη ταξινομηθεί για αυτές τις γενετικές παραλλαγές με πλήρη πρωτόκολλα των συμβατικών και κρύο -PCR, High Resolution Melting ανάλυση και άμεση αλληλούχιση. Η άριστη έκβαση των αποτελεσμάτων θα συζητηθούν, προκειμένου να δείξει τα πλεονεκτήματα και τα μειονεκτήματα και των δύο τεχνολογιών.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική

Δείγματα ιστών συλλέχθηκαν σε Azienda Ospedaliera Universitaria Careggi σε Φλωρεντία (Ιταλία) από 75 ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση για CRC στην περίοδο 1/6 /2009-2 /5/2011. Όλα τα άτομα που συμμετείχαν σε αυτή τη μελέτη με την προϋπόθεση γραπτή συγκατάθεση. Η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημίου της Φλωρεντίας. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκαν δύο κυτταρικές σειρές που παρέχονται από ATCC-LGC Πρότυπα Σύμπραξης: Η κυτταρική γραμμή CCRF-CEM ως αναφορά για KRAS p.G12D μετάλλαξη (ετερόζυγη) και το ανθρώπινο μελάνωμα Α375 κυτταρική γραμμή ως την πηγή του ομόζυγου BRAF

DNA V600E . Το καρκινικών κυττάρων του παχέος σειρά ανθρώπινου SW620 (που χρησιμοποιείται ως σημείο αναφοράς για την KRAS μετάλλαξη pG12V, homozygousand ο καρκίνος κυτταρική σειρά ανθρώπινου μαστού MCF-7 (άγριου τύπου τόσο για KRAS και BRAF γονίδια) χορηγήθηκαν από την Banca Biologica e εργοστάσιο κύτταρο (IRCCS Azienda Ospedaliera Universitaria San Martino -. IST Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro)

Η προετοιμασία των δειγμάτων

Εξήντα δείγματα ιστών συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια της χειρουργικής επέμβασης και αμέσως βυθίζονται σε RNAlater (Qiagen Gmbh, Hilden, Γερμανία) στους 4 ° C για 24 ώρες και αποθηκεύεται στη συνέχεια στους -80 ° C μέχρι την ανάλυση. οι ιστοί διασπάστηκαν με Tissue Lyser με ανοξείδωτο χάλυβα Χάντρες 5 mm (Qiagen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. καθαρισμός DNA πραγματοποιήθηκε με QIAcube ™ και QIAamp DNA mini Kit (Qiagen )

Η συγκέντρωση του DNA προσδιορίστηκε με Nanodrop ND-1000 Φασματοφωτόμετρο (Thermo Scientific, DE, USA)

Επιπλέον, 15 FFPE ιστούς αναλύθηκαν επίσης?.. DNA από ιστούς FFPE εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας το κιτ Tissue FFPE (Qiagen) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.

ϋΝΑ δείγματα πρώτον διερευνήθηκαν με τη βοήθεια συμβατικών PCR και ενίσχυση COLD-PCR ακολουθούμενη από HRM και άμεση αλληλούχιση. Στη συνέχεια ήταν τυφλά υποβληθεί στην ανάλυση του νεοαποκτηθέντα συσκευή μικροσυστοιχιών για να εκτιμήσουν την ικανότητά του στο KRAS και BRAF μεταλλάξεις του γονότυπου.

Τα θετικά δείγματα ελέγχου εκπροσωπήθηκαν από το DNA των κυτταρικών σειρών που φέρουν μεταλλάξεις στα γονίδια-στόχους (βλέπε προηγούμενη ενότητα Δεοντολογίας). Ειδικότερα άγριου τύπου και μεταλλαγμένων δείγματα δοκιμάστηκαν χωριστά ως μεμονωμένα δείγματα και ως μίγματα, προκειμένου να πάρει γνωστές ποσοστό μεταλλαγμένο αλλήλιο (από 6% σε 0,01%) που θα χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό της ευαισθησίας της δοκιμασίας για KRAS p.G12D και BRAF V600E παραλλαγές.

Επιπλέον, πλασμιδιακό DNA που περιέχει τις αλληλουχίες άγριου τύπου και εναλλακτικά όλες τις θεωρούνται παραλλαγές χρησιμοποιήθηκε για να ληφθεί ανασύσταση δειγμάτων για να αποδείξουν την ευαισθησία ανιχνεύσεως και ειδικότητα για όλες τις άλλες μεταλλάξεις KRAS.

Mutagenesis

Μεταλλαγμένα φέρουν πλασμίδια που παράγονται μέσω της κλωνοποίησης του ειδικού μεταλλαγμένου PCR προϊόντων που φιλοξενούν τις επτά μεταλλάξεις ελέγχθηκαν στη δοκιμασία και το αντίστοιχο θραύσμα άγριου τύπου. Μεταλλαγμένα θραύσματα παρασκευάσθηκαν χρησιμοποιώντας μια τροποποίηση της μεθόδου που αναφέρθηκε προηγουμένως [22]. Εν συντομία, η μεταλλαξογένεση επιτεύχθηκε με διαίρεση κάθε αμπλικόνιο σε δύο θραύσματα. Το 5 ‘θραύσμα στη συνέχεια ενισχύθηκε με την αρχική προς τα εμπρός εναρκτήρα και ενός μεταλλαξογένεση αντίστροφο εκκινητή εισάγοντας μια συντηρητική μεταστροφής. Παράλληλα, η «θραύσμα 3 ενισχύθηκε με την αρχική αντίστροφο εκκινητή και μεταλλάχθηκε προς τα εμπρός εκκινητή εισάγοντας την ίδια παραλλαγή νουκλεοτιδίου όπως παραπάνω (βλέπε Πίνακα S1). Αυτό οδήγησε στην παραγωγή δύο μερικώς επικαλυπτόμενα θραύσματα, τα οποία το καθένα γέλης εκλούσθηκε σε ένα τελικό όγκο των 50-100 μL αποσταγμένου νερού για την εξάλειψη των μη-ενσωματωμένα εναύσματα. Αναμίξαμε 2 μL κάθε εκλουσμένο διάλυμα μαζί? κάθε μίγμα στη συνέχεια επιμηκύνεται επί 15 κύκλους με την παρουσία του μίγματος της αντίδρασης PCR που περιέχει όλα τα αντιδραστήρια αλλά εκκινητές. Το προϊόν της αντίδρασης επιμήκυνσης, με αποτέλεσμα ένα πλήρους μήκους κεντρικά μεταλλαγμένο θραύσμα, ήταν ενισχύθηκε περαιτέρω με PCR για 20-30 κύκλους με προσθήκη του πλήρους μείγματος PCR και κλωνοποιήθηκε στον πλασμιδικό φορέα (ΤΟΡΟ ΤΑ Cloning, Invitrogen, LifeTechnologies, Μιλάνο, Ιταλία ) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Άμεση αλληλούχιση επιβεβαίωσε ότι η επιθυμητή αλλαγή νουκλεοτιδίου εισήχθη στο μεταλλαγμένο έλεγχο

συνθήκες PCR

Το εξόνιο 2 του γονιδίου KRAS ενισχύθηκε με το ακόλουθο σύνολο αστάρι:. 5′-GCC TGC TGA ΑΑΑ TGA CTG ΑΑ -3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-AGA ATG GTC CTG CAC CAG ΤΑΑ-3′ (5-αμινο-τροποποιημένο, πίσω) δημιουργώντας ένα θραύσμα 167 bp. Εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση της BRAF εξόνιο 15 (μέγεθος αμπλικονίου 173 bp) ήταν 5’-TGC TTG CTC TGA TAG GAA ΑΑΤ G-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-CCA CAA ΑΑΤ GGA TCC AGA CA-3’ (5-αμινο -τροποποιημένης, αντίστροφη).

PCR για αμφότερα τα γονίδια εκτελέστηκε σε αντίδραση 25 μλ που περιέχει 15 ng του DNA, 200 υΜ από κάθε δεοξυνουκλεοτιδίων, 10 mM Tris-HCl (ρΗ 8.3), 50 μ Μ ΚΟΙ, 1,5 mM MgCl

2, 1,5 υ DNA πολυμεράσης (AmpliTaq Gold? Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) και 10 pmoles του κάθε εκκινητή. Οι συνθήκες κύκλων συνεπαγόταν μια αρχική μετουσίωση στους 95 ° C για 10 λεπτά που ακολουθείται από 35 κύκλους στους 95 ° C για 30 s, 58 ° C για 30 s και 72 ° C για 30 s, και μια τελική επιμήκυνση στους 72 ° C για 10 λεπτά .

PCR καθαρισμό

Μετά τη διαδικασία ενίσχυσης, κάθε αμπλικόνιο καθαρίστηκε και αφαλατώθηκε με χρήση ενός 96-φρεατίων (Multiscreen-PCR πλάκες MANU 030) συζευγμένο με το Σύστημα Multiscreen διαχωρισμού (Millipore Corporation, Billerica, ΜΑ, USA). PCR προϊόντα εκλούστηκαν σε 35 υί 1 × ρυθμιστικού εκτύπωσης (150 mM φωσφορικό νάτριο ρΗ 8,5).

Reporter και σταθεροποιητής σχεδιασμό

Δημοσιογράφοι σχεδιάστηκαν σε μορφή dot-blot με τη διακύμανση βάση που αντιστοιχούν στα ενεργά σημεία που βρίσκονται εσωτερικά (Πίνακας 1). Μία καθολική μορφή σήμανσης χρησιμοποιήθηκε (Σχήμα 1), με βάση ρεπόρτερ που περιέχει μια αλληλουχία-ειδική ουρά που υβριδοποιείται με καθολική Cy3 ή Cy5 επισημασμένα ανιχνευτές (ανιχνευτή άγριου τύπου: CTC ΑΑΤ GTT CGG ACT CAG-Cy3? Μεταλλαγμένο ιχνηλάτη: TGT CAA GCG ATA TAC TGC-Cy5) [23]

βήματα υβριδισμός:. 1) σταθεροποιητή ολιγονουκλεοτιδίων για να ανοίξετε τη δευτερεύουσα δομή του θραύσματος PCR? 2) Η «καθολική μείγμα δημοσιογράφος». Το μείγμα περιέχει το άγριου τύπου και μεταλλαγμένων ρεπόρτερ. Κάθε ρεπόρτερ παρατείνεται από μια ουρά συμπληρωματική προς την επισημασμένο καθολική ολιγονουκλεοτιδίου. Κυανίνη 3- (Cy3) και Κυανίνη 5- (Cy5) επισημασμένο καθολική ολιγονουκλεοτιδίων αναδιατάσσονται σε άγριου τύπου και των μεταλλαγμένων δημοσιογράφους, αντίστοιχα.

Η

Σταθεροποιητής (ολιγονουκλεοτιδίων απαραίτητο να ανοίξουν οι δευτερογενείς δομές που υπάρχουν στο το αμπλικόνιο) και ο σχεδιασμός δημοσιογράφος έγινε με τη βοήθεια του web-ελεύθερα προγράμματα (server DNAmfold: https://www.bioinfo.rpi.edu/Ezukerm/rna και OligoAnalyzer 3,0 από το Ολοκληρωμένο DNA Technologies: http: //www.idtdna .com) [24]. Όλες οι ανταποκριτές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας τον κλώνο αντινόημα ως αμπλικονίου-στόχου. Όλες οι 7 μεταλλάξεις KRAS αναλύθηκαν με το ίδιο ολιγονουκλεοτίδιο σταθεροποιητή αναφέρονται στον Πίνακα 1. Το κωδικόνιο 600 BRAF μετάλλαξη απαιτείται η χρήση δύο σταθεροποιητές (Stab 1: βρίσκεται στο 5 ‘ως προς τη μετάλλαξη? Stab 2: που βρίσκεται στο 3’ στη μετάλλαξη , αναφέρονται στον πίνακα 1).

Σιλίκωση διαφάνεια και μικροσυστοιχιών προετοιμασία

τα ανεπεξέργαστα πυριτίου διαφάνειες 1000A Thermal Oxide (14 × 14 mm

2) διατέθηκαν από SVM, Silicon Valley Μικροηλεκτρονικής Inc . (Santa Clara, Καλιφόρνια ΗΠΑ). slides πυριτίου προ-αγωγή με 0.1 Μ υδροξείδιο του νατρίου για 30 λεπτά και πλύθηκε με νερό και ξηραίνεται. Μετά την προ-θεραπεία, διαφάνειες πυρίτιο βυθίστηκαν για 30 λεπτά σε ένα συμπολυ (DMA-NAS-MAPS) διάλυμα (1% w /v σε 0.9 Μ (NH4)

2SO

4 υδατικό διάλυμα). Συμπολυ (DMA-NAS-MAPS) συντέθηκε και χαρακτηρίστηκε όπως περιγράφεται [14].

Τα πλακίδια τελικά ξεπλένεται με νερό και ξηραίνεται υπό κενό στους 80 ° C.

Τα προϊόντα της PCR για κάθε γονίδιο, ενισχύθηκε από εκκινητές με 5 ‘πρωτοταγή αμινο-ομάδα, είναι αναγκαίο να δεσμεύει τα αμπλικόνια ομοιοπολικά στο υπόστρωμα μέσω μιας αντίδρασης μεταξύ των αμινομάδων και των ενεργών εστέρων της επικάλυψης πολυμερούς, κηλιδώθηκαν επί των υποστρωμάτων μικροσυστοιχίας. Τρία μλ από τα αμινο-τροποποιημένα αμπλικόνια τυπώθηκαν σε 6 επαναλήψεις χρησιμοποιώντας ένα πιεζοηλεκτρικό spotter, SciFLEXARRAYER S5 (Scienion Γερμανία), επί επικαλυμμένων διαφάνειες πυριτίου. Μία αμινο-τροποποιημένο ολιγονουκλεοτίδιο σημασμένο με Cy3 είχε εντοπιστεί ως θέσης αναφοράς σε τέσσερις στήλες σε κάθε συστοιχία. συνθήκες Spotting διεξήχθη στους όπως περιγράφεται [25]. Τα αμπλικόνια συνδέθηκαν με τις συστοιχίες με επώαση σε ακάλυπτο κουτί αποθήκευσης, που σε ένα σφραγισμένο θάλαμο, κορεσμένο με χλωριούχο νάτριο (40 g /100 mL H

2O) και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου όλη τη νύκτα.

Μετά την επώαση, κάθε υπολειμματική αντιδραστικές ομάδες του πολυμερούς επικάλυψης αποκλείστηκαν με εμβάπτιση του slide σε προθερμασμένο διάλυμα αποκλεισμού όπως αναφέρθηκε [25].

Hybridization

Αμέσως πριν την υβριδοποίηση, τυπωμένες διαφάνειες βυθίστηκαν σε 0.1 Μ NaOH για 5 λεπτά για να μετουσιωθεί το διπλόκλωνο ακινητοποιημένο αμπλικόνια στη συνέχεια ξεπλένεται με νερό και ξηραίνεται. Οι αλληλουχίες του ρεπόρτερ και σταθεροποιητές, μαζί με τις θερμοκρασίες υβριδοποίησης που περιγράφονται στον Πίνακα 1. Στο πρώτο στάδιο, 0,5 μι του ολιγονουκλεοτιδίου σταθεροποιητή αναμίχθηκαν με 49,5 μΐ διαλύματος υβριδοποίησης (2 χ SSC, 0,1% SDS, 0,2 mg /mL BSA) έως τελική συγκέντρωση 1 μΜ και απλώνονται πάνω στην στίγματα περιοχή του κλείστρου. Τα πλακίδια επωάστηκαν στους 20 ° C για 30 λεπτά στο θάλαμο υβριδισμού Thermomixer Comfort (Eppendorf), και στη συνέχεια πλύθηκε σε θερμοκρασία δωματίου σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα SSC 4 × για να αφαιρέσετε το καλυπτρίδα. Αυτό το πρώτο στάδιο έκπλυσης ακολουθείται από μία σύντομη πλύση (30 s) σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα χαμηλής περιεκτικότητας σε αλάτι (0.2 χ SSC). Στη συνέχεια, για την ανίχνευση της G12S, G12D, G12C, G12R, G13D KRAS μεταλλάξεις και για τις BRAF

μεταλλάξεις V600E, ο δημοσιογράφος του άγριου τύπου και των μεταλλαγμένων αλληλουχιών και των αντίστοιχων καθολική ολιγονουκλεοτίδια τους σημανθεί με Cy3 και Cy5 αντίστοιχα, αναμίχθηκαν μαζί σε ισομοριακές ποσότητες (τελική συγκέντρωση 1 μΜ) και προστέθηκε στο ρυθμιστικό υβριδισμού (2 χ SSC, 0,1% SDS, 0,2 mg /mL BSA) (βλέπε Σχήμα 1 για το σύστημα δοκιμασίας). Στην περίπτωση των G12A και G12V KRAS μεταλλάξεις ήταν απαραίτητο να επωαστούν τα αμπλικόνια σε δύο διαδοχικά στάδια. Στο πρώτο στάδιο τα αμπλικόνια υβριδοποιήθηκαν με τον ανταποκριτή συμπληρωματικό προς την μεταλλαγμένη αλληλουχία μαζί με το αντίστοιχο καθολική ολιγονουκλεοτίδιο σημασμένο με Cy5? Στη συνέχεια, μετά από μια σύντομη πλύση σε 4 Χ SSC για να αφαιρέσετε το κάλυμμα ολίσθησης, στο δεύτερο τα αμπλικόνια υβριδοποιήθηκαν με τον ανταποκριτή συμπληρωματικό προς το άγριου τύπου και το αντίστοιχο καθολική ολιγονουκλεοτίδιο του επισημασμένα με Cy3. Αμφότερες οι επωάσεις διήρκεσαν επί 1 ώρα.

Τέλος, τα πλακίδια πυριτίου αφαιρέθηκαν από τον θάλαμο υβριδισμού και εμποτισμένο με συντομία σε SSC ρυθμιστικό 4 × για να αφαιρέσετε το καλυπτρίδα, πλύθηκε δύο φορές για 5 λεπτά σε 2 χ SSC /0.1% SDS , προθερμασμένο σε συγκεκριμένη θερμοκρασία υβριδοποίησης, τότε βυθίζεται, σε σειρά, σε ένα διάλυμα 0,2 χ SSC και 0,1 χ SSC επί 1 λεπτό σε θερμοκρασία δωματίου, ξηραίνεται με φυγοκέντρηση στις 780 rpm για 3 λεπτά και σαρώνεται.

σάρωση εικόνας και ανάλυση δεδομένων

ProScanArray (Perkin Elmer, ΜΑ, USA) χρησιμοποιήθηκε για τη σάρωση των υβριδοποιημένων διαφάνειες. Ειδικότερα, ένα πράσινο λέιζερ (λ

ex 543 nm /λ

em 570 nm) για τη βαφή Cy3 και ένα κόκκινο laser (λ

ex 633 nm /λ

em 670 nm) για την Cy5 βαφή εφαρμόστηκαν. Η φωτοπολλαπλασιαστή (PMT) κέρδος σωλήνα και η ισχύς του λέιζερ άλλαξε μεταξύ φθοριοχρώμων και διαφορετικά πειράματα. εικόνες TIFF 16-bit αναλύθηκαν σε 5 μm ανάλυση. εντάσεις δεδομένα εκχυλίζονται με το λογισμικό του σαρωτή και η ανάλυση των δεδομένων έγινε για κάθε πείραμα όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25].

Συμβατικά και κρύο-PCR ενίσχυση ακολουθείται από High Resolution τήξης (HRM) και άμεση

αλληλουχίας

Η συμβατική PCR, COLD-PCR, Διαχείρισης Ανθρώπινου Δυναμικού και αλληλούχιση πρωτόκολλα έχουν ήδη περιγραφεί [11], [26].

Αποτελέσματα

1) Συμβατικές και ΚΡΥΟ-PCR HRM ενίσχυση και αλληλούχιση αποτελέσματα

Αρχικά, όλα τα 75 δείγματα εξετάστηκαν για την έρευνα των μεταλλάξεων KRAS και BRAF

V600E με HRM και αλληλουχίας. Σε μια δεύτερη φάση, όλα τα δείγματα (μεταλλαγμένες και άγριου τύπου) έχουν υποβληθεί εκ νέου σε πλήρη έλεγχο χρησιμοποιώντας κρύο-PCR ενίσχυση ακολουθείται από HRM και αλληλούχιση όπως έχει ήδη αναφερθεί [11].

Σε παγκόσμιο επίπεδο, 59 από τα 75 δείγματα περιέχεται εναλλακτικά μία μετάλλαξη είτε με hotspots KRAS ή στο BRAF

παραλλαγή V600E, ενώ 16 είχαν ταξινομηθεί ως δείγματα άγριου τύπου και περιλαμβάνονται ως αρνητικοί μάρτυρες. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι σε 9/59 μεταλλαχθεί δείγματα, ο προσδιορισμός των υποκαταστάσεις βάσεων κατέστη δυνατή μόνο μέσω της χρήσης του γρήγορου ή πλήρους πρωτόκολλα ΚΡΥΟ-PCR, πιθανώς λόγω των χαμηλότερων ποσοστών μεταλλαγμένα αλληλόμορφα στα δείγματα εκκίνησης. Αυτά τα δείγματα εύστοχα εισαχθεί στην μελέτη επικύρωσης για να ελεγχθεί η ευαισθησία της προτεινόμενης πλατφόρμας. Για παραλλαγές μια λεπτομερή περιγραφή της κατανομής του KRAS και BRAF στα δείγματα μας βλέπε Πίνακα 2.

Η

2) Βελτιστοποίηση της ολίσθησης πυριτίου ανάλυση

δείγματα ελέγχου άγριου τύπου και να ανασυσταθεί ετερόζυγο ελέγχου δείγματα (που παράγεται από την ανάμιξη σωστά πλασμιδιακό DNA που περιέχει άγριου τύπου και μεταλλαγμένες αλληλουχίες όλων των 7 μεταλλάξεων KRAS και του BRAF

παραλλαγή V600E) χρησιμοποιήθηκαν για να δοκιμαστεί η εξειδίκευση του προσδιορισμού. Μετά βελτιστοποίηση της θερμοκρασίας και του χρόνου υβριδισμού, επιτεύχθηκε μια σωστή ταυτοποίηση όλων των γονότυπων. Ένα παράδειγμα απεικονίζεται στα Σχήματα 2 και 3, όπου ένα πείραμα υβριδισμού για την G12R KRAS και το BRAF

V600E μετάλλαξη δείχνεται, αντίστοιχα. Στο βελτιστοποιημένο σύστημα, για όλα τα αναλύθηκαν μεταλλάξεις θα μπορούσαμε αποδεικτικά στοιχεία ότι: i) σημάτων φθορισμού ήταν υψηλές, ii) δεν διασταυρούμενη υβριδοποίηση αποκτήθηκε, ακόμη και για τις παραλλαγές που επηρεάζουν τα ίδια ή σε γειτονικές θέσεις νουκλεοτιδίων (Σχήμα 2D) και iii) καλή αναπαραγωγιμότητα από το σημείο στο σημείο (δείχνεται με γραμμές σφάλματος) βρέθηκε.

(Α) μικροσυστοιχία σάρωσης του σήματος φθορισμού Cy3 που αντιστοιχεί στο αλληλόμορφο άγριου τύπου. Κηλίδες στη στήλη 1,2,3,4 αντιπροσωπεύουν αμινο-τροποποιημένο ολιγονουκλεοτίδιο σημασμένο με Cy3 χρησιμοποιούνται ως σημεία αναφοράς. (Β) σάρωση του σήματος φθορισμού Cy5 αντιστοιχεί στο μεταλλαγμένο αλληλόμορφο. καθεστώς κηλίδες αίματος (C) μικροσυστοιχιών. κβ: δείγματα ελέγχου άγριου τύπου? Het1, Het2 και Het3: ετερόζυγα δείγματα ελέγχου για G12A, G12C, G12R, G12S, G12V, G13D? G12D KRAS μεταλλάξεις? ανοιχτό γκρι τετράγωνα αντιπροσωπεύουν αμινο-τροποποιημένο ολιγονουκλεοτίδιο σημασμένο με Cy3 χρησιμοποιούνται ως σημεία αναφοράς. (D) κανονικοποιημένη σχετική ένταση φθορισμού μετά από υβριδισμό των γνωστών δειγμάτων ελέγχου με τους δημοσιογράφους συμπληρωματικά προς τη διακύμανση G12R. Bars είναι ο μέσος όρος της έντασης των 6 επαναλήψεων κάθε δείγματος. Οι μπάρες σφάλματος είναι οι τυπικές αποκλίσεις της έντασης φθορισμού κάθε δείγματος. Σήμα

Η

(Α) φθορισμού Cy3 που αντιστοιχεί στο αλληλόμορφο άγριου τύπου. Κηλίδες στη στήλη 1,2,3,4 αντιπροσωπεύουν αμινο-τροποποιημένο ολιγονουκλεοτίδιο σημασμένο με Cy3 χρησιμοποιούνται ως σημεία αναφοράς. σήμα (Β) φθορισμός Cy5 αντιστοιχεί στο μεταλλαγμένο αλληλόμορφο. καθεστώς κηλίδες αίματος (C) μικροσυστοιχιών. κβ: δείγματα ελέγχου άγριου τύπου? Het1, Het2 και Het3: Δείγματα ετερόζυγα ελέγχου? mut: ομόζυγο μεταλλαγμένο δείγμα ελέγχου? ανοιχτό γκρι τετράγωνα αντιπροσωπεύουν αμινο-τροποποιημένο ολιγονουκλεοτίδιο σημασμένο με Cy3 χρησιμοποιούνται ως σημεία αναφοράς. (D) κανονικοποιημένη σχετική ένταση φθορισμού μετά από υβριδισμό των γνωστών δειγμάτων ελέγχου με τους δημοσιογράφους συμπληρωματικά προς τη διακύμανση V600E BRAF. Bars είναι ο μέσος όρος της έντασης των 6 επαναλήψεων κάθε δείγματος. Οι μπάρες σφάλματος είναι οι τυπικές αποκλίσεις της έντασης φθορισμού κάθε δείγματος.

Η

3) Ευαισθησία της

δοκιμασίας

ευαισθησία της δοκιμασίας σε διακριτική διαφορετικές αναλογίες μεταλλαγμένα αλληλόμορφα αξιολογήθηκε σε σειριακές αραιώσεις (6%, 3%, 1,6%, 0,8%, 0,4%, 0,2%, 0,1%, 0,05%, 0,02%, 0,01% μεταλλαγμένα /άγριου τύπου) του μεταλλαγμένο DNA επίκαιρα αναμιγνύεται με άγριου τύπου DNA. Συγκεκριμένα χρησιμοποιήσαμε κυτταρική γραμμή CCRF-CEM ως αναφορά για KRAS p.G12D μετάλλαξη (ετερόζυγη), την κυτταρική ορθοκολικό καρκίνωμα σειρά ανθρώπινου SW620 (που χρησιμοποιείται ως αναφορά για KRAS μετάλλαξη pG12V, ομόζυγα), και το ανθρώπινο μελάνωμα Α375 κυτταρικές γραμμές (που χρησιμοποιείται ως η πηγή της ομόζυγη BRAF

DNA V600E). Ο καρκίνος του μαστού ανθρώπινη κυτταρική σειρά MCF-7 χρησιμοποιήθηκαν ως άγριου τύπου και για τις δύο KRAS και BRAF γονίδια. Για όλες τις άλλες μεταλλάξεις KRAS χρησιμοποιήσαμε τα πλασμίδια μεταλλαγμένο φέρουν δημιουργείται.

Το όριο ανίχνευσης της προτεινόμενης μεθόδου ήταν διαφορετική για τις 7 μεταλλάξεις KRAS ελεγχθεί και για τη μετάλλαξη V600E BRAF. Ειδικότερα, το σύστημα μικροσυστοιχιών κατόρθωσε να ανιχνεύσει ένα ελάχιστο περίπου 0,01% των μεταλλαγμένα αλληλόμορφα σε υπόβαθρο άγριου τύπου DNA για την μετάλλαξη G13D, περίπου 0,025% του μεταλλαγμένου αλληλόμορφου για τη μετάλλαξη G12R, 0,05% για τη μετάλλαξη G12C , 0,1% για τη μετάλλαξη G12D, 0,2% για την μετάλλαξη V600E BRAF, 0,4% για το G12A και τα G12S μεταλλάξεων και 0,8% για το G12V αντίστοιχα. Στο Σχήμα 4 Οι δύο παραδείγματα των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται για τη μετάλλαξη G13D KRAS και για τη μετάλλαξη BRAF

V600E δείξει.

Το όριο ανίχνευσης της μετάλλαξης G13D (Α) και της μετάλλαξης V600E BRAF (Β) . κβ: δείγματα ελέγχου άγριου τύπου? Het1, Het2 και Het3: Δείγματα ετερόζυγα ελέγχου? αριθμούς από 1 έως 10: διαδοχικές αραιώσεις, 1 = 6%, 2 = 3%, 3 = 1,6%, 4 = 0,8%, 5 = 0,4%, 6 = 0,2%, 7 = 0,1%, 8 = 0,05%, 9 = 0,02%, 10 = 0,01%, αντίστοιχα. Bars είναι ο μέσος όρος της έντασης των 6 επαναλήψεων κάθε δείγματος. Οι γραμμές σφάλματος είναι οι τυπικές αποκλίσεις της έντασης φθορισμού του κάθε δείγματος.

Η

4) Blind επικύρωση

Έλεγχος καταλληλότητας της δοκιμασίας πραγματοποιήθηκε με τυφλό τρόπο από την ανάλυση 75 δειγμάτων από άτομα είτε θετική ή άγριου τύπου για KRAS και BRAF μεταλλάξεων, που προηγουμένως χαρακτηρίζεται από HRM και άμεση αλληλούχιση. Ως παράδειγμα, τα αποτελέσματα μικροσυστοιχιών για την G12C KRAS μετάλλαξης και για BRAF

μετάλλαξη V600E κατεψυγμένων ιστών φαίνεται στα σχήματα 5 και 6, αντίστοιχα. Επιπλέον στο Σχήμα 7 και 8 τα αποτελέσματα μικροσυστοιχιών για την μετάλλαξη G12R KRAS και για BRAF

μετάλλαξη V600E σε δείγματα FFPE δείχνεται, αντίστοιχα. Το σύστημα ήταν πολύ ειδικά για την ταξινόμηση της ορθής γονότυπο για όλα τα δείγματα. Τυφλή επικύρωση εμφανίζεται πλήρης αντιστοιχία των αποτελεσμάτων (Πίνακας 2) με την αναμενόμενη εξαίρεση των δειγμάτων N.31 και N.40, που φέρει το p.G13C και τις παραλλαγές p.V14I KRAS, τα οποία είχαν εισαγάγει ρητώς να δοκιμάσει την ιδιαιτερότητα του νεοαποκτηθέντα ανιχνευτές (βλέπε πίνακα 2).

(Α) σήμα φθορισμού Cy5 αντιστοιχεί στο μεταλλαγμένο αλληλόμορφο. καθεστώς κηλίδες αίματος (Β). κβ: δείγματα ελέγχου άγριου τύπου? Het1, Het2 και Het3: ετερόζυγα δείγματα ελέγχου για G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G13D, G12V KRAS μεταλλάξεις? αριθμούς από 1 έως 60: εξήντα διαφορετικά δείγματα DNA στερεού όγκου. Γκρι δείκτες αντιπροσωπεύουν τα δείγματα θετικά για μετάλλαξη G12C? ανοιχτό γκρι τετράγωνα αντιπροσωπεύουν μία αμινο-τροποποιημένο ολιγονουκλεοτίδιο σημασμένο με Cy3 χρησιμοποιήθηκε ως κηλίδες αναφοράς. (C) Ανάλυση HRM του αριθμού του δείγματος 30 (αριθμός 2) σε σύγκριση με τα προφίλ τήξης των δειγμάτων ελέγχου (αναφοράς άγριου τύπου = αριθμός 1? Μεταλλαγμένο αναφοράς = αριθμός 3) μετά από ενίσχυση από κρύο-PCR: η συμπεριφορά τήξης είναι ενδεικτικό για την παρουσία του μεταλλαγμένου DNA στο δείγμα. (Δ) Ανάλυση άμεση αλληλούχιση του αριθμού του δείγματος 30 υποβάλλεται στο πρωτόκολλο ενίσχυσης COLD-PCR: ηλεκτροφόρημα επιβεβαιώνει την παρουσία μεταλλαγμένου DNA (G12C) στο δείγμα

Η

(Α) σήμα φθορισμού Cy3 αντιστοιχούν σε. το αλληλόμορφο άγριου τύπου. Κηλίδες στη στήλη 1,2,3,4 αντιπροσωπεύουν αμινο-τροποποιημένο ολιγονουκλεοτίδιο σημασμένο με Cy3 χρησιμοποιούνται ως σημεία αναφοράς. σήμα (Β) φθορισμός Cy5 αντιστοιχεί στο μεταλλαγμένο αλληλόμορφο. (C) σύστημα κηλίδες. κβ: δείγματα ελέγχου άγριου τύπου? BRAF Het1, Het2 και Het3: Δείγματα ετερόζυγα ελέγχου? mut: ομόζυγο μεταλλαγμένο δείγμα ελέγχου? αριθμούς από 1 έως 60: εξήντα διαφορετικά δείγματα στερεού όγκου. Γκρι δείκτες αντιπροσωπεύουν τα δείγματα θετικά για μετάλλαξη BRAF? ανοιχτό γκρι τετράγωνα αντιπροσωπεύουν μία αμινο-τροποποιημένο ολιγονουκλεοτίδιο σημασμένο με Cy3 χρησιμοποιήθηκε ως κηλίδες αναφοράς. σήμα

Η

(Α) φθορισμού Cy3 που αντιστοιχεί στο αλληλόμορφο άγριου τύπου. Κηλίδες στη στήλη 1,2,3,4 αντιπροσωπεύουν αμινο-τροποποιημένο ολιγονουκλεοτίδιο σημασμένο με Cy3 χρησιμοποιούνται ως σημεία αναφοράς. σήμα (Β) φθορισμός Cy5 αντιστοιχεί στο μεταλλαγμένο αλληλόμορφο. (C) σύστημα κηλίδες. κβ: δείγματα ελέγχου άγριου τύπου? Het: ετερόζυγα δείγματα ελέγχου για G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, G13D, KRAS μεταλλάξεις? αριθμούς 1-15: δεκαπέντε διαφορετικά δείγματα στερεών DNA του όγκου FFPE. Γκρι δείκτες αντιπροσωπεύουν τα δείγματα θετικά για μετάλλαξη G12R? ανοιχτό γκρι τετράγωνα αντιπροσωπεύουν μία αμινο-τροποποιημένο ολιγονουκλεοτίδιο σημασμένο με Cy3 χρησιμοποιήθηκε ως κηλίδες αναφοράς. (D) Σχετική ένταση φθορισμού για την ανίχνευση της ευαισθησίας του συστήματος αξιολογούνται για την μετάλλαξη G12R. κβ: δείγματα ελέγχου άγριου τύπου? Het: Δείγματα ετερόζυγα ελέγχου? αριθμούς 1-15: δείγματα FFPE. Bars είναι ο μέσος όρος της έντασης των 6 επαναλήψεων κάθε δείγματος. Οι μπάρες σφάλματος είναι οι τυπικές αποκλίσεις της έντασης φθορισμού κάθε δείγματος. Σήμα

Η

(Α) φθορισμού Cy3 που αντιστοιχεί στο αλληλόμορφο άγριου τύπου. Κηλίδες στη στήλη 1,2,3,4 αντιπροσωπεύουν αμινο-τροποποιημένο ολιγονουκλεοτίδιο σημασμένο με Cy3 χρησιμοποιούνται ως σημεία αναφοράς. σήμα (Β) φθορισμός Cy5 αντιστοιχεί στο μεταλλαγμένο αλληλόμορφο. (C) σύστημα κηλίδες. κβ: δείγματα ελέγχου άγριου τύπου? BRAF het1, het2: ετερόζυγα δείγματα ελέγχου? BRAF Mut1, mut2: ομόζυγο δείγμα μεταλλαγμένου ελέγχου? αριθμούς 1-15: δεκαπέντε διαφορετικά δείγματα στερεών DNA του όγκου FFPE. Γκρι δείκτες αντιπροσωπεύουν τα δείγματα θετικά για μετάλλαξη BRAF? ανοιχτό γκρι τετράγωνα αντιπροσωπεύουν μία αμινο-τροποποιημένο ολιγονουκλεοτίδιο σημασμένο με Cy3 χρησιμοποιήθηκε ως κηλίδες αναφοράς. (D) Σχετική ένταση φθορισμού για την ανίχνευση της ευαισθησίας του συστήματος αξιολογούνται για την μετάλλαξη V600E BRAF. κβ: δείγματα ελέγχου άγριου τύπου? Het: Δείγματα ετερόζυγα ελέγχου? αριθμούς 1-15: δείγματα FFPE. Bars είναι ο μέσος όρος της έντασης των 6 επαναλήψεων κάθε δείγματος. Οι γραμμές σφάλματος είναι οι τυπικές αποκλίσεις της έντασης φθορισμού του κάθε δείγματος.

Η

Συζήτηση

Η ευαισθησία και η ειδικότητα είναι θεμελιώδη χαρακτηριστικά της κάθε διαγνωστικής μεθόδου. Πολύ ευαίσθητο δοκιμασίες, είναι σε θέση να ανιχνεύει μικρές ποσότητες της ουσίας υπό έρευνα, μπορεί να ανοίξει νέες ευκαιρίες σε αρκετές κλινικές εφαρμογές. Ειδικότερα, η ταυτοποίηση των μειονότητα μεταλλαγμένα αλληλόμορφα μέσα σε ένα πλεόνασμα αλληλόμορφων άγριου τύπου που αντιπροσωπεύει ένα κοινό πρόβλημα στην ανάλυση του DNA του καρκίνου, είναι τεχνικά πολύ δύσκολο και απαιτεί την χρήση πολύ ευαίσθητες τεχνικές.

Εντός αυτό