Αφηρημένο

Ιστορικό

Η μετάλλαξη των ανταγωνιστών σήματος Wnt APC ή Axin ενεργοποιεί σηματοδότησης β-κατενίνης σε πολλούς καρκίνους, συμπεριλαμβανομένης της πλειοψηφίας του ανθρώπινου παχέος αδενοκαρκινώματα. Ο φαινότυπος των

APC

ή

αξίνη

μετάλλαξη στον καρπό πετάξει

Drosophila melanogaster

είναι εντυπωσιακά παρόμοια με αυτή που προκαλείται από μετάλλαξη στο γονίδιο τμήμα-πολικότητα,

γυμνός επιδερμίδα (NKD)

. NKD αναστέλλει σηματοδότηση Wnt με σύνδεση προς την οικογένεια Dishevelled (Dsh /ϋνΙ) πρωτεϊνών σκαλωσιά που συνδέουν την ενεργοποίηση του υποδοχέα Wnt σε β-κατενίνης συσσώρευσης και TCF-εξαρτώμενη μεταγραφή, αλλά η ανθρώπινη

NKD

γονίδια δεν έχουν ακόμη εμπλέκονται άμεσα στον καρκίνο

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Έχουμε εντοπίσει για πρώτη φορά μεταλλάξεις στο

NKD1

-. ένα από τα δύο ανθρώπινα

NKD

ομόλογα – σε μια υποσύνολο αναντιστοιχία DNA ορθοκολικών όγκων επισκευή ανεπάρκεια που δεν είναι γνωστό ότι το λιμάνι μεταλλάξεις σε άλλα γονίδια Wnt-μονοπάτι. Οι μεταλλαγμένες πρωτεΐνες Nkd1 είναι ελαττωματικά στην αναστολή σηματοδότηση Wnt? Επιπλέον, οι μεταλλαγμένες πρωτεΐνες Nkd1 σταθεροποίηση β-κατενίνης και την προώθηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, εν μέρει λόγω της μειωμένης ικανότητας του κάθε μεταλλαγμένης πρωτεΐνης Nkd1 να δεσμεύει και να αποσταθεροποιήσει πρωτεΐνες ϋνΙ.

Συμπεράσματα /σημαντικότητα

Τα δεδομένα μας αυξήσει την υπόθεση ότι η συγκεκριμένη

NKD1

μεταλλάξεις προώθηση Wnt-εξαρτώμενη ογκογένεση σε ένα υποσύνολο του DNA αναντιστοιχία επισκευή ανεπάρκεια του παχέος αδενοκαρκινώματα και ενδεχομένως άλλα Wnt-σήμα οδηγείται ανθρώπινων καρκίνων

Αιτιολογική αναφορά.: Guo J, Cagatay T, Zhou G, Chan CC, Blythe S, Suyama K, et al. (2009) Μεταλλάξεις στο Ανθρώπου

γυμνή επιδερμίδα

ομόλογο

NKD1

Βρέθηκαν σε καρκίνο του παχέος εντέρου Alter Wnt /ϋνΙ /β-κατενίνης σηματοδότησης. PLoS ONE 4 (11): e7982. doi: 10.1371 /journal.pone.0007982

Επιμέλεια: Neil A. Hotchin, Πανεπιστήμιο του Birmingham, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: πέμπτης Αύγ του 2009? Αποδεκτές: 19, Οκτώβρη του 2009? Δημοσιεύθηκε: 24 Νοεμβρίου 2009

Copyright: © 2009 Guo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την αμερικανική Αντικαρκινική Εταιρεία Θεσμικών Research Grant (σε KW)? τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (R01-GM65404 να K.W .; R01-CA60117 να S.N.T.)? και η Mayo Clinic /Ίδρυμα (στο W.L.). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η ενεργοποίηση του «κανονικού» Wnt /β-κατενίνης σηματοδότησης σε όλα σχεδόν τα ανθρώπινα παχέος αδενοκαρκινώματα (CRC) καθιστά το μονοπάτι Wnt μια πολλά υποσχόμενη ακόμη αναξιοποίητο θεραπευτικό στόχο [1]. Η επικρατούσα παράδειγμα για κανονική Wnt σηματοδότησης είχε συναχθεί εν μέρει μέσω κομψό αναπτυξιακές μελέτες της μύγας των φρούτων

Drosophila melanogaster

και το αμφίβιο

Xenopus laevis

: Απουσία του σήματος Wnt, ένα «πολύπλοκο καταστροφής» που αποτελείται των πρωτεϊνών της APC, Axin, ΟδΚ3β και CK1 φωσφορυλιώνει β-κατενίνης, οδηγώντας σε β-κατενίνης ουβικιτινίωση και την υποβάθμιση του πρωτεασώματος [2]. Σύνδεση συνδετήρων Wnt να Frizzled /LRP συνδέκτες ενεργοποιεί την πρωτεΐνη ικρίωμα Dishevelled (Dsh? Dvl1, Dvl2, Dvl3 στα θηλαστικά), που οδηγεί σε παγίδευση και την υποβάθμιση των Axin, η οποία επιτρέπει β-κατενίνης να συσσωρεύονται, εισάγετε τον πυρήνα, και δεσμεύουν τη μεταγραφή TCF παράγοντες για τη ρύθμιση γονιδίων-στόχων [2].

Η πλειοψηφία (60-85%) των ανθρώπινων CRC έκθεμα ενεργοποιηθεί κανονική Wnt σηματοδότησης λόγω περικοπή μεταλλάξεις στο

APC

που σταθεροποιούν β-κατενίνης [3 ]. Εναλλακτικά, οι μεταλλάξεις σε β-κατενίνης

(CTNNB1)

ότι η φωσφορυλίωση μπλοκ και την υποβάθμιση που βρέθηκαν σε κάποια CRC ότι η έλλειψη

APC

μετάλλαξη [4]. CRCs οθόνη τουλάχιστον δύο τύπους γονιδιωματικής αστάθειας: χρωμοσωμική αστάθεια (CIN) που σχετίζονται με μεταλλαγμένο APC και p53 και οδηγεί σε ανευπλοειδία και μικροδορυφορικού-αστάθεια (MSI), που προκαλούνται από ελαττωματικά επιδιόρθωση του DNA αναντιστοιχία (MMR) και οδηγεί σε μεταλλάξεις σε απλή ακολουθία επαναλήψεις (SSR) σε όλο το γονιδίωμα [5], [6]. Μετάλλαξη SSRs στην κωδικοποίηση ή διασταύρωση ματίσματος περιοχές των βασικών ρυθμιστικών γονιδίων μπορεί να δημιουργήσει το σημείο μεταλλαγμένες ή κομμένες πρωτεΐνες που προωθούν την εξέλιξη του καρκίνου? πράγματι, ανεπάρκεια MMR και MSI είναι χαρακτηριστικές των όγκων σε ασθενείς με σύνδρομο ορθοκολικό καρκίνο κληρονομικό μη-πολυποειδούς {HNPCC? Σύνδρομο γνωστός και ως Lynch (ΟΜΙΜ 120435)} και του 13-17% των σποραδικών CRC [7].

APC

μεταλλάξεις είναι διαδεδομένη σε CIN-CRC [3], αλλά το γονίδιο μονοπάτι φάσμα μετάλλαξη Wnt σε MSI-CRC είναι λιγότερο καλά χαρακτηρισμένες, με μεταλλάξεις στο ομόλογο Axin

AXIN2

και η TCF -Οικογένεια μεταγραφικού παράγοντα

TCF7L2

προσδιορίζονται στο -25% και -35% της MSI-CRC, αντίστοιχα [8], [9].

APC

μετάλλαξη είναι λιγότερο συχνή σε MSI-CRC ό, τι σε CIN-CRC [10], [11], ενώ ενεργοποιώντας μεταλλάξεις στο

CTNNB1

, αν και ευρέως διαδεδομένη σε όλο το φάσμα του καρκίνου στον άνθρωπο, είναι σπάνια στην MSI-CRC [11]. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι πρόσθετους μηχανισμούς ενεργοποιήσετε Wnt /β-κατενίνης σηματοδότησης σε MSI-CRC

Η γυμνή επιδερμίδα (NKD) οικογένεια πρωτεϊνών εξασθενεί κανονική σηματοδότηση Wnt μέσω δέσμευσης και ενδεχομένως αποσταθεροποιητικές /ϋνΙ πρωτεΐνες Dsh [12] -. [ ,,,0],17].

Drosophila NKD

μεταλλάξεις αναπτύξει θανατηφόρο ελαττώματα τμηματοποίησης πολύ παρόμοιες με εκείνες που παρατηρήθηκαν σε

APC

ή

αξίνη

μεταλλάξεις [12], [18], [19] (Εικ. 1Α ). Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι η μεταβολή στο

NKD

γονίδιο δραστηριότητα στα θηλαστικά μπορεί να ενεργοποιήσει Wnt σηματοδότησης και προκαλούν καρκίνο. Εδώ έχουμε εντοπίσει νέες μεταλλάξεις στο ανθρώπινο

NKD1

γονιδίων σε MSI-CRC που αλλοιώνουν Wnt σηματοδότηση και τη μείωση NKD /Dsh αλληλεπιδράσεις. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι συγκεκριμένες

NKD1

μεταλλάξεις μεταβάλλουν Wnt /β-κατενίνης σηματοδότησης σε μια μειοψηφία των MSI-CRC, καθώς και, ενδεχομένως, σε άλλους όγκους του σήματος που εξαρτώνται από β-κατενίνης στα οποία μεταλλάξεις στα γνωστά Wnt ρυθμιστικές αρχές είναι σπάνια .

(Α) Άγρια τύπου,

αξίνη, APC

, και

NKD Drosophila

επιδερμίδες. Άγριου τύπου έχει εναλλασσόμενες ζώνες denticle (βέλος) και γυμνή επιδερμίδα (βέλος), με κάθε μεταλλαγμένο λείπει denticle ζώνες. (Β)

NKD1

τόπος έχει 10 εξόνια. Nkd1 σχηματική (πορτοκαλί) περιλαμβάνει Ν-τερματικό μυριστοϋλίωση, EFX, 30aa (μπλε), και καρβοξυ-τερματικό Ηίδ-πλούσια μοτίβα. Οι εξόνιο 10 σειρές γύρω από πολυ- (Γ) εκτάσεις (κόκκινο) πάνω μητρική (μαύρο) και μεταλλαγμένων (μπλε) τα κατάλοιπα της περιόδου αυτής. (C)

NKD1

ηλεκτροφορήματα δείχνει άγριου τύπου (WT) πολυ- (C)

7, κυτταρική γραμμή TC7 με C-διαγραφή (C6), κυτταρική γραμμή RKO με C-εισαγωγής (C8), και κυτταρική γραμμή HCT15 με G & gt? Μια μετάλλαξη (βέλος) 3 ‘του πολυ- (C)

7. (D, Ε) α-Nkd1 κηλίδες των εκχυλισμάτων ολόκληρων κυττάρων (D) και Triton Χ-100 διαλυτά και αδιάλυτα κλάσματα (Ε) από κυτταρικές γραμμές με υποδεικνύεται

NKD1

μετάλλαξη. Βέλη ορίζουν πρωτεΐνες Nkd1. β-ακτίνης φορτώνει τον έλεγχο στο Δ CCD841 έχει όλο το μήκος Nkd1, με μια μικρή προϊόν αποικοδόμησης σε ~ 35 kDa επίσης δει με επιμολυσμένα

NKD1

(π.χ. Σχ. 1Ε, 5C), ενώ SW480 με πιο άφθονη, αλλά άγριου τύπου Nkd1 έχει αρκετά προϊόντα αποδόμησης.

Η

Αποτελέσματα

NKD1

μεταλλάξεις στο ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα

Έχουμε εντοπίσει τρεις διαφορετικές

NKD1

εξόνιο 10 κωδικοποιητική μεταλλάξεις περιοχή σε 5/11 κυτταρικές σειρές CRC και 2/40 σποραδικά καρκινώματα CRC με MSI (Πίνακας 1), αλλά όχι

NKD1

περιοχή κωδικοποίησης ή διασταύρωση ματίσματος μεταλλάξεις στο 5/5 κύτταρο CRC γραμμές και 50/50 όγκους χωρίς MSI. Δύο μεταλλάξεις, είτε ένα δεοξυκυτιδίνη (C) διαγραφή ή εισαγωγή λόγω ολίσθηση της πολυμεράσης μέσα σε ένα εξόνιο-10 πολυ- (C)

7 οδού, έχει ως αποτέλεσμα την σύνθεση των κομμένων πρωτεϊνών του 345 ή 298 αμινοξέα (aa) (Εικ . 1Β, C). Α (C)

7-παρακείμενα παρερμηνεύσιμη μετάλλαξη (G & gt? Α) μετατρέπει Arg-288, συντηρημένα σε Nkd2, σε His (Σχήμα 1Β, C.).

NKD1

μεταλλάξεις δεν ανιχνεύθηκαν σε 32/40 όγκους MSI-CRC που φιλοξενούν μεταλλάξεις σε άλλα γονίδια Wnt-πορεία, περιλαμβανομένων

APC

,

CTNNB1

,

AXIN2

και

TCF7L2

, αλλά βρέθηκαν σε 2 από τα υπόλοιπα 8/40 όγκους χωρίς αλλοιώσεις σε αυτές τις γνωστές γονίδια Wnt-οδού (ρ = 0,036 με μονόπλευρο ακριβές τεστ του Fisher) (Πίνακας 1? βλέπε Υλικά και μέθοδοι). Τα δεδομένα αυτά δείχνουν μια αμοιβαία αποκλειστικότητα μεταξύ των μεταλλάξεων στο

NKD1

και άλλα γονίδια Wnt-μονοπάτι στην ομάδα μας δείγματα όγκων MSI-CRC, γεγονός που υποδηλώνει ότι η

NKD1

μεταλλάξεις είναι παθολογική σημασία.

Τόσο η παχέος επιθηλιακών CCD841 κυτταρική σειρά και η CRC κυτταρική γραμμή SW480, ο τελευταίος με ένα C & gt? Τ μετάλλαξη στο

APC

κωδικόνιο # 1338 [20], κωδικοποιεί μια άγριου τύπου Nkd1 (470 αα) του 53.2 kDa που μεταναστεύει σε περίπου 50 kDa σε κηλίδα western (Σχ. 1 D, Ε). Οι κυτταρικές σειρές Co115 και TC7, το καθένα με το (C)

6 μετάλλαξη, έχουν μια μπάντα ~39 kDa που αντιστοιχεί στο 38,1 kDa Nkd1

C6, ενώ κυτταρική γραμμή RKO, με το (C)

8 μετάλλαξης, έχει μία ζώνη ~ 33 kDa που αντιστοιχεί στο 33,4 kDa Nkd1

C8? Και οι τρεις κυτταρικές γραμμές με κολοβωμένη Nkd1 έχουν επίσης λιγότερο άφθονη πλήρους μήκους Nkd1, υποδηλώνοντας ότι η άγριου τύπου

NKD1

locus δεν υφίστανται απώλεια του ετεροζυγωτία (Σχ. 1D). Με κηλίδα western με Nkd1 αντισώματα δεν είμαστε σε θέση να διακρίνουμε άγριου τύπου από το μεταλλαγμένο Nkd1 στην κυτταρική σειρά HCT15, που φιλοξενεί

NKD1

R288H

(Εικ. 1D).

NKD πρωτεΐνες είναι μεμβράνη που σχετίζονται με τα Nkds θηλαστικών λόγω της Ν-τερματικής μυριστοϋλίωσης [14], [21], [22]. Οι κομμένες πρωτεΐνες Nkd1 έχουν μειωμένη συγγένεια για μεμβράνες σε σύγκριση με πλήρους μήκους Nkd1 όπως προκύπτει από Triton X-100 διαλυτότητα: 95% των NKD

C6 ή NKD

C8 από μεταλλαγμένες κυτταρικές σειρές είναι TX-100 διαλυτό, ενώ 0-26% του πλήρους μήκους Nkd1 από όλες τις κυτταρικές σειρές είναι ΤΧ-100 διαλυτό (Εικ. 1 Ε).

Μεταλλαγμένες πρωτεΐνες Nkd1 είναι ελαττωματικά στην αναστολή Wnt /ϋνΙ σηματοδότησης

ποντίκι Nkd1 μπορεί αναστέλλουν την επικάλυψη άξονα που προκαλείται από έκτοπη σηματοδότηση Wnt στο

Xenopus

έμβρυα [16]. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α, & gt? 90% των

Xenopus

έμβρυα ένεση με

XWnt8

mRNA αναπτύχθηκε μερική-to-πλήρη άξονα επικάλυψη? συνεπής με δραστηριότητα Nkd1 ως ανταγωνιστής Wnt, αγρίου-τύπου ανθρωπίνου

NKD1

mRNA συν-ένεση μειωμένη συχνότητα άξονα επικαλύψεις έως 42%, με μόνο το 3% πλήρης επαναλήψεις. Σε αντίθεση, συν-ένεση του κάθε μεταλλαγμένο ανθρώπινο

NKD1

οδήγησε σε συχνότητες επικαλύψεις άξονα παρόμοια με αυτή που παρατηρήθηκε με

XWnt8

ένεση μόνο (Σχ. 2Α). Όπως και σε κυτταρικές σειρές, misexpressed Nkd1

C6 και Nkd1

C8 ήταν πιο πλούσια από ό, τι άγριου τύπου Nkd1 ή Nkd1

R288H με κηλίδα western (δεν φαίνεται). Σε συμφωνία με το

Xenopus

αποτελέσματα, άγριου τύπου Nkd1, αλλά καμία από τις τρεις μεταλλάξεις, κατέστειλε ϋνΙ που προκαλείται από την ενεργοποίηση του TOPflash TCF-ρεπόρτερ σε κύτταρα ΗΕΚ-293 (Εικ. 2Β). Έκφραση του μεταλλαγμένου Nkd1 μόνος ελαφρώς αυξημένη βασική δραστικότητα TOPflash και δεν είχε καμία επίδραση στην ενδογενή

Xenopus

άξονα σχηματισμός (δεν φαίνεται), υποδεικνύοντας ότι η επίδραση της Nkd1, όπως αυτή του

NKD

στην ιπτάμενη , εξαρτάται από την σηματοδότηση Wnt [23].

(Α)%

Xenopus

έμβρυα με φαινότυπο ενδεικνυόμενη άξονα μετά την ένεση του

XWnt8

+/- άγριου τύπου ή μεταλλαγμένο

NKD1

. (N) = # έμβρυα ενέθηκαν. Πάνελ στα δεξιά δείχνουν εκπρόσωπος πλάγια (L) και ραχιαία (Δ) τις απόψεις των εμβρύων που σκόραρε ως ενιαίο άξονα (λευκό), άξονας σύντομη Α /Π (ανοιχτό γκρι), μερική άξονα επικάλυψη (σκούρο γκρι), και την πλήρη άξονα επικάλυψη (μαύρο) σύμφωνα με τα Υλικά και Μέθοδοι. Σε έμβρυα με μονό άξονα στα αριστερά πάνελ, σημειώστε τον κορμό (λευκό βέλος) και αδένα του τσιμέντου (μαύρο βέλος). Αιχμές βελών ορίσει κάθε άξονα σε έμβρυα με άξονα επαναλήψεις (δεξιά πάνελ). Έμβρυα με μερική άξονα επικάλυψη έχουν αναπαραχθεί κορμό ιστού, αλλά ένα ενιαίο αδένα του τσιμέντου, ενώ τα έμβρυα με πλήρη άξονα επικάλυψη έχουν αναπαραχθεί ιστών του κορμού και των αδένων του τσιμέντου. (Β) δραστηριότητα λουσιφεράσης Κανονικοποιημένο TOPflash (RLU) σε κύτταρα ΗΕΚ-293 επιμολυσμένα με δημοσιογράφο +/- Dvl2 +/- αναφέρεται Nkd1 κατασκευάσει.

Η

NKD1

μεταλλάξεις σταθεροποίηση της β-κατενίνης και προάγουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων

Σύμφωνα με το

NKD1

μεταλλάξεις ενεργοποίησης σηματοδότηση Wnt σε CRC, κυτταροπλασματική και πυρηνική επίπεδα β-κατενίνης είναι υψηλότερα σε κύτταρα Co115 παρά σε κύτταρα CCD841 (Εικ. 3Α). Κατά συνέπεια, η πυρηνική β-κατενίνης ήταν εμφανής σε κύτταρα Co115 αλλά όχι σε CCD841 κύτταρα (Σχ. 3Β, C). κύτταρα ΗΕΚ-293Τ επιμολυσμένα με Nkd1

C6, Nkd1

C8, ή Nkd1

R288H είχαν υψηλότερα επίπεδα της κυτοσολικής β-κατενίνης από κύτταρα επιμολυσμένα με άγριου τύπου Nkd1 ή όργανα ελέγχου (Εικ. 3D), υποδεικνύοντας ότι κάθε μεταλλαγμένη πρωτεΐνη Nkd1 μπορεί να σταθεροποιήσει β-κατενίνης.

(Α) Western blot των εκχυλίσματα κυτταρολύματος και πυρήνων των κυττάρων με άγριου τύπου (CCD841) ή μεταλλαγμένο (Co115)

NKD1

. GAPDH και HDAC2 ανιχνεύθηκαν ως έλεγχοι φόρτωσης. (Β-Β «, C-C») β-κατενίνης (κόκκινο) και DNA (μπλε) διανομή σε κύτταρα CCD841 (Β-Β ») και Co115 (C-C») κύτταρα. Βέλη ορίζουν πυρήνες. Συγχωνευθείσας εικόνες στην Β «και Γ». (D) στυπώματος Western εκχυλίσματα κυτταρολύματος από κύτταρα ΗΕΚ-293 διαμολυνθέντα με το

lacZ

ελέγχου (-), άγριου τύπου Nkd1 (WT), ή υποδεικνύεται μεταλλαγμένο Nkd1 κατασκεύασμα, και ανιχνεύτηκαν για β-κατενίνης, Nkd1, και φόρτωση GAPDH ελέγχου. Σημειώστε ότι κάθε μεταλλαγμένο Nkd1 αλλά όχι άγριου τύπου Nkd1 αυξάνει τα επίπεδα της β-κατενίνης. (Ε) σχετικό αριθμό κυττάρων ως συνάρτηση των ημερών μετά ρετροϊική μόλυνση του CCD841 κυττάρων με κενό φορέα ελέγχου, άγριου τύπου Nkd1, ή υποδεικνύεται Nkd1 μεταλλάκτη (p = 0.016, 0.012, και 0.0091 για C6, C8, και μεταλλάξεις R288H σε σύγκριση με έλεγχος) () σχετικό αριθμό κυττάρων F ως συνάρτηση των ημερών μετά ρετροϊική μόλυνση των κυττάρων Co115 με έλεγχο ή άγριου τύπου Nkd1 (p = 0.022). α-Nkd1 κηλίδες Western των κυτταρικών εκχυλισμάτων, με GAPDH ή ελέγχου φόρτωσης β-ακτίνης, δείχνονται κάτω από κάθε οικόπεδο στην Ε και ΣΤ

Η

Από κανονική σηματοδότηση Wnt προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [2], προσδιορίσαμε η συσσώρευση των κυττάρων που εκφράζουν ομοιόμορφα συγκρίσιμα επίπεδα είτε άγριου τύπου ή μεταλλαγμένο Nkd1. Ρετροϊική έκφραση κάθε μεταλλαγμένης πρωτεΐνης Nkd1 σε κύτταρα CCD841 αυξημένους αριθμούς κυττάρων σε σύγκριση με το αγρίου τύπου Nkd1 ή κενό φορέα ελέγχου (Σχ. 3Ε). Αντιστρόφως, η έκφραση της άγριου τύπου σε κύτταρα Nkd1 Co115 μείωση του αριθμού των κυττάρων (Σχ. 3F). Αυτά τα στοιχεία δείχνουν ότι η

NKD1

μεταλλάξεις μπορεί να προωθήσει τη σταθεροποίηση της β-κατενίνης και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του παχέος εντέρου.

Altered υποκυτταρικό εντοπισμό και ϋνΙ συνεντόπισης των περικοπεί Nkd1

Δεν ήταν σε θέση να ανιχνεύσουν ενδογενή Nkd1 σε κυτταρικές σειρές με ανοσοκυτταροχημεία, έτσι ώστε να διερευνηθεί περαιτέρω η σχέση μεταξύ Nkd1 εντοπισμό και τη δραστηριότητα που εξέτασε τον εντοπισμό της με ετικέτα πρωτεϊνών στα κύτταρα ΗΕΚ-293. Nkd1 εντοπίζεται σε μια στικτή, κυρίως κυτταροπλασματική κατανομή παρόμοια με

Drosophila

NKD

GFP όταν εκφράζεται σε μύγα σιελογόνων αδένων (Εικ. 4Α, F). Σε αντίθεση, Nkd1

C6 και Nkd1

C8 διανέμουν διάχυτα στο κυτταρόπλασμα (Εικ. 4Β και δεν απεικονίζεται), σύμφωνα με ενισχυμένο απορρυπαντικό διαλυτότητα τους σε σχέση με Nkd1 (Εικ. 1 Ε), ενώ Nkd1

αδρανών R288H όπως άγριου τύπου Nkd1 (δεν φαίνεται).

(Α, Β) ΗΕΚ-293 κύτταρα που εκφράζουν ΗΑ /Flag-tagged Nkd1 (Α) ή Nkd1

C8 (Β) χρωματισμένο με α-ΗΑ (πράσινο ). Nkd1 συσσωρεύεται σε puncta (βέλη), ενώ Nkd1

C8 είναι διάχυτα κατανεμημένα στο κυτταρόπλασμα. Nkd1

C6 διανέμεται σε ένα μοτίβο παρόμοιο με Nkd1

C8 (δεν φαίνεται). (C, D) Κύτταρα συν-εκφράζουν Dvl3 και άγριου τύπου (C) ή C8 (D) Nkd1

GFP κατασκευάσματα. Nkd1-GFP (πράσινη, C) δείχνει σχεδόν πλήρη colocalization (βέλη) με Dvl3 (κόκκινο, Γ ‘), ενώ Nkd1

C8-GFP (D) συσσωρεύεται στην κυτταροπλασματική αδρανών υλικών που περιβάλλεται από Dvl3 (βέλη). Συγχωνευθείσας εικόνες είναι σε C «, D», το DNA είναι το μπλε στο A-D. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε κύτταρα που συνεκφράζουν Nkd1

C8-GFP και Dvl1 ή Dvl2, και σε κύτταρα που εκφράζουν Nkd1

C6-GFP και Dvl1, Dvl2, ή Dvl3 (δεν φαίνεται). (Ε) σιελογόνων αδένων από άγριου τύπου τρίτου σταδίου

Drosophila

προνύμφη βάφονται με α-Dsh (κόκκινο) που δείχνει διάχυτη και στικτή κηλίδωση. (F-F «)

A8-Gal4 /UAS-NKD

GFP

σιελογόνων αδένων χρώση με α-Dsh και απεικονίστηκαν για GFP (F) και Dsh (F ‘? Συγχωνεύθηκε στο F»). Fly NKD

GFP relocalizes Dsh να περιπυρηνικού αδρανών υλικών (βέλη) παρόμοιες με εκείνες που παρατηρήθηκαν με Nkd1

GFP /Dvl3 στο Γ

Η

ϋνΙ πρωτεΐνες εντοπίζονται σε δυναμικές, κυτταροπλασματική και το πλάσμα μεμβράνη που σχετίζεται συσσωματώματα που έχουν προταθεί για την ενίσχυση Wnt /β-κατενίνης σηματοδότηση [24]. Συνεπής με το

in vitro

ένωση NKD /Dsh, έκφραση Nkd1

GFP στα κύτταρα ΗΕΚ-293 ή πετάξει NKD

GFP σε σιελογόνων αδένων οδήγησε σε ενδοκυτταρική αδρανών υλικών με colocalized NKD και Dsh /ϋνΙ ( Σχ. 4C-C «, F-F», και δεν φαίνεται). Αντίθετα, κάθε ϋνΙ συν-συντίθενται με κάθε περικοπεί Nkd1

GFP (C6 ή C8) σχηματίζονται συσσωματώματα, αλλά colocalization αντ ‘αυτού παρατηρείται σε συγκεντρωτικό διασυνδέσεις, με ϋνΙ αδρανών συνήθως γύρω περικομμένο αδρανών Nkd1 (Εικ. 4D-D «και όχι απεικονίζεται). Αν και η σημασία αυτών των εντοπίσεις έναντι των αναληφθεισών σηματοδότηση Wnt είναι ασαφές, το ακρωτηριασμένο Nkd1 πρωτεΐνες που προσδιορίζονται στο CRC παρουσίασαν μειωμένη ικανότητα να αποικίζει με ϋνΙ πρωτεΐνες σε σύγκριση με πλήρους μήκους Nkd1.

Mutant Nkd1 πρωτεΐνες είναι ελαττωματικό σε δεσμευτική ϋνΙ πρωτεΐνες

στη συνέχεια ερευνήσαμε το βιοχημικό μηχανισμό των ελαττωματικών Wnt αναστολή του σήματος από μεταλλαγμένες πρωτεΐνες Nkd1. Το μοτίβο NKD EFX συνδέει την περιοχή βασικό /ΡΟΖ της ϋνΙ πρωτεϊνών Dsh /[14]. Παραδόξως, κάθε μετάλλαγμα Nkd1, παρά το γεγονός ότι ένα άθικτο μοτίβο EFX, δεσμεύεται κάθε ϋνΙ πρωτεΐνη λιγότερο από άγριου τύπου Nkd1 από ζυμομύκητες δύο υβριδίων (Y2H) δοκιμασία (Εικ. 5Α). Nkd1 αποκοπή στο (C)

7-οδού (Nkd1

1-286) επίσης μείωσε ϋνΙ δέσμευσης (Σχ. 5Α), υποδεικνύοντας ότι η δέσμευση μειώνεται ϋνΙ δεν οφειλόταν σε μετατόπιση πλαισίου που προκαλείται μοναδικό C-άκρα στην δύο κολοβωμένη μεταλλάκτες. Κάθε κομμένη πρωτεΐνη Nkd1 διατηρεί κοντά Ο-άκρου του ενός 30aa αμφιπαθή α-έλικας μοτίβο που είναι εξαιρετικά διατηρημένη (28/30 αα) σε Nkd2 [14]. Στην μύγα NKD, ένα ομοίως τοποθετημένο μοτίβο 30aa είναι κρίσιμης σημασίας για τη λειτουργία και τον πυρηνικό εντοπισμό [25], αλλά ο ρόλος του μοτίβου 30aa σπονδυλωτών πρωτεΐνες NKD παραμένει άγνωστη. Διαγραφή του μοτίβου 30aa στο Nkd1

1-286 αποκατασταθεί ϋνΙ δεσμευτικές, ενώ περαιτέρω διαγραφή του μοτίβου EFX εξαλειφθεί ϋνΙ δεσμευτική (Εικ. 5Α). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι μία λειτουργία του σπονδυλωτού NKD 30aa μοτίβο είναι να αντιταχθεί Nkd1-EFX /ϋνΙ αλληλεπιδράσεις, η οποία είναι η ίδια προφανώς σε αντίθεση με την περαιτέρω C-τερματική αλληλουχία που διαγράφεται σε όγκους MSI-CRC μας.

( Α) Y2H μεταξύ Nkd1-δολώματα και ϋνΙ-θήραμα προσδιορίστηκαν για την ανάπτυξη σε τριπλή εγκατάλειψης (3D + 3AT) ή διπλή (2D) μέσα μαζικής ενημέρωσης εγκατάλειψης. ιστογράμματα στα δεξιά μονάδες δείχνουν ONPG από την ποσοτική ανάλυση Y2H. κηλίδα Western δεικνύει ότι μεταλλαγμένες πρωτεΐνες Nkd1 έχουν συγκρίσιμη αφθονίας (δεν φαίνεται). (Β) GST-pull-down ανάλυση των

in vitro

μεταφραστεί,

35 [S] σημασμένα Dvl1-3 με κάθε πρωτεΐνη GST-Nkd1. ραβδόγραμμα είναι ποσοτική ένταση μπάντα. Χρώση με Coomassie γέλη δείχνει κάθε πρωτεΐνη σύντηξης GST, με αιχμές βελών υποδεικνύοντας πρωτεΐνες πλήρους μήκους. (Γ) Western blots του Flag-IPs από εκχυλίσματα κυττάρων ΗΕΚ-293 με ίσες ποσότητες από κάθε ΗΑ /Flag-tagged Nkd1, και έπειτα ανιχνεύθηκαν με α-HA (άνω) και α-Dvl3 (μέση). β-ακτίνης φορτώνει ελέγχου (κάτω). Σημειώστε ότι λιγότερο Dvl3 είναι IP’d από Nkd1

C6 ή Nkd1

C8 σε σύγκριση με πλήρους μήκους Nkd1. Δεν συν-IP παρατηρήθηκε μεταξύ άγριου τύπου ή μεταλλαγμένο Nkd1s και Dvl1 ή Dvl2, που θυμίζει την έλλειψη σταθερών συν-IP μεταξύ

Drosophila

NKD και Dsh [13].

Η

Επιβεβαιώσαμε τα αποτελέσματα Y2H από την GST-pull-down και πειράματα Συνανοσοκατακρήμνιση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Β, κάθε ϋνΙ πρωτεΐνη εμφάνισαν μειωμένη σύνδεση με GST-Nkd1

C6 και GST-Nkd1

C8 σε σύγκριση με το αγρίου τύπου GST-Nkd1, ενώ GST-Nkd1

R288H έδειξαν μειωμένη ενώσεις με Dvl1 και Dvl2, αλλά σε μικρότερο βαθμό με Dvl3, παρόμοια με αυτή που παρατηρήθηκε από Y2H. Όταν εκφράζεται σε κύτταρα ΗΕΚ-293, Nkd1

C6 και Nkd1

C8 συσσωρευτεί σε υψηλότερα επίπεδα από ό, τι Nkd1 και Nkd1

R288H (δεν φαίνεται)? από την ομαλοποίηση λύματα εισόδου έτσι ώστε ανοσοκαταβυθίστηκαν ίσες ποσότητες άγριου τύπου Nkd1 και κάθε μεταλλαγμένη πρωτεΐνη Nkd1, παρατηρήσαμε μια διπλή μείωση του ποσού της Dvl3 συν-ανοσοκαταβυθίστηκε από Nkd1

C6 ή Nkd1

C8 σύγκριση να Nkd1 ή Nkd1

R288H (Εικ. 5C). Έτσι, η

NKD1

μεταλλάξεις μειώνουν Nkd1 /ϋνΙ ενώσεις

in vitro

και

in vivo

.

Mutant Nkd1s είναι ελαττωματικά στη μεταβολή των επιπέδων ϋνΙ

DVLs μπορεί να ουβικουιτινωμένης και αποικοδομείται από το πρωτεάσωμα, και η δέσμευση του NKD ή άλλων ϋνΙ-δεσμευτικές πρωτεΐνες οδηγεί σε ϋνΙ κύκλου εργασιών [17], [26] – [28]. Η

NKD1

μεταλλάξεις θα μπορούσαν, επομένως, να θέσει σε κίνδυνο την ικανότητα των Nkd1 να αποσταθεροποιήσουν DVLs. Εκφράζοντας

Drosophila

NKD

GFP σε διαφορετικά επίπεδα σε γειτονικά κύτταρα του τρίτου σταδίου

Drosophila

σιελογόνων αδένων, παρατηρήσαμε με συνέπεια μια αντίστροφη σχέση μεταξύ των επιπέδων της NKD

GFP και Dsh (Σχ. 6Α-Α «). Δεδομένου ότι

DSH

μεταγραφή δεν είναι γνωστό να ρυθμιστεί σε

Drosophila

, NKD

GFP είναι πιθανό να αποσταθεροποιήσει Dsh, όπως παρατηρήθηκε όταν Nkd1 ήταν υπερεκφράζεται σε καλλιεργημένα κύτταρα θηλαστικών [17]. Στη συνέχεια, συν-επιμολυσμένα άγριου τύπου ή κάθε μεταλλαγμένο Nkd1 με Dvl1, Dvl2, ή Dvl3 σε κύτταρα ΗΕΚ-293 και εξέτασε τα επίπεδα της κάθε πρωτεΐνης ϋνΙ με κηλίδα western. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Β, Dvl1 και Dvl2, και σε μικρότερο βαθμό Dvl3, ήταν λιγότερο άφθονα όταν συν-εκφράζεται με άγριου τύπου Nkd1 από όταν εκφράζεται μόνη της. Ούτε κενός-φορέα ούτε συν-εκφράζεται GFP επηρεάζονται τα επίπεδα της κάθε ϋνΙ (δεν φαίνεται). Σε αντίθεση, η ποσότητα του ανιχνεύσιμου Dvl1 με συν-έκφραση της κάθε μεταλλαγμένης Nkd1 ήταν παρόμοια με την Dvl1 μόνο επιμολυσμένα ελέγχου (Εικ. 6Β). επίπεδα Dvl2 μερικώς μειωθεί με κάθε μεταλλαγμένο Nkd1, ενώ τα επίπεδα Dvl3 μειώθηκαν λιγότερο από συνέκφραση είτε κόλουρου Nkd1 παρά με άγριου τύπου Nkd1. Παρόμοια με την αντίστροφη σχέση μεταξύ NKD

GFP και τα επίπεδα Dsh στο

Drosophila

σιελογόνων αδένων (Εικ. 6Α-Α «), πρόστιμο στικτή Dvl1 ανοσολογική αντίδραση σε κύτταρα με υψηλά επίπεδα Nkd1

GFP εμφανίστηκε μειωμένη σε σύγκριση με γειτονικά κύτταρα με χαμηλότερα επίπεδα Nkd1

GFP (Σχ. 6C, C ‘). Στο σύνολό τους, τα δεδομένα μας υποστηρίζουν την υπόθεση ότι η συγκεκριμένη τροποποίηση της ικανότητας Nkd1 για την προώθηση της ϋνΙ κύκλου εργασιών θα μπορούσε να ενεργοποιήσετε Wnt /β-κατενίνης σηματοδότησης κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου CRC.

(Α-Α «)

71Β-Gal4 /UAS-NKD

GFP

τρίτου σταδίου

Drosophila

σιελογόνων αδένων χρώση με α-Dsh και απεικονίστηκαν για GFP (Α) και Dsh διανομές (Α ‘) (συγχωνευμένη εικόνα στο Α «). Ο ποσοτικός προσδιορισμός των Dsh έντασης των εικονοστοιχείων (άσπρο κουτί σε Α ‘) αποκαλύπτει μειωμένη χρώση στο κύτταρο που εκφράζει περισσότερο (δεξιά, πράσινο αστερίσκο) NKD

GFP σε σχέση με το γειτονικό κύτταρο που εκφράζει λιγότερο NKD

GFP. (Β) κηλίδες Western των κυττάρων ΗΕΚ-293 διαμολυνθέντα με ενδεικνυόμενη Flag /ΗΑ-tagged κατασκευάσματα ανιχνεύθηκαν με α-HA, α-Dvl1-3, και α-βtubulin ως έλεγχος φόρτωσης Nkd1 και Dvl1, Dvl2, ή Dvl3. Κάθε μία από τις κηλίδες Dvl1-3 φορτώθηκε με ίσες ποσότητες εκχυλίσματος, όπως επιβεβαιώθηκε με ανίχνευση κάθε κηλίδα με α-βtubulin. (C) ΗΕΚ-293 κύτταρα που συν-εκφράζουν Nkd1

GFP και Dvl1, χρωματίστηκαν με α-Dvl1, και απεικονίζεται για GFP (πράσινη), Dvl1 (κόκκινο), και DNA (μπλε) που δείχνει ωραία στικτή διανομή Dvl1 σε κύτταρα που εκφράζουν χαμηλή για να απουσιάσει Nkd1

GFP (λευκό βέλος). Σε γειτονικά κύτταρα που εκφράζουν Nkd1

GFP, Dvl1 είναι relocalized να Nkd1

GFP /Dvl1 αδρανών υλικών (κίτρινο βέλος), με την απώλεια του προστίμου στικτή χρώση Dvl1 (αιχμές βελών). (D, E) Μοντέλα της λειτουργίας NKD στο

Drosophila

(D) και

NKD1

μεταλλαγμένου CRC (Ε). Διπλές γραμμές: ανώτερο = μεμβράνη πλάσματος? χαμηλότερο = πυρηνική μεμβράνη. (D) Fly Wg (Wnt) δεσμεύεται Fz /Arrow υποδοχέων (LRP5 /6), η οποία αναστέλλει το σύμπλοκο του APC /Axin /CK1 /ΟδΚ3β που προάγει αποικοδόμηση του βραχίονα (β-κατενίνης). συγκροτήματα βραχίονας με Pan (TCF) για την ενεργοποίηση των γονιδίων στόχων, συμπεριλαμβανομένων

NKD

. NKD προωθεί Dsh κύκλο εργασιών να αναστείλουν μερικώς σηματοδότησης, και απασχολεί τον παράγοντα πυρηνικής εισαγωγής Imp-α3 να εισάγετε τον πυρήνα και περαιτέρω αναστέλλει τη σηματοδότηση μέσω άγνωστων μηχανισμών [31]. (Ε) Σε

NKD1

μεταλλαγμένου CRC, η μεταλλαγμένη πρωτεΐνη Nkd1 δεν συνδέεται πλέον και προωθεί ϋνΙ κύκλου εργασιών, τη σταθεροποίηση της β-κατενίνης και την ενεργοποίηση TCF-εξαρτώμενη μεταγραφή των γονιδίων στόχων.

Η

Συζήτηση

η μετάλλαξη της καταστολής του όγκου

APC

ανυψώνει σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης στην πλειονότητα των & gt? 1 εκατομμύρια νέες περιπτώσεις διαγιγνώσκονται ετησίως CRC παγκοσμίως [3], [29 ]. Υποθέσαμε ότι οι μεταλλάξεις σε άλλους ανταγωνιστές των Wnt μπορούσε ανυψώσει σηματοδότησης στο υποσύνολο των CRC, ιδιαίτερα MSI-CRC, χωρίς μεταλλάξεις σε γνωστές Wnt ρυθμιστές. Αναφέρουμε τρεις σχετίζονται με τον καρκίνο του ανθρώπου

NKD1

μεταλλάξεις που μεταβάλλουν σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης και διασπούν την δέσμευση Nkd1 /ϋνΙ. Με βάση τη συχνότητα των

NKD1

μετάλλαξη (5%) που προσδιορίζονται στην ομάδα μας MSI-CRCs, εκτιμούμε ότι

NKD1

μεταλλάξεις συμβαίνουν σε μέχρι και ~ 1% των νεοδιαγνωσθέντων CRC, ή ~10,000 περιπτώσεις ανά έτος.

από MSI όγκοι είναι επιρρεπής σε μετάλλαξη σε όλο το γονιδίωμα, τίθεται το ερώτημα του κατά πόσον η

NKD1

μεταλλάξεις οδηγούν την εξέλιξη του όγκου ή είναι απλώς «παριστάμενος» μεταλλάξεις. Ένα εργαστήριο Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου [30] πρότεινε πέντε κριτήρια για τη διάκριση καλόπιστες γονιδίων στόχου από μεταλλάξεις των παρευρισκομένων, συμπεριλαμβανομένων α) υψηλή συχνότητα μετάλλαξης, β) διαλληλικών αδρανοποίηση, γ) ένα ρόλο σε μία οδό καταστολέας ανάπτυξης, δ) αδρανοποίηση της ίδιας ανάπτυξη καταστολή της οδού σε όγκους χωρίς MSI μέσω μετάλλαξης στο ίδιο γονίδιο ή σε ένα άλλο γονίδιο μέσα στο ίδιο μονοπάτι, και ε) λειτουργικές μελέτες καταστολέα, αν και έχει αμφισβητηθεί η εγκυρότητα αυτών των κριτηρίων στην αξιολόγηση των σπάνιων ή νέων μεταλλάξεων του οδηγού {π.χ. [6]}. Η εργασία μας δείχνει ότι η

NKD1

μεταλλάξεις πληρούν τέσσερα από τα πέντε κριτήρια – ένα, γ, δ και ε. Ενώ η συχνότητα των

NKD1

μετάλλαξη ήταν σχετικά χαμηλό σε σύγκριση με εκείνη των γνωστών Wnt γονίδια οδού, μια αμοιβαία αποκλειστικότητα μεταξύ των μεταλλάξεων στο

NKD1

και άλλα γονίδια μονοπάτι Wnt ήταν στατιστικά σημαντική σε δείγματα όγκων. Η απουσία

NKD1

μεταλλάξεις στο δείγμα μας των όγκων χωρίς MSI θα μπορούσε να οφείλεται στη σπάνια φύση των συγκεκριμένων κολόβωση Nkd1 σε όγκους με άθικτη MMR, ή λόγω του μικρού μεγέθους του δείγματος μας. Ωστόσο, άλλα γονίδια στο μονοπάτι σηματοδότησης Wnt όπως

APC

μεταλλάσσονται συχνά, διαγραφεί ή μεθυλιωμένα σε όγκους με άθικτα MMR. Διαλληλικών αδρανοποίηση του

NKD1

δεν παρατηρήθηκε, αλλά η παρουσία του άγριου τύπου Nkd1 σε κυτταρικές γραμμές όγκου, καθώς και την ικανότητα του μεταλλαγμένου Nkd1 για τη σταθεροποίηση β-κατενίνης, υποδηλώνει ότι η

NKD1

μεταλλάξεις θα μπορούσαν να δράσουν δεσπόζει (βλέπε παρακάτω). Τέλος, η οικογένεια NKD πρωτεϊνών αναστέλλει κανονικών σηματοδότηση Wnt, και αυτή η δραστηριότητα είναι ελαττωματική και στις τρεις μεταλλαγμένες πρωτεΐνες Nkd1, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι μεταλλάξεις μεταβάλλουν Nkd1 σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης

in vivo

.

Έχουμε ακόμη να αποδείξει ότι NKD μπορεί να περιορίσει Dsh /ϋνΙ αφθονία τόσο στην καλλιέργεια κυττάρων θηλαστικών και τα συστήματα πετάξει, με μύγα NKD επιπλέον έχει άγνωστη, αλλά απαραίτητη πυρηνική λειτουργίες [25], [31] (Εικ. 6D). Προτείνουμε ότι οι μεταλλαγμένες ανθρώπινες πρωτεΐνες Nkd1, το καθένα με μειωμένη ικανότητα να δεσμεύει και να περιορίσει την αφθονία του DVLs, αυξάνουν Wnt-εξαρτώμενη ϋνΙ δραστηριότητα, εξασθένιση έτσι αποικοδόμηση β-κατενίνης και την αύξηση TCF-εξαρτώμενη μεταγραφή των γονιδίων στόχων που προάγουν τον πολλαπλασιασμό (Εικ . 6Ε). Ωστόσο, αποτρέποντας την άμεση Nkd1 /ϋνΙ ένωση είναι προφανώς ανεπαρκής για την προώθηση νεοπλασία, όπως διαγραφή της ϋνΙ-δεσμευτική

Nkd1

EFX μοτίβο ούτε καθίστανται μεταλλαγμένα ποντίκια επιρρεπή σε καρκίνο, ούτε ενίσχυσε τη συχνότητα του

Αρο

μετάλλαξη με γνώμονα την εντερική αδενώματα [32]. Παρομοίως, τα ποντίκια που φέρουν Ν-τερματικό περικοπή

Nkd1

και /ή

Nkd2

μεταλλάξεις δεν αναπτύσσουν αυθόρμητα όγκους [33]. Από NKD είναι αναπόσπαστο με βρόχους ανατροφοδότησης των μύγες και σπονδυλωτά [12], [34], που προηγουμένως υπέθεσαν ότι στα θηλαστικά η έλλειψη δραστηριότητας NKD μπορεί να αντισταθμιστεί από περιττές μηχανισμούς ανάδρασης, ενώ στις μύγες δεν υπάρχει τέτοια αποζημίωση είναι δυνατή λόγω της απουσίας γονίδια που κωδικοποιούν εξωκυτταρικά ανταγωνιστές σηματοδότησης Wnt [33].

Η μη τυχαία αντιστοίχιση των ανόμοιων

APC

μεταλλάξεις στους όγκους {π.χ., πρωτεΐνη περικοπή κοντά στην περιοχή του συμπλέγματος μετάλλαξη (MCR) με τη διαγραφή αλληλομόρφων ή μεθυλίωση}, σε συνδυασμό με λειτουργικές μελέτες των μεταλλαγμένων πρωτεϊνών Αρο [35], [36], πρότεινε ότι το κύτταρο πρέπει να διατηρούν κάποια ικανότητα να ρυθμίζουν σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου – το λεγόμενο «ακριβώς δεξιά» υπόθεση [ ,,,0],37]. Μια θεώρηση των γνωστών ρόλων για Wnt /β-κατενίνης σηματοδοτήσεως κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του ορθοκολικού καρκινώματος παρέχει κάποια λογική για αυτήν την υπόθεση: στα πρώτα στάδια, η αυξημένη σηματοδότηση προάγει βλαστικών κυτταρική ανανέωση και μεταβάλλει τη μετανάστευση των κρυπτών επιθηλιακών κυττάρων [38], ενώ αργότερα ενεργεί ως διακόπτης για τη ρύθμιση των επιθηλιακών σε μεσεγχυματικά μεταβάσεις κατά τη διάρκεια της εισβολής και της μετάστασης [39]. Έτσι, η εξέλιξη του όγκου μπορεί να απαιτούν παροδική επέκτασης ή υποβιβασμού ρύθμιση έκφρασης γονιδίου-στόχου ανάλογα με την μεταλλακτική φορτίο και τις τοπικές περιβαλλοντικές συνθήκες. Δεδομένου ότι η άγριου τύπου Nkd1 πρωτεΐνη παραμένει στο

NKD1

μεταλλαγμένου κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, υποθέτουμε ότι οι μεταλλαγμένες πρωτεΐνες Nkd1 – καθένα από τα οποία διατηρεί πολλαπλά λειτουργικά μοτίβα (Ν-τερματικό μυριστοϋλίωσης, EFX και 30 aa μοτίβα ) – ενεργοποίηση Wnt σηματοδότησης

in vivo

, ίσως ανάλογο με τον τρόπο με τον οποίο Αρο πρωτεΐνες περικοπεί κοντά στην MCR ενεργοποιήσετε Wnt σηματοδότηση [36]

Παρά τα συντριπτικά στοιχεία ότι η ανώμαλη Wnt /β-. κατενίνης σηματοδότηση προκαλεί καρκίνο, ο ρόλος των πρωτεϊνών Dsh /ϋνΙ σε νεοπλασία παραμένει ασαφής. Σηματοδότηση Wnt μπορεί να προωθήσει Dsh /ϋνΙ συσσώρευση [40], και ϋνΙ υπερέκφραση μπορεί να μιμούνται την ενεργοποίηση του άξονα σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης [41], υποδηλώνοντας ότι ϋνΙ υπερδραστηριότητα, όπως σταθεροποίηση β-κατενίνης λόγω μετάλλαξης, θα μπορούσε να είναι μια κύρια αιτία της αυξημένης σηματοδότηση Wnt σε καρκίνο. Πράγματι, ϋνΙ ενίσχυση και υπερέκφραση έχει ταυτοποιηθεί σε νεοπλασία {π.χ. καρκίνο του πνεύμονα [42]}, αλλά ϋνΙ συσσώρευση στον καρκίνο θα μπορούσε επίσης να είναι μια δευτερεύουσα συνέπεια ομόφωνα συνδέτη με γνώμονα αυτοενεργοποίηση Wnt σηματοδότησης [43]. Δεδομένων των κρίσιμους ρόλους για Dsh /DVLs σε «μη-κανονικό» Wnt μονοπάτια που διέπουν επίπεδων κυττάρων-πολικότητα και τη μετανάστευση των κυττάρων στα σπονδυλωτά [44], του

NKD1

μεταλλάξεις μπορεί επίσης να αλλάξει ϋνΙ δραστηριότητα σε μη κανονική Wnt μονοπάτια που ελέγχουν την κυτταρική πολικότητα ή τη μετανάστευση κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου. Μελλοντικά πειράματα θα επικεντρωθεί στην κατανόηση του πώς οι μεταλλαγμένες πρωτεΐνες Nkd1 αλλάξει σηματοδότηση Wnt κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου

in vivo

.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Αυτή η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τις αρχές που διατυπώνονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι. Η μελέτη εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review της Mayo Clinic νοσοκομεία. Όλοι οι ασθενείς παρέχεται γραπτή συγκατάθεση για τη συλλογή των δειγμάτων και την επακόλουθη ανάλυση. Βάτραχος εκτροφής, in vitro γονιμοποίηση και καλλιέργεια εμβρύων και σταδιοποίηση διεξήχθησαν σύμφωνα με τυποποιημένα πρωτόκολλα και όλα τα ζώα αντιμετωπίζονται αυστηρά σύμφωνα με τις ορθές πρακτικές των ζώων, όπως ορίζεται από την Αμερικανική Ένωση για Ζώων Εργαστηρίου, και το

Xenopus

Για το σχ. Στο Σχ.