Καρκίνο

Αφηρημένο

Ιστορικό

βλαστικά κύτταρα αποτελούν ένα πληθυσμό ανώριμων καρκινικών κυττάρων βρέθηκαν στα περισσότερα συμπαγείς όγκους. ιδιαίτερα χαρακτηριστικά τους, τους καθιστούν ιδανικά μοντέλα για τη μελέτη της αντίστασης στα φάρμακα και την ευαισθησία. Σε αυτή τη μελέτη, ερευνήσαμε αν καρκινικά βλαστικά κύτταρα απομόνωση και ανάλυση ευαισθησίας vitro είναι εφικτές σε ένα κλινικό περιβάλλον.

Μέθοδοι

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα απομονώθηκαν από διαφυγές ή φρέσκο ​​ιστό καρκίνου των 23 ασθενών που προχώρησαν μετά από τυπική αποτυχία της θεραπείας. Ειδικές συνθήκες καλλιέργειας που επιλέγονται για τα ανώριμα κύτταρα όγκου που εκφράζουν δείκτες βλαστική ικανότητα. Αυτά τα κύτταρα εκτέθηκαν in vitro σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες και στοχευμένες.

Αποτελέσματα

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα που προέρχονται από ηπατικές μεταστάσεις σε 6 περιπτώσεις (25%), οζίδια πνεύμονα σε 2 (8%), λεμφαδενικές μεταστάσεις σε 3 (12,5%) και του υπεζωκότα /περιτοναϊκή /περικαρδιακή συλλογή σε 13 (54%). Καρκίνος βλαστικά κύτταρα επιτυχώς απομονώθηκαν σε 15 ασθενείς (63%), συμπεριλαμβανομένων 14 με καρκίνο του πνεύμονα (93,3%). Μια δοκιμή ευαισθησίας έγινε με επιτυχία σε 7 ασθενείς (30,4%), με ένα μέσο όρο 15 φαρμάκων /συνδυασμούς που ελέγχθηκαν (εύρος 5-28) και ένα μέσο χρόνο που απαιτείται για τα αποτελέσματα 51 ημέρες (εύρος 37-95).

Συμπέρασμα

Η προσέγγιση που χρησιμοποιείται για τη δοκιμή ΣΤΕΛΛΑ επέτρεψε την απομόνωση των καρκινικών βλαστικών κυττάρων σε ένα σταθερό ποσοστό των ασθενών. Το χαμηλό ποσοστό των περιπτώσεων την ολοκλήρωση της πλήρους διαδικασίας και τη μακρά διάμεσος χρόνος για την επίτευξη αποτελεσμάτων υπογραμμίζει την ανάγκη για μια πιο αποτελεσματική διαδικασία.

Δίκη ΕΓΓΡΑΦΕΣ

ClinalTrials.gov NCT01483001

Παράθεση: D’Arcangelo Μ, Todaro Μ, Salvini J, Benfante Α, Colorito ML, D’Incecco A, et al. (2015) Cancer Stem Cells Δοκιμασία Ευαισθησία (ΣΤΕΛΛΑ) σε ασθενείς με προχωρημένο πνεύμονα και τον καρκίνο του παχέος εντέρου: μια μελέτη σκοπιμότητας. PLoS ONE 10 (5): e0125037. doi: 10.1371 /journal.pone.0125037

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Xiaoan Liu, το πρώτο συνδεδεμένες νοσοκομείο με Ιατρικό Πανεπιστήμιο Nanjing, Κίνα

Ελήφθη: 6 Αυγούστου του 2014? Αποδεκτές: 10 Μαρτίου του 2015? Δημοσιεύθηκε: May 8, 2015

Copyright: © 2015 D’Arcangelo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού και την υποστήριξη των αρχείων πληροφοριών του

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από την Ιταλική Ένωση για την Έρευνα του Καρκίνου (AIRC 5×1000) να MatildeTodaro, Giorgio Stassi και Federico Cappuzzo, από το Fondazione Ricerca Traslazionale (ForRT) να Federico Cappuzzo και Istituto Toscano Tumori να Federico Cappuzzo και Armida D’Incecco. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν ανταγωνιστικών συμφερόντων υπάρχει

Εισαγωγή

ο καρκίνος είναι η δεύτερη αιτία θανάτου μετά τα καρδιαγγειακά νοσήματα σε όλο τον κόσμο και του πνεύμονα, του μαστού, του παχέος εντέρου και οι όγκοι είναι οι τρεις μεγάλες παίκτες. Μαστού (BC) και ο καρκίνος του πνεύμονα (LC) είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σε άνδρες και γυναίκες, αντίστοιχα, ενώ ορθοκολικού καρκίνου (CRC) αντιπροσωπεύει περίπου το 10% όλων των συχνότητας εμφάνισης καρκίνου και θνησιμότητας [1]. Χειρουργική εκτομή και την επικουρική θεραπεία μπορεί να θεραπεύσει όγκους πρώιμο στάδιο πρωτογενούς. Από την άλλη πλευρά, η μεταστατική ασθένεια είναι ως επί το πλείστον ανίατη, λόγω της συστημικής φύσης και την αντοχή του σε θεραπευτικούς παράγοντες. Πράγματι, περισσότερο από το 90% των θανάτων από καρκίνο σχετίζονται μπορεί να αποδοθεί σε υποτροπή /υποτροπή και όχι στην πρωτογενή αλλοιώσεις [2,3]. Κατά τις δύο τελευταίες δεκαετίες, το αποτέλεσμα της θεραπείας έχει κυρίως βελτιωθεί χάρη στην καλύτερη κατανόηση της βιολογίας του καρκίνου, η εισαγωγή νέων στοχευμένων /χημειοθεραπευτικούς παράγοντες και, το σημαντικότερο, την επιλογή των ασθενών που βασίζονται σε βιοδείκτες ή αναλύσεις του όγκου που βασίζεται. Ωστόσο, ακόμη και αυτή η νέα προσέγγιση αποδείχθηκε ότι είναι ακατάλληλες για να θεραπεύσουν ασθενείς με μεταστατική νόσο [4-7]. Αυτή η κλινική πραγματικότητα υπογραμμίζει την ανάγκη αξιολόγησης νέων προσεγγίσεων για τη θεραπεία των ασθενών με καρκίνο και για την ανάπτυξη νέων κλινικών εργαλείων για την επιλογή της βέλτιστης θεραπευτική επιλογή για τον κάθε ασθενή.

Τα τελευταία χρόνια, ένα μικρό υποπληθυσμό αδιαφοροποίητα καρκινικά κύτταρα με χαρακτηριστικά στέλεχος-όπως ταυτοποιήθηκε εντός των όγκων και ονομάζεται καρκινικά βλαστικά κύτταρα (CSC) ή καρκινικά κύτταρα έναρξη της έρευνας. Φαίνονται υπεύθυνη για την έναρξη του καρκίνου, τροφή, την πρόοδο και την αντίσταση σε αντινεοπλασματικά φάρμακα [8]. Σύμφωνα με αυτή την υπόθεση, CSC προέρχονται από τον μετασχηματισμό των φυσιολογικών αρχέγονων κυττάρων. Πράγματι, λόγω της μακροζωίας τους, τα βλαστικά κύτταρα συσσωρεύονται πολλαπλές μεταλλάξεις που είναι απαραίτητα για την καρκινογένεση. Υποστηρίζοντας την υπόθεση αυτή, φυσιολογικά βλαστικά κύτταρα και το μερίδιο της CSC αρκετές σημαντικές ιδιότητες, όπως:

(α)

αυτο-ανανέωση,

(β)

διαφοροποίηση,

(γ)

ενεργή έκφραση της τελομεράσης,

(δ)

ενεργοποίησης των αντι-αποπτωτικών μονοπατιών,

(ε)

αυξημένη δραστηριότητα μεταφορέα μεμβράνης και

(στ)

ικανότητα να μεταναστεύουν και μεταστάσεις [9] . Επιπλέον, οι καρκίνοι εμφανίζουν συνήθως εκτεταμένες φαινοτυπικά, λειτουργική και μοριακή ετερογένεια που μπορεί εύκολα να εξηγηθεί από τη θεωρία CSC [10-12]. Δύο μοντέλα έχουν προταθεί για τη διαλεύκανση των ανάμικτες χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων εντός ενός όγκου: 1) η κλωνική εξέλιξη μοντέλο, και 2) το μοντέλο CSC. Ενώ το πρώτο αξιώματα που όλα τα κύτταρα εντός ενός καρκίνου έχουν τη δυνατότητα να δημιουργούν νέους όγκους, η τελευταία δείχνει ότι μόνο τα καρκινικά κύτταρα με χαρακτηριστικά στέλεχος-όπως μπορούν να διατηρήσουν έναρξη και την πρόοδο [13-16] όγκου. Πειραματική απόδειξη σε μία ποικιλία όγκων στηρίζει σθεναρά την υπόθεση CSC. Η σημασία της CSC σε έναρξη όγκου έχει εδραιωθεί στη λευχαιμία και αναφέρθηκε πρόσφατα σε μια ποικιλία στερεών όγκων όπως του μαστού, του παχέος εντέρου, του εγκεφάλου, του προστάτη, των ωοθηκών, καρκίνο του πνεύμονα και το μελάνωμα [17-24]. Η ομάδα μας έχει ήδη αναγνωριστεί και χαρακτηριστεί ένα υποπληθυσμό CD133

+ καρκινικών κυττάρων προικισμένο με αυτο-ανανέωσης και της ικανότητας διαφοροποίησης multi-γενεαλογία ακριβώς όπως το κανονικό βλαστικά κύτταρα [25]. Αυτό το μικρό υποπληθυσμό CSC διατηρεί ογκογόνων ικανότητα όταν μεταμοσχεύονται σε ανοσο-ανεπαρκή ποντίκια [25,26]. Τα προκύπτοντα ξενομοσχεύματα είναι ιστολογικά και μοριακά παρόμοιο με το γονικό του όγκου από το οποίο προέρχονται [27]. Αυτό ενδιαφέρουσα ιδιότητα καθιστά CSC ένα καλό μοντέλο για τη μελέτη της βιολογίας και της ευαισθησίας των όγκων του κάθε ασθενή στη αντινεοπλασματικοί παράγοντες.

επίπεδα CSC απεικόνιση υψηλή έκφραση του ΑΤΡ-σύνδεσης κασέτας (ABC) μεταφορέων, αντι-αποπτωτικών παραγόντων , και ένα ενεργό ικανότητα επιδιόρθωσης DNA που τα καθιστούν ιδιαίτερα ανθεκτικά σε φάρμακα και τοξίνες [28-30]. Επιπλέον, η φαινομένη debulk όγκος που λαμβάνεται με χημειοθεραπεία συμβάλλει στον εμπλουτισμό πισίνα CSC, αυξάνοντας έτσι τον κίνδυνο ανάπτυξης ανθεκτικών φαινοτύπων περισσότερο [31]. Αυτή η συλλογική στοιχεία δείχνουν ότι η κοινή αναποτελεσματικότητα των συμβατικών θεραπειών για τον πληθυσμό αρχέγονων κυττάρων θα μπορούσε να εξηγήσει εν μέρει την αντίσταση του καρκίνου στις διαθέσιμες θεραπείες. Συνεπώς, γνωρίζοντας το φάσμα της ευαισθησίας του υποπληθυσμό CSC του ατόμου όγκου και στοχεύουν επιλεκτικά αυτό υποπληθυσμό θα μπορούσε να προσφέρει σημαντική βελτίωση των αποτελεσμάτων της θεραπείας.

Λαμβάνοντας υπόψη την τρέχουσα έλλειψη συγκεκριμένων παραγόντων με στόχο την CSC και την έχουν αναφερθεί στο παρελθόν παρατηρήσεις, πραγματοποιήσαμε μια προοπτική μη τυχαιοποιημένη μελέτη (ΣΤΕΛΛΑ δίκη, ClinicalTrials.gov: NCT01483001) για να αξιολογήσει κατά πόσον είναι εφικτή σε κλινικό περιβάλλον απομόνωση και δοκιμή CSC ενάντια σε ένα ευρύ φάσμα των αντινεοπλασματικών παραγόντων. Επιπλέον, η μελέτη προσπάθησε να προσδιορίσει εάν μια τέτοια προσέγγιση θα μπορούσε δυνητικά να εντοπίσει τα ναρκωτικά με

in vitro

δραστικότητα έναντι του CSC που προέρχεται από τον συγκεκριμένο ασθενή, παρέχοντας έτσι νέα εξατομικευμένα θεραπευτικές επιλογές. Η μελέτη έδειξε ότι η δοκιμή της CSC χημειοευαισθησία είναι εφικτή σε κλινικό περιβάλλον, αν και μια πιο αποτελεσματική

είναι απαραίτητη in vitro

μέθοδο.

Μέθοδοι

Επιλεξιμότητα, την πρόσληψη και την παρακολούθηση

Το πρωτόκολλο για αυτή τη δοκιμή και την υποστήριξη κατάλογος TREND είναι διαθέσιμο ως υποστηρικτικές πληροφορίες? δείτε S1 πρωτοκόλλου και S1 TREND πίνακας ελέγχου.

Η μελέτη ΣΤΕΛΛΑ ήταν μια προοπτική, μη τυχαιοποιημένη, ανοικτή, κλινική δοκιμή που αξιολόγησε τη σκοπιμότητα της παρέμβασης της απομόνωσης CSC και δοκιμασία χημειοευαισθησία στην κλινική (S1 Πρωτόκολλο). Η μελέτη εγκρίθηκε από το «Συμβούλιο Δεοντολογίας κριτική για διερεύνηση των Ναρκωτικών» του Αστικού Νοσοκομείου Λιβόρνο. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε ασθενή πριν από την εγγραφή. Οι ασθενείς οι οποίοι παρακολουθήθηκαν ή αναφέρονται στο Ογκολογικό Τμήμα Ιατρικής του Νοσοκομείου της Λιβόρνο και που πληρούσαν τα κριτήρια επιλεξιμότητας είχαν εγγραφεί στη μελέτη. Επιλέξιμες ασθενείς είχαν επιβεβαιώσει κυτταρολογική ή ιστολογική διάγνωση του μεταστατικού του πνεύμονα, του μαστού ή του παχέος εντέρου? προ-επεξεργασία με πρότυπο θεραπείες και χωρίς πρόσθετες τυπικές θεραπευτικές επιλογές? με μια κατάσταση απόδοσης 100%, σύμφωνα με την βαθμολογία Karnofsky? επαρκείς αιματολογικές, νεφρικές και ηπατικές λειτουργίες. Βασικά κριτήρια μη επιλεξιμότητας περιλαμβάνονται η αδυναμία να λάβει νέα ιστό του όγκου ή νεοπλασματική συλλογή κατάλληλη για εξόρυξη CSC και συννοσηρότητα ενδεχομένως να παρεμβαίνει με τη μελέτη. Κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών, καθώς και μοριακά χαρακτηριστικά των όγκων (όταν είναι διαθέσιμο) συλλέχθηκαν και είναι νηολογημένα στην ηλεκτρονική βάση δεδομένων του Τμήματος Ιατρικής Ογκολογίας του Αστικού Νοσοκομείου Λιβόρνο. Δύο ασθενείς είχαν αρχικά διαγνωστεί με CRC και συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη, αλλά η αναθεώρηση παθολογία έδειξε μια διαφορετική ιστολογία (παγκρεατικό καρκίνο και το λεπτό έντερο αδενοκαρκίνωμα), που αντιπροσωπεύει έτσι ένα απόκλιση από το πρωτόκολλο της μελέτης.

Ο πρωταρχικός στόχος της η μελέτη ήταν να αξιολογηθεί η σκοπιμότητα μιας δοκιμασίας ευαισθησίας CSC σε ένα κλινικό περιβάλλον, λαμβάνοντας υπόψη το ποσοστό των ασθενών για τους οποίους ήταν δυνατό να διεξαχθεί η δοκιμασία και η χρονική περίοδος για να ληφθούν τα αποτελέσματα ευαισθησίας. Δευτερεύοντα τελικά σημεία ήταν ο προσδιορισμός των LC, CRC και BC βλαστικών κυττάρων και η αξιολόγηση της τους

in vitro

ευαισθησία στο αντι-όγκου. Το τελευταίο εκφράστηκε ως ποσοστό θνησιμότητας, δηλαδή το ποσοστό των νεκρών κυττάρων μετά τη δοκιμασία χημειοευαισθησία.

Οι ασθενείς εντάχθηκαν σε διάστημα δύο μηνών από το χρόνο (Δεκέμβριος 6

ου, 2011-31ης Ιανουαρίου

st, 2012), και παρακολουθήθηκαν μέχρι το θάνατο ή την άρνηση του ασθενούς (Δεκέμβριος 2011-Δεκέμβριος 2013) σε τακτά χρονικά διαστήματα σύμφωνα με την κλινική ανάγκη και τη γνώμη του κλινικού ιατρού. Τηλεφωνικές συνεντεύξεις πραγματοποιήθηκαν σε περίπτωση που ο ασθενής δεν ήταν σε θέση να παρακολουθήσουν τις επισκέψεις στα εξωτερικά ιατρεία.

Συλλογή Ιστών, απομόνωση, και Πολιτισμού των καρκινικών κυττάρων

Νεοπλασματική συλλογή (αν υπάρχει) ή του ιστού του όγκου από την πρωτογενή καρκίνο ή από την πιο προσιτή μεταστατική εντόπιση λήφθηκε από όλους τους επιλέξιμους ασθενείς μετά από ενημέρωση υπογραφή συγκατάθεση του Αστικού Νοσοκομείο του Λιβόρνο. Φρέσκα δείγματα στάλθηκαν όλη τη νύκτα σε θερμοκρασία δωματίου έως την Κυτταρική και Μοριακή Παθοφυσιολογία Εργαστήριο του Πανεπιστημίου του Palermo, Ιταλία. δείγματα όγκων εντατικά πλύθηκαν σε διάλυμα PBS και επωάστηκαν όλη τη νύκτα σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (ϋΜΕΜ, GIBCO) συμπληρωμένο με πενικιλλίνη (500 U /ml, GIBCO), στρεπτομυκίνη (500 μg /ml, GIBCO) και αμφοτερικίνη Β (1,25 μg /ml , GIBCO) για να αποφευχθεί μικροβιακή μόλυνση. δείγματα όγκων ενζυματικώς σε πέψη με κολλαγενάση και υαλουρονιδάση και μηχανικά ανακινήθηκε για 1 ώρα στους 37 ° C. Εναλλακτικά, νεοπλασματικών διαχύσεις διαχωρίστηκαν με φυγοκέντρηση (1200 rpm, 10 min, 4 ° C). Συνολικές κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο ελεύθερο βλαστοκυττάρων ορό συμπληρωμένο με επιδερμικό αυξητικό παράγοντα (EGF, 20 ng /mL, Sigma-Aldrich) και βασικού αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών (bFGF, 10 ng /mL, Sigma-Aldrich) και επιστρώθηκαν σε εξαιρετικά χαμηλές πλάκα προσάρτησης (Corning) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Αυτές οι συνθήκες ευνοούν την ανάπτυξη των πολύ ογκογόνων βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν, ενώ αρνητικά την επιλογή για λιγότερο ογκογονικά διαφοροποιημένα κύτταρα όγκου, όπως έδειξε προηγουμένως από Eramo et al [24]. Surviving ανώριμα κύτταρα του όγκου αργά πολλαπλασιάζονται και σχηματίζουν σφαίρες των κυττάρων. κύτταρα Σφαίρα προερχόμενα επεκτάθηκαν με μηχανικά και /ή ενζυματική διάσπαση και την εκ νέου επιστρώθηκαν σε πλήρες φρέσκο ​​μέσο βλαστοκυττάρων. Οι κυτταρικές καλλιέργειες διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 υγροποιημένο επωαστήρα.

περιλαμβάνεται Το πρωτόκολλο της μελέτης

in vivo πειράματα

που δεν έχουν ποτέ πραγματοποιηθεί επειδή όλα τα διαθέσιμα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για τις δοκιμές χημειοευαισθησία στην προσπάθεια του δοκιμές, όπως πολλά φάρμακα δυνατό και εντοπίζοντας έτσι μια πιθανή θεραπεία για τον ασθενή.

χαρακτηρισμός ανοσοφθορισμού σφαιρών

Σφαίρα προερχόμενα κύτταρα αποδείχθηκαν CSC με χαρακτηρισμό ανοσοφθορισμού για την βλαστική ικανότητα μεμβράνης δείκτες. Εν συντομία, σφαίρες όγκου μηχανικά και ενζυμικά διαχωρίστηκαν για τη λήψη μεμονωμένων κυττάρων. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και διαπερατά όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [25]. κυτταρονήματος πλύθηκαν σε PBS και εξετέθησαν όλη τη νύχτα σε 4 ° C σε αντισώματα έναντι CD133 (AC133, ποντικού IgG

1, Miltenyi), CD166 (lgG1 ποντικού, R &? D Systems), OCT3 /4 (sc-5279, το ποντίκι IgG2b, Santa Cruz), ΑΙ_ϋΗ-1 (IgG 1 ποντικού, BD Bioscience), CD90 (IgG1k ποντίκι, BD Bioscience), ή τους ελέγχους ισότυπο. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επισημάνθηκαν με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) συζευγμένων αντισωμάτων ποντικού (Invitrogen) και οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με χρήση Toto-3 ιωδίδιο. Η χρώση φθορισμού αξιολογήθηκε με ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο.

Ιη vitro ευαισθησία Δοκιμασία

Μετά τη μηχανική και την ενζυματική διάσπαση, τα καρκινικά κύτταρα βάφτηκαν με κυανούν του τρυπανίου και μετρήθηκαν με ένα αιμοκυτταρόμετρο. Καρκινικά κύτταρα (2×10

4 ανά φρεάτιο) εκτέθηκαν σε διάφορα φάρμακα κατά του όγκου, προκειμένου να αξιολογηθεί η ευαισθησία τους στις θεραπευτικές ενώσεις. Ο πίνακας 1 δείχνει τα φάρμακα ή συνδυασμοί που χρησιμοποιούνται. Οι κλινικοί ιατροί επέλεξαν εμπειρικά τα φάρμακα για τη δοκιμή με βάση τις προηγούμενες θεραπευτικές αγωγές και βασικής μοριακής εκτροπή του συγκεκριμένου ασθενούς. Η

in vitro

δοκιμασία ευαισθησίας πραγματοποιήθηκε ταυτόχρονα σε δύο 96 και εξαιρετικά χαμηλής πλάκες στερέωσης (Corning). Ο χρόνος θεραπείας καθορίστηκε με βάση τα ναρκωτικά χρόνο ημίσειας ζωής και συνεχίστηκε μέχρι και 96 ώρες. Κάθε αγωγή αξιολογήθηκε εις τριπλούν.

Η

Κυτταρική βιωσιμότητα αξιολογήθηκε με χρώση πορτοκαλί ακριδίνης /βρωμιούχο αιθίδιο (AO /EB), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34]. Το κυτταρικό εναιώρημα επωάστηκε σε διάλυμα AO /EB σε αναλογία 1: 1, αντιστοίχως, και απαλά αναμειγνύονται. Αυτή η διαδικασία πραγματοποιήθηκε ακριβώς πριν την ποσοτικοποίηση με ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο. Οκτώ μΐ κυτταρικού εναιωρήματος τοποθετήθηκαν επί ενός μικροσκοπική πλάκα και καλύφθηκε με καλυπτρίδα γυάλινη. Ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο χρησιμοποιήθηκε για την εξέταση του δείγματος και την ποσοτικοποίηση κυτταρικού θανάτου [34]. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης ευαισθησίας κοινοποιήθηκαν στους κλινικούς ιατρούς για να επιλέξετε, όταν αυτό είναι δυνατόν, ένα σχήμα θεραπείας βελτιστοποιηθεί για τον κάθε ασθενή.

Στατιστική Ανάλυση

Το μέγεθος του δείγματος υπολογίστηκε με το λογισμικό IBM SPSS Δείγμα Ισχύς 3,0 επί τη βάσει του ποσοστού των ασθενών για τους οποίους δεν ήταν δυνατή η εκτέλεση της ανάλυσης. Χρησιμοποιώντας το τεστ για το ποσοστό (δύο όψεων της δοκιμής), με την παραδοχή του ποσοστού του 33% (έναντι τυπική διαδικασία του 5%), απαιτήθηκε ένα μέγεθος δείγματος των 18 ασθενών, με ισχύ από 90% και σε επίπεδο σημαντικότητας 0,05 . Η περιγραφική στατιστική (συχνότητα, ποσοστό, η διάμεση και ενδοτεταρτημοριακό εύρος) χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση των δεδομένων όπου ενδείκνυται. Τα αποτελέσματα του

in vitro

διαδικασία (είδος των δειγμάτων που συλλέχθηκαν, CSC ποσοστό αποτυχίας απομόνωσης) αναλύθηκαν λαμβάνοντας υπόψη το συνολικό αριθμό των δειγμάτων. Τα άλλα αποτελέσματα (ποσοστό επιτυχίας δοκιμασία ευαισθησίας, ο χρόνος για το αποτέλεσμα και τον αριθμό των φαρμάκων που δοκιμάζονται) αναλύθηκαν λαμβάνοντας υπόψη μόνο τα δεδομένα του ασθενούς »με σκοπό την θεραπεία» του πληθυσμού.

Αποτελέσματα

Ασθενείς χαρακτηριστικά

από τις 6 Δεκεμβρίου

ου 2011 έως 31η Γενάρη

ου 2012, συνολικά 23 ασθενείς εντοπίστηκαν στο Ογκολογικό Τμήμα Ιατρικής του Λιβόρνο και συμμετείχαν στη μελέτη (Σχήμα 1). Όλοι οι ασθενείς εξετάστηκαν ήταν επιλέξιμες και ξεκίνησε τη διαδικασία για την απομόνωση CSC. Όλοι οι ασθενείς συμπεριλήφθηκαν στις ακόλουθες αναλύσεις. Ο Πίνακας 2 συνοψίζει τα κλινικά χαρακτηριστικά των μεμονωμένων ασθενών. Η διάμεση ηλικία ήταν 66 έτη (εύρος διατεταρτημοριακό, IQR: 51-72) και η πλειονότητα των υποκειμένων ήταν άνδρες (n = 15, 65%) και είχε καρκίνο του πνεύμονα (n = 18, 78%). Δεν π.Χ. ασθενής είχε εγγραφεί. Βιο-μοριακός χαρακτηρισμός δεν ήταν διαθέσιμη σε 5 περιπτώσεις. Μεταξύ των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα,

EGFR

μεταλλάξεις ανιχνεύθηκαν σε 4 περιπτώσεις,

ALK

μετατόπιση σε 1 περίπτωση και

KRAS

μετάλλαξη σε μια άλλη υπόθεση. Δύο από τους τρεις CRC ασθενείς έτρεφε μια

KRAS

μετάλλαξη. Οι ασθενείς έλαβαν μια διάμεση των 3 προηγούμενων γραμμές θεραπείας (IQR: 1-3). Όλοι οι ασθενείς ολοκλήρωσαν την παρακολούθηση, εκτός από έναν ασθενή που είναι ακόμα ζωντανός. Κανένας ασθενής δεν χάθηκε κατά την παρακολούθηση.

Η

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα απομόνωση και την ευαισθησία

δοκιμασία

βιοψία του όγκου ή νεοπλασματική διαδικασία συλλογής συλλογή επαναλήφθηκε όχι περισσότερο από μία φορά ανά ασθενή , εκτός από μία περίπτωση. Δεν υπήρξαν επιπλοκές που προκύπτουν από τη διαδικασία συλλογής ιστού όγκου /συλλογή. Απομόνωση CSC διεξήχθη χρησιμοποιώντας υπεζωκότα /περιτοναϊκή /περικαρδιακή συλλογή σε 13 περιπτώσεις (54%), του ιστού του όγκου από τις πνευμονικές μεταστάσεις σε 2 περιπτώσεις (8%), μεταστάσεις ήπατος σε 6 (25%) και λεμφαδένα μεταστάσεων σε 3 (13% ). CSC επιτυχώς απομονώθηκαν σε 15 από τα δείγματα 24 όγκων συλλέγεται (63%). Το υλικό δεν ήταν επαρκής σε 8 περιπτώσεις και ένα δείγμα επιδεινώθηκε κατά τη διάρκεια της μεταφοράς. Το ποσοστό αποτυχίας ήταν υψηλότερος με βιοψίες των όγκων (5 αποτυχημένες περιπτώσεις από τις 11, ποσοστό αποτυχίας: 45%) από ό, τι με κακοήθεις συλλογές (3 απέτυχε περιπτώσεις από τις 13, ποσοστό αποτυχίας: 23%). Ειδικότερα, η χαμηλότερη απόδοση ελήφθη με μεταστάσεις λεμφαδένα (2 απέτυχε περιπτώσεις από τις 3, ποσοστό αποτυχίας: 67%). Σύμφωνα με την πρωτογενή θέση του καρκίνου, ποσοστό αποτυχίας ήταν 30% για τον καρκίνο του πνεύμονα και 80% για γαστρεντερικών όγκων.

Προσφάτως απομονωθέντα κύτταρα όγκου πνεύμονα είχαν φαινότυπο στελέχους όπως επιβεβαιώνεται από την ταυτόχρονη έκφραση από τα πιο κοινά βλαστική ικανότητα σημειωτές , συμπεριλαμβανομένων των CD133, CD166, OCT3 /4, ALDH-1 και CD90 (Σχήμα 2) [32,33]. Η ταυτόχρονη υψηλή έκφραση αυτών των δεικτών υποστηρίζει σθεναρά το γεγονός ότι τα απομονωμένα κύτταρα ήταν CSC. Ο Πίνακας 3 δείχνει το μοτίβο της έκφρασης των δεικτών στις περιπτώσεις στις οποίες διεξήχθη μία δοκιμασία ευαισθησίας. Αριθ ανοσο-φθορισμού μελέτη διεξήχθη επί γαστρεντερική δείγματα για περιορισμένο αριθμό απομονωμένων κυττάρων και ανεπαρκής

in vitro

ανάπτυξη.

Το ακόλουθο πίνακα των εικόνων αναφέρεται στο χαρακτηρισμό των κυττάρων που απομονώνονται από το δείγμα ενός ασθενούς που εγγράφονται στη μελέτη. Πράσινο επισήμανση είναι χαρακτηριστικό των θετικών κυττάρων. Όλες οι δείκτες βλαστική ικανότητα (CD133, CD166, Οκτ 3/4, ΑΙ_ϋΗ1, CD90) είναι θετική σε αυτό το δείγμα CSC.

Η

Μεταξύ των 15 περιπτώσεων στις οποίες CSC απομονώθηκαν με επιτυχία,

in vitro

κυτταρική ανάπτυξη παρατηρήθηκε σε 12 και μόνο σε 7 περιπτώσεις ο αριθμός των διαθέσιμων κυττάρων ήταν επαρκής για να εκτελέσει μια δοκιμή χημειοευαισθησίας. Το συνολικό ποσοστό επιτυχίας της όλης διαδικασίας ήταν 30,4%. Η

in vitro

ανταπόκριση στη θεραπεία εκτιμήθηκε σε 96 φρεάτια πλακών εις τριπλούν με χρώση AO /ΕΒ. Η χρώση AO /EB χρησιμοποιήθηκε για να απεικονίσει την πυρηνική αλλαγές και σχηματισμό αποπτωτικών σώμα που είναι χαρακτηριστικές της απόπτωσης. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η ΑΟ είναι ένα ζωτικής σημασίας χρωστική ουσία και λεκέδες τόσο ζωντανά και νεκρά κύτταρα, EB λεκέδες μόνο τα κύτταρα που έχασε την ακεραιότητα της μεμβράνης. Ως εκ τούτου, τα βιώσιμα κύτταρα εμφανίστηκαν ομοιόμορφα πράσινο και τα νεκρά κύτταρα που ενσωματώνονται ΕΒ και, κατά συνέπεια, βάφτηκαν σε πορτοκαλί (Σχήμα 3). Η ανταπόκριση στη θεραπεία, παρατηρήθηκε στην πρώτη πλάκα επισημασμένο με AO /EB, ήταν ομοιογενής σε όλες τις τρεις εκβαθύνσεις. Βιώσιμα κύτταρα της δεύτερης πλάκας διατηρήθηκαν σε καλλιέργεια για παρατήρηση και δεν ανιχνεύθηκε μορφολογικές ή φαινοτυπικά αλλαγή.

ΑΟ είναι ένα ζωτικής σημασίας χρωστική και λεκέδες τόσο ζωντανά και νεκρά κύτταρα. EB διεισδύει σε κύτταρα με διασπάστηκαν κυτταροπλασματική μεμβράνη, η χρώση μόνο τα νεκρά κύτταρα. Ως εκ τούτου, τα βιώσιμα κύτταρα είναι ομοιόμορφα πράσινο και τα νεκρά κύτταρα επισημαίνονται με πορτοκαλί χρώμα. α) Χαμηλή ευαισθησία (κυτταρική θνησιμότητα 5%). β) Μέσος όρος της ευαισθησίας (κυτταρική θνησιμότητα 40%). γ) Η υψηλή ευαισθησία (κυτταρική θνησιμότητα 80%).

Η

Όλοι οι ασθενείς των οποίων οι όγκοι ελέγχθηκαν επιτυχώς

in vitro

είχε LC, συμπεριλαμβανομένων των 5 αδενοκαρκινώματα πνεύμονα, 1 αδιαφοροποίητα μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα καρκίνο και 1 μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα. Ο μέσος χρόνος μεταξύ της συλλογής δειγμάτων και αποτελέσματα της ανάλυσης ευαισθησίας ήταν 51 ημέρες (ΙΟΚ: 47-54). Ο Πίνακας 1 δείχνει τα φάρμακα ή συνδυασμούς που χρησιμοποιούνται για το

in vitro

δοκιμασία ευαισθησίας και πιο αναλυτικές πληροφορίες για τα ενιαία δοκιμές μπορούν να βρεθούν στον Πίνακα 3. Ο διάμεσος αριθμός των φαρμάκων /συνδυασμούς που δοκιμάστηκαν ήταν 15 (ΙΟΚ: 5-22). Η

in vitro

CSC ποσοστό θνησιμότητας κυμαίνεται από 0 έως 80%, αλλά μόνο σε μία περίπτωση το ποσοστό θνησιμότητας ήταν & gt? 50% (Πίνακας 3)

θεραπεία ασθενείς

Η μελέτη δεν προέβλεπε τη θεραπεία των ασθενών και των τελικών σημείων της δεν περιλαμβάνουν το αν οι

in vitro

αποτελέσματα συσχετίζονται με την κλινική ανταπόκριση. Ωστόσο, δεν ισχύει θεραπευτική επιλογή ήταν διαθέσιμη για αυτούς τους ασθενείς και, όταν είναι δυνατόν, θα τους προσφέρεται μια θεραπεία με μια από τις δοκιμασμένες φαρμάκων. Το επιλεγμένο σχήμα ήταν πάντα η μία με την υψηλότερη

in vitro

ποσοστό θνησιμότητας. Δεδομένου ότι δεν υπάρχει αναγνωρισμένο αποκοπής αξία του

in vitro

αποτέλεσμα τον ορισμό της κλινικής ευαισθησίας /ανθεκτικότητας, δεν μπορεί να αποκλειστεί ότι σχήματα με χαμηλή

in vitro

θνησιμότητας μπορεί να παράγει κλινικές αποκρίσεις και, Ως εκ τούτου, η επιλεγείσα αγωγή θα μπορούσε να έχει ένα χαμηλό ποσοστό θνησιμότητας. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 3, μεταξύ των 7 άτομα για τα οποία ένας προσδιορισμός ευαισθησίας ήταν διαθέσιμη, μόνο 3 έλαβε θεραπεία με βάση τα αποτελέσματα των δοκιμών. Το υψηλότερο ποσοστό θνησιμότητας παρατηρήθηκε

in vitro

ήταν 10% σε 2 από αυτούς τους ασθενείς και η νόσος προχώρησε σύντομα μετά την έναρξη της θεραπείας. Ο πρώτος ασθενής ήταν ποτέ καπνιστής γυναίκα με μεταστατικό αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα χωρίς εκτροπή μοριακή οδηγού. Έλαβε ένα συνδυασμό οξαλιπλατίνη και πακλιταξέλη, αλλά η ασθένεια προχωρούσε μετά από μόνο δύο κύκλους. Ο δεύτερος ασθενής ήταν ένας πρώην άνθρωπος καπνιστής με

KRAS

μεταλλαχθεί προχωρημένο αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα. Έλαβε ένα συνδυασμό καρβοπλατίνη και πεμετρεξίδη και την ασθένεια του προχώρησε αμέσως μετά. Από την άλλη πλευρά, σε ένα νεαρό άνδρα με ένα μεταστατικό

EGFR

μεταλλαγμένο αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα η

in vitro δοκιμασία

έδειξε μία κυτταρική θνησιμότητα κατά 40% για τον συνδυασμό οξαλιπλατίνη και πακλιταξέλη. Ο ασθενής έλαβε 5 κύκλοι των προαναφερθέντων χημειοθεραπευτικών φαρμάκων, επιτυγχάνοντας σταθεροποίηση της νόσου. Παρά την ευεργετική επίδραση, δεδομένου ότι ο ασθενής είχε ήδη λάβει 7 γραμμές της θεραπείας, ο γιατρός αποφάσισε να διακόψει τη θεραπεία για αυξημένο κίνδυνο τοξικότητας. Οι άλλοι 4 ασθενείς για τους οποίους έγινε ένα τεστ ευαισθησίας δεν έλαβαν τη θεραπεία επειδή πέθανε προτού να είναι διαθέσιμα τα αποτελέσματα. Συνολικά, αυτές οι ανέκδοτες ευρήματα φαίνεται να δείχνουν ότι τα υψηλότερα

in vitro

ευαισθησία θα μπορούσε να μεταφραστεί σε καλύτερη κλινική έκβαση.

Συζήτηση

Συσσωρευμένα στοιχεία υποστηρίζουν την ύπαρξη των ΚΕΠ σε ανθρώπινους όγκους. Αυτά τα κύτταρα έχουν την ικανότητα να αυτο-ανανέωση και διαφοροποιούνται σε ώριμα κύτταρα του όγκου. Φαίνονται να οδηγούν την έναρξη του όγκου, της προόδου και της μετάστασης. Δεδομένης της υψηλής αντοχής τους σε αντικαρκινικά φάρμακα, πιστεύεται ότι συμβάλει ουσιαστικά στην υποτροπή μετά τη χημειοθεραπεία και αντιπροσωπεύουν έναν ελκυστικό θεραπευτικό στόχο για δυνητικά επίτευξη μακρόβιων θεραπευτικές αποκρίσεις. Ως εκ τούτου, η αναγνώριση των πιο δραστικών φαρμάκων στον υποπληθυσμό CSC έχει τη δυνατότητα να προσδιορίσει την καλύτερη επιλογή θεραπείας για τον κάθε ασθενή ή νέες θεραπευτικές επιλογές για τους ασθενείς προχωρούν σε καθιερωμένες θεραπείες.

Προηγούμενες μελέτες έχουν ήδη περιγραφεί η απομόνωση διαδικασία της CSC. Η μελέτη ΣΤΕΛΛΑ είναι η πρώτη προοπτική μελέτη που αξιολογεί τη δυνατότητα εφαρμογής της διαδικασίας αυτής σε κλινικό περιβάλλον με στόχο τη δοκιμή του

in vitro

ευαισθησία της CSC και ενδεχομένως τον εντοπισμό νέων θεραπευτικών επιλογών για τον ασθενή. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η σκοπιμότητα ήταν το πρωταρχικό καταληκτικό σημείο της μελέτης, ένας περιορισμένος αριθμός ατόμων γράφτηκε, η συντριπτική πλειοψηφία με διάγνωση LC, η πιο συχνή ασθένεια που αναφέρεται στο Ίδρυμα μας. Η μελέτη έδειξε ότι η διαδικασία ήταν εφικτή σε 65% των περιπτώσεων, που οδηγεί σε ένα αποτέλεσμα χημειο-ευαισθησία στο ένα τρίτο των ασθενών σε διάμεσο χρόνο 51 ημερών. Συνολικά, αυτή η προκαταρκτική εμπειρία μας έδωσε πολύ χρήσιμες πληροφορίες.

Πρώτα απ ‘όλα, το site της συλλογής δειγμάτων όγκου ήταν κρίσιμη για την επιτυχία της διαδικασίας απομόνωσης από το νεοπλασματικών συλλογές ήταν ο πιο ικανός για το σκοπό αυτό. Αυτό είναι επίσης ένα σημαντικό στοιχείο για την κλινική πρακτική, δεδομένου συλλογή συλλογή είναι σχετικά εύκολη και συχνά απαιτούνται για τη διαχείριση των συμπτωμάτων, έχει χαμηλό ρίσκο και είναι γενικά καλά αποδεκτή από τους ασθενείς. Κατά τη γνώμη μας, το είδος του δείγματος, αν ήταν φρέσκο ​​ιστό βιοψίας ή νεοπλασματική συλλογή, ήταν ο παράγοντας που επηρέασε κυρίως στο χαμηλό ποσοστό των ασθενών που επωφελούνται από τη δοκιμή. Άλλοι παράγοντες, όπως το είδος του μέσου καλλιέργειας, μπορεί να είχε μικρό αντίκτυπο.

Ο διάμεσος χρόνος μεταξύ των αποτελεσμάτων συλλογής δειγμάτων και ανάλυσης ευαισθησίας ήταν 51 ημέρες. Αυτό είναι ένα σχετικά μεγάλο χρονικό διάστημα για τους ασθενείς με καρκίνο μεταστατικό, εξηγώντας γιατί λιγότερο από το 50% των ατόμων για τα οποία η δοκιμή ευαισθησίας ήταν διαθέσιμο έλαβε θεραπείας βάσει των αποτελεσμάτων της. Είτε αυτό το χρονικό διάστημα είναι αρκετό για να αλλάξει περαιτέρω τη βιολογία των καρκινικών κυττάρων και την ευαισθησία τους για τα ναρκωτικά δεν είναι γνωστή και επί του παρόντος δεν υπάρχει καμία επιστημονική απόδειξη γι ‘αυτό. Για να μειωθεί αυτό το χρονικό πλαίσιο, με βάση την εμπειρία ΣΤΕΛΛΑ, μια συνεχιζόμενη κλινική μελέτη (LUCAS) χρησιμοποιεί μια διαφορετική δοκιμασία (Tecan Άπειρο F500 μετά Δοκιμασία βιωσιμότητα των κυττάρων Ο τίτλος-Glo φθορισμού κυττάρων? Promega). Η μέθοδος αυτή προσδιορίζει τον αριθμό των βιώσιμων κυττάρων με βάση την ποσοτικοποίηση ενός σήματος φωταύγειας η οποία είναι ανάλογη με την ποσότητα του ΑΤΡ? απαιτεί ένα μικρότερο αριθμό κυττάρων και αποδίδει άμεσα αποτελέσματα σε μόνο 7 ημέρες από τη βιοψία. Αυτό μπορεί να βοηθήσει στην επίτευξη αποτελεσμάτων σε συντομότερο χρονικό διάστημα και να δοκιμάσουν περισσότερα φάρμακα για τους ασθενείς με αργή

in vitro

ανάπτυξης της CSC. Επιπλέον, παρέχει ποσοτικά αποτελέσματα, εξαλείφοντας την κατώτερη ακρίβεια της προηγούμενης ημι-ποσοτική μέθοδος. Αυτή η νέα προσέγγιση θα μπορούσε επίσης να βελτιώσει το ποσοστό των ασθενών στους οποίους η δοκιμή χημειοευαισθησία μπορεί να εκτελεστεί με επιτυχία. Στην πραγματικότητα, στην ΣΤΕΛΛΑ μελετήσει την δοκιμασία ευαισθησίας διεξήχθη σε μόνο 7 περιπτώσεις κυρίως για τους φτωχούς

in vitro

κυτταρικής ανάπτυξης.

Στη μελέτη μας έδειξε CSC υψηλή αντοχή σε επί του παρόντος διαθέσιμα φάρμακα, συμπεριλαμβανομένων πρότυπο παράγοντες χημειοθεραπείας και στοχευμένων θεραπειών, με μόνο μία περίπτωση δείχνει ένα ποσοστό θνησιμότητας άνω του 50%. Αυτό δεν είναι απροσδόκητο λαμβάνοντας υπόψη την υψηλή αντοχή του CSC να χρησιμοποιούνται συνήθως αντικαρκινικών παραγόντων, τονίζοντας την επείγουσα ανάγκη για πιο αποτελεσματικά φάρμακα που στοχεύουν ειδικά αυτού του πληθυσμού κυττάρων.

Εν κατακλείδι, η προσέγγιση που χρησιμοποιείται για τη δίκη ΣΤΕΛΛΑ επέτρεψε την απομόνωση CSC στην ένα σταθερό ποσοστό των ασθενών. Το χαμηλό ποσοστό των περιπτώσεων την ολοκλήρωση της πλήρους διαδικασίας της δοκιμασίας χημειοευαισθησία και τη μεγάλη διάμεσος χρόνος για την απόκτηση των πλήρη αποτελέσματα τονίζει την ανάγκη για μια πιο αποτελεσματική διαδικασία. Σε μια τέτοια προοπτική, η εν εξελίξει μελέτη LUCAS θα αποσαφηνίσει τις πιθανές κλινικές επιπτώσεις των θεραπειών που στοχεύουν σε ΚΕΠ.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 πρωτοκόλλου. πρωτόκολλο της μελέτης, ενημερωτική επιστολή για το γενικό ιατρό και έντυπο συγκατάθεσης

doi:. 10.1371 /journal.pone.0125037.s001

(PDF)

S1 TREND Checklist. . TREND λίστα ελέγχου

doi: 10.1371 /journal.pone.0125037.s002

(PDF)