Αφηρημένο

Πρόσφατα στοιχεία παρέχουν ενδείξεις για ένα σημαντικό ρόλο των αιμοπεταλίων στη λεμφαγγειογένεση μέσα στα ανθρώπινα κακοήθη νόσο. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να διερευνηθεί ο ρόλος των θρομβοκυττάρων σε λεμφαγγειογένεση σε ανθρώπινο καρκίνο του οισοφάγου. Η περιεγχειρητική μετρήσεις περιφερικού αιμοπεταλίων (PBPC) αξιολογήθηκαν αναδρομικά σε 320 ασθενείς με καρκίνο του οισοφάγου, που περιλαμβάνει 184 αδενοκαρκινώματα (AC), και 136 καρκινώματα πλακωδών κυττάρων (SCC). Τα στοιχεία σχετικά με λεμφαγγειογένεση αξιολογούνται από αντι-podoplanin ανοσοχρώση ήταν διαθέσιμα από προηγούμενες μελέτες, αιμοπετάλια εντός του ιστού του όγκου εκτιμήθηκαν με CD61 ανοσοχρώση. Για

in vitro μελέτες

, τα ανθρώπινα λεμφικά ενδοθηλιακά κύτταρα (LECs) απομονώθηκαν και συν-καλλιεργήθηκαν με τα αιμοπετάλια του περιφερικού αίματος. Στρωματικά θρομβοπενική clusters (STC) ήταν εμφανής σε 82 δείγματα (25,6%), και η αγγειακή θρομβοπενική clusters (ΚΕΚ) σε 56 (17,5%). STC και VTC συσχετίστηκαν με σημαντικά υψηλότερο PBPC σε διερεύνηση όλων των περιπτώσεων. Η παρουσία του STC συσχετίστηκε με υψηλότερη πυκνότητα των μικροαγγείων του λεμφικού (ρ & lt? 0.001), PBPC και STC σχετίστηκαν με lymphovascular εισβολή των κυττάρων του όγκου σε ένα μοντέλο παλινδρόμησης. Η παρουσία των ρητρών αυτών σχετίστηκε με μικρότερη DFS όλων των ασθενών (p = 0,036, δοκιμή Breslow), και VTC με μικρότερη DFS στο SCC (p = 0,025, δοκιμή Breslow). Σε κυτταρική καλλιέργεια, LEC πολλαπλασιασμός ενισχύεται από συν-καλλιέργεια με ανθρώπινα αιμοπετάλια σε μια δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο που διαμεσολαβείται από την απελευθέρωση του ΡϋΟΡ-ΒΒ και VEGF-C. Τα αιμοπετάλια παίζουν ένα σημαντικό ρόλο στην λεμφαγγειογένεση και lymphovascular εισβολή σε καρκίνο του οισοφάγου, που επηρεάζουν την πρόγνωση. Έτσι, η διακοπή των μονοπατιών μεταξύ των αιμοπεταλίων, τα καρκινικά κύτταρα και του λεμφικού ενδοθηλίου σηματοδότησης μπορεί να είναι επωφελής για τους ασθενείς

Παράθεση:. Schoppmann SF, Alidzanovic L, Schultheis Α, Perkmann Τ, Brostjan C, Birner P (2013) Θρομβοκύτταρα συσχετίζονται με λεμφαγγειογένεση στην Ανθρώπινη καρκίνο του οισοφάγου και μεσολαβούν Ανάπτυξης της λεμφικά ενδοθηλιακά κύτταρα

In Vitro

. PLoS ONE 8 (6): e66941. doi: 10.1371 /journal.pone.0066941

Συντάκτης: Claudia Daniela andl, Πανεπιστήμιο Vanderbilt, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 8 Απρίλη, 2013? Αποδεκτές: 13η Μαΐου 2013? Δημοσιεύθηκε: 26 του Ιούνη του 2013

Copyright: © 2013 Schoppmann et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

οισοφάγου αδενοκαρκινώματα (AC) της γαστροοισοφαγικής συμβολής είναι. πιστεύεται ότι επάγεται κυρίως από γαστροοισοφαγική παλινδρόμηση, ενώ οι πλακωδών κυττάρων καρκινώματα (SCC) οφείλεται κυρίως στην κατανάλωση αλκοόλ και του καπνού [1], [2]. Τις τελευταίες δεκαετίες, η συχνότητα εμφάνισης των AC έχει αυξηθεί δραματικά στις δυτικές χώρες [3]. Παρά τις πολυτροπικές θεραπευτικές στρατηγικές, συνολικό αποτέλεσμα για τους ασθενείς με καρκίνο γαστροοισοφαγική παραμένει φτωχή. Έτσι νέες θεραπευτικές έννοιες χρειάζονται επειγόντως, και γνώσεις σχετικά με την παθοφυσιολογία της νόσου είναι απαραίτητη προϋπόθεση για την ανάπτυξή τους. Όπως και πολλά άλλα καρκινώματα, του οισοφάγου εξαπλωθεί κυρίως μέσω του λεμφικού συστήματος και lymphovascular εισβολή των καρκινικών κυττάρων συνδέεται με μειωμένη πρόγνωση των ασθενών [4].

υπάρχει σήμερα εντυπωσιακή απόδειξη ότι οι όγκοι μπορεί να καθορίσει όχι μόνο το δικό τους αίμα εφοδιασμού πλοίων, αλλά μπορεί επίσης να προκαλέσει το σχηματισμό νέων λεμφαγγείων (λεμφαγγειογένεση) και να μεταναστεύσουν ενεργά σε αυτή τη νεοσυσταθείσα σκάφη για την προώθηση της εξάπλωσής τους [5].

Έτσι, είναι δυνατόν η αναστολή της διαδικασίας αυτής θα μπορούσε να είναι επωφελής για ασθενείς, ειδικά τα πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι η διαδικασία της λεμφαγγειογένεσης και του λεμφικού εισβολή σκάφος (LVI) δεν περιορίζεται μόνο σε πρωτογενείς όγκους, αλλά είναι επίσης εμφανές σε μεταστάσεις λεμφαδένα, με αποτέλεσμα την περαιτέρω εξάπλωση των καρκινικών κυττάρων [6].

Ο σχηματισμός που σχετίζονται με όγκο αιμοφόρων λεμφικό είναι μια σύνθετη διαδικασία και επί του παρόντος μόνο εν μέρει κατανοητή. Κατά την εμβρυϊκή αγγειογένεση, αιμοπετάλια φαίνεται να παίζουν καθοριστικό ρόλο στον διαχωρισμό του αίματος και του λεμφικού αγγειακού συστήματος [7]. Αλλά υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι τα αιμοπετάλια μπορεί να αλληλεπιδρά με το ανθρώπινο λεμφικό σύστημα και σε κακοήθη νόσο, και θα μπορούσε να διευκολύνει λεμφαγγειογένεση και μετάσταση όγκου [8], [9].

Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να διερευνηθεί ο ρόλος αιμοπεταλίων σε σχέση με λεμφαγγειογένεση σε ανθρώπινο καρκίνο του οισοφάγου.

Υλικά και Μέθοδοι

ασθενείς

Όλοι οι ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργική εκτομή του καρκινώματα του οισοφάγου ή γαστρο-οισοφαγική ένωση μεταξύ 1.992 και το 2011 στο Τμήμα Χειρουργικής, Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου της Βιέννης, συμπεριλήφθηκαν σε αυτή τη μελέτη, αν επαρκή ιστό και προεγχειρητική θρομβοπενική καταμέτρηση ήταν διαθέσιμα. Οι όγκοι όλων των ασθενών είχαν επαναξιολογούνται σύμφωνα με την UICC 7η έκδοση TNM στάσης.

Ηθική Δήλωση

έγκριση του διοικητικού συμβουλίου Θεσμικών επανεξέταση ελήφθη (επιτροπή δεοντολογίας του Ιατρικού Πανεπιστημίου της Βιέννης, στην Αυστρία, EK 1122/2009). Λόγω της αναδρομικής φύσης της παρούσας μελέτης, χρησιμοποιώντας μόνο αρχειοθετημένα ιστού, απαιτήθηκε και έλαβε καμία ενημερωμένη συγκατάθεση των ασθενών, όπως εγκρίθηκε από το διοικητικό συμβούλιο επανεξέτασης. Τα συγκεκριμένα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη έχουν ήδη χρησιμοποιηθεί σε προηγούμενες εκδόσεις [4], [10] – [15].

Ανάλυση του περιφερικού αίματος Αιμοπεταλίων (PBPC)

PBPC των ασθενών προσδιορίστηκε συνήθως πριν από την επέμβαση και πριν την έναρξη της εισαγωγική χημειοθεραπεία, εάν χορηγηθεί.

Ανάλυση των PBPC ήταν συνήθως πραγματοποιείται σε στάνταρ αυτοματοποιημένους αναλυτές αιματολογίας στο Τμήμα Εργαστηριακής Ιατρικής, Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου της Βιέννης. Κατά τη διάρκεια της περιόδου παρατήρησης 1992-2011 εφαρμόστηκαν οι ακόλουθες αιματολογικοί αναλυτές: μέχρι το 1995 Coulter STKS (Coulter, Hialeah, FL), 1995-2001 Sysmex NE-8000 (ΤΟΑ Medical Electronics, Kobe, Ιαπωνία), από το 2001 Sysmex XE- 2100 (Sysmex Corporation, Kobe, Japan).

ανοσοχρώση

ανοσοϊστοχημεία (IHC) εκτελέστηκε σε εγκλεισμένα σε παραφίνη δείγματα μονιμοποιήθηκαν σε 4% ρυθμισμένη φορμαλίνη, χρησιμοποιώντας τρεις μm πάχους ιστολογικών τομών.

Τα στοιχεία σχετικά με λεμφαγγείων αξιολογούνται από την αντι-podoplanin D2-40 μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (Ventana Medical Systems, Tucson, Αριζόνα) ήταν διαθέσιμα από προηγούμενες μελέτες [4], [15].

για την ανίχνευση θρομβοκυττάρων ανοσοχρώση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα μονοκλωνικό αντι CD61 αντίσωμα (NCL-CD61-308, Leica Biosystems, Newcastle, UK) σε αραίωση 1:1600. Μια Benchmark Ultra ανοσοκηλιδωτή (Ventana Medical Systems, Tucson, Αριζόνα) χρησιμοποιήθηκε για την ανοσοϊστοχημική

Ανάλυση της αντι-podoplanin ανοσοχρώση πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]:.

Εν συντομία, για τον καθορισμό της LMVD, η περιοχή εντός ή σε άμεση γειτνίαση με σχηματισμούς όγκου με τον μεγαλύτερο αριθμό ευδιάκριτα τόνισε μικροαγγείων ( «hot spot») επιλέχθηκε σε χαμηλή μεγέθυνση. LMVD στη συνέχεια προσδιορίζεται με καταμέτρηση όλων ανοσοχρωματίστηκε δοχεία, σε συνολική μεγέθυνση του x200 σε μια περιοχή εξέτασης του 0,25 mm

2. Μια υπόθεση θεωρήθηκε ως θετική σε σχέση με LVI, όταν σε σάρωση του συνόλου ανοσοχρωματίστηκε σύρετε μια συστάδα των κυττάρων του όγκου ήταν ορατή μέσα σε ένα podoplanin διακοσμημένο αγγειακό χώρο.

Για την ανάλυση των αντι-CD61 ανοσοχρώση, επιφανειακή, exulcerated ή αιμορραγία περιοχές όγκων αποκλείστηκαν από την ανάλυση. Ένας όγκος βαθμολογήθηκε ως θετικό για θρομβοπενική clusters σε πλοία (Κ.Ε.Κ.), εάν τουλάχιστον σε δύο πλοία, όπως συστάδες παρατηρήθηκαν (Εικόνα 1Α).

Α:. Αγγειακή θρομβοπενική cluster (ΚΕΚ) σε ένα οισοφάγου δείγμα καρκίνου (αρχική X400 μεγέθυνση). Β: στρωματικά θρομβοπενική cluster (STC) σε ένα οισοφάγου δείγμα καρκίνου αξιολογήθηκε με αντι – ανοσοχρώση CD61 (αρχική μεγέθυνση Χ400). C: οισοφάγου δείγμα καρκίνου με υψηλή λεμφικού μικροαγγειακή πυκνότητα (LMVD) αξιολογούνται από αντι-ανοσοχρώση podoplanin (αρχική μεγέθυνση x200). D: Lymphovascular εισβολή των κυττάρων του όγκου αξιολογήθηκε με αντι-podoplanin ανοσοχρώση (αρχική μεγέθυνση χ200). Ε: Διπλή χρώση για λεμφικών σκάφη που χρησιμοποιούν (κόκκινο, αντι-podoplanin) και αιμοπεταλίων (καφέ, αντι-CD61) (αρχική μεγέθυνση Χ400). F-Η: Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν τις μέσες τιμές ± 2 × τυπικό σφάλμα. μετρήσεις του περιφερικού αιμοπεταλίων (PBPC) ήταν σημαντικά υψηλότερη στα δείγματα με VTC (F). PBPC (G) και LMVD (H) ήταν σημαντικά υψηλότερη σε οισοφάγου δείγματα καρκίνου με STC.

Η

Ένας όγκος θεωρήθηκε ως δείχνοντας θρομβοπενική συμπλέγματα εντός του στρώματος του όγκου (STC), εάν υπάρχουν περισσότερες από μία κατηγορηματική CD61 ανοσοχρωματισμένες σύμπλεγμα ήταν ορατά εντός του στρώματος του όγκου (Εικ. 1Β).

Ανάλυση ανοσοϊστοχημεία έγινε από δύο ανεξάρτητους ερευνητές (SFS, PB) τύφλωσε με τα κλινικά δεδομένα. Θήκες με αποκλίνοντα αποτελέσματα αξιολογήθηκαν από κοινού χρήση ενός multiheaded μικροσκόπιο.

Στατιστική Ανάλυση

T-test, test Mann-Whitney, Χι τετράγωνη και δοκιμές γραμμικής παλινδρόμησης χρησιμοποιήθηκαν ως κατάλληλη. Όλοι οι αριθμοί που δίνονται είναι μέσες τιμές ± τυπικές αποκλίσεις, εάν δεν αναφέρεται διαφορετικά.

Συνολική επιβίωση (OS) ορίστηκε ως ο χρόνος μεταξύ πρωτογενών χειρουργείο και το θάνατο του ασθενούς, την επιβίωση μέχρι το τέλος της περιόδου παρατήρησης θεωρήθηκε ως λογοκριμένη παρατήρηση. Ελεύθερη νόσου επιβίωση (DFS) ορίστηκε ως χρόνος από την ημέρα της επέμβασης μέχρι την πρώτη ένδειξη της νόσου-εξέλιξης. Μονοπαραγοντική ανάλυση επιβίωσης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τεστ Breslow, πολυπαραγοντική ανάλυση με τη χρήση του μοντέλου Cox αναλογικότητας κινδύνους. Ασθενείς ηλικίας, ριζοσπαστικότητα της εκτομής, όγκου και το στάδιο λεμφαδένα (σύμφωνα με την τρέχουσα ταξινόμηση UICC), βαθμού του όγκου και την κατάσταση των λεμφαδένων συμπεριλήφθηκαν σε Cox παλινδρόμησης. Μια two-tailed p-τιμή ≤0.05 θεωρήθηκε ως σημαντική, SPSS 19.0 χρησιμοποιήθηκε για όλους τους υπολογισμούς.

Η ενδοθηλιακή Απομόνωση και καλλιέργεια κυττάρων

Πρωτογενή ενδοθηλιακά κύτταρα απομονώθηκαν από ανθρώπινο ακροποσθία δείγματα από πρωτεολυτική πέψη, και καθαρίζεται χρησιμοποιώντας αντι-CD31 αντίσωμα συζευγμένο μαγνητικά σφαιρίδια (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Οι απομονώσεις καλλιεργήθηκαν σε μικροαγγειακά ενδοθηλιακά μέσο ανάπτυξης EGM2-MV (Clonetics®, Lonza, Walkersville, MD) που περιέχει 1 μg /ml ινωδονεκτίνης, 5% FCS και ανθρώπινους παράγοντες ανάπτυξης, χωρίς την συμπλήρωση του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF). Για περαιτέρω διαχωρισμό του λεμφικού και του αίματος ενδοθηλιακά κύτταρα (LECs και BECs), εφαρμόστηκαν αντι-podoplanin αντίσωμα συζευγμένο μαγνητικά σφαιρίδια. Όλες οι απομονώσεις έδειξαν καθαρότητα ≥98% και η βιωσιμότητα.

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 1 × 10

5 σε 30 φρεάτια mm για 24 ώρες. Μετά από εκτεταμένη πλύση με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό, τα κύτταρα επωάστηκαν με 10

5-10

7 γέλη διηθείται αιμοπεταλίων σε ΕΒΜ-2 βασικό μέσο (Lonza) που περιέχει 0.5% FCS. Για πειράματα αποκλεισμού, τα ακόλουθα αντιδραστήρια προστέθηκαν σε συν-καλλιέργειες: κατσίκας αντι-ανθρώπινης ΡϋΟΡΡ-β εξουδετέρωσης IgG στο 1 μg /ml (R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ), ποντικού αντι-ανθρώπινο VEGFR-2 εξουδετέρωσης IgG

1 σε 50 ng /ml (R &? D Systems) και VEGFR-3 /ανθρώπινης Fc διαλυτό ανταγωνιστή σε 1 μg /ml (Cell Sciences, Canton, μΑ). Για αρνητικό έλεγχο, μη ειδική IgG αίγας, ποντικού IgG

1 και ανθρώπινη IgG εφαρμόστηκαν στις ίδιες συγκεντρώσεις.

ανάλυση κυττάρων διεξήχθη μετά από 24 έως 72 ώρες. Ψηφιακές εικόνες των κυττάρων ελήφθησαν με ένα μικροσκόπιο Axiovert 40CFL (Zeiss, Oberkochen, Germany). Τα κύτταρα στη συνέχεια απελευθερώνεται από τις πλάκες καλλιέργειας με θρυψινοποίηση και ο αριθμός των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας βαφή κυανούν τρυπανίου. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται αντιπροσωπεύουν μέση τιμή και την τυπική απόκλιση των δειγμάτων εις τριπλούν. Κάθε πείραμα διεξήχθη ≥3 φορές με LEC απομονώσεις από διαφορετικούς δότες.

αιμοπεταλίων Απομόνωση

φλεβικού αίματος από υγιείς εθελοντές σε σωληνάρια κιτρικού νατρίου και υποβλήθηκε σε φυγοκέντρηση στα 85 χ g και RT για 20 λεπτά. Το ληφθέν υπερκείμενο πλούσιο σε αιμοπετάλια πλάσμα υποβλήθηκε σε καθαρισμό με διήθηση σε πήκτωμα χρησιμοποιώντας Sepharose 2Β (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ). Η ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων κατά τη διάρκεια καθαρισμού αναστάλθηκε με 100 μΜ προσταγλανδίνης Ε1. Μετά από φυγοκέντρηση των αιμοπεταλίων γέλη διηθείται στους 3000 χ g και θερμοκρασία δωματίου για 1.5 λεπτά, τα αιμοπετάλια επαναιωρήθηκαν σε ΕΒΜ-2 μέσο που περιέχει 0,5% FCS και η συγκέντρωση των αιμοπεταλίων προσδιορίσθηκε με ένα μετρητή Sysmex (Kobe, Japan).

φορμαζάνης βάση κυτταρικού πολλαπλασιασμού δοκιμασία

το μη-ραδιενεργό πολλαπλασιασμό των κυττάρων και προσδιορισμός κυτταροτοξικότητας (EZ4U®, Biomedica, Βιέννη, Αυστρία) χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η μεταβολική δραστηριότητα των LECs από τετραζολίου μείωση. 100 μΐ του διαλυμένου χρωμογόνου υποστρώματος προστέθηκαν σε κάθε 30 πιπί και επωάζονται στους 37 ° C για 2 ώρες. Στη συνέχεια, το υπερκείμενο καλλιέργειας ανακτήθηκε και η απορρόφηση στα 450 nm μετρήθηκε με αναγνώστη πλακός Varioskan Flash (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, ΜΑ).

Μετρήσεις Παράγοντα Ανάπτυξης

Συνεργασίας υπερκείμενα καλλιέργειας αναλύθηκαν για την περιεκτικότητα του VEGF-A, -C, -D και PDGF-ΒΒ από ανοσορροφητική δοκιμασία συνδεδεμένη με ένζυμο (Quantikine? R &? D Systems) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή

Αποτελέσματα

.

χειρουργικά δείγματα

Συνολικά, 320 επεμβατική οισοφάγου καρκίνων συμπεριλήφθηκαν σε αυτή τη μελέτη: 184 αδενοκαρκινώματα (AC), και 136 πλακωδών κυττάρων καρκινώματα (SCC)

τα κλινικά δεδομένα των ασθενών είναι. καταρτίζονται στον πίνακα 1, εισαγωγική χημειοθεραπεία πριν από την εγχείριση χορηγήθηκε σε 98 ασθενείς. Για τους υπολογισμούς, σε αυτούς τους ασθενείς γενικά PBPC πριν χρησιμοποιήθηκαν έναρξη της εισαγωγική χημειοθεραπεία. Σε 11 ασθενείς, δεν υπάρχουν στοιχεία για PBPC πριν εισαγωγική χημειοθεραπεία ήταν διαθέσιμα. Δεδομένου ότι καμία σημαντική διαφορά στην PBPC πριν και μετά την εισαγωγική χημειοθεραπεία βρέθηκε στα υπόλοιπα 87 ασθενείς (ρ & gt? 0,05, t-test), PBPC μετά εισαγωγική χημειοθεραπεία (αμέσως πριν την επέμβαση) χρησιμοποιήθηκαν σε αυτούς τους ασθενείς για ανάλυση. STC ήταν παρόντες σε 82 δείγματα (25,6%? 36 AC, 46 SCC), VTC σε 56 (17,5%, 22 AC, 34 SCC). Σχήμα 1 δίνει δείγματα ανοσοχρώση. Σε γενικές γραμμές, STC (p = 0,004, Πλατεία Chi δοκιμή) και VTC (p = 0.002, Chi square test) ήταν πιο συχνές σε SCC σε σύγκριση με το AC. Μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ των CFP παρουσία και τυποποιημένες ρήτρες παρατηρήθηκε σε έρευνα όλων των περιπτώσεων και σε έρευνα της AC και SCC ξεχωριστά. (P & lt? 0.001, αντίστοιχα, Chi square test)

Η

Αν και καμία συσχέτιση της παρουσία STC με σταδιοποίηση όγκου και ιστολογική διαβάθμιση παρατηρήθηκε σε όλες τις περιπτώσεις και AC, σε SCC πιο προηγμένη κατάσταση λεμφαδένων παρατηρήθηκε σε όγκους με STC (διάμεσος του ρΝ1 και στις δύο περιπτώσεις, ρ = 0,024, Mann Whitney τεστ).

Η παρουσία του Κ.Ε.Κ. συσχετίστηκε με πιο προχωρημένο στάδιο του όγκου σε όλες τις περιπτώσεις (διάμεσος των ρΤ3 και στις δύο περιπτώσεις με μια τάση προς υψηλότερα στάσης σε ασθενείς με ΚΕΚ, p = 0,036, Mann Whitney test), αλλά η συσχέτιση αυτή δεν θεωρήθηκε κατά τη διερεύνηση AC και SCC ξεχωριστά.

PBPC ήταν υψηλότερες σε περιπτώσεις με ΚΕΚ σε διερεύνηση όλων των υποθέσεων (275 ± 83 έναντι 250 ± 79 g /L, p = 0,001, t-test) (Εικ. 1F ), αλλά η συσχέτιση αυτή παρατηρήθηκε σε ξεχωριστή έρευνα τύπων όγκων μόνο σε SCC (282 ± 75 έναντι 243 ± 81 G /l? ρ = 0.007, t-test), αλλά όχι σε AC (ρ = 0.077, t-test) . Καμία συσχέτιση των ΚΕΚ με LMVD παρατηρήθηκε σε όλες τις περιπτώσεις και AC και SCC ξεχωριστά. (P & gt? 0,05, t-test).

Η παρουσία του STC σχετίστηκε με υψηλότερη PBPC σε διερεύνηση όλων των υποθέσεων σε σύγκριση με ασθενείς χωρίς STC (279 ± 88 G /l έναντι 246 ± 76 G /l? ρ = 0.001, t-test) (Εικ 1G).. Σε έρευνα τύπων όγκων χωριστά, μια τέτοια ένωση βρέθηκε μόνο σε SCC (282 ± 75 g /l έναντι 243 ± 82 g /L, ρ = 0.007, t-test), αλλά έχασε σημασία σε AC (274 ± 101 G /l έναντι 247 ± 73 g /l, p = 0.077, t-test). Η παρουσία του STC σχετίστηκε με υψηλότερη LMVD σε όλες τις περιπτώσεις (16 ± 7 έναντι 12 ± 5 μικροαγγείων /τομέα? P & lt? 0.001, t-test) (Εικ. 1), καθώς και για το εναλλασσόμενο ρεύμα (16 ± 6 έναντι 12 ± 5 μικροαγγείων /πεδίο, σ & lt? 0.001, t-test) και SCC (17 ± 7 έναντι 13 ± 6, p = 0,002, t-test) ξεχωριστά

Δεν υπάρχει άμεση συσχέτιση της STC ή VTC με LVI. παρατηρήθηκε (ρ & gt? 0,05, Chi square test)., αλλά σε ένα γραμμικό μοντέλο παλινδρόμησης με LVI ως εξαρτημένη μεταβλητή και περιλαμβάνει PBPC, STC και VTC έδειξε ότι PBPC (ρ = 0,035, συντελεστής παλινδρόμησης & lt? 0.001) και VTC (p = 0,018, συντελεστής παλινδρόμησης 0,175) συσχετίστηκαν με LVI.

σε ένα δεύτερο μοντέλο γραμμικής παλινδρόμησης χρησιμοποιώντας LMVD ως εξαρτημένη μεταβλητή, συμπεριλαμβανομένων των ίδιων των ανεξάρτητων μεταβλητών, και πάλι PBPC (p = 0,034, συντελεστής παλινδρόμησης -0,009) και STC. (p & lt? 0.001, συντελεστής παλινδρόμησης 5.415) επηρεάζεται LMVD

Ανάλυση επιβίωσης

Μέσος χρόνος παρακολούθησης ήταν 50 ± 3 (τυπικό σφάλμα) μήνες, κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου παρατήρησης, 154 ασθενείς (48,1 %) ανέπτυξε υποτροπιάζουσα νόσο και 131 (40,9%) έχασαν τη ζωή τους.

Η παρουσία του STC σχετίστηκε με μικρότερη DFS όλων των περιπτώσεων σε μονοπαραγοντική ανάλυση (p = 0,036, δοκιμή Breslow, Εικ. 2Α). Σε έρευνα τύπων όγκων χωριστά, καμία τέτοια επίδραση βρέθηκε σε AC, αλλά σε ανάλυση του SCC (p = 0,037, δοκιμή Breslow, Σχ. 2Β). STC συσχετίστηκαν με μικρότερη DFS σε πολυπαραγοντική ανάλυση των AC (p = 0,022, Cox παλινδρόμησης, πίνακας 2, σχήμα 2C.)

2Α:. Παρουσία των στρωματικών θρομβοπενική clusters (STC) σχετίστηκε με μικρότερη DFS σε κάθε περίπτωση. Σε έρευνα τύπων όγκων χωριστά, STC σχετίστηκε με μικρότερη DFS σε καρκίνο πλακωδών κυττάρων (SCC) (Σχ. 2Β), καθώς και σε αδενοκαρκίνωμα (AC) (Σχ. 2C). Σύκο. 2D: Παρουσία των αγγειακών θρομβοπενική clusters (ΚΕΚ) σχετίστηκε με μικρότερη DFS σε SCC. Σύκο. 2Ε: Παραδόξως, VTC συσχετίστηκε με σημαντικά μεγαλύτερο DFS στο AC στην πολυπαραγοντική ανάλυση. Παρ ‘όλα αυτά, σημειώστε ότι μόνο σχετικά λίγα γεγονότα φαίνεται στην καμπύλη VTC +, και οι καμπύλες διασχίζουν ο ένας τον άλλο πάνω, δικαιούνται αυτή τη διαπίστωση. Σύκο. 2F: VTC σχετίστηκε με μικρότερη OS σε SCC

Η

Καμία επίδραση της STC παρατηρήθηκε σε OS σε διερεύνηση όλων των υποθέσεων, καθώς και σε έρευνα της AC και SCC ξεχωριστά (p & gt? 0,05. , τεστ Breslow ή Cox παλινδρόμησης, αντίστοιχα?. πίνακα 2)

Δεν ενδιαφέρον των ΚΕΚ σε DFS παρατηρήθηκε σε έρευνα όλων των περιπτώσεων. Σε έρευνα της AC και SCC ξεχωριστά, VTC σχετίστηκε με μικρότερη DFS στην μονοπαραγοντική ανάλυση SCC (p = 0,025, δοκιμή Breslow, διάμεση DFS 506 ± 82 έναντι 794 ± 139 ημέρες? Σχ. 2D), αλλά συνδέονται με την πλέον DFS σε πολυπαραγοντική ανάλυση των AC (p = 0,008, Cox παλινδρόμησης, η διάμεση DFS 2928 ± 990 έναντι 700 ± 141 ημέρες? Σχήμα 2Ε). Παρουσία του ΚΕΚ συσχετίστηκε επίσης με σημαντικά μικρότερη OS σε SCC (p = 0,049, δοκιμή Breslow, Σχήμα 2F.)

PBPC ήταν που δεν συνδέονται με DFS ή OS σε uni-ή πολυπαραγοντική ανάλυση (p & gt?. 0.05, ομοιόμορφη ή πολυμεταβλητή παλινδρόμηση Cox, αντίστοιχα).

Cell Culture

LECs σπάρθηκαν σε 1 × 10∧5 ανά 30 πιπί, και μετά από 24 ώρες απομονώθηκε αιμοπετάλια προστέθηκαν σε 3 × 10 ∧7, 10∧6 ή 10∧5 ανά φρεάτιο και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για άλλες 48 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α-Ε, LEC κυττάρων αυξήθηκε με τον αριθμό των προστιθέμενων απομονωμένων αιμοπεταλίων, υποδεικνύοντας ότι LEC πολλαπλασιασμός ενισχύεται από συν-καλλιέργεια με ανθρώπινα αιμοπετάλια με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο

Α:. LEC πολλαπλασιασμός ενισχύεται από συν-καλλιέργεια με ανθρώπινα αιμοπετάλια με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. LECs σπάρθηκαν σε 1 × 10∧5 ανά 30 χιλιοστά καλά. Μετά από 24 ώρες απομονώθηκαν αιμοπετάλια προστέθηκαν σε 3 χ 10∧7, 10∧6 ή 10∧5 ανά φρεάτιο και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για άλλες 48 ώρες. Για την ποσοτικοποίηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, ο LEC καταμέτρηση προσδιορίστηκε (μαύρες μπάρες, δεξιά κλίμακα) και μεταβολική δραστηριότητα μετρήθηκε με τετραζολίου δοκιμασία μείωσης (λευκές ράβδοι, αριστερά κλίμακα). Β-Ε: Αντίστοιχη μικροσκοπικές εικόνες σε Α: Β: Έλεγχος? C: ΕΚ + Px10∧7, D: ΕΚ + Px10∧6, Ε: ΕΚ + Px10∧5. F: LEC πολλαπλασιασμός ενισχύεται από συν-καλλιέργεια με ανθρώπινα αιμοπετάλια σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. LECs σπάρθηκαν σε 1 × 10∧5 ανά 30 χιλιοστά καλά. 24 ώρες μετά απομονώθηκαν αιμοπετάλια προστέθηκαν σε 1 × 10∧7 ανά φρεάτιο και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν επί άλλες 24, 48 και 72 ώρες. Οι αριθμοί κυττάρων προσδιορίστηκαν για LEC-αιμοπεταλίων συν-καλλιέργειες (συνεχής γραμμή) σε σύγκριση με LECs χωρίς προσθήκη αιμοπεταλίων (διακεκομμένη γραμμή). G + H: Ανάπτυξη απελευθέρωση του παράγοντα κατά τη διάρκεια της συν-καλλιέργεια των LECs και ανθρώπινα αιμοπετάλια. LECs σπάρθηκαν σε 1 × 10∧5 ανά 30 χιλιοστά καλά. Μετά από 24 ώρες απομονώθηκαν αιμοπετάλια προστέθηκαν σε 7 × 10∧7, 10∧6 ή 10∧5 ανά φρεάτιο και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για άλλες 48 ώρες. Υπερκείμενο καλλιέργειας συλλέχθηκε, φυγοκεντρήθηκε (για την απομάκρυνση κυτταρικών συστατικών) και στη συνέχεια αναλύθηκαν για τη συγκέντρωση του PDGF-ΒΒ (G) και VEGF-C (H) με ανοσορροφητική δοκιμασία συνδεδεμένη με ένζυμο. I: πολλαπλασιασμός των αιμοπεταλίων που προκαλείται από LEC διαμεσολαβείται από PDGFRβ, VEGFR-2 και -3. LECs σπάρθηκαν σε 1 × 10∧5 ανά 30 χιλιοστά καλά. Μετά από 24 ώρες απομονώθηκαν αιμοπετάλια προστέθηκαν σε 7 × 10∧7 ανά φρεάτιο με ή χωρίς αντιδραστήρια μπλοκαρίσματος ενάντια PDGFRß, VEGFR-2 και /ή VEGFR-3. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για άλλες 48 ώρες πριν από τον προσδιορισμό LEC μετρήσεις.

Η

Ως δεύτερο πείραμα, ερευνήσαμε αν πολλαπλασιασμός LEC ενισχύεται από ανθρώπινα αιμοπετάλια σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Για το σκοπό αυτό, τα αιμοπετάλια σε 1 × 10∧7 ανά φρεάτιο προστέθηκαν σε απομονωμένα LECs (1 × 10∧5 ανά 30 mm) και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για άλλες 24, 48 και 72 ώρες. Σύκο. 3F δείχνει ότι LEC πολλαπλασιασμός ενισχύεται από συν-καλλιέργεια με ανθρώπινα αιμοπετάλια σε ένα χρονοεξαρτώμενο τρόπο σε σύγκριση με LECs χωρίς προσθήκη των αιμοπεταλίων.

Ως επόμενο βήμα, ερευνήσαμε αν τα προ-lymphangiogenic παράγοντες απελευθερώνονται κατά τη διάρκεια συν-καλλιέργεια της LECs και αιμοπετάλια. Απομονωμένα αιμοπετάλια προστέθηκαν σε 7 × 10∧7, 10∧6 ή 10∧5 ανά φρεάτιο να LECs (1 χ 10∧5 ανά 30 mm) μετά από 24 ώρες, και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για άλλες 48 ώρες. Υπερκείμενο καλλιέργειας συλλέχθηκε, φυγοκεντρήθηκε για την απομάκρυνση των κυτταρικών συστατικών και στη συνέχεια αναλύθηκε για τη συγκέντρωση του ΡϋΟΡ-ΒΒ και VEGF-C με ανοσορροφητική δοκιμασία συνδεδεμένη με ένζυμο.

Σχήμα 3G και 3Η δείχνουν ότι σε συγκέντρωση αιμοπεταλίων του 10∧ 6, PDGFR-β και VEGF-C αφέθηκαν ελεύθεροι, και αυτό απελευθέρωση αυξητικών παραγόντων ήταν έντονα αυξήθηκε σε συγκέντρωση αιμοπεταλίων 10∧7

Ως τελευταίο βήμα, τα πειράματα αποκλεισμού πραγματοποιήθηκαν:.

LECs σπάρθηκαν σε 1 × 10∧5 ανά 30 χιλιοστά καλά. Μετά από 24 ώρες απομονώθηκαν αιμοπετάλια προστέθηκαν σε 7 × 10∧7 ανά φρεάτιο με ή χωρίς αντιδραστήρια μπλοκαρίσματος ενάντια PDGFRß, VEGFR-2 και /ή VEGFR-3. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για άλλες 48 ώρες πριν από τον προσδιορισμό LEC μετρήσεις. Σύκο. 3I δείχνει ότι ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων LEC εν μέρει μειώνεται με την προσθήκη των μεμονωμένων ενώσεων σε σύγκριση με LEC /αιμοπεταλίων συν-καλλιέργειας χωρίς κλείδωμα ουσίες. Αναστολή της VEGFR-3 (αποκλεισμού σηματοδότηση VEGF-C) ήταν πιο ισχυροί και μείωσε τον πολλαπλασιασμό LEC που προκαλούνται από αιμοπετάλια κατά 90%. Αυτό το αποτέλεσμα δεν θα μπορούσε να ενισχυθεί περαιτέρω με συνδυασμό με αντι-PDGFRß και αντι VEGFR-2-αντισώματα

Συζήτηση

Τα αιμοπετάλια παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανθρώπινη κακοήθη ασθένεια:. Έτσι έχει αποδειχθεί σε πολλές μελέτες που προεγχειρητική αυξημένη μέτρηση περιφερικού αιμοπεταλίων προβλέπει κακή πρόγνωση σε ποικιλία καρκίνων του ανθρώπου [17] μεταξύ των οποίων και γαστρικού καρκίνου [18].

καρκίνο του οισοφάγου (SCC και AC), μια αύξηση του αριθμού των αιμοπεταλίων μετά en bloc εκτομή έχει αναφερθεί ότι σχετίζεται με καλύτερη πρόγνωση σε μία μελέτη [19], και σε μία μελέτη από το Πακιστάν, χαμηλό προεγχειρητικό αριθμό των αιμοπεταλίων συσχετίστηκαν με φτωχή πρόγνωση [20]. Σε αντίθεση, μια άλλη μελέτη διαπίστωσε ότι η προεγχειρητική θρομβοκυττάρωση αναφέρεται φτωχή πρόγνωση σε οισοφάγου SCC [20].

Παρ ‘όλα αυτά, δεν είναι εντελώς σαφές αν ο αυξημένος αριθμός αιμοπεταλίων που προκαλείται από μια πιο επιθετική φαινότυπο των όγκων, ή να συμβάλουν οι ίδιοι στην κλινική συμπεριφορά των όγκων. Πιθανότατα οι όγκοι μπορεί να προκαλέσουν thrombopoesis άμεσα π.χ. μέσω παράγοντας όπως η IL-6 [21].

Τα αιμοπετάλια φαίνεται επίσης να προωθήσει την μετάσταση, αλλά οι ακριβείς μηχανισμοί είναι ακόμα ασαφείς [22], [23].

Τα αιμοπετάλια παίζουν επίσης ρόλο στην αγγειογένεση όγκου μετά την ενεργοποίηση, π.χ. σε απόκριση στα ενδοθηλιακά βλάβη [24]. Αυτή η επίδραση φαίνεται να επάγεται όχι μόνο από την έκκριση των αιμοπεταλίων παράγοντας, αλλά επίσης και με άμεση διέγερση της αγγειογένεσης [25].

Είναι γνωστό ότι η περιφερική ανθρώπινα αιμοπετάλια είναι σε θέση να εκκρίνουν προ-lymphangiogenic παράγοντες όπως VEGF-C και PDGFR-Β, που απελευθερώνονται κατά την ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων [26]. Επιπλέον, τα αιμοπετάλια παίζουν σημαντικό ρόλο στην εμβρυϊκή ανάπτυξη του λεμφικού συστήματος [7]. Έτσι έχουν αναφερθεί ότι αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των λεμφικών ενδοθηλιακών κυττάρων κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη κατά την ενεργοποίηση από την αλληλεπίδραση του CLEC2 και podoplanin, η οποία εκφράζεται σε λεμφικά ενδοθηλιακά κύτταρα [27].

κακοήθης νόσος, η αλληλεπίδραση μεταξύ αιμοπετάλια και podoplanin μέσω CLEC-2 επάγει έναν αριθμό οδών που εμπλέκονται στην μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και ανάπτυξη [28].

Αναπάντεχα, με τις γνώσεις μας δεν υπάρχουν στοιχεία σχετικά με το ρόλο των αιμοπεταλίων στο λεμφαγγειογένεση στην ανθρώπινη κακοήθη ασθένεια έτσι μακριά.

στην παρούσα μελέτη μας, μελετήσαμε σε μια μεγάλη σειρά του οισοφάγου η ένωση των PBPC με αιμοπετάλια στα καρκινικά αγγεία, εντός του στρώματος του όγκου και με λεμφαγγειογένεσης.

Περιεγχειρητική PBPC συνδέθηκαν με την παρουσία των αιμοπεταλίων εντός του ιστού του όγκου, και τα αιμοπετάλια εντός του ιστού του όγκου που σχετίζεται με αυξημένη λεμφαγγειογένεση. Ενώ δεν υπάρχει άμεση συσχέτιση της STC ή ΚΕΚ με LVI των καρκινικών κυττάρων παρατηρήθηκε, PBPC και VTC επηρεάζεται LVI σε analysis.This παλινδρόμησης δείχνει ότι μια σύνθετη αλληλεπίδραση μεταξύ PBPC, ΚΕΚ και STC προωθεί LVI των καρκινικών κυττάρων.

Για να διερευνήσει τα ευρήματά μας με λεπτομέρεια

in vitro

, εκτελέσαμε πειράματα καλλιέργειας κυττάρων, δείχνοντας ότι τα αιμοπετάλια την προώθηση της ανάπτυξης του LECs σε μια δόση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Αυτή η επαγωγή του LEC ανάπτυξη φαίνεται να επάγεται από έκκριση προ-lymphangiogenic παράγοντες όπως VEGF-C και PDGF-ΒΒ.

Έτσι τα ευρήματά μας θα μπορούσε να είναι μια πιθανή εξήγηση γιατί αυξημένη προεγχειρητική PBPC σχετίζονται με μειωμένη πρόγνωση σε ένα ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων, αν και αυτό δεν ήταν εμφανές στη μελέτη μας. Αν και podoplanin αλληλεπιδρά με τα αιμοπετάλια κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης, μια αλληλεπίδραση μεταξύ λεμφικά ενδοθηλιακά κύτταρα και αιμοπετάλια δεν έχει περιγραφεί προηγουμένως. Αυτό μπορεί να εξηγηθεί από το γεγονός ότι θρομβοκυττάρων δεν βρίσκονται εντός του λεμφικού αγγειακού συστήματος. Παρ ‘όλα αυτά, τα αιμοπετάλια να διευκολύνει την εξαγγείωση από την απελευθέρωση των μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας και με διέγερση του όγκου και ενδοθηλιακών κυττάρων [28]. Όπως εμφανής στη μελέτη μας, οι συστάδες των αιμοπεταλίων μπορεί να βρεθεί, επίσης, όχι μόνο στο εσωτερικό των αιμοφόρων αγγείων, αλλά και στο εσωτερικό του στρώματος του όγκου, υποδεικνύοντας διαρροή σκάφη. Από αγγειακές και στρωματικών αιμοπεταλίων συστάδες συσχετίζονται, η μετανάστευση των αιμοπεταλίων από τα πλοία φαίνεται να επάγεται από αγγειακή συστάδες. Οι lymphangiogenic παράγοντες που εκκρίνονται εντός του στρώματος με εξαγγειωμένα αιμοπετάλια θα μπορούσε να προκαλέσει αύξηση του λεμφικού ενδοθηλίου, υποστηρίζοντας έτσι το σχηματισμό νεοσύστατου λεμφαγγείων.

Α δείχνεται σε πειράματα καλλιέργειας κυττάρων μας, αυτή η διέγερση του πολλαπλασιασμού των LECs από τα αιμοπετάλια φαίνεται να επαχθεί σε ένα χρόνο και την εξαρτώμενη από τη δόση τρόπο κυρίως από VEGF-C και PDGF-ΒΒ, που εκκρίνονται από τα αιμοπετάλια. Αποκλεισμός πειράματα υποδεικνύουν κυρίαρχο ρόλο του VEGF-C σε αυτή τη διαδικασία.

Όπως αναφέρεται σε μια ποικιλία μελετών, η αύξηση των λεμφαγγείων συσχετίζεται με την πιθανότητα να αναπτύξουν LVI και μετέπειτα μεταστάσεις λεμφαδένα. [29] – [34]. Το γεγονός ότι τα αιμοπετάλια προάγουν την εξαγγείωση των καρκινικών κυττάρων είναι πολύ γνωστή [17], αλλά με βάση τα δεδομένα μας φαίνεται ότι είναι πολύ πιθανό ότι τα αιμοπετάλια στο στρώμα του όγκου προωθούν επίσης εισβολή των καρκινικών κυττάρων στο lymphovascular σύστημα

εν περιλήψει, δείχνουμε για πρώτη φορά σε μεγάλη σειρά ασθενών με καρκίνο του ανθρώπου και επίσης

in vitro

ότι τα αιμοπετάλια του περιφερικού αίματος διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην οισοφάγου λεμφαγγειογένεση καρκίνο και LVI, επηρεάζοντας έτσι την πρόγνωση του ασθενείς. Έτσι, η διακοπή των μονοπατιών μεταξύ των αιμοπεταλίων, τα καρκινικά κύτταρα και του λεμφικού ενδοθηλίου σηματοδότησης μπορεί να είναι επωφελής για τους ασθενείς.