Αφηρημένο

CD47 είναι μια ευρέως εκφραζόμενη πρωτεΐνη κυτταρικής επιφάνειας που λειτουργεί ως ρυθμιστής της φαγοκυττάρωση που διαμεσολαβείται από τα κύτταρα του έμφυτο ανοσοποιητικό σύστημα, όπως είναι τα μακροφάγα και τα δενδριτικά κύτταρα. CD47 χρησιμεύει ως πρόσδεμα για έναν υποδοχέα επί αυτών έμφυτο ανοσοποιητικό κύτταρα, SIRP-αλφα, το οποίο με τη σειρά του παραδίδει ένα ανασταλτικό σήμα για φαγοκυττάρωση. Βρήκαμε προηγουμένως αυξημένη έκφραση του CD47 σε πρωτογενή ανθρώπινης οξείας μυελοειδούς λευχαιμίας (AML) βλαστοκύτταρα, και απέδειξαν ότι η αναστολή μονοκλωνικά αντισώματα που κατευθύνονται έναντι CD47 επέτρεψε την φαγοκυττάρωση και την εξάλειψη της AML, λέμφωμα μη Hodgkin (NHL), και πολλές συμπαγείς όγκους σε ξενομοσχεύματος μοντέλα. Εδώ, αναφέρουμε την ανάπτυξη ενός εξανθρωπισμένου αντι-CD47 αντίσωμα με ισχυρούς αποτελεσματικότητα και την ευνοϊκή τοξικοκινητικές ιδιότητες ως υποψήφια θεραπευτική. Μια νέα μονοκλωνικά αντι-ανθρώπινο αντίσωμα CD47, 5F9, δημιουργήθηκε και εξανθρωπισμός αντισωμάτων διεξήχθη με εμβολιασμό συμπληρωματικότητα της περιοχές καθορισμού (CDR) σε μια μορφή ανθρώπινης IgG4. Το προκύπτον εξανθρωπισμένο αντίσωμα 5F9 (Hu5F9-G4) δεσμεύεται μονομερική ανθρώπινη CD47 με 8 ηΜ συγγένειας. Hu5F9-G4 επαγόμενη ισχυρός μακροφάγων διαμεσολαβείται φαγοκυττάρωση των πρωτογενών ανθρώπινων κυττάρων AML in vitro και εντελώς εξαλειφθεί ανθρώπινη AML in vivo, οδηγώντας σε μακροχρόνια ελεύθερη νόσου επιβίωση ξενομοσχευμάτων ασθενή προέλευσης. Επιπλέον, Hu5F9-G4 synergized με rituximab για την εξάλειψη NHL μεταμόσχευση και θεραπεία ξενομοσχεύτηκε ποντίκια. Τέλος, τοξικοκινητικές μελέτες σε μη ανθρώπινα πρωτεύοντα έδειξαν ότι Hu5F9-G4 θα μπορούσαν να χορηγηθεί με ασφάλεια ενδοφλεβίως σε δόσεις σε θέση να επιτύχει δυνητικά θεραπευτικά επίπεδα στον ορό. Έτσι, Hu5F9-G4 ενεργά αναπτύσσονται για και έχει τεθεί σε κλινικές δοκιμές σε ασθενείς με AML και συμπαγείς όγκους (ClinicalTrials.gov αναγνωριστικό: NCT02216409).

Παράθεση: Liu J, Wang L, Zhao F, Tseng S, Narayanan C, Σούρα L, et al. (2015) Προ-κλινική ανάπτυξη ενός εξανθρωπισμένου αντι-CD47 αντίσωμα με Anti-Cancer θεραπευτικές δυνατότητες. PLoS ONE 10 (9): e0137345. doi: 10.1371 /journal.pone.0137345

Συντάκτης: Kevin D. Bunting, Πανεπιστήμιο Emory, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 2 Ιουν 2015? Αποδεκτές: 14 Αυγούστου, 2015? Δημοσιεύθηκε: 21, Σεπτέμβρη 2015

Copyright: © 2015 Liu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

χρηματοδότηση:.. η εργασία αυτή υποστηρίζεται από μια επιχορήγηση από το California Institute for αναγεννητικής Ιατρικής και χρηματοδότηση από την Βιρτζίνια και DK Ταμείο Ludwig για την Έρευνα του Καρκίνου

οι ανταγωνιστικές ενδιαφέροντα: JL, RM, και ILW έχουν καταθέσει Διεθνούς Διπλώματος Ευρεσιτεχνίας WO 2011/143624 Α2 ​​τίτλο «Εξανθρωπισμένα και χιμαιρικά μονοκλωνικά αντισώματα προς CD47». JL, RM, ILW, SW, JV, ΜΗ, και SP έχουν κατατεθεί αριθμό U.S. αίτηση διπλώματος ευρεσιτεχνίας PCT /US2014 /018743 με τίτλο «Μέθοδοι για την επίτευξη θεραπευτικά αποτελεσματικές δόσεις του αντι-παραγόντων CD47». Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Η ανάπτυξη του καρκίνου απαιτεί φυσιολογικά κύτταρα να αποκτήσουν μεθόδους για να dysregulate πολλαπλασιασμό, την αποφυγή προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο, και να αποκτήσουν πολλά από τα άλλα χαρακτηριστικά του καρκίνου [1]. Επιπλέον, τα καρκινικά κύτταρα πρέπει να αποφύγει προγραμματισμένο απομάκρυνση των κυττάρων, η οποία είναι η φαγοκυτταρική εξάλειψη των αποκλινόντων κυττάρων από κύτταρα του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος, συμπεριλαμβανομένων των μακροφάγων, των δενδριτικών κυττάρων, και ουδετεροφίλων [2]. Η διέγερση του προγραμματισμένου αφαίρεσης κυττάρου χρησιμοποιεί έναν αριθμό προ-φαγοκυτταρικά σήματα, πολλά από τα οποία δεν έχουν μοριακά χαρακτηριζόμενη, αλλά μπορεί να περιλαμβάνουν σήματα πρωτεΐνης όπως Καλρετικουλίνης [3], φωσφολιπίδια όπως φωσφατιδυλοσερίνη, και μη φυσιολογική γλυκοζυλίωση. Ωστόσο, η αναστολή του προγραμματισμένου αφαίρεσης κυττάρου αναστέλλεται κατά κύριο λόγο από ένα μόνο κυρίαρχο μόριο, CD47. Όλα ανθρώπινων καρκίνων έχουν μελετηθεί μέχρι σήμερα, συμπεριλαμβανομένων τόσο συμπαγείς όγκους και λευχαιμία, εκφράζουν CD47, κάνοντας CD47 μια καθολική στόχο στον ανθρώπινο καρκίνο.

Ανθρώπινο οξεία μυελοειδή λευχαιμία (AML) είναι μια επιθετική κακοήθεια των προγονικών κυττάρων του μυελού των οστών, που χαρακτηρίζεται από μια αύξηση στην ανώριμα λευκά αιμοσφαίρια και αποτυχία του μυελού των οστών. AML είναι ο πιο κοινός τύπος της οξείας λευχαιμίας ενηλίκων επηρεάζουν, με κακή πρόγνωση και λίγες θεραπευτικές επιλογές. Τρέχον πρότυπο της περίθαλψης για υγιείς ασθενείς AML αποτελείται από χημειοθεραπεία υψηλής δόσης, που συχνά περιλαμβάνουν αλλογενή μεταμόσχευση αιμοποιητικών κυττάρων. Ακόμη και με αυτές τις επιθετικές θεραπείες, οι οποίες προκαλούν σημαντική νοσηρότητα και θνησιμότητα, η υποτροπή είναι κοινή και πέντε χρόνια συνολική επιβίωση είναι μόνο 30-40%. Επιπλέον, η πλειοψηφία των ασθενών είναι πάνω από την ηλικία των 65 ετών και δεν είναι υποψήφιοι για χημειοθεραπεία υψηλής δόσης, οδηγώντας σε μια πενταετή συνολική επιβίωση 5-10% αυτής της ομάδας [4,5].

Πρόσφατα μελέτες έχουν δείξει ότι AML οργανώνεται ως ένα κυτταρικό ιεραρχία ξεκίνησε και συντηρείται από λευχαιμία βλαστικά κύτταρα (LSC), τα οποία διαθέτουν τις κανονικές ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων των αυτο-ανανέωση και την ικανότητα να παράγουν τεράστιους αριθμούς των λευχαιμικών προγονικών κυττάρων και εκρήξεις [6,7]. Μια βασική επίπτωση αυτού του μοντέλου καρκίνου των βλαστικών κυττάρων είναι ότι LSC πρέπει να εξαλειφθούν για τη θεραπεία? Ωστόσο, LSC κατέδειξαν αντίσταση στην συνήθη χημειοθεραπεία και θεραπεία ακτινοβολίας [8,9]. Ταυτοποίηση των μορίων κυτταρικής επιφάνειας εκφράζονται κατά προτίμηση σε κλινικά σχετικές βλαστικά κύτταρα AML προσφέρει μία ελκυστική στρατηγική για την ανάπτυξη νέων θεραπειών AML, όπως αυτά τα μόρια κυτταρικής επιφάνειας μπορούν να χρησιμεύσουν ως πιθανοί στόχοι για θεραπεία με μονοκλωνικά αντισώματα. Ένας αριθμός μορίων κυτταρικής επιφάνειας εκφράζονται κατά προτίμηση σε AML LSC σε σύγκριση με φυσιολογικά ανθρώπινα αιμοποιητικά βλαστικά και των προγονικών κυττάρων έχουν ταυτοποιηθεί, συμπεριλαμβανομένων CD47 [10].

CD47 έχει μία μεταβλητή περιοχή και μόνο ανοσοσφαιρίνης (IgV) -όπως εξωκυτταρικό πεδίο και ρυθμίζει πολλαπλές κυτταρικές διεργασίες που εμπλέκονται στην ανοσολογικές αποκρίσεις [11]. Είναι ευρέως εκφράζεται σε αιμοποιητικά και μη-αιμοποιητικά κύτταρα? Ωστόσο, έχουμε διαπιστώσει στο παρελθόν ότι η CD47 ήταν περισσότερο εντόνως εκφρασμένο σε AML LSC από το κανονικό τους ομολόγους τους, και ότι η αυξημένη έκφραση CD47 σε AML σχετίζεται με κακή κλινική έκβαση [6,7,12]. CD47 κάνει μια σειρά από αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων

σε cis

με ιντεγκρίνες και

σε trans

με δύο συνδέτες, θρομβοσπονδίνη-1 (TSP-1) και σηματοδοτούν ρυθμιστική πρωτεΐνη άλφα (SIRPα). SIRPα κωδικοποιεί μια Ig-υπεροικογένεια υποδοχέων των οποίων η κυτταροπλασματική περιοχή περιλαμβάνει ανοσοϋποδοχέα τυροσίνης που βασίζεται μοτίβα αναστολής (ΙΤΙΜ) και εκφράζεται σε μακροφάγα, δενδριτικά κύτταρα, και οι νευρώνες [13-18]. Κατά την δέσμευση CD47, SIRPα εκκινεί ένα ανασταλτικό καταρράκτη μεταγωγής σήματος μέσω της πρόσληψης του src ομολογία-2 τομείς περιέχει πρωτεΐνη τυροσίνη φωσφατάσες SHP-1 και SHP-2, η οποία με τη σειρά τους παρέχουν ανασταλτικά σήματα για φαγοκυττάρωση [19-22]. Στην κανονική φυσιολογία, CD47 ανακαλύφθηκε ότι είναι ένας δείκτης της ηλικίας επί RBCs ποντίκι, τα οποία εμφανίζουν προοδευτικά φθίνουσα έκφραση του CD47 πιθανόν οδηγώντας σε ενδεχόμενη φαγοκυτταρικής απομάκρυνσή τους με ημιτονοειδή μακροφάγα της σπλήνας, υποδηλώνοντας ότι οι περισσότεροι ηλικίας RBCs είναι πιθανό να είναι σε μεγαλύτερο κίνδυνο για εξωαγγειακή φαγοκυττάρωση από CD47 αντισώματα αποκλεισμού [17,18,23].

Η περίπλοκη διαδικασία της φαγοκυττάρωσης εξαρτάται από τη σχετική ισορροπία των προ-φαγοκυτταρικά και αντι-φαγοκυτταρικά εισόδους [2]. Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, προτείναμε ένα μοντέλο στο οποίο τα κύτταρα λευχαιμίας συσσωρεύονται προ-φαγοκυτταρικά σήματα, πολλά από τα οποία δεν έχουν μοριακώς χαρακτηρισθεί. Κατά συνέπεια, τα κύτταρα λευχαιμίας που εκφράζουν υψηλά επίπεδα του CD47 είναι πιθανό επιλέγονται για την αντιμετώπιση προ-φαγοκυτταρικά σήματα. Με τον τρόπο αυτό, τα κύτταρα λευχαιμίας εξαρτώνται από την έκφραση CD47 για την πρόληψη της φαγοκυτταρικής αποβολή από έμφυτο ανοσοποιητικό κυττάρων [24].

Από το μοντέλο αυτό, προβλέψαμε ότι το μπλοκάρισμα της αλληλεπίδρασης CD47-SIRPα θα οδηγήσει στην κυριαρχία προ- φαγοκυτταρικά σήματα με αποτέλεσμα φαγοκυττάρωση των κυττάρων λευχαιμίας. Εμείς επικυρωθεί αυτή η υπόθεση, αποδεικνύοντας ότι ένα διαθέσιμο αντίσωμα αντι-ανθρώπινου CD47 αποκλεισμού ποντικού, B6H12, διεγερμένα φαγοκυττάρωση και μείωσε το βάρος της AML εμφύτευση σε πρωτογενείς μοντέλα ξενομοσχεύματος ανθρώπινου [6]. Υποθέσαμε επίσης ότι ένα ανασταλτικό αντίσωμα αντι-CD47 θα συνεργούν με ένα δεύτερο αντίσωμα ικανό να δεσμεύει Fc-υποδοχείς και να απελευθερώνει ένα ισχυρό προ-φαγοκυτταρικά σήματος. Συνεπής με αυτή την ιδέα, βρήκαμε ότι B6H12 και rituximab ισχυρά synergized στην εξάλειψη της NHL σε μοντέλα ξενομοσχεύματος [25]. Τέλος, η έκφραση CD47 ανιχνεύθηκε σε καρκινικά κύτταρα από πολλές αιματολογικές και συμπαγών όγκων, και βρήκαμε ότι B6H12 επέτρεψε τη φαγοκυττάρωση των πρωτογενών ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων in vitro, ανέστειλε την ανάπτυξη των ορθοτοπικά ξενομεταμοσχευμένων ανθρώπινων όγκων, και εμπόδισε την μετάσταση των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων [ ,,,0],26-30].

Συλλογικά, οι μελέτες αυτές δείχνουν ότι ένα εξανθρωπισμένο αποκλεισμού αντι-CD47 αντίσωμα μπορεί να είναι ένα αποτελεσματικό αντικαρκινικό θεραπευτικό τόσο ως μονοθεραπεία και σε συνδυασμούς. Στην παρούσα μελέτη, αναφέρουμε την ανάπτυξη ενός νέου ανθρωποποιημένου αντισώματος αντι-ανθρώπινου CD47, που ορίζεται Hu5F9-G4, που δημιουργούνται από περιοχή καθορισμού συμπληρωματικότητας (CDR) εμβολιασμό σε ένα ανθρώπινο ικρίωμα IgG4 για την ελαχιστοποίηση της πρόσληψης των λειτουργιών τελεστή Fc-εξαρτώμενου αντισώματος. Hu5F9-G4 επαγόμενη ισχυρός μακροφάγων διαμεσολαβείται φαγοκυττάρωση των πρωτογενών ανθρώπινων κυττάρων AML in vitro και εντελώς εξαλειφθεί ανθρώπινη AML in vivo, οδηγώντας σε μακροχρόνια ελεύθερη νόσου επιβίωση ξενομοσχευμάτων ασθενή προέλευσης. Επιπλέον, Hu5F9-G4 synergized με rituximab για την εξάλειψη NHL μεταμόσχευση και θεραπεία ξενομοσχεύτηκε ποντίκια. Τέλος, τοξικοκινητικές μελέτες σε μη ανθρώπινα πρωτεύοντα έδειξαν ότι Hu5F9-G4 θα μπορούσαν να χορηγηθεί με ασφάλεια ενδοφλεβίως σε δόσεις σε θέση να επιτύχει δυνητικά θεραπευτικά επίπεδα στον ορό. Έτσι, Hu5F9-G4 ενεργά αναπτύσσεται για κλινικές δοκιμές σε ανθρώπινα AML και συμπαγείς όγκους.

Υλικά και Μέθοδοι

αντισωμάτων γενιά

Ένα θραύσμα cDNA του ανθρώπινου CD47 που κωδικοποιούν το εξωκυτταρική περιοχή κλωνοποιήθηκε από πλήρους μήκους ανθρώπινου CD47 cDNA (Open Biosystems) και συντήχθηκε με το ποντίκι Fc για τη δημιουργία ενός /πρωτεΐνη σύντηξης MFC CD47, το οποίο χρησιμοποιήθηκε για την ανοσοποίηση ποντικών για την παραγωγή αντισωμάτων ποντικού μονοκλωνικό αντι-ανθρώπινο CD47. Υβριδώματα παρήχθησαν χρησιμοποιώντας τυποποιημένα πρωτόκολλα. Εν συντομία, ηλικίας 4-6 εβδομάδων ποντικούς Balb /c ανοσοποιήθηκαν με καθαρισμένη ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη σύντηξης huCD47 /MFC δύο φορές την εβδομάδα για ένα σύνολο 4 εβδομάδων. Οι τίτλοι εκτιμήθηκαν στη συνέχεια και τα κύτταρα της σπλήνας συντήχθηκαν με κύτταρα SP2 /0. Υβριδώματα επιλέχθηκαν και τα υπερκείμενα από τα προκύπτοντα κλώνοι σαρώθηκαν με ένζυμο συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA) και φθορίζοντα ενεργοποιημένου κυττάρου (FACS).

V αντισώματος κλωνοποίηση και αλληλούχιση

Η στρατηγική κλωνοποίησης που χρησιμοποιήθηκε εδώ εμπλέκεται μια αρχική απομόνωση RNA από κύτταρα υβριδώματος (Qiagen). Οι αλληλουχίες cDNA που κωδικοποιούν τις βαριάς και ελαφριάς αλυσίδας μεταβλητές περιοχές του μονοκλωνικού αντισώματος 5F9 ελήφθησαν χρησιμοποιώντας 5 ‘RACE τεχνικές-PCR (Clontech) και υποβλήθηκαν σε καθορισμό αλληλουχίας χρησιμοποιώντας τυπικές τεχνικές προσδιορισμού αλληλουχίας DNA.

Μοριακή μοντελοποίηση και εξανθρωπισμό αντισωμάτων

η ανθρωποποίηση του αντι-CD47 αντίσωμα ποντικού 5F9 διεξήχθη με την εγκατάσταση υπολείμματα CDR από αντίσωμα ποντικού σε ένα ανθρώπινο πλαίσιο βλαστικής σειράς (FR) [31]. Εν συντομία, το ποντίκι 5F9 ήταν εξανθρωπίζεται με συνετή πρόσληψη των αντίστοιχων υπολειμμάτων CDR. Διαφορές μεταξύ 5F9 ποντικού και τα ανθρώπινα υπολείμματα FR ατομικά πρότυπο για τη διερεύνηση πιθανών επιρροή τους στη διαμόρφωση CDR. Εξανθρωπισμένα γονίδια VH και VL συντέθηκαν με McLab (South San Francisco, CA).

διαμόλυνσης κυττάρων

293F κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό FreeStyle ™ 293 Expression Medium (Invitrogen). Παροδική διαμόλυνση εκτελέστηκε με συν-επιμόλυνση των φορέων έκφρασης που κωδικοποιούν βαριά αλυσίδα αντισώματος και ελαφριάς αλυσίδας χρησιμοποιώντας 293fectin αντιδραστηρίου επιμόλυνσης (Invitrogen), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τέσσερις έως πέντε ημέρες αργότερα, τα υπερκείμενα από τα επιμολυσμένα κύτταρα συλλέχθηκαν και εξετάστηκαν για έκκριση αντισωμάτων με ELISA. Εν συντομία, τρυβλία 96 φρεατίων (Nunc, Roskilde, Denmark) επικαλύφθηκαν με αντι-ανθρώπινο γάμμα Fc αντισώματος /ml κατσίκα 1 μα σε φωσφορικό ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα (PBS) για 16 ώρες στους 4 ° C. Μετά τον αποκλεισμό για 1 ώρα με 0.4% BSA σε PBS σε θερμοκρασία δωματίου, απομονωμένο υπερκείμενα προστέθηκαν σε ένα τρίτο διαδοχικό αραιώσεις και επωάστηκε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι πλάκες στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές και επωάστηκαν με ΗΚΡ-συζευγμένο γίδινο αντι-ανθρώπινο κάπα ειδικό αντίσωμα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την πλύση, οι πλάκες αναπτύχθηκαν με OPT. Η αντίδραση διακόπηκε με 2Μ H

2SO

4, και OD μετρήθηκε στα 490 nm.

καθαρισμό αντισωμάτων και χαρακτηρισμό

Το υπερκείμενο της καλλιέργειας εφαρμόζεται σε στήλες πρωτεΐνης A-Sepharose (GE Healthcare). Η στήλη πλύθηκε με PBS, και πρωτεΐνη μετά εκλούστηκε με ρυθμιστικό έκλουσης (ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού νατρίου 0,1 Μ, ρΗ 3,0). Τα συλλεχθέντα κλάσματα εξουδετερώθηκαν με 1 Μ Tris ρΗ 9.0. Τέλος, καθαρισμένα δείγματα υποβλήθηκαν σε διαπίδυση έναντι PBS. Η καθαρότητα του κλάσματος που εκλούεται αντίσωμα αναλύθηκε με ηλεκτροφόρηση επί πηκτώματος δωδεκυλθειικού νατρίου πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) επί% γέλες 10 υπό αναγωγικές ή μη αναγωγικές συνθήκες. Συγκροτήματα έγιναν ορατά με Coomassie brilliant blue χρώση.

κυτταρικής επιφάνειας που προσδένει αντιγόνο

δοκιμασίας

ΥΒ2 /0 κύτταρα τα οποία είχαν σταθερώς επιμολυσμένα με ανθρώπινο CD47 επωάστηκαν με 10 μg /ml του Hu5F9-G4 ή HuIgG4 στους 4 ° C για 1 ώρα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS τρεις φορές, ακολουθούμενη από incabation με 10 μg /ml ΡΕ-επισημασμένο αντι-ανθρώπινο Fc ειδικό αντίσωμα γάμμα (eBiosciences, San Diego, CA, USA) στους 4 ° C για 1 ώρα. Η πρόσδεση μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα FACSCanto (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA). Un-επιμολυσμένα ΥΒ2 /0 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός έλεγχος.

Ανταγωνισμός ELISA

Μια ανταγωνιστική δοκιμασία σύνδεσης χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η εξειδίκευση δέσμευσης αντιγόνου του αντι-CD47 mAbs. Εν συντομία, πλάκες των 96 φρεατίων (Nunc, Roskilde, Denmark) επικαλύφθηκαν με /ml huCD47 /πρωτεΐνη σύντηξης MFC 1 μg σε φωσφορικό ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα (PBS) για 16 ώρες στους 4 ° C. Μετά τον αποκλεισμό για 1 ώρα με 0.4% BSA σε PBS σε θερμοκρασία δωματίου, 10 μg /ml βιοτίνη-επισημασμένη ποντικού 5F9 προστέθηκε στις πλάκες με την παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων μη επισημασμένου Hu5F9-G4 σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Οι πλάκες στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές και επωάστηκαν με συζευγμένο με HRP στρεπταβιδίνη (Thermo Scientific Pierce) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την πλύση, οι πλάκες αναπτύχθηκαν με OPT. Η αντίδραση διακόπηκε με 2Μ H

2SO

4, και OD μετρήθηκε στα 490 nm.

συγγένειας αντισώματος

μέτρηση

Ένα cynomolgus CD47 cDNA κλωνοποιήθηκε από cynomolgus βιβλιοθήκη cDNA σπλήνας (BioChain, Κίνα). Η εξωκυτταρική περιοχή του CD47 cynomolgus κλωνοποιήθηκε και συντήκονται με Fc ποντικού για να δημιουργηθεί μια πρωτεΐνη σύντηξης cynoCD47 /MFC, το οποίο χρησιμοποιήθηκε στη μέτρηση συγγένειας. Ανθρώπινο CD47 /MFC έγινε από την σύντηξη της εξωκυτταρικής περιοχής του ανθρώπινου cDNA CD47 (Open Biosystems) με το ποντίκι Fc όπως περιγράφεται παραπάνω και χρησιμοποιείται για τη μέτρηση διμερή συγγένεια δέσμευσης με Hu5F9-G4. Επιπλέον, η ανθρώπινη CD47 /πρωτεΐνη σύντηξης του έγινε από την σύντηξη της εξωκυτταρικής περιοχής του ανθρώπινου CD47 σε His-tag και χρησιμοποιείται για τη μέτρηση μονομερούς συγγένεια δέσμευσης με Hu5F9-G4. Μελέτες δέσμευσης έγιναν χρησιμοποιώντας Biacore 2000 (GE). Το διάλυμα διαδρομής ήταν 10 mM HEPES ρΗ 7,4, 150 mM NaCl, 0.005% Tween-20. Τα δεδομένα συλλέχθηκαν σε 25 ° C. Κάθε δείγμα mAb ήταν αμίνη συνδέεται με ένα τσιπ αισθητήρα CM4 χρησιμοποιώντας πρότυπες ενεργοποίηση NHS /EDC (7 λεπτά). Κάθε αντίσωμα αραιώθηκε σε 10 μg /ml σε 10 mM οξικό Na ρΗ 5,0 και εγχύθηκε έως ότου ελήφθη το επιθυμητό επίπεδο ακινητοποίησης. Κάθε επιφάνεια κατόπιν μπλοκαρίστηκαν με 1 Μ αιθανολαμίνη για 7 λεπτά. Κάθε δείγμα ελέγχθηκε εις διπλούν.

CD47-SIRPα αλληλεπίδραση δοκιμασία αποκλεισμού

πλάκες

96-φρεατίων (Nunc, Roskilde, Denmark) επικαλύφθηκαν με 1 μg /ml του SIRPα /ανθρώπινης πρωτεΐνης σύντηξης Fc σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) για 16 ώρες στους 4 ° C. Μετά τον αποκλεισμό για 1 ώρα με 0.4% BSA σε PBS σε θερμοκρασία δωματίου, 1 μg /ml του CD47 /Fc ποντικού πρωτεΐνη προστίθεται είτε σε απουσία ή παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων του Hu5F9-G4 σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Οι πλάκες στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές και επωάστηκαν με ένα δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με HRP αντι-ποντικού Fc για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την πλύση, οι πλάκες αναπτύχθηκαν με OPT. Η αντίδραση διακόπηκε με 2Μ H

2SO

4, και OD μετρήθηκε στα 490 nm. Κάθε δείγμα δοκιμάστηκε εις τριπλούν.

In vitro

φαγοκυττάρωση δοκιμασία

Ιη vitro δοκιμασίες φαγοκυττάρωσης έγιναν όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Εν συντομία, πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα AML από διαφορετικούς ασθενείς HL-60 ή είχαν CFSE σημασμένο και επωάστηκαν με ανθρώπινα μακροφάγα περιφερικού αίματος που προέρχεται από την παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων 5F9 ποντικού, Hu5F9-G4, ή ένα αντίσωμα ελέγχου ισοτύπου για 2 ώρες στους 37 ΝΤΟ. Τα κύτταρα πλύθηκαν με IMDM μέσα χωρίς ορό και επαναιωρήθηκαν σε 200 μΙ μέσου. Στη συνέχεια, τα κύτταρα αναλύθηκαν με μικροσκοπία φθορισμού για τον προσδιορισμό της φαγοκυτταρικής δείκτης (αριθμός κυττάρων προσλαμβάνεται ανά 100 μακροφάγα). Η στατιστική ανάλυση με τη χρήση t δοκιμή Student διεξήχθη με GraphPad Prism.

εξαρτώμενη από αντίσωμα διαμεσολαβούμενη από κύτταρα κυτταροτοξικότητα (ADCC) δοκιμασία

ADCC διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες από το κιτ Acella-ΤΟΧ ™ βιοφωταύγεια κυτταροτοξικότητα (τεχνολογία των κυττάρων). Εν συντομία, ανθρώπινα PBMC επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 10

6 κύτταρα /mL σε IMDM ανθρώπινο πλήρες μέσο με 400 μονάδες /mL IL-2 (PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA). Την επόμενη ημέρα, ενεργοποιημένα PBMC χρησιμοποιήθηκαν ως κύτταρα τελεστές. 5 x10

3 HL60 κύτταρα σε 25 μί IMDM ανθρώπινο πλήρες μέσον, προστέθηκαν ανά φρεάτιο σε μια πλάκα πυθμένα σχήματος U 96 φρεατίων. Στη συνέχεια, 25 μλ ΙΜϋΜ ανθρώπινης πλήρους μέσου που περιέχει διάφορα αντισώματα στις επιθυμητές συγκεντρώσεις προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Μετά από 5 λεπτά επώασης στους 37 ° C, 2.5 x10

5 PBMC σε 25 μL IMDM ανθρώπινο πλήρες μέσο προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο για να δώσει μια αναλογία κυττάρων τελεστών προς κύτταρα στόχους 50: 1. Μείγματα επωάστηκαν στους 37 ° C για 4 ώρες, ακολουθούμενη από ανίχνευση χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια που παρέχονται από το κιτ. Δοκιμασίες επαναλήφθηκαν τρεις φορές και αντιπροσωπευτικά στοιχεία που παρουσιάζονται εδώ.

κυτταροτοξικότητα εξαρτώμενη από συμπλήρωμα (CDC) δοκιμασία

5 x 10

4 κύτταρα-στόχους σε 50 μί ΙΜϋΜ + 10% FBS + Pen /Strep προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 96 φρεατίων U πυθμένα. 50 μι αντισωμάτων προστέθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις (αραιωμένο με μέσον), ξεκινώντας από 10 μg /mL έως 10

-5 μg /mL, με διαστήματα αραίωση χ 100. Το μίγμα επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά, και στη συνέχεια 50 μL ανθρώπινου συμπληρώματος ορού προστέθηκαν σε κάθε κοιλότητα, αναμίχθηκε και το τρυβλίο επωάστηκε στους 37 ° C. Μετά από 2 ώρες επώαση, 50 μL Alamar Blue (Serotec ΝΑΒ) προστέθηκε σε κάθε κοιλότητα, αναμίχθηκε και το τρυβλίο επωάστηκε στους 37 ° C όλη τη νύκτα. Την επόμενη ημέρα, η πλάκα ψύχθηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά και διαβάζεται από συσκευή ανάγνωσης πλάκας SpectraMax Μ3 για σήματα φθορισμού σε μήκος κύματος διέγερσης 530 nm και μήκος κύματος εκπομπής 590 nm. Σχετική μονάδα φθορισμού (RFU) ήταν χρησιμοποιήσει για να δείξει σχετικό ποσό για τα ζωντανά κύτταρα μετά από δοκιμασία. Δοκιμασίες επαναλήφθηκαν τρεις φορές και αντιπροσωπευτικά στοιχεία που παρουσιάζονται εδώ.

υποδοχέα CD47 δοκιμασία χωρητικότητα

CD47 δεσμευτικό πρότυπο καμπύλη σε κύτταρα AML έγινε με τη χρήση AF488 συζευγμένο Hu5F9-G4 σε διάφορες συγκεντρώσεις. Receptor χωρητικότητα μετρήθηκε με επώαση των κυττάρων στόχων με μη επισημασμένη Hu5F9-G4 υπό διαφορετικές συγκεντρώσεις, και στη συνέχεια τα κύτταρα είτε προσδιορίστηκαν σε

in vitro

φαγοκυττάρωση ή επωάστηκαν με μία συγκέντρωση κορεσμού AF488-Hu5F9-G4 με βάση την πρότυπη καμπύλη και αναλύθηκαν για σύνδεση με κυτταρομετρία ροής. κατάληψης υποδοχέα υπολογίστηκε ως εξής:

Προσδιορισμός απόπτωσης

Ανθρώπινα πρωτογενή κύτταρα AML αποψύχθηκαν και βιώσιμα μονοπύρηνα κύτταρα απομονώθηκαν με φυγοκέντρηση βαθμίδωσης σε Ficoll χρησιμοποιώντας τυποποιημένα πρωτόκολλα. Τα βιώσιμα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 1×10

6 ανά 50 μλ σε ΙΜϋΜ + 5% FBS. 10 μg /ml Hu5F9-G4 ή ελέγχου ισοτύπου αντίσωμα προστέθηκε και τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για 3 ώρες. Η σταυροσπορίνη χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Τα αποπτωτικά κύτταρα ταυτοποιήθηκαν με χρώση με Annexin V (BD Biosciences, Cat. # 556547) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

In vivo

θεραπεία αντισώματος της ανθρώπινης ΑΜΙ μεταμοσχευμένων ποντικών

Όλα τα πειράματα του ποντικιού διεξήχθησαν σύμφωνα με μια Φροντίδα και Χρήση Θεσμικών Ζωικά Επιτροπής-εγκεκριμένο πρωτόκολλο (Stanford APLAC # 22264) και στην τήρηση των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας

Οδηγός για τη Φροντίδα και Χρήση ζώων Εργαστηρίου

. Όλα τα ποντίκια σε αυτή τη μελέτη αγοράστηκαν από το The Jackson Laboratory ή εκτρέφονται στο σπίτι. Κάθε ζώο που παρουσίασαν απώλεια βάρους, λήθαργος, κυρτή στάση του σώματος, ή αναστατωμένα γούνα που δεν βελτιωθεί μέσα σε 1 εβδομάδα θεραπείας με Nutrical και υγρά έγινε ευθανασία. Εμείς ευθανασία των ζώων, όταν νοσηρή ανά θεσμικό πρωτόκολλα

Υπήρχαν δύο ομάδες ποντικών στις μελέτες:. Η ομάδα ελέγχου που έλαβαν θεραπεία με IgG ποντικού και την πειραματική ομάδα που έλαβε θεραπεία με αντίσωμα Hu5F9-G4. Οι θάνατοι ήταν αναμενόμενα στην ομάδα ελέγχου λόγω αποτυχίας του μυελού των οστών από κεραυνοβόλο λευχαιμία. Η πειραματική ομάδα επιβίωσαν καλά και υποβλήθηκε σε ευθανασία στο τέλος της μελέτης.

κρυοδιατηρημένα κύτταρα από ανθρώπινο SU028 δείγμα, SU048, SU266 και αποψύχθηκαν σε 10 ml μέσου (IMDM + 10% FBS + glutamax + πενικιλλίνη στρεπτομυκίνη) και 100 μg ϋΝάσης Ι (StemCell) να εκτελεί εξάντληση των Τ κυττάρων. Εν συντομία, τα κύτταρα πλύθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό Robosep. επελέγη πρόγραμμα 18051-υψηλή ανάκτηση Human CD3 θετική επιλογή και μετά την ολοκλήρωση του προγράμματος, το κλάσμα CD3- συλλέχθηκε, μετρήθηκαν, και παρασκευάζεται για ενδοφλέβια ένεση σε HBSS (Technology Life) + 2% ρυθμιστικό FBS (Omega Science). Ανθρώπινα πρωτογενή μοντέλο ξενομοσχεύματος AML ιδρύθηκε το NOD /SCID /IL-2Rgnull (NSG) θηλυκά ποντίκια ηλικίας 8-10 εβδομάδων. Οι ποντικοί κλιματιζόμενο με 200 rads χρησιμοποιώντας ένα Faxitron CP-160 γάμμα ακτινοβολίας μέχρι και 24 ώρες πριν από την ενδοφλέβια ένεση. 100 μL 5 x 10

6 πρωτογενή κύτταρα AML στη συνέχεια με ένεση σε ποντίκια NSG από ουραία φλέβα με μια βελόνα Terumo 29 G. Σε 5-εβδομάδων μετά τη μεταμόσχευση, κύτταρα μυελού των οστών αναρροφάται από το μηριαίο οστούν, χρησιμοποιώντας BD 27G βελόνες και χρωματίστηκαν με αντι-ποντικού CD45.1 PECy7 (eBiosciences, San Diego, CA, USA), αντι-ποντικού αρουραίου TER119 PECy5 (eBiosciences , San Diego, CA, USA), ποντικού αντι-ανθρώπινο CD45 PB (BD Bioscience, San Jose, CA, USA), ποντικού αντι-ανθρώπινου CD3 APC-Cy7 (BD Bioscience, San Jose, CA, USA), αντι- ποντικού ανθρώπινο CD33 ΡΕ (BD Bioscience, San Jose, CA, USA), και ποντικού αντι-ανθρώπινο CD19 APC (BD Bioscience, San Jose, CA, USA). Το ποσοστό των κυττάρων CD33 + AML ανθρώπινο CD45 + προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής. Με βάση το επίπεδο των κυττάρων μεταμόσχευσης ανθρώπινης ΑΜΙ, πέντε ποντίκια μεταμοσχεύθηκαν με κάθε SU028 ή SU048 δείγμα χωρίστηκαν σε μία από τις δύο ομάδες θεραπείας: έλεγχος IgG ποντικού ή Hu5F9-G4 σε 100 μg ημερησίως με ενδοπεριτοναϊκή ένεση. Η θεραπεία ξεκίνησε την Ημέρα 1 και διήρκεσε για 14 συνεχόμενες ημέρες. Ορός συλλέχθηκε σε προ-επεξεργασία και 2 ώρες μετά τη θεραπεία, μετά την 1η, 5η, 8η, 12η, 14η και δόσεις για ανάλυση ΡΚ. Κύτταρα μυελού οστών αναρροφήθηκαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία για την ανάλυση AML μεταμόσχευση. Μια γενική αίματος αναλύθηκε μια φορά το μήνα χρησιμοποιώντας HemaTrue Αιματολογικό Αναλυτή. Την Ημέρα 159, επιζώντα ποντίκια που λαμβάνονται κάτω για ανάλυση ιστολογία των οστών της κνήμης. Για τη θεραπεία των ποντικών μεταμοσχευμένων με SU266, τέσσερις ή πέντε χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες θεραπείας: τον έλεγχο του ποντικιού IgG, Hu5F9-G4 σε 100 μg ημερησίως, και Hu5F9-G4 στα 500 μg δύο φορές την εβδομάδα. Η θεραπεία ξεκίνησε την Ημέρα 1 και διήρκεσε για 14 ημέρες. Ορός συλλέχθηκε σε προ-επεξεργασία και 2 ώρες μετά τη θεραπεία για ανάλυση ΡΚ. Κύτταρα μυελού οστών αναρροφήθηκαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία για την ανάλυση AML μεταμόσχευση. Όλοι οι ποντικοί παρακολουθήθηκαν για τη συνολική επιβίωση, και η ρ-τιμή της επιβίωσης σε ομάδες που υπέστησαν αγωγή Hu5F9-G4 συγκρίθηκε με τις ομάδες ελέγχου IgG ποντικού. Στο τέλος της μελέτης, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία με τη χρήση CO2 για ευθανασία τρωκτικών.

Συνέργεια του Hu5F9-G4 και rituximab σε Raji Luc-EGFP μεταμοσχευμένα NSG ποντίκια

Ποντίκια με εμφυτευμένα Raji Luc-EGFP σε μια συγκέντρωση σε 1 εκατομμύριο κύτταρα /ποντικό μέσω ένεσης στην ουραία φλέβα. Είχαν απεικονίστηκαν

in vivo

να προσδιοριστεί το επίπεδο της μεταμόσχευσης επτά ημέρες από την εμφύτευση. Η θεραπεία άρχισε την ίδια ημέρα για 21 διαδοχικές ημέρες. Όλα τα ποντίκια ενέθηκαν μέσω ενδοπεριτοναϊκής ένεσης. Ποντίκια απεικονίστηκαν

in vivo

μέσω IVIS Spectrum Σύστημα Απεικόνισης στα ακόλουθα χρονικά σημεία: Προ-θεραπεία την Ημέρα 7 της μεταμόσχευσης, Ταχυδρομείο επτά δόσεις την Ημέρα 14 της μεταμόσχευσης, Ταχυδρομείο δεκατέσσερις δόσεις για την Ημέρα 21 της μεταμόσχευσης, Ταχυδρομείο είκοσι μία δόσεις κατά την Ημέρα 28 και μία εβδομάδα μετά την θεραπεία την Ημέρα 35. εκτίμηση επιβίωσης διεξήχθη κατά την Ημέρα 217. στο τέλος της μελέτης, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία με τη χρήση CO2 για ευθανασία τρωκτικών.

μελέτη τοξικότητας σε μη ανθρώπινα πρωτεύοντα

Όλα τα πειράματα σε πρωτεύοντα μη ανθρώπινα διεξήχθησαν σύμφωνα με μια Φροντίδα και Χρήση Θεσμικών Ζωικά Επιτροπής-εγκεκριμένο πρωτόκολλο (Stanford APLAC # 26070) και στην τήρηση των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας

Οδηγός για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου

. Οι πίθηκοι κοινωνικά στέγασης (ενημέρωση σε 3 ζώα του ίδιου φύλου και η δοσολογία της ομάδας μαζί) σε κλουβιά από ανοξείδωτο χάλυβα εξοπλισμένο με ένα ανοξείδωτο πάτωμα πλεγμάτων και αυτόματη βαλβίδα πότισμα. Όλες οι πρωτογενείς περιβλήματα ήταν σύμφωνα με αυτό, όπως ορίζεται στο νόμο USDA Animal Welfare (9 CFR, Μέρη 1, 2 και 3) και όπως περιγράφονται στον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου (Εθνικό Συμβούλιο Έρευνας. Οδηγός για τη Φροντίδα και τη χρήση των πειραματόζωων Washington, DC:.. National Academy Press τρέχουσα έκδοση). Κάθε κλουβί ήταν σαφώς επισημαίνονται με μια ετικέτα κλουβί που δείχνει μελέτη, την ομάδα, τον αριθμό των ζώων, και το σεξ. Θερμοκρασία: 64 ° F έως 84 ° F (18 ° C έως 29 ° C)? Υγρασία: 30% έως 70%? Κύκλο φωτός: 12 ώρες φως και 12 ώρες σκοτάδι (εκτός κατά τη διάρκεια καθορισμένων διαδικασιών)? Εξαερισμός: Δέκα ή περισσότερο αέρα αλλαγές ανά ώρα με 100% καθαρό αέρα (δεν υπάρχει ανακυκλοφορία)

Για την μελέτη κλιμάκωσης της δόσης, δύο θηλυκά ζώα είχαν εγγραφεί και δόσεις σε διαστήματα μίας εβδομάδας:. Ένα ΝΗΡ χορηγήθηκε μια ενιαία δόση της ΕΡΟ (17.000 U /kg) 5 ημέρες πριν την πρώτη δόση του Hu5F9-G4 (3, 10, 30, 100, και 300 mg /kg), και ένας ΝΗΡ χορηγήθηκε Hu5F9-G4 (1, 3, 10 , 30, και 100 mg /kg) χωρίς προ-επεξεργασία της ΕΡΟ. συλλέχθηκαν δείγματα αίματος για τη μέτρηση των γενικών εξετάσεων αίματος συμπεριλαμβανομένης της αιμοσφαιρίνης και για το επίπεδο του ορού Hu5F9-G4.

Σε ξεχωριστές μελέτες ΝΗΡ, πιθήκους θηλυκό cynomolgus χορηγήθηκε μία εφάπαξ ενδοφλέβια έγχυση διάρκειας 1 ώρας των 0,1, 0,3, 1, 3, 10 ή 30 mg /kg του Hu5F9-G4 ή PBS όχημα ως ομάδα ελέγχου (ένα ζώο ανά ομάδα) την ημέρα 1, ή μια δόση γόμωσης (PD) κατά την Ημέρα 1 σε δόσεις 1 ή 3 mg /kg, ακολουθούμενη από εβδομαδιαίες δόσεις συντήρησης (MD) των 10 ή 30 mg /kg Hu5F9-G4 μέχρι την Ημέρα 43. δείγματα συλλέγονται στις διάφορες μελέτες ήταν ως ακολούθως:

Hematology. Απλή δόση: αίμα τραβήχτηκε δύο φορές πριν από τις ενέσεις και στις 3, 6, 10 και 14 ημέρες μετά την χορήγηση. PD /MD δόση: αίμα τραβήχτηκε δύο φορές πριν από τις ενέσεις και στις 3, 6, 10, 13, 17, 20, 24, 27, 29, 36, και 43 ημέρες μετά τη χορήγηση

κλινικής χημείας.. Απλή δόση: αίμα τραβήχτηκε δύο φορές πριν από τις ενέσεις και σε 6 και 14 ημέρες μετά την χορήγηση. ΠΔ /MD δόση: το αίμα αποσύρθηκε δύο φορές πριν από τις ενέσεις και σε 6, 13, 20, 29, 36, και 43 ημέρες μετά τη χορήγηση

ούρων.. Απλή δόση: μέχρι 14 ml ούρων συλλέχθηκαν δύο φορές πριν από την ένεση και στα 3 και 10 ημέρα μετά την ένεση. PD /MD δόση: μέχρι 14 ml ούρων συλλέχθηκαν δύο φορές πριν την ένεση και στις 3, 10, 17, και 24 ημέρα μετά την ένεση

Φαρμακοκινητική ανάλυση.. Το αίμα συλλέχθηκε με φλεβική παρακέντηση σε σωληνάρια χωρίς αντιπηκτικό σε διαφορετικά χρονικά σημεία, όπως υποδεικνύεται στο Σχήμα 4Β και 4D. επίπεδο ορού του Hu5F9-G4 μετρήθηκε με ELISA όπως περιγράφηκε ανωτέρω με τη χρήση πρωτεΐνης σύντηξης CD47 /Fc ποντικού ως το αντιδραστήριο επικάλυψης, που ακολουθείται από ανίχνευση με ένα δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με HRP αντι-ανθρώπινο κάπα.

Η

Όλα τα ζώα παρακολουθήθηκαν δύο φορές ημερησίως για θνησιμότητα και νεκρότητα ελέγχους. Τα σωματικά βάρη μετρήθηκαν τουλάχιστον μία φορά προ-μελέτης και εβδομαδιαία μετέπειτα αρχής γενομένης από την ημέρα 7.

Αποτελέσματα

Δημιουργία μονοκλωνικών αντισωμάτων κατά της ανθρώπινης CD47

Ένα θραύσμα cDNA του ανθρώπινου CD47 που κωδικοποιεί την εξωκυτταρική περιοχή συντήχθηκε στο Fc ποντικού για να δημιουργήσει ένα /πρωτεΐνη σύντηξης MFC hCD47, το οποίο χρησιμοποιήθηκε για την ανοσοποίηση ποντικών για την παραγωγή αντισωμάτων ποντικού μονοκλωνικό αντι-ανθρώπινο CD47. Η ειδικότητα των επιλεγμένων κλώνων υβριδώματος εξετάστηκε με FACS δέσμευσης είτε γονική ή ανθρώπινα 0 κύτταρα ΥΒ2 αρουραίου CD47-επιμολυσμένα /. Ένας από τους θετικούς κλώνους ελήφθη και ορίστηκε ως 5F9. Χρησιμοποιώντας την καθολική εκκινητές αντίσωμα, βαριάς και ελαφριάς αλυσίδας μεταβλητές περιοχές του 5F9 με επιτυχία κλωνοποιηθεί. Πολλαπλές κλώνοι του κάθε προϊόντος γονιδίου V αλληλουχήθηκαν για την παρακολούθηση της PCR που προκαλείται από σφάλματα, και οι αλληλουχίες αμινοξέων της VH και VL του 5F9 προσδιορίστηκαν (Σχήμα 1Α και 1Β). Η ανάλυση αλληλουχίας DNA έδειξε ότι η βαριά αλυσίδα του 5F9 χρησιμοποιεί ένα τμήμα V της οικογένειας IGHV1, και ότι η ελαφριά αλυσίδα ανήκει στην υποομάδα IGKV1.

(ΑΒ) Σύγκριση ποντικού και εξανθρωπισμένων 5F9 μεταβλητής βαριάς (Α) και το φως (Β) περιοχές. Οι CDR επισημαίνονται, όπως αναφέρεται. (C) αρουραίου ΥΒ2 /0 κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με ανθρώπινο CD47 και γονική ΥΒ2 /0 κύτταρα χρωματίστηκαν με ανθρώπινο IgG4 ισότυπου ελέγχου ή Hu5F9-G4 και αναλύθηκαν ως προς τη δέσμευση της επιφάνειας με κυτταρομετρία ροής. (D) Βιοτινυλιωμένο ποντίκι 5F9 σύνδεση με ανθρώπινο CD47 /MFC ανιχνεύτηκε με ELISA σε απουσία ή παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων μη επισημασμένου Hu5F9-G4 ή ισοτυπικού ελέγχου. Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις διπλούν και οι τιμές SEM παρουσιάζονται. Ενδείκνυται p-τιμές προσδιορίστηκαν από Δύο Way ANOVA σε σύγκριση. (Ε) Η σύνδεση του Hu5F9-G4 για μονομερή ή διμερή CD47 αναλύθηκε με συντονισμό επιφανειακών πλασμονίων αποδίδοντας τα υποδεικνυόμενα ίχνη και σταθερές σύνδεσης. Τα δεδομένα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με την αφαίρεση απαντήσεις από την επιφάνεια αναφοράς, καθώς και ένα μέσο όρο των ενέσεων ρυθμιστικού. Οι απαντήσεις ήταν συνολικά ταιριάζει σε 1: μοντέλο αλληλεπίδρασης 1 συμπεριλαμβανομένου ενός χρόνου για τη μαζική μεταφορά. Ο αριθμός στην παρένθεση αντιπροσωπεύει το τυπικό σφάλμα στο τελευταίο ψηφίο αναφερθεί.

Η

Μοριακή μοντελοποίηση και εξανθρωπισμό της 5F9 αντισώματος

Για να εξανθρωπίσει 5F9, πολλές 3D μοντέλα του Fv του αντισώματος στόχου κτίστηκαν χρησιμοποιώντας συνδυασμών γνωστών δομών. 2PCP και 2JEL εμφανίζουν 93% και 95% ταυτότητα με 5F9, αντίστοιχα, χρησιμοποιήθηκαν για τη μοντελοποίηση VL. 2PCP και 1CIC εμφανίζουν 70% και 78% ταυτότητα με 5F9, αντίστοιχα, χρησιμοποιήθηκαν για τη μοντελοποίηση VH. Για να επιλέξετε ανθρώπινες περιοχές πλαισίου του αντισώματος (FR) για να χρησιμοποιηθούν ως πρότυπα για CDR-εμβολιασμό, τα 5F9 VL και VH περιοχές ποντικού συγκρίθηκαν με εκείνες των ανθρώπινων αλληλουχιών βλαστικής σειράς. Το πείραμα επαναλήφθηκε 3 φορές. Το πείραμα επαναλήφθηκε 3 φορές.