Αφηρημένο

Η ηπατική πυρηνικού παράγοντα HNF4α είναι μια έκφραση ευέλικτο μεταγραφικού παράγοντα και τους ελέγχους των πολλών γονιδίων στην ανάπτυξη , το μεταβολισμό και την ασθένεια. Για να οριοθετηθούν ρυθμιστικό δίκτυο γονιδίων του σε καρκίνο του παχέος εντέρου και να καθορίσει νέους στόχους γονίδιο μια ολοκληρωμένη γονιδιώματος σε επίπεδο σάρωση διεξήχθη με ανάλυση 35 bp με χρωματίνη IP DNA που λαμβάνεται από την κυτταρική σειρά καρκινώματος κόλου σειρά ανθρώπινου Caco-2 που είναι ιδιαιτέρως πλούσιος πηγή HNF4α. Περισσότερο από το 90% των θέσεων δέσμευσης HNF4α χαρτογραφήθηκαν ως υποκινητής απώτερες ακολουθίες ενώ στοιχεία ενισχυτή μπορούν να καθοριστούν για την προώθηση βρόχους χρωματίνη για την αλληλεπίδραση με άλλους παράγοντες μεταγραφής προαγωγέα συνδεδεμένο. ανάλυση μοτίβο αλληλουχίας από διάφορους γενετικούς αλγόριθμους αποδεικνύεται μια μοναδική ενισχυοσώματος που αποτελούνταν από τις πυρηνικές πρωτεΐνες ΕΚα, ΑΡ1, GATA και HNF1α ως συνεργαζόμενες παράγοντες μεταγραφής. Συνολικά & gt? Θέσεις πρόσδεσης 17.500 DNA ταυτοποιήθηκαν με μια δεσμευτική αναλογία γονίδιο /site που διέφεραν & gt? 6 φορές μεταξύ χρωμοσωμάτων και συγκεντρωμένα σε ξεχωριστές χρωμοσωμικές περιοχές μεταξύ & gt? 6600 γονίδια που στοχεύονται από HNF4α. Αποδεικτικά στοιχεία που παρουσιάζονται για πυρηνικών υποδοχέων cross-talk της HNF4α και του υποδοχέα α οιστρογόνου που ανακεφαλαιώνει σε επίπεδο αλληλουχίας. Αξίζει να σημειωθεί ότι, το Υ-χρωμόσωμα στερείται θέσεων δέσμευσης HNF4α. Η λειτουργική σημασία των τόπων εμπλουτισμού επιβεβαιώθηκε σε μελέτες γονιδιακής έκφρασης του γονιδιώματος-ευρεία σε διάφορα επίπεδα της πρωτεΐνης HNF4α. Λαμβάνονται συλλογικά, ένα γονιδίωμα-ευρεία σάρωση των θέσεων δέσμευσης HNF4α έχει αναφερθεί για την καλύτερη κατανόηση βασικών μηχανισμών του μεταγραφικού ελέγχου του HNF4α στοχευμένων γονιδίων. Τα νέα υποστηρικτής περιοχές άπω δέσμευσης προσδιορίζονται τα οποία αποτελούν ενισχυόσωμα διευκολύνοντας με αυτόν τον τρόπο τα γεγονότα επεξεργασίας RNA

Παράθεση:. Weltmeier F, Borlak J (2011) υψηλή ανάλυση Γονιδιώματος-Wide σάρωση των HNF4α Αναγνώριση τοποθεσίες συνάγει ένα ρυθμιστικό γονίδιο Δικτύου Καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 6 (7): e21667. doi: 10.1371 /journal.pone.0021667

Επιμέλεια: Ying Xu, University of Georgia, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2 του Φεβρουαρίου 2011? Αποδεκτές: 6 Ιουν 2011? Δημοσιεύθηκε: 28 του Ιούλη 2011

Copyright: © 2011 Weltmeier, Borlak. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από το Υπουργείο Κάτω Σαξονία Πολιτισμού και Επιστημών και την ίδρυση της Volkswagen, Γερμανία. αριθμός Grant: 25A.5-7251-99-3 /00. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ηπατική πυρηνικού παράγοντα HNF4α είναι μέλος της υπερ-οικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων και ένα εξαιρετικά ευέλικτο μεταγραφικού παράγοντα [1]. Αυτή η πρωτεΐνη δακτύλου ψευδαργύρου εκφράζεται στο ήπαρ, έντερο, πάγκρεας και άλλους ιστούς, και δεσμεύεται με συγγενείς ακολουθίες DNA ως ομοδιμερές [2]. Στο παρελθόν, ορισμένες θέσεις σύνδεσης ντουζίνα υποστηρικτής αναφέρθηκαν. Η χρήση της χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση και υβριδοποίησης μικροσυστοιχιών μεθοδολογίες τσιπ τσιπ απέδειξε ότι αυτές είναι μόνο το μικρότερο κλάσμα των πραγματικών θέσεων σύνδεσης HNF4α. Με τη χρήση συστοιχίας πλακόστρωση περιέχει τις περιοχές ΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΣΗ που αντιπροσωπεύουν το 1% του γονιδιώματος της κυτταρικής γραμμής ηπατώματος HepG2 ανθρώπινο [3] θα μπορούσε να χαρτογραφηθεί συνολικά 194 θέσεις πρόσδεσης HNF4α. Σε μια άλλη μελέτη δεσμευτική HNF4α sites σε ηπατοκύτταρα και τα παγκρεατικά νησίδια χαρτογραφηθεί, αλλά η προσέγγιση επικεντρώνεται στις περιοχές υποκινητή μόνο [4]. Μέχρι σήμερα, ένα γονιδίωμα-ευρεία αποτύπωμα της HNF4α δεν έχει αναφερθεί. Αξίζει να σημειωθεί ότι, HNF4α είναι μία ρυθμιστική πρωτεΐνη κύριος και δυσλειτουργία του HNF4α έχει συσχετισθεί με μεταβολικές και καρκινικών νόσων. Ήμασταν ιδιαίτερα ενδιαφέρονται για την εξερεύνηση μιας γονιδιωματικής αποτύπωμα HNF4α στο ανθρώπινο adenocarcinmoa παχέος εντέρου κυτταρική σειρά Caco-2 που έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για να εξερευνήσετε δραστηριότητα HNF4α [5] αναγνωρίζοντας έτσι ένα δίκτυο των ρυθμιζόμενων γονιδίων. Συγκεκριμένα, η κυτταρική γραμμή διαφοροποιεί σε εντεροκύτταρα κατά συρροή [6] και εκφράζει πρωτεΐνη HNF4α συγκρίσιμο με το ήπαρ [7]. Εδώ αναφέρουμε το πρώτο γονιδίωμα-ευρεία σάρωσης που επέτρεψε την ταυτοποίηση των & gt? 17.500 θέσεις πρόσδεσης στόχο HNF4α και περιγράφουν χρωμοσωμικές διανομής τους. Επιπλέον, μελετήσαμε τις συνέπειες της επαγωγής πρωτεΐνης HNF4α στην μεταγραφική δραστηριότητα του

de novo

εντοπίστηκαν γονίδια και να επιδείξει καλή συμφωνία μεταξύ των στόχων νέο γονίδιο και την έκφραση τους στα κύτταρα Caco-2. Τέλος, αναλύσαμε HNF4α τοποθεσίες για εμπλουτισμένο δεσμευτική μοτίβα και προσδιορίζονται συνεργαζόμενους παράγοντες μεταγραφής που εμφανίστηκε να ενεργεί σε συνεννόηση με HNF4α σε ένα ενισχυόσωμα της μεταγραφικής ρύθμισης δεσμευτική.

Αποτελέσματα

πειράματα χρωματίνης IP πραγματοποιήθηκαν με Caco-2 κυτταρικές καλλιέργειες και ένα αντίσωμα ειδικό για υψηλά HNF4α. Αξίζει να σημειωθεί ότι, το σύνολο των εισροών καθώς και ΙΡ-DNA από τρεις ανεξάρτητες βιολογικές επαναλήψεις ελήφθη και υποβλήθηκε σε ένα βελτιστοποιημένο πρωτόκολλο για αμερόληπτη ενίσχυσης σύμφωνα με τις κατασκευές σύσταση (βλέπε επίσης τμήμα Υλικά και Μέθοδος). Το ενισχυμένο DNA από ανεξάρτητα πειράματα υποβλήθηκε σε υβριδισμό σε συστοιχίες Affymetrix Human πλακάκια 2.0R με ένα γονιδίωμα-ευρεία ανάλυση των 35 bp. Στη συνέχεια, τα ανεπεξέργαστα δεδομένα εξετάστηκαν για εμπλουτισμένα περιοχές με χρήση τριών ανεξάρτητων αλγορίθμων (TAS [8], ΜΑΤ [9] και Tilemap [10]). Οι αρχικές κριτήρια αποκοπής καθορίστηκαν με ασθενώς εμπλουτισμένο θετικό μάρτυρα (

OTC

) και να βελτιωθεί περαιτέρω με βάση τη συχνότητα του HNF4α -motifs εντός των εμπλουτισμένων περιοχές, όπως καθορίζεται από τον αλγόριθμο MATCH [11]. Για να αποκτήσουν εμπιστοσύνη στα δεδομένα, τα αποτελέσματα από τις τρεις αλγόριθμοι διασταυρώνεται. Η επικάλυψη των περιοχών εμπλουτισμού (ES) που προσδιορίζονται από τις τρεις προσεγγίσεις ήταν πολύ υψηλή (Εικ. 1), αν και μικρές διαφορές παρατηρήθηκαν πιθανώς οφείλεται στα διαφορετικά επανάληψης βιβλιοθήκες που χρησιμοποιούνται. Συνολικά η προσέγγιση αυτή οδήγησε σε ταυτοποίηση των 17.561 ES (Πίνακας S1). Επιπλέον, ένα σύνολο δεδομένων χαμηλής αυστηρότητας δημιουργήθηκε συνδυάζοντας τα δεδομένα ES ανιχνεύεται με ΜΑΤ και αλγορίθμων Tilemap. Αυτό οδήγησε σε ένα σύνολο 25.419 ES (Πίνακας S2).

Πρώτες δεδομένα αναλύθηκαν με τρία διαφορετικά προγράμματα (Tilemap, ΜΑΤ και TAS) για τον εντοπισμό θέσεων δέσμευσης HNF4α. Παρά το γεγονός ότι χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικές ρυθμίσεις παραμέτρων (π.χ. εύρος ζώνης 200, 300 και 400 νουκλεοτίδια) και διαφορετικούς αλγόριθμους, η επικάλυψη ήταν εκπληκτικά υψηλό. Το διάγραμμα Venn υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την λειτουργία διασταύρωσης του Galaxy [47].

Η

Επιπλέον, 15 ES γνωστών στόχων γονιδίου HNF4α επιλέχθηκαν και ο εμπλουτισμός τους σε πρωτογενή ΠΕ-DNA προσδιορίστηκε με ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο . Για όλα τα επιλεγμένα sites εμπλουτισμό θα μπορούσε να επιβεβαιωθεί. Έτσι, η ευρωστία και η ποιότητα των δεδομένων που ελέγχθηκε (Εικ. 2). Μεταξύ των εντοπίστηκαν ES υπήρχαν θέσεις πρόσδεσης HNF4α ήδη περιγραφεί στη βιβλιογραφία ή αναφέρονται αλλού, όπως

ΑΑΤ

(R00114),

GCC

(R08885),

PCK

(R12074 ),

APOB

(R01612),

CYP2C9

(R15905),

AKR1C4

(R13037),

ACADM

(R15923) ή

CYP27A1

(R15917). Στην περίπτωση της SHBG (R15941), ES προσδιορίστηκαν μέσα σε μερικές εκατοντάδες ζεύγη βάσεων σχέση με τις αναφερόμενες θέσεις δέσμευσης. Άλλες θέσεις πρόσδεσης που περιγράφονται στην βιβλιογραφία, όπως

ALDH2

(R15845), δεν μπορεί να επιβεβαιωθεί. Ωστόσο, η ποσοτικοποίηση σε πραγματικό χρόνο PCR έδειξε ότι το

ALDH2 Ιστοσελίδα δεν ήταν εμπλουτισμένο σε πρωτογενή IP-DNA. Δεδομένου ότι οι λειτουργίες πρωτεΐνη HNF4α σε έναν ιστό ειδικό τρόπο, δεν είναι απροσδόκητο ότι ορισμένα ES δεν δεσμεύονται σε κύτταρα Caco-2? προσβασιμότητά τους εξαρτάται μάλλον από χρωματίνη οργάνωση, η οποία με τη σειρά της εξαρτάται από τον τύπο του κυττάρου. Αυτό υποστηρίζεται από ανεξάρτητες έρευνες, όπου σημαντικές διαφορές στις θέσεις πρόσδεσης DNA σε διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους είχαν παρατηρηθεί [12].

Εμπλουτισμός των νέων θέσεων σύνδεσης HNF4α ανιχνεύεται με τσιπ chip επιβεβαιώθηκε με πραγματικού χρόνου PCR. Χρησιμοποιήθηκε τσιπ DNA από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Η κανονικοποίηση πραγματοποιήθηκε με χρήση β-ακτίνης αρνητικό έλεγχο, και οι αντίστοιχες τιμές παρουσιάζονται ως φορές εμπλουτισμός έναντι συνολικής εισαγωγής. HNF1α ανάντη είναι ένα δεύτερο αρνητικό έλεγχο, που βρίσκεται ανάντη της γνωστής θέσης δέσμευσης HNF4α στον υποκινητή HNF1α και χρησιμοποιείται για να επιβεβαιώσει το SS-ακτίνης αρνητικό έλεγχο.

Η

Το μοτίβο HNF4α είναι πολύ εμπλουτισμένο εντός του τσιπ περιοχές

ChIP εμπλουτισμένο περιοχές εξετάστηκαν για HNF4α δεσμευτική μοτίβα με τον αλγόριθμο MATCH [11]. Χρησιμοποιώντας αυστηρά κριτήρια για την ελαχιστοποίηση των ψευδώς θετικών, & gt?. Εμπλουτισμό 14 φορές παρατηρήθηκε για HNF4α στοχευμένες ακολουθίες, σε σύγκριση με γενωμική φόντο (Πίνακας S3)

Οι περιοχές των 500 bp που περιβάλλουν τις 17.561 εντοπίστηκαν θέσεις δέσμευσης αναλύθηκαν για HNF4α μοτίβα με τις ρυθμίσεις για την ελαχιστοποίηση των ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα από τη χρήση του αλγορίθμου MATCH [11]. Ουσιαστικά, οι περιφέρειες είχαν κατά διαστήματα σε κάδους των 25 bp, και ο αριθμός των εμφανίσεων των διαφόρων μοτίβων μέσα σε κάθε κάδο μετρήθηκε. Αυτό οδήγησε σε ένα σύνολο 23.145 μοτίβα και ισοδυναμεί με 1,32 μοτίβα /περιοχή chip. Για 98,1% των περιφερειών ChIP ανιχνεύθηκε τουλάχιστον ένα μοτίβο. Αυτό υποδηλώνει ότι οι περισσότερες από τις περιοχές ChIP εμπλουτίστηκαν λόγω της άμεσης σύνδεσης του HNF4α. Με την ίδια προσέγγιση οι θέσεις δέσμευσης που αναφέρθηκαν για τις περιφέρειες ΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΣΗ [3] εξετάστηκαν και 1,13 μοτίβα /περιοχή Chip εκτιμήθηκε η οποία είναι μικρότερη από αυτή που παρατηρήθηκε στην παρούσα μελέτη και ενδεχομένως να προτείνουν συστοιχίες υψηλής ανάλυσης πλακάκια για τον καλύτερο εντοπισμό ES. Ακολούθως, η κατανομή των μοτίβων HNF4α γύρω από το κέντρο του τσιπ εμπλουτισμένο περιοχές αναλύθηκε (Σχ. 3α). Η πλειοψηφία των μοτίβων βρίσκεται σε μια περιοχή του μόνο -500 ζευγών βάσεων. Όταν οι εμπλουτισμένο περιοχές στις θέσεις κορυφής που ανιχνεύεται με τον αλγόριθμο ΜΑΤ ευθυγραμμίσθηκαν έναντι μεσαία θέση, ο αριθμός των μοτίβων HNF4α αυξάνεται, ως εκ τούτου δείχνει ότι η θέση κορυφής καλύτερη ανάλυση πραγματική θέση πρόσδεσης. Επιπλέον, το μοτίβο δειγματολήπτης Gibbs εφαρμόστηκε για τον προσδιορισμό περιοχών ES να επιτρέπουν την εύκολη

de novo

ορισμός του μοτίβου HNF4α (Σχ. 3β).

α) μοτίβα HNF4α στην περιοχή της 1000 bp περιβάλλοντα χώρο εμπλουτισμού (ES) κορυφή ή στο κέντρο θέσεις όπως ανιχνεύεται με MATCH, χρησιμοποιώντας αποκοπές για την ελαχιστοποίηση των ψευδώς θετικών. Η απόσταση από το κέντρο του ανιχνεύεται μοτίβων στην κορυφή ή στο κέντρο θέση του ES υπολογίστηκε. Ένα ιστόγραμμα δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας κάδους των 50 νουκλεοτιδίων γύρω από το κέντρο ή θέσεις κορυφής. Η μπλε γραμμή δείχνει την απόκλιση των HNF4α μοτίβα σε σχέση με το κέντρο ES, η κόκκινη γραμμή δείχνει την απόκλιση σε σχέση με την θέση κορυφής. β) ES HNF4α τσιπ τσιπ για να επιτρέπουν την εύκολη

de novo

πρόβλεψη του μοτίβου δέσμευσης HNF4α. Μετά την ανάλυση της αλληλουχίας των περιοχών εμπλουτίζεται από HNF4α τσιπ τσιπ με Gibbs μοτίβο δειγματολήπτη, η HNF4α-μοτίβο ήταν στην πραγματικότητα εντοπιστεί δύο φορές, με το δεύτερο μοτίβο παρουσιάζει μόνο το μισό ενός site. γ) Διατήρηση όλων των θέσεις πρόσδεσης HNF4α (μπλε γραμμή). ES κέντρα (μπλε) ή θέσεις των κορυφών (κόκκινο) επεκτάθηκαν στις 1000 bp και στις δύο κατευθύνσεις, και για κάθε νουκλεοτίδιο ο μέσος όρος της διατήρησης, με βάση την υψηλή ποιότητα Phast-Cons πληροφορίες από το UCSC GoldenPath Genome Resource, υπολογίστηκε. Οι μέσες βαθμολογίες διατήρηση σχεδιάστηκαν έναντι της θέσης νουκλεοτιδίων. Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με ΚΕΣΑ [43].

Η

Για να υπογραμμίσει τη βιολογική σημασία των τόπων που έχουν χαρακτηριστεί δεσμευτικό μέσο διατήρησης τους μελετήθηκε επίσης. Τα νουκλεοτίδια στο κέντρο, όπου θα μπορούσε να αναμένεται μια θέση δέσμευσης, εμφανίζουν δύο φορές υψηλότερο από εκείνα διατήρηση στα άκρα του οικοπέδου (γονιδιωματική φόντο) (Σχ. 3c). Και πάλι, όταν το τσιπ εμπλουτίζεται περιοχές ήταν ευθυγραμμισμένα με τη θέση της κορυφής, η κορυφή της διατήρησης ήταν ακόμα καλύτερα ορίζεται.

HNF4α δεσμεύεται κυρίως σε στοιχεία ενισχυτή

Η απόσταση από τη θέση συνδέσεώς HNF4α στο πλησιέστερο μεταγραφή θέση εκκίνησης (TSS) ενός γονιδίου REFSEQ προσδιορίστηκε. Εδώ, παρατηρήθηκε σχεδόν 5-φορές υπερεκπροσώπηση των θέσεων πρόσδεσης στην περιοχή προαγωγού των -1000 έως 0 σε σχέση με το TSS (Σχ. 4α, b). Ωστόσο, μόνο το 5,8% του συνόλου των θέσεων δέσμευσης αντιστοιχίζονται με υποκινητή εγγύς περιοχές και 3,6% του συνόλου των REFSEQ οι δικαιούχοι δεσμεύονται από HNF4α. Μια παρόμοια και σημαντική έλλειψη προτίμησης για τη δέσμευση σε περιοχές προαγωγού-εγγύς 5 ‘είχε αναφερθεί για τους παράγοντες μεταγραφής Sp1, Ρ53, cMyc και ΕΡα [13], [8]. Ενώ ορισμένοι μεταγραφικοί παράγοντες όπως E2F1 δείχνουν μια σαφή προτίμηση για 5 περιοχές «προαγωγός-εγγύς [14], συγκεντρώνοντας στοιχεία είναι άκρως ενδεικτικό για τις περιοχές προαγωγού-εγγύς προς αποτελούν μόνο ένα μικρό κλάσμα των ρυθμιστικών αλληλουχιών γονιδίων θηλαστικών. Πράγματι, ορισμένοι από τους πυρηνικούς υποδοχείς εμφανίζουν υψηλότερη δραστικότητα σε ενισχυτή αντί θέσεις δέσμευσης προαγωγέα [13], [15]. Ως εκ τούτου, οι μελέτες με συστοιχίες υποστηρικτής είναι περιορισμένης αξίας.

α) Θέση του HNF4α περιοχές σε σχέση με το πιο κοντινό TSS γονιδίων REFSEQ δέσμευσης σε σύγκριση με τυχαία κατανομή. Οι περιοχές 100,000 νουκλεοτιδίων που περιβάλλουν κάθε TSS χωρίστηκαν σε κάδους των 5000 νουκλεοτιδίων, και ο αριθμός των θέσεων σύνδεσης σε κάθε κάδο μετρήθηκε. β) τη διανομή Γονιδιωματική των θέσεων δέσμευσης HNF4α. Ο αριθμός των θέσεων σύνδεσης που βρίσκονται στις καθορισμένες περιοχές του REFSEQ σχολιασμένα γονίδια υπολογίστηκε από την CisGenome εργαλείο λογισμικού. TSSup1k: 1000 bp ανοδικά μιας θέσης έναρξης μεταγραφής (TSS)? TESdown1k: 1.000 bp καθοδικά ενός τέλους μεταγραφής περιοχή. γ) Κατανομή των θέσεων δέσμευσης HNF4α βρίσκεται κοντά στο TSS γονιδίων REFSEQ, σε σύγκριση με τυχαία κατανομή. Οι περιοχές του 5000 νουκλεοτιδίων που περιβάλλουν κάθε TSS χωρίστηκαν σε κάδους από 200 νουκλεοτίδια, και ο αριθμός των θέσεων σύνδεσης σε κάθε κάδο μετρήθηκε. δ) υπερεκπροσώπηση των HNF4α χώρους στην ανάντη και κατάντη περιοχές TSS εγγύς και στο πρώτο δεσμευτικό, το δεύτερο ένα τρίτο εσώνια της REFSEQ σχολιασμένη γονιδίων, σε σχέση με ένα τυχαίο περιοχές ελέγχου. Οι θέσεις του TSS, πρώτη, δεύτερη και τρίτη εσώνια του REFSEQ σχολιασμένα γονίδια ανακτήθηκαν από UCSC, και ο αριθμός των θέσεων σύνδεσης HNF4α βρίσκονται στις καθορισμένες περιοχές υπολογίστηκε. TSSup600: 600 bp ανοδικά μιας θέσης έναρξης μεταγραφής? TSSdown600: 600 bp καθοδικά ενός σημείου έναρξης της μεταγραφής? TSSup10k: 10.000 bp ανοδικά ενός TSS? TSSdown10k:. 10.000 bp καθοδικά ενός TSS

Η

Μια ανάλυση της κατανομής των ES στα 600 bp γύρω από το TSS προσκόμισε αποδεικτικά στοιχεία για την προτιμησιακή δέσμευσης στην περιοχή ανάντη (Σχήμα 4γ και δ.). Ωστόσο, σε μια απόσταση μεγαλύτερη από 800 bp του TSS, οι περισσότερες θέσεις σύνδεσης που βρίσκονται κατάντη. Αξίζει να σημειωθεί ότι, πολλοί παράγοντες μεταγραφής θέσεις πρόσδεσης που βρίσκονται στο πρώτο ιντρόνιο? η δεύτερη κορυφή που φαίνεται στο Σχ. 4c οφείλεται σε δέσμευση των εσωνίων περιοχών. Η συχνότητα των θέσεων δέσμευσης HNF4α στο REFSEQ σχολιασμένο γονίδια αναλύθηκε περαιτέρω. Αυτό αποδεικνύεται μια υπερεκπροσώπηση των ES στα πρώτα εσώνια, αλλά σε μικρότερο βαθμό στη δεύτερη ή τρίτη (Εικ. 4δ).

Είναι σημαντικό, μια πρόσφατη μελέτη HNF4α τσιπ τσιπ πρότεινε ES υποκινητή-εγγύς οφείλονται σε έμμεσες αλληλεπιδράσεις του HNF4α με άλλους μεταγραφικούς παράγοντες [3]. Κατά συνέπεια, αναπτύχθηκε ένα μοντέλο σύμφωνα με την οποία δεσμεύεται με HNF4α μακρινά στοιχεία ενισχυτή και δημιουργεί βρόχους χρωματίνης αλληλεπιδρώντας με άλλους μεταγραφικούς παράγοντες προαγωγό συνδεδεμένο. Δυστυχώς, αυτό το μοντέλο βασίστηκε σε λιγότερο από 1% των γονιδιωματικών αλληλουχιών. Με βάση την ευρεία σάρωση γονιδιώματος αναφέρονται εδώ HNF4α μοτίβα στις περιοχές προαγωγού-άπω υπερεκπροσωπούνται δέσμευσης σε σύγκριση με περιοχές προαγωγέα-εγγύς (Εικ. 5α), παρ ‘όλα αυτά οι περιοχές με χαμηλό εμπλουτισμό εμφανίζουν ένα υψηλότερο ποσοστό των θέσεων πρόσδεσης προαγωγού-εγγύς από περιοχές με υψηλή εμπλουτισμού (Σχ. 5β). Ενδεχομένως, οι επαφές HNF4α προαγωγού-εγγύς περιοχές με φυσική αλληλεπίδραση με άλλους παράγοντες μεταγραφής και ως εκ τούτου εμφανίζει προαγωγού, καθώς και μια δραστικότητα σύνδεσης ενισχυτή.

α) ανάλυση Bootstrapping του HNF4α μοτίβο σύνδεσης (μήτρα M01031) σε προαγωγέα-εγγύς και υποκινητή απομακρυσμένες περιοχές. 100 ES υποκινητή-εγγύς (-138 έως -2 σε σχέση με το TSS) συγκρίθηκαν με 100 ES προαγωγό-άπω (-24972 να -23489 σε σχέση με το TSS) από το εργαλείο ανάλυσης bootstrapping Pobo [48]. Υποστηρικτής-εγγύς ES παρουσιάζουν σημαντικά μικρότερο αριθμό HNF4α μοτίβα. β) ES (300 bp γύρω από την θέση κορυφής) ταξινομήθηκαν από την P-αξία τους (όπως υπολογίζεται από τον αλγόριθμο ΜΑΤ) και διαιρείται σε κάδους του 1000 ES. Για κάθε bin υπολογίστηκαν ο αριθμός των περιστατικών HNF4α μοτίβο και το ποσοστό των ES-υποκινητή εγγύς. Όπως μπορεί να φανεί, ES με υψηλή τιμή Ρ (ασθενής ES) είναι πιο πιθανό να βρίσκονται προαγωγού-εγγύς αλλά να περιέχουν κανένα μοτίβο πρόσδεσης HNF4α.

Η

Η κατανομή των προσδιορισμένων ES μήκος των χρωμοσωμάτων ποικίλη & gt? 6 φορές. Εντυπωσιακά, το χρωμόσωμα Υ στερείται HNF4α ES (Πίνακας S6) και το χρωμοσωμικό κατανομή των ES δεν διανέμεται τυχαία? μάλλον Τα συμπλέγματα σχηματίζονται (Εικ 6α?. Εικ. 7). Αυτές οι συστάδες δεν σχετίζονται με διαφορές στην πυκνότητα γονίδιο μέσα σε αυτές τις περιοχές, όπως φαίνεται για χρωμοσώματος 10. Η περιοχή με την υψηλότερη πυκνότητα των θέσεων δέσμευσης στο χρωμόσωμα 10 περιέχει δύο συστάδες των χώρων με την αλληλοεπικάλυψη ACSL5 τόπους και VTI1A1 (Εικ δεσμευτική. 6β ). Με τη σάρωση του γονιδιωματική αλληλουχία για τα παράθυρα των 100.000 bp που περιέχουν ≥10 θέσεις πρόσδεσης HNF4α, δεκαπέντε συστάδες θα μπορούσε να οριστεί (Πίνακας S7). Πράγματι, οι περισσότεροι ενισχυτές φαίνεται να είναι ετερόκλητη και έτσι ρυθμίζει πολλαπλά γονίδια [16]. Ενώ δραστηριότητα ενισχυτής μπορεί να λάβει χώρα σε εκατοντάδες χιλιοβάσεων [17] και ακόμη και περιπτώσεις ενδο-χρωμοσωμικό ρύθμιση από ενισχυτές έχουν αναφερθεί [18], οι περισσότεροι είναι εντός 100,000 bp των αντίστοιχων TSS τους. Για να ορίσετε την καλύτερη πιθανή ενισχυοσώματος για τα γονίδια στόχους ακολουθίες επιλέχθηκαν πιο κοντινό σε γονίδια REFSEQ με TSS διαχωρίζονται από λιγότερο από 100.000 νουκλεοτίδια (Πίνακας S8).

α) Η κατανομή των θέσεων δέσμευσης HNF4α (μοβ γράφημα γραμμής, ανώτερο μισό) συγκρίνεται με την κατανομή των γνωστών γονιδίων στο χρωμόσωμα 10. Πράσινη βέλη σήμα δύο γονιδίων-αραιές περιοχές στις οποίες βρίσκονται ES. Τα κόκκινα βέλη σήμα δύο περιοχές με υψηλό αριθμό των θέσεων δέσμευσης HNF4α και χαμηλό αριθμό γονιδίων. Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του εργαλείου Ensembl Karyoview (https://www.ensembl.org/Homo_sapiens/karyoview). β) Οι όμιλοι της HNF4α θέσεων δέσμευσης σε μια γονιδιακή περιοχή στο χρωμόσωμα 10 με υψηλή περιεκτικότητα σε θέσεις πρόσδεσης (περιοχή που χαρακτηρίζεται από το δεύτερο κόκκινο βέλος σε α)). Οι θέσεις σύνδεσης που προσδιορίζονται στην παρούσα μελέτη, που εμφανίζεται ως μπλε αιχμές στο άνω ήμισυ, παρουσιάζονται με τη χρήση του προγράμματος περιήγησης IGB γονιδίωμα. Οι θέσεις σύνδεσης κατανέμονται σε δύο ομάδες γύρω από τη θέση έναρξης μεταγραφής του τόπου ACSL5 και στην 3′-περιοχής του τόπου VTI1A.

Η

Κάθε χρωμόσωμα διαιρέθηκε σε 150 ‘

κάδους

», και μέσα σε κάθε κάδο μετρήθηκε ο αριθμός των ES. Στο μπλε γράφημα γραμμής, ο αριθμός των θέσεων δέσμευσης HNF4α μέσα σε κάθε κάδο αναπαρίσταται ως ένα ενιαίο σημείο δεδομένων. Κάτω από κάθε χρωμόσωμα δίνεται το ελάχιστο και το μέγιστο αριθμό των θέσεων δέσμευσης που βρίσκονται σε ένα μόνο κάδο. Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του εργαλείου Ensembl Karyoview (https://www.ensembl.org/Homo_sapiens/karyoview).

Η

HNF4α μεταγραφικού παράγοντα cross-talk

Για να αναζητήσετε παράγοντα μεταγραφής cross-talk θεωρήθηκαν οι περιοχές ChIP για υπερεκπροσωπούνται μοτίβα. Μεταξύ των μοτίβων με την υψηλότερη εμπλουτισμού είναι μήτρες παρόμοιες με την HNF4α μοτίβο δέσμευσης, π.χ. εκείνες για COUP-TF, PPAR ή Ι.ΕΡ1 (Εικ. 8, Πίνακες S3, S4, S5). Αυτοί οι παράγοντες μεταγραφής είναι γνωστές για να ανταγωνιστεί με HNF4α για κοινές θέσεις πρόσδεσης [19] – [21]. Ωστόσο, πολλά μοτίβα ανόμοια με HNF4α, π.χ. οι δεσμευτικές μοτίβα για HNF1α, ΑΡ1 ή παράγοντες μεταγραφής GATA, ήταν επίσης σημαντικά εμπλουτισμένη. Αν αυτοί οι παράγοντες δρουν από κοινού με HNF4α, θα μπορούσε να αναμένεται ότι η συχνότητα των μοτίβων τους αυξάνει με τη μείωση της απόστασης προς τις θέσεις σύνδεσης HNF4α. Ως εκ τούτου, η συχνότητα αυτών των μοτίβων σε σχέση με τις θέσεις δέσμευσης HNF4α αναλύθηκε (Σχ. 9α και 9β). Ο εμπλουτισμός αυτών των μοτίβων περιορίζεται σε μία περιοχή μερικών εκατοντάδων ζευγών βάσεων γύρω από την θέση της κορυφής, ως εκ τούτου υποστηρίζουν την ιδέα ότι είναι μέρος ενός ενισχυοσώματος που ορίζεται από HNF4α. Εκτός από την αύξηση της συχνότητας των μοτίβων πρόσδεσης για ΑΡ1, GATA, Ετα και HNF1α παρατηρήθηκε μια αντίστροφη σχέση μεταξύ HNF4α και μοτίβα CART, αλλά δεν υπήρξε καμία σχέση με SREBP1 (Εικ. 9a). Είναι δελεαστικό να υποθέσουμε ότι αυτό είναι ρυθμιστικών σημασίας για HNF4α. Άλλες αναλύονται μοτίβα έδειξε μόνο μια μικρή συσχέτιση μεταξύ του αριθμού των μοτίβων και την απόσταση από τη θέση αιχμής, αν και ήταν σαφώς εμπλουτισμένη σε περιοχές ChIP (π.χ. USF, CREB, HNF6).

Το 10,000 πιο σημαντικές ChIP- εμπλουτισμένα περιοχές αναλύθηκαν για υπερεκπροσωπούνται μοτίβα με χρήση του εργαλείου ΚΕΣΑ [43]. Παρουσιάζονται οι 10 μοτίβα με το πιο σημαντικό εμπλουτισμό, ενώ αφαιρέθηκαν περιττή μοτίβα (δηλαδή πολλαπλά μοτίβα για τον ίδιο παράγοντα μεταγραφής). Η ομοιότητα ή ανομοιότητα των μοτίβων οπτικοποιείται με τη χρήση Weblogo απεικόνιση (https://weblogo.berkeley.edu/). Ανάλυση εμπλουτισμός μοτίβο με Genomatix RegionMiner και MATCH [11] βρίσκονται στους πίνακες S3, S4, S5.

Η

α) θέσεις Peak (εκπροσωπήθηκαν ως 0) επεκτάθηκαν σε 500 bp και στις δύο κατευθύνσεις, και μοτίβα ανιχνεύθηκαν με χρήση του αλγορίθμου MATCH [11] χρησιμοποιώντας κριτήρια αποκοπής για να ελαχιστοποιηθεί το άθροισμα των ψευδώς θετικών και ψευδώς αρνητικών. Περιφέρειες κατά διαστήματα σε κάδους των 25 bp, και ο αριθμός των εμφανίσεων των διαφορετικών μοτίβων μέσα σε κάθε κάδο μετρήθηκε. β) Plot της σχετικής απόστασης του HNF4α μοτίβα σε άλλα μοτίβα εμπλουτισμένο στην περιοχή chip. Εντός των περιφερειών ChIP τα πιο συντηρημένα μοτίβα HNF4α όπου εντοπίζονται. Οι αλληλουχίες των νουκλεοτιδίων 500 που περιβάλλουν αυτά τα πλέον συντηρημένα μοτίβα HNF4α όπου ανακτημένων και αναλύθηκαν για τα εν λόγω μοτίβα άλλων TF που εμπλουτίζεται επίσης στις περιοχές του τσιπ. Στη συνέχεια, η απόσταση μεταξύ αυτών των μοτίβων και το μοτίβο HNF4α υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας CisGenome για ανίχνευση μοτίβο και σημειώνονται σαν ιστόγραμμα χρησιμοποιώντας κάδους των 20 bp. Το μοτίβο HNF4α βρίσκεται στο κέντρο, φθάνοντας από bp -6 έως +6 bp. HNF4α και ΕΡα μοιράζονται κοινές και επικαλυπτόμενες θέσεις πρόσδεσης. γ) Ένδειξη της επικάλυψης μεταξύ των δεσμευτικών μοτίβα της HNF4α και του υποδοχέα οιστρογόνων (ΕΡα) με τη χρήση Weblogo εικονογραφήσεις. Και τα δύο μοτίβα δείχνουν μια μερική επικάλυψη. δ) Επικάλυψη μεταξύ θέσεων πρόσδεσης ΕΡα και θέσεις πρόσδεσης HNF4α. Η υψηλή αυστηρότητα ορίζεται θέσεων δέσμευσης ΕΚα προσδιορίζονται από τσιπ τσιπ [13] λήφθηκε. Το ποσοστό των θέσεων δέσμευσης Ετα που προσδιορίζονται στην παρούσα μελέτη και δεσμεύεται επίσης από HNF4α εμφανίζεται σε ένα γράφημα μπαρ. Η επικάλυψη των θέσεων δέσμευσης ΕΚα με τυχαίες περιοχές ελέγχου προσδιορίσθηκε.

Η

Η υψηλή ομοιότητα αλληλουχίας των χώρων για HNF4α και υποδοχέα οιστρογόνου (ΕΚα) σύνδεση είναι πολύ σημαντική (Σχ. 9c). Να αναλύσει περαιτέρω την πιθανότητα συν-πληρότητας του εμπλουτισμένου μοτίβα οι θέσεις δέσμευσης HNF4α προσδιορίστηκαν επακριβώς με ανάλυση μοτίβο. Η γονιδιωματική θέση της υψηλότερης βαθμολογίας μοτίβο HNF4α εντός των περιοχών ChIP ανακτήθηκε και επεκτάθηκε σε 500 νουκλεοτίδια προς τα αριστερά και δεξιά πλευρικές αλληλουχίες. Εντός αυτών των αλληλουχιών, άλλες εμπλουτισμένο μοτίβα ανιχνεύθηκαν και η απόσταση από το μοτίβο HNF4α υπολογίστηκε (Εικ. 9β). Όπως ήταν αναμενόμενο, τα περισσότερα μοτίβα ΕΚα συν-εντοπίζονται στην HNF4α ES προκαλώντας μια υψηλή κορυφή στο κέντρο. Σε αντίθεση, HNF1α, ΑΡ1 και GATA μοτίβα εμφανίσει εμπλουτισμού σε απόσταση 20 έως 60 νουκλεοτίδια στο μοτίβο HNF4α. Υπάρχει επίσης ένας εμπλουτισμός του λιγότερο διατηρημένων θέσεων πρόσδεσης HNF4α σε άμεση γειτνίαση με την υψηλότερη βαθμολογία HNF4α μοτίβο. Αυτή η υπερεκπροσώπηση των λιγότερο συντηρημένα μοτίβα HNF4α μπορεί να διαδραματίσει έναν ρόλο στην αύξηση της πιθανότητας HNF4α δέσμευσης σε τοπικό πλαίσιο αλληλουχία γύρω από την θέση πρόσδεσης.

Καθώς το μοτίβο ΕΡα επικαλύπτει εν μέρει με το μοτίβο HNF4α, είναι δελεαστικό να υποθέσουμε ότι ο εμπλουτισμός εντός των περιοχών τσιπ οφείλεται σε μια λειτουργική σύνδεση μεταξύ των δύο παραγόντων. Πρόσφατα, ένα γονιδίωμα κλίμακα χάρτη θέσεων δέσμευσης ΕΚα αναφερθεί [13]. Συνεπώς, τα δεδομένα για τις περιοχές ΕΚα και HNF4α αναλύθηκαν και βρέθηκαν να επικαλύπτονται σημαντικά (Σχ. 9d). Χρησιμοποιώντας είτε την χαμηλή ή υψηλή αυστηρότητα ορίζεται από HNF4α ή ΕΚα θέσεις δέσμευσης μέχρι περίπου 15% των θέσεων δέσμευσης ΕΚα επίσης στόχο HNF4α, υποστηρίζοντας έτσι την ιδέα της συνεργασίας μεταξύ HNF4α και του πυρηνικού υποδοχέα ΕΚα. Είναι σημαντικό, αρκετές ανεξάρτητες έρευνες αναφέρουν συνέργεια στη δραστικότητα του παράγοντα μεταγραφής HNF4α και ΕΡα στη γονιδιακή ρύθμιση, για παράδειγμα, της απολιποπρωτεΐνης Α1, apoVLDII και το μικρό ετεροδιμερές εταίρο.

Μια σάρωση του γονιδιώματος-ευρεία αποκαλύπτει πλοιάρχου λειτουργία HNF4α του

Τα στοιχεία από την παρούσα μελέτη σε σχέση με τα δημοσιευμένα στοιχεία, προκειμένου να προσδιοριστούν οι περιοχές που επικαλύπτονται μεταξύ αυτών των μελετών (Εικ. 10). Από τους 194 ES αναφερθεί εντός των ΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΣΗ περιοχές [3], 76 επικαλύπτονται με τα ευρήματα της παρούσας μελέτης. Δυστυχώς, οι περιοχές ΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΣΗ περιλαμβάνουν 1% του μόνο ολόκληρο το γονιδίωμα. Επιπλέον, σε μία μελέτη υποκινητή εστιασμένη [4] 1553 δεσμεύεται αλληλουχίες έχουν αναφερθεί για ηπατοκύτταρα. Στην παρούσα μελέτη και με την επιλογή συγκρίσιμες περιοχές αλληλουχίας συνολικά 575 θέσεων πρόσδεσης θα μπορούσε να διερευνηθεί. Από αυτούς, 200 θέσεις πρόσδεσης ήταν σε κοινή, ως εκ τούτου, επιβεβαιώνοντας το 13% των προτεινόμενων θέσεων δέσμευσης υποκινητή. Επιπλέον, ο ίδιος ερευνητής ανέφερε ES για παγκρεατικά νησίδια αλλά μόνο το 9% θα μπορούσε να επιβεβαιωθεί στην παρούσα μελέτη με DNA IP από την κυτταρική σειρά Caco-2. Τέτοιες διαφορές μπορεί να προκύπτουν από τα διάφορα πειραματικά πρωτόκολλα και τις διαφορές σε κυτταρικούς τύπους.

Ποσοστό θέσεων δέσμευσης HNF4α προσδιορίζονται από Rada-Iglesias et al. [3] ή Odom et al. [4], η οποία θα μπορούσε να επιβεβαιωθεί σε αυτή τη μελέτη. Για Rada-Iglesias et al. μια ομάδα ελέγχου τυχαίων γονιδιωματικών αλληλουχιών χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό του τυχαίου επικάλυψη. Για Odom et al., Μια ομάδα ελέγχου δημιουργήθηκε με τυχαία επιλογή ενός αριθμού από περιοχές υποκινητή από τη συστοιχία Huk13 χρησιμοποιείται στη μελέτη τους, που ισούται με τον αριθμό των υποκινητών που ανιχνεύεται ως να δεσμεύεται από HNF4α.

Η

Βιολογικές οντολογίες του

de novo

προσδιορίζονται οι στόχοι γονίδιο HNF4α

Με βάση την οντολογία γονιδίων η

de novo

εντοπίστηκαν γονίδια ομαδοποιήθηκαν (Πίνακας S9). Πολλές από τις στοχευμένες γονίδια εμπλέκονται σε διαφορετικές μεταβολικές διεργασίες, π.χ. λιπίδιο, οργανικό οξύ ή μεταβολισμό των υδατανθράκων. Κατηγορίες που σχετίζονται με τις μεταφορές, δηλαδή μεταφορά λιπιδίων, ήταν σημαντικά υπερεκπροσωπούνται, όπως ήταν το μεταβολισμό των λιπαρών οξέων και χοληστερόλης [1], [22]. Επιπλέον, πολλά γονίδια για την ανάπτυξη και διαφοροποίηση ταυτοποιήθηκαν ως εκ τούτου καθησυχαστικό ρόλο HNF4α στην ανάπτυξη [23] και επιθηλιακή διαφοροποίηση [22], [24] – [26]. Η πρωτεΐνη αυτή ελέγχει επίσης την έκκρισης ινσουλίνης οδό [27] και συνδέεται με σπάνιες μονογονικές διαταραχή, δηλαδή την ωριμότητα διαβήτης των νέων (MODY) [28]. Έτσι, τα γονίδια στοχεύονται από HNF4α στην οδό σηματοδότησης της ινσουλίνης, καθώς και τέτοιες σχετικές με κυτταρικό θάνατο και ογκοκατασταλτικά δραστηριότητα ταυτοποιήθηκαν [29]

Καθορισμός λειτουργικές θέσεις σύνδεσης -. Συσχέτιση μεταξύ γονιδιώματος σε επίπεδο HNF4α τσιπ τσιπ και γονιδιακή έκφραση δεδομένων

μια κοινή προσέγγιση για τον εντοπισμό γονιδίων που απευθύνονται κατά ένα παράγοντα μεταγραφής είναι να καθορίσει mRNA αφθονία που προκαλείται από HUH7 της αυξημένη ή μειωμένη μεταγραφική δραστηριότητα διερευνήθηκε σε ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά (ΗΕΚ293 [30]) και κύτταρα ηπατώματος ( [31], HepG2 [32]). Παραδόξως, πειράματα επιμόλυνσης HNF4α επηρέασε τη μεταγραφή ενός μικρού αριθμού μόνο γονίδια. Ενώ είναι γνωστό ότι η μεταγραφική ρύθμιση δεν διαμεσολαβείται στο επίπεδο της DNA πρόσδεσης και μόνο [33] σε τέτοια πειράματα πλέον μεταγραφικούς παράγοντες συνδέονται υπό «μη ενεργοποίηση» συνθήκες. Για να επιβεβαιώσετε λειτουργικές θέσεις πρόσδεσης του

de novo

προσδιορίζονται οι στόχοι γονίδιο HNF4α, πολιτισμών Caco-2 κυττάρων υποβλήθηκαν σε θεραπεία με έναν επαγωγέα του HNF4α πρωτεΐνη [34]. Μετά την κατεργασία των κυττάρων Caco-2 με Aroclor 1254, η δέσμευση της πρωτεΐνης HNF4α να το

HNF1α

υποκινητή αυξήθηκε [7], ενώ η επαγωγή της πρωτεΐνης επιβεβαιώθηκε με Western blotting πειράματα (Εικ. 11). Οι καλλιέργειες που αντιμετωπίζονται Aroclor 1254 υποβλήθηκαν σε γονιδιώματος σε επίπεδο μεταγραφής προφίλ. Χρησιμοποιώντας αυστηρά κριτήρια, 536 μοναδικά γονίδια REFSEQ-σχολιασμένο ορίστηκαν ως εκφράζονται διαφορικά (Πίνακας S10). Από αυτά, 383 γονίδια ρυθμισμένα προς τα πάνω και προς τα κάτω 153 ρυθμιστεί. Οι αλληλουχίες υποκινητή των ρυθμιζόμενων γονιδίων αναλύθηκαν για θέσεις πρόσδεσης HNF4α και συγκρίνεται με τον κατάλογο των πρόσφατα ταυτοποιημένων στόχων γονίδιο τσιπ τσιπ. Μια επικάλυψη 63% ή 336 διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων (Πίνακας S11) ταυτοποιήθηκαν ως στόχοι γονίδιο HNF4α, ως εκ τούτου επιβεβαιώνοντας τη λειτουργική σημασία των ES που προσδιορίζονται στην δοκιμασία τσιπ τσιπ.

α) HNF4α στύπωμα Western 20 μα εκχύλισμα Caco-2 κυττάρων. Μια σαφής επαγωγή έκφρασης πρωτεΐνης HNF4α παρατηρήθηκε μετά από 48 ώρες και 72 ώρες της θεραπείας Aroclor1254. β) δοκιμασίες μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας με πυρηνικό εκχύλισμα 2,5 μg Caco-2 κυττάρων και ολιγονουκλεοτίδια που αντιστοιχούν στην Α-θέση του υποκινητή HNF1α (HNF1pro) ως 32Ρ σημασμένο ανιχνευτή. Σε υπερμετατόπισης Δοκιμασίες ένα αντίσωμα που κατευθύνεται έναντι HNF4α (+) προστέθηκε. Η σύνδεση του HNF4α αυξήθηκε σημαντικά μετά από 72 ώρες από την επαγωγή Aroclor1254.

Η

Τέλος, δημοσιευμένα στοιχεία για HNF4α υπερεκφράζουν κυτταρικές σειρές θηλαστικών σε σύγκριση με τα δεδομένα της παρούσας μελέτης. Η επικάλυψη κυμαίνονταν από 65 σε 94% των γονιδίων που ταυτοποιούνται (Πίνακας S10). Είναι σημαντικό, η υψηλότερη επικάλυψη λήφθηκε σε μελέτες που απασχολούνται knock-down πειράματα siRNA για την επικύρωση ευρήματά τους [32]. Ως εκ τούτου, οι στόχοι γονίδιο που αναφέρονται εδώ μπορεί να θεωρείται πιο αξιόπιστη.

Συζήτηση

Στο παρελθόν, η έρευνα σχετικά με τους παράγοντες trans-δράσης και τις αντίστοιχες

cis

-Στοιχεία επικεντρώθηκε υποκινητή αμινο-εγγύς θέσεις πρόσδεσης. Με την ανάπτυξη των δοκιμασιών τσιπ τσιπ, γονιδιώματος σε επίπεδο σαρώνει για θέσεις πρόσδεσης παράγοντα μεταγραφής έγινε εφικτή. Αυτό βελτίωσε σημαντικά την κατανόηση των βασικών μηχανισμών του μεταγραφικού ελέγχου και μια αναγνώριση του υποκινητή άπω θέσεις πρόσδεσης διευκόλυνση εκδηλώσεις επεξεργασία του RNA.

Στην παρούσα μελέτη, ένα γονιδίωμα-ευρεία χάρτη των θέσεων δέσμευσης HNF4α κατασκευάστηκε. Αυτή η πρωτεΐνη παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του ήπατος, και κύριος ρυθμιστικό ρόλο του στην διατήρηση της μεταβολικής ικανότητας του ήπατος τόνωσε την έρευνα για HNF4α στοχευμένες θεραπείες του καρκίνου για την ικανότητά του να επανέλθει καρκίνου του ήπατος σε ένα λιγότερο επιθετικό φαινότυπο [35].

Οι παρούσες αποδείξεις μελέτη & gt? 90% των θέσεων δέσμευσης HNF4α να βρίσκονται σε περιοχές προαγωγού-άπω και αυτή η κατανομή των ES είναι παρόμοια με εκείνη που αναφέρθηκε για τον ΕΚα [13]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, με την εξαίρεση των περιοχών λιγότερο από 600 ζεύγη βάσεων στο TSS, θέσεις δέσμευσης είχαν συχνότερα κατάντη. Ως εκ τούτου, οι δοκιμασίες τσιπ τσιπ εστιάζοντας σε περιοχές υποκινητή μόνο [4], [36] θα μπορούσε να χάσει την πλειοψηφία των θέσεων δέσμευσης.

Επιπλέον, η ανάλυση των μοτίβων HNF4α εντός των περιφερειών ChIP εμπλουτισμένο καταδεικνύει ως υψηλή ακρίβεια και σε