Αφηρημένο

Ιστορικό

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα ( CSC) οδηγούν προστάτη επιβίωσης του όγκου του καρκίνου και μετάσταση. Παρ ‘όλα αυτά, η ανάπτυξη ειδικών θεραπειών έναντι ΚΕΠ παρεμποδίζεται από την έλλειψη αυτών των κυττάρων σε ιστούς του προστάτη. Τα συστήματα ανάρτησης καλλιέργειας έχουν αναφερθεί για τον εμπλουτισμό CSCs σε πρωτογενείς καλλιέργειες και κυτταρικές γραμμές. Ωστόσο, οι μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν αυτό το φαινόμενο δεν έχουν διερευνηθεί πλήρως.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Έχουμε περιγράψει μια δοκιμασία prostasphere για τον εμπλουτισμό του CD133

+ ΚΕΠ σε τέσσερις εμπορικές κυττάρων του προστάτη γραμμές: 22Rv1, DU145, LNCaP και PC3. Η υπερέκφραση του CD133, όπως προσδιορίστηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής, συσχετίζεται με αυξημένη κλωνογονική, χημειοθεραπεία, και επεμβατική δυναμικό in vitro. Αυτός ο φαινότυπος είναι σύμφωνη με εκείνη των ΚΕΠ in vivo. προφίλ γονιδιακής έκφρασης στη συνέχεια διεξάγεται χρησιμοποιώντας τον πίνακα του καρκίνου αναφοράς και το σύστημα nCounter από NanoString Technologies. Αυτή η ανάλυση αποκάλυψε αρκετές απορυθμίζεται μεταγραφές που μπορούν να διερευνηθούν περαιτέρω ως πιθανοί διαγνωστικοί δείκτες ή θεραπευτικούς στόχους. Επιπλέον, λειτουργική ανάλυση σχολιασμό δείχνει ότι ΔNp63α ρυθμίζει την ενεργοποίηση των αναπτυξιακών μονοπατιών υπεύθυνη για την αυξημένη ταυτότητα βλαστικών κυττάρων που αναπτύσσονται σε καλλιέργειες εναιωρήματος.

Συμπεράσματα /Σημασία

Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι το προφίλ των γενετικών μηχανισμών που εμπλέκονται στην CSC εμπλουτισμού θα μας βοηθήσει να κατανοήσουμε καλύτερα τις μοριακές οδούς που αποτελούν τη βάση CSC παθοφυσιολογία. Η πλατφόρμα αυτή μπορεί εύκολα να προσαρμοστεί για να εμπλουτίσουν και ποσοτικός προσδιορισμός πραγματική δείγματα ασθενών, με σκοπό το σχεδιασμό θεραπειών ειδικά για τον ασθενή που στοχεύουν ιδιαίτερα κατά ΚΕΠ

Παράθεση:. Πορτίγιο-Lara R, Alvarez MM (2015) Εμπλουτισμός του καρκινικά βλαστικά φαινότυπο σε Σφαίρα Πολιτισμών του καρκίνου του προστάτη κυτταρικών γραμμών πραγματοποιείται μέσω ενεργοποίησης της Αναπτυξιακής Μονοπάτια διαμεσολαβείται από τον μεταγραφικό ρυθμιστή ΔNp63α. PLoS ONE 10 (6): e0130118. doi: 10.1371 /journal.pone.0130118

Επιμέλεια: Γκάγκαν Βαθιά, Πανεπιστήμιο του Κολοράντο, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 9 Φεβ, 2015? Αποδεκτές: 18 Μαΐου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 25 Ιουνίου 2015

Copyright: © 2015 Portillo-Lara, Alvarez. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Πιο σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού και Υποστήριξη αρχείο πληροφοριών (S1 File) της, η οποία περιέχει όλες τις τιμές της γονιδιακής έκφρασης από τα πειράματά μας. δεδομένα γονιδιακής έκφρασης υποβλήθηκαν για την έκφραση του γονιδίου Omnibus αποθετήριο από το NCBI. Τα δεδομένα μπορούν να έχουν πρόσβαση στο δικτυακό τόπο GEO https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/υπό τον αριθμό ένταξης GSE67248

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς αναγνωρίζουν με ευγνωμοσύνη χρηματοδότηση από το Zambrano-Hellion Οικογένειας ( έργο ZH-Stem), Τεχνολογικό de Monterrey (χρηματοδότηση Seed CAT-122), και Consejo Nacional de Επιστήμης και Tecnología του Μεξικού (CONACYT). Οι συγγραφείς είναι ευγνώμονες προς (CONACYT) για την οικονομική στήριξη της ΑΠΜ, με τη μορφή ενός διδακτορικού Υποτροφιών

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η δεύτερη πιο συχνή κακοήθεια στον άνθρωπο σε όλο τον κόσμο, και όμως αιτιολογία της είναι ακόμη σε μεγάλο βαθμό άλυτο. Όπως συμβαίνει και σε άλλα επιθηλιακά ιστών, την κυτταρική ομοιόσταση στον ενήλικο προστάτη διατηρείται μέσω ιεραρχικά οργανωμένων κυττάρων με διαφορετικές πολλαπλασιαστική δυναμικά [1]. Σωματικά ΠΚ που βρίσκεται στην κορυφή της ιεραρχίας εμφανίζουν κάποια μοναδικά χαρακτηριστικά, όπως: η ικανότητα να αυτο-ανανέωση και διαφοροποίηση κατά μήκος αρκετών κυτταρικών σειρών, τοπική ανάπτυξη σε εξειδικευμένες φυσιολογικές μικροπεριβάλλοντα (κόγχες), και παρόλο που είναι συνήθως ήρεμα, εμφανίζουν μια αξιοσημείωτη πολλαπλασιαστικού δυναμικού [2]. Η ιεραρχική βλαστοκυττάρων (SC) μοντέλο καρκινογένεσης υποστηρίζει ότι PCa προέρχεται μέσω μεταβολών των γενετικών και επιγενετικών παραγόντων που ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό των φυσιολογικών SCs [3]. Αυτά εκφράζονται ανώμαλα μονοπάτια τελικά να οδηγήσει στη μετατροπή της κανονικής ΠΚ σε κακοήθη καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ). ΚΕΠ διατηρήσουν μερικά από τα χαρακτηριστικά που συνδέονται με μη-κακοήθεις τους ομολόγους τους, και πιστεύεται ότι είναι υπεύθυνη για την έναρξη του όγκου, της προόδου και της υποτροπής, καθώς και μεταστατική νόσο.

ΚΕΠ είναι επίσης πιστεύεται ότι είναι υπεύθυνη για την ανάπτυξη αντοχής σε συμβατικές θεραπείες [4,5]. Παραδοσιακά ακτινοθεραπεία και μέσα χημειο-θεραπευτικά συλλαμβάνονται υπό την έννοια ότι όλα τα κύτταρα εντός του όγκου είναι φαινοτυπικά ίσα. Ωστόσο, ΚΕΠ βασίζονται σε εγγενείς μηχανισμούς που καθιστούν συγκριτικά πιο ανθεκτικές από τερματικά διαφοροποιημένα κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων αργά πολλαπλασιαζόμενα φύση τους, την υψηλή έκφραση των μεταφορέων μεμβράνης ΑΤΡ-σύνδεσης κασέτας (ABC), και αντίσταση σε βλάβη του DNA και το οξειδωτικό στρες [6]. Ως εκ τούτου, CSC ειδικές θεραπείες έχουν τη δυνατότητα για την εξάλειψη της ασθένειας στον τόπο καταγωγής του, και να διαθέσει μη ογκογόνων ΠΚ, ελαχιστοποιώντας έτσι τις αρνητικές επιπτώσεις που συνδέονται με διαφορετικά nondiscriminating θεραπείες.

Οι τρέχουσες μεθοδολογίες για την απομόνωση και τη μελέτη των τα ΚΕΠ με βάση την έκφραση των δεικτών επιφανείας εντοπίστηκε για πρώτη φορά σε κανονική ΠΚ προστάτη (CD44

+ /α

2β

1

hi /CD133

+) [7]. CD133 ειδικότερα, έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως ως βιοδείκτη για την απομόνωση των κυττάρων τα οποία εμφανίζουν ένα φαινότυπο στέλεχος που μοιάζει σε μια ποικιλία φυσιολογικών και κακοηθών ιστών [8,9]. Το απομονωμένο μελέτη των ΚΕΠ επιτρέπει την ανάλυση των μοριακών μηχανισμών που ευθύνονται για κακοήθη κυτταρική επιβίωση, χωριστά από αυτές που παρουσιάζονται στον τελικά διαφοροποιημένα κύτταρα όγκου ή σε μη ογκογόνα πληθυσμούς SC. Παρ ‘όλα αυτά, η ανάπτυξη θεραπευτικών στρατηγικών που βασίζονται σε CSC-στόχευση έχει περιορισθεί λόγω της έλλειψης κατάλληλων πειραματικά μοντέλα.

Δείγματα ανθρώπινου πρωτογενούς όγκου (PTS) θεωρούνται ότι είναι η πιο ακριβή αναπαράσταση του όγκου in vivo . Ωστόσο, η πολυπλοκότητα της φυσιολογικής πλαίσιο επηρεάζει συχνά την ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Αντίθετα, κυτταρικές γραμμές ανθρώπινου καρκίνου (CCLs) είναι περισσότερο δυναμικές εργαλεία που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να τεμαχίσει τα πολλά διαφορετικά μοριακές διαδικασίες που εμπλέκονται στην καρκινογένεση. Αν και οι PTS ακόμη ευνοούνται έναντι CCLs, ιδιαίτερα περιορισμένη πρόσβαση τους καθιστά in vitro μοντέλα της «go-to» επιλογή για πολλές ερευνητικές ομάδες σε ολόκληρο τον κόσμο.

Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι CCLs είναι παρόμοιες με in vivo κακοήθεις όγκους, όπως μπορούν επίσης να αποτελείται από οργανωτικές ιεραρχίες με διαφορετικούς βαθμούς διαφοροποίησης [10-12]. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής κυτταρικών σειρών προστάτη υποδεικνύει ότι ακόμα και μετά από πολλαπλασιασμένα για χρόνια, αυτές εξακολουθούν να περιέχουν ανιχνεύσιμα αριθμοί των βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν, αν και συχνά σε εξαιρετικά χαμηλά ποσοστά. Pfeiffer et al. ανέφεραν ότι CD133

+ κυττάρων εντός του λογαριασμού κυτταρική γραμμή DU145 περίπου 0,01% του συνολικού πληθυσμού, ενώ DuCaP, LAPC-4, LNCaP, PC3 και 22Rv1 αποδώσει καμία ανιχνεύσιμη έκφραση CD133 όταν αναλύθηκε μέσω φθορισμό ενεργοποιημένων κυττάρων (FACS ) [13]. Έτσι, αν και CCLs αντιπροσωπεύουν μια πολύ προσιτή και πρακτική εναλλακτική λύση για PTSS, απομόνωση του ΚΕΠ από την πηγή αυτή παραμένει δύσκολη λόγω του μικρού αριθμού των αδιαφοροποίητα κύτταρα που περιέχονται στο εμπορικό κυτταρικές σειρές.

Τα συστήματα ανάρτησης πολιτισμό χρησιμοποιούνται όλο και περισσότερο για να εμπλουτίζουν αδιαφοροποίητο πληθυσμούς κυττάρων σε PTSS και CCLs. Τα κύτταρα πολλαπλασιάστηκαν με χρήση μη προσκολλημένα υποστρώματα και μέσα ελεύθερα ορού αυξάνεται καθώς τρισδιάστατο συστάδες σφαιροειδές κύτταρο (tumorspheres), που προάγουν τον πολλαπλασιασμό των προγονικών κυττάρων φαινοτύπων [14,15]. Αυτό είναι ένα πολύπλοκο φαινόμενο κατά το οποίο οι σπάνιες αδιαφοροποίητα κύτταρα διεγείρονται για να συμμετάσχουν σε συμμετρική διαίρεση για να επεκτείνετε τη θήκη SC. Αν και έχουν αρκετές παραλλαγές του προσδιορισμού tumorsphere έχουν αναφερθεί, οι γενετικοί μηχανισμοί που προκαλούν βλαστικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε σφαιροειδείς καλλιέργειες δεν έχουν διερευνηθεί πλήρως.

έκφραση Σύγχρονη γονιδίου εργαλεία ανάλυσης επιτρέπουν τη μελέτη των μεταγραφικών τροποποιήσεων με αυξημένη ευαισθησία και ειδικότητα , σε σύγκριση με συμβατικές προσεγγίσεις βάσει μικροδιάταξης που περιορίζονται από σημαντικές τεχνολογικές προκλήσεις [16]. Για παράδειγμα, το σύστημα nCounter Nanostring παραδίδει ψηφιακές ενδείξεις του κάθε μόριο του mRNA στόχου, χρησιμοποιώντας ελάχιστες ποσότητες υλικού έναρξης, και χωρίς την ανάγκη για τη σύνθεση cDNA [17]. Εν συντομία, το σύστημα αυτό κάνει χρήση των ζευγών δέσμευσης και δημοσιογράφος ανιχνευτές που είναι προσαρμοσμένα σε κάθε αλληλουχία-στόχο mRNA. Μετά την υβριδοποίηση, τα σύμπλοκα μετεγγραφής /ανιχνευτών ακινητοποιείται, ευθυγραμμισμένα σε ένα ηλεκτρικό πεδίο, που προσδιορίζονται και απαριθμούνται με βάση τις ετικέτες με χρωματικό κώδικα που συνδέονται με τον ανιχνευτή ανταποκριτή.

Σύζευξη τη δυναμική των in vitro μοντέλα με υψηλή -throughput γονίδιο προφίλ έκφρασης θα μπορούσε να βοηθήσει στην ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών CSC στοχευμένες θεραπευτικές στρατηγικές. Εδώ, έχουμε προσαρμόσει ένα πρωτόκολλο tumorsphere πολιτισμού για την αποτελεσματική εμπλουτισμό του CD133

+ ΚΕΠ σε τέσσερις εμπορικές κυτταρικές σειρές προστάτη: 22Rv1, DU145, LNCaP και PC3. Όλες οι κυτταρικές γραμμές ήταν σε θέση να σχηματίσουν εντόνως πολλαπλασιαστικά και αυτο-ανανέωση σφαίρες όταν απλώνονται στα, ανεξάρτητη από προσκόλληση συνθήκες χωρίς ορό που χρησιμοποιήσαμε. Έχουμε αποδείξει ότι η CSC που σχετίζονται με τα χαρακτηριστικά (π.χ., έκφραση CD133, καθώς και η αυξημένη πολλαπλασιαστική, επεμβατική, και στη χημειοθεραπεία δυναμικό) ήταν σημαντικά εμπλουτισμένη σε όλους τους πολιτισμούς prostasphere. Γονιδιακή προφίλ έκφρασης των γονικών και εμπλουτισμένες καλλιέργειες με τη χρήση του συστήματος nCounter NanoString αποκάλυψε αρκετές απορυθμίζεται μεταγραφές που συμμετέχουν στη δημιουργία του κακοήθους φαινοτύπου του στελέχους. Επιπλέον, οι λειτουργικές σχολιασμό υποδηλώνει ότι η CSC-εμπλουτισμός παρατηρήθηκε σε καλλιέργειες prostasphere λαμβάνει χώρα μέσω της ενεργοποίησης των αναπτυξιακών μονοπατιών διαμορφωμένου εν μέρει από τον μεταγραφικό ρυθμιστή ΔNp63α.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και τα πρωτόκολλα καλλιέργειας

Όλες οι κυτταρικές σειρές που αγοράζονται απευθείας από την ATCC. Τα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν στους ακόλουθους αριθμούς απόσπασμα: 22Rv1, δίοδο 11? DU145, απόσπασμα 16? LNCaP, απόσπασμα 13? PC3, πέρασμα 18. Για την έκφραση του γονιδίου προφίλ πειράματα, τα κύτταρα PC3 αναπτύχθηκαν σε 6-πηγαδιών πλάκες καλλιέργειας προσκόλλησης εξαιρετικά χαμηλή, με EpiGRO ανθρώπινου προστάτη Complete Kit Media (hPCM, Millipore). Για το υπόλοιπο των πειραμάτων, οι τέσσερις κυτταρικές σειρές πολλαπλασιάστηκαν χρησιμοποιώντας τρία διαφορετικά πρωτόκολλα καλλιέργειας: α) DMEM-FBS: καλλιέργειες μονοστιβάδας σε DMEM-F12 (Gibco) συμπληρωμένο με ορό 5% εμβρυϊκό ορό (FBS, Invitrogen) και 100 U /100 μg /ml πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (Gibco)? β) DMEM-PLUS: σφαίρα μη προσκολλημένα (prostasphere, PS) καλλιέργειες που αναπτύσσονται σε πλάκες 6-φρεατίων εξαιρετικά χαμηλής καλλιέργειας προσκόλλησης (Corning) με DMEM-F12 συμπληρωμένου με 20 ng /μl hEGF (Gibco), 20 ng /μl bFGF (Gibco), 1χ Β27 χωρίς βιταμίνη Α (Invitrogen), 1χ Insulin-τρανσφερίνης-Σελήνιο Α (Invitrogen) και 100 U /100 μg /ml πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη? και γ) hPCM-PLUS: καλλιέργειες σφαίρα σε hPCM, περαιτέρω συμπληρωμένο με 20 ng /μl hEGF και 20 ng /μl bFGF. Καλλιέργειες μονοστιβάδας διατηρήθηκαν σε ανώτατο επίπεδο συρροή 80% και το μέσο καλλιέργειας αντικαταστάθηκε κάθε 48 ώρες. Prostasphere καλλιέργειες σπάρθηκαν σε πυκνότητα 2×10

4 κύτταρα /ml και μέσα καλλιέργειας αντικαταστάθηκε πλήρως κάθε 96 ώρες ημέρα 4, και 8. Η γονική και prostasphere καλλιέργειες πολλαπλασιάστηκαν επί 12 ημέρες στους 37 ° C σε 95% σχετική υγρασία σε ένα 5%

2 και 95% ατμόσφαιρα αέρα CO. Στο τέλος του πρωτοκόλλου καλλιέργειας, τα κύτταρα που αναπτύσσονται σε μονοστιβάδα και εναιώρημα καλλιέργειες ενζυματικά διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας 0,05% διάλυμα θρυψίνης-ΕϋΤΑ (Gibco) και StemPro Accutase (Gibco), αντίστοιχα, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

επισήμανσης ανοσοφθορισμού, ταξινόμηση κυττάρων, και κυτταρομετρία ροής ανάλυση

διαχωρισμένα κύτταρα σημασμένα με φθορισμό σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας δύο μονοκλωνικά αντισώματα: Αντι-Ανθρώπινο CD133 /2 (293C3) ΡΕ (Miltenyi Biotec) και αντι-Ανθρώπινη CD44 PE-Cyanine5 (eBioscience). Μαγνητική-ενεργοποιούμενο κυτταρικό διαχωρισμό (MACS) πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μικροσφαιρίδια αντι-φυκοερυθρίνη (Miltenyi Biotec) και η /2 (293C3) ΡΕ μονοκλωνικό αντίσωμα CD133 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκε με ροή FACSCanto II κυτταρόμετρο με ένα λέιζερ 488-nm. Ένα ελάχιστο των 10

4 γεγονότα καταγράφηκε για κάθε ανάγνωση. Anti-Mouse IgG2b-ΡΕ ελέγχου ισοτύπου (Miltenyi) και μη χρωματισμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

nCounter NanoString προφίλ γονιδιακής έκφρασης.

Ολικό RNA εξήχθη από prostaspheres PC3 και καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy Mini ή Micro ανάλογα με την ποσότητα του αρχικό υλικό (Qiagen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ακεραιότητα του καθαρισμένου RNA δείγματα εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας NanoDrop ND-1000 φασματοφωτόμετρο στα 260/280 nm. Ανίχνευση μεταγραφών mRNA Εν συνεχεία πραγματοποιήθηκε σε αντιδράσεις υβριδισμού πολυπλεξίας χρησιμοποιώντας το Σύστημα NanoString nCounter Analysis. Δύο διαφορετικές CodeSets Expression nCounter Gene χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση: το GX Human Cancer Kit αναφοράς που αποτελείται από 230 γονίδια που σχετίζονται με τον καρκίνο, και η παραγγελία ITESM codeset που αποτελείται από 14 PCA-σχετιζόμενα γονίδια (NanoString Technologies). απόκτηση δεδομένων και κανονικοποίηση διεξήχθη με τη χρήση του nSolver Analysis έκδοση λογισμικού 2.0 (NanoString Technologies). Μέσες μεταβολές φορές (τις αναλογίες, η = 3) του κάθε γονιδίου υπολογίστηκαν από κανονικοποιημένα δεδομένα και ανάλογα με τη χρήση του Microsoft Excel. Γονίδια με μια πτυχή της αλλαγής & gt? 1.5 επιλέχθηκαν για περαιτέρω ανάλυση (Πίνακας 1). Γενικοί ορισμοί για κάθε γονίδιο ανακτήθηκαν από την ιστοσελίδα εγκυκλοπαίδεια GeneCards (www.genecards.org) [18].

Η

Prostasphere αυτο-ανανέωση

δοκιμασία

Το ποσοστό των κυττάρων σε εμπλουτισμένο καλλιέργειες ικανού να δημιουργήσει νέες prostaspheres προσδιορίστηκε με επίστρωση κυττάρων σε πυκνότητα 1×10

3 κύτταρα /ml σε μέσα μαζικής ενημέρωσης hPCM-PLUS. Την ημέρα 10 της καλλιέργειας, οι σφαίρες (& gt? 100 μm) βαθμολογήθηκαν, σε διάσταση, και υπο-καλλιεργήθηκαν κάτω από τις ίδιες συνθήκες. Αυτή η διαδικασία επαναλήφθηκε δύο φορές προκειμένου να λάβει 2

ου και 3

prostaspheres ης γενιάς κατά την ημέρα 20 και 30, αντίστοιχα. αποδοτικότητα σχηματισμός Sphere (SFE) υπολογίστηκε ως ο αριθμός των prostaspheres δημιουργείται από τον αριθμό των κυττάρων seeded, πολλαπλασιαζόμενο επί 100. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τρεις φορές. Μετέπειτα πειράματα πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση σφαιρών πρώτη γενιά μόνο

Colony κυττάρων που σχηματίζουν (CFC) δοκιμασίες

δοκιμασίες CFC Αναστολή διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας StemXVivo συμπύκνωμα μεθυλοκυτταρίνη. (R &? D Systems) σε συνδυασμό με DMEM-FBS χωρίς ερυθρό της φαινόλης ή μέσα hPCM-PLUS. Εν συντομία, 1×10

3 κύτταρα σπάρθηκαν σε τρυβλία Petri 35 mm με ημιστερεό μέσο καλλιέργειας. Μετά από 14 ημέρες, οι καλλιέργειες έγιναν ορατά κάτω από ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο και οι αποικίες μεγαλύτερες από 100 μπι με το χέρι δέχεται κατά μέσο όρο από 5 τυχαία πεδία ανά πιάτο. Για προσκολλητικά δοκιμασίες CFC, 1×10

3 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 35-mm πιάτα κατεργασμένη καλλιέργεια ιστού με DMEM-FBS ή hPCM-PLUS. Μετά από 14 ημέρες, οι καλλιέργειες σταθεροποιήθηκαν χρησιμοποιώντας 3,7% φορμαλδεΰδη σε PBS (1Χ) και βάφτηκαν με διάλυμα χρωστική κρυσταλλικού ιώδους (Fisher Scientific). Αποικίες που αποτελείται περίπου από περισσότερα από 50 κύτταρα βαθμολογήθηκαν. Η ανάλυση εικόνας πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού ImageJ (rsbweb.nih.gov/ij). αποδοτικότητες σχηματισμού αποικίας υπολογίστηκαν ως το ποσοστό των επιστρώθηκαν κυττάρων που ήταν σε θέση να σχηματίσουν κλώνους. Πειράματα CFC Αναστολή διεξήχθησαν εις διπλούν και επαναλήφθηκαν τρεις φορές. πειράματα προσκολλημένα CFC πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

In vitro χημειοαντίσταση δοκιμασία

Η βιωσιμότητα των κυττάρων για την αντιμετώπιση της χημειοθεραπευτικό φάρμακο Docetaxel εκτιμήθηκε με τη χρήση του CellTiter 96 AQ

ueous One Λύση Αντιδραστήριο (Promega). Η βασική ευαισθησία φαρμάκου καλλιεργειών αναφοράς συστάθηκε με επίστρωση 1×10

4 κύτταρα και από τις τέσσερις κυτταρικές σειρές προσκολλημένων PCA σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 96 φρεατίων σε 100 μλ DMEM-F12. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα επωάστηκαν με 100 μΐ DMEM-F12 σε τελική συγκέντρωση 10, 5, 2.5, 1.25, και 0.625 μg /ml docetaxel (Sigma-Aldrich). Στη συνέχεια, και με βάση την συμπεριφορά των καλλιεργειών αναφοράς που εκτίθενται σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις Docetaxel, prostasphere καλλιέργειες αναλύθηκαν με παρόμοιο τρόπο. Εν συντομία, 1×10

4 κύτταρα μονοστοιβάδας, όπως επίσης και CD133

+ – διαλογή και μη ταξινομημένα κύτταρα prostasphere απλώθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε τελική συγκέντρωση 5 και 10 μg /ml docetaxel σε 100 μΙ μέσο καλλιέργειας. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Κάθε αγωγή διεξήχθη εις τριπλούν, και το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές.

In vitro βασικής μεμβράνης μήτρα εισβολή

δοκιμασία

Η επεμβατική δυναμικό αναφοράς και εμπλουτίζεται κυτταρικές σειρές προστάτη αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία Transwell . Εν συντομία, 12 ημερών καλλιέργειες διαχωρίστηκαν και διατηρήθηκαν σε DMEM-F12 άνευ ορού (για μονοστρωματικές καλλιέργειες) και DMEM-F12 άνευ ορού χωρίς ερυθρό φαινόλης (για καλλιέργειες prostasphere) για 24 ώρες. Πεινασμένο καλλιέργειες ήταν τότε εμβολιάζονται σε 200 μΙ μέσου χωρίς ορό επί 6,5 mm Transwell ένθετα με ένα 8-μm μεμβράνη με μέγεθος πόρων ΡΕΤ (Corning), επικαλυμμένα με 50 μΙ Geltrex LDEV χωρίς μήτρα μειώνεται βασικής μεμβράνης αυξητικού παράγοντα (Gibco) σε πυκνότητα των 1×10

5 κύτταρα ανά ένθετο. Ένας όγκος 650 μΐ DMEM-FBS προστέθηκε στον κάτω θάλαμο ως χημειοελκτικό. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C και αφέθηκε να εισβάλουν μέσω της μήτρας για 24 ώρες. Μη εισβάλλοντας κύτταρα απομακρύνθηκαν προσεκτικά από τον άνω θάλαμο χρησιμοποιώντας ένα μάκτρο βάμβακος. Εισβάλλοντας κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας διάλυμα χρώση κρυσταλλικού ιώδους. Ο αριθμός των μετανάστευσαν κυττάρων υπολογίστηκε από τις εικόνες των πέντε πεδία τυχαίων x10 άποψη που αποκτήθηκαν με Axiovert 200 ανεστραμμένο μικροσκόπιο. Οι εικόνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν και επαναλήφθηκε δύο φορές.

Λειτουργική ομαδοποίηση σχολιασμό και την οντολογία γονιδίων (GO) ανάλυση

Ο DAVID Λειτουργική εργαλείο σχολιασμού [19] και το εργαλείο ανάλυσης υπερεκπροσώπηση των ConsensusPathDB [20 ] χρησιμοποιήθηκαν για τον εντοπισμό υπερεκπροσωπούνται μονοπάτια χρησιμοποιώντας δεδομένα από απορυθμίζεται γονίδια (πάσο αλλαγή & gt? 1.5) σηματοδότησης. μέσω της ανάλυσης λειτουργικών εμπλουτισμό

Στατιστική ανάλυση

τα αποτελέσματα για τις συνεχείς μεταβλητές εκφράζονται ως μέσοι όροι ± τυπική απόκλιση (StdDev). Κατά ζεύγη πολλαπλές συγκρίσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) που ακολουθείται από δοκιμή του Tukey HSD (* Ρ & lt? 0,05). Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση JMP έκδοση 9.0.

Αποτελέσματα

22Rv1, DU145, LNCaP και PC3 είναι σε θέση να αυξηθεί η αυτο-ανανέωση σφαίρες που μπορούν να περνιούνται σειριακά in vitro

Tumorsphere ικανότητα σχηματισμού αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μια πυκνότητα σποράς 2×10

4 κύτταρα /ml σε 6 φρεατίων εξαιρετικά χαμηλής πλάκες στερεώσεως που περιέχει 2 mL μέσου hPCM-PLUS. Όλες οι τέσσερις κυτταρικές σειρές προστάτη σχηματίζονται σφαιρικές αποικίες από την 4η ημέρα της καλλιέργειας. Γονική προσκολλημένες καλλιέργειες διαδόθηκαν ταυτόχρονα σε ανώτατο επίπεδο συμβολή των 80%. Ημέρα 12 tumorspheres και μονοστοιβάδες (Σχήμα 1Α) διαχωρίστηκαν και αναλύθηκαν για την έκφραση του CSC που σχετίζεται βιοδείκτες CD133 και CD44. Η έκφραση του CD44 ανιχνεύθηκε ετερογενώς σε υψηλά επίπεδα σε PC3 και DU145 κύτταρα, ενώ ελάχιστο έως καθόλου ανιχνεύσιμη έκφραση παρατηρήθηκε σε 22Rv1 και LNCaP κύτταρα (Εικ S1A). Το σχήμα 1Β δείχνει ότι CD133 παρατηρήθηκε σταθερά σε εξαιρετικά χαμηλά επίπεδα (& lt? 0,5%) σε όλες τις κυτταρικές σειρές. Ο πίνακας δείχνει επίσης ότι, σε αντίθεση με τη γονική τους πολιτισμούς, το ποσοστό των CD133

+ γεγονότα αυξήθηκε σημαντικά (

σ

& lt? 0,05) σε όλους τους πολιτισμούς prostasphere της 22Rv1 (0,067% ± 0.058% έως 4.267% ± 1,419%), DU145 (0,433% ± 0,252% έως 2,433% ± 0,709%), LNCaP (0.033% ± 0,058% έως 4,033% ± 1,966%), και PC3) κύτταρα (0,133% ± 0,058% έως 4,467% ± 1,358% . Prostaspheres φτάσει γρήγορα διαμέτρους & gt? 100 μm από την ημέρα 12 της καλλιέργειας (Σχήμα 2Α). Τα κύτταρα 22Rv1 και DU145 σχηματίζεται συμπαγές και στρογγυλό σχήμα σφαίρες με καλά οριοθετημένο σύνορα, ενώ η LNCaP και ιδιαίτερα τα κύτταρα PC3 σχηματίζονται πιο ακανόνιστες δομές που αποτελούνται από μεγαλύτερα μεμονωμένα κύτταρα. Η σφαίρα που σχηματίζει απόδοσης (SFE) αξιολογήθηκε για πρώτης (Ημέρα 10), δεύτερου (Ημέρα 20), και των τρίτων (Ημέρα 30) σφαίρες γενιάς. SFE σταθερά αυξημένη (

σ

& lt? 0,05) με κάθε νέα γενιά σε όλες τις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 2Β). Είναι ενδιαφέρον, άμεση παρατήρηση των PC3 και DU145 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε εναιώρημα αποκάλυψε περαιτέρω εκβλάστηση από prostaspheres σε αυτό το σημείο (S1B σχήμα). Η παρατήρηση αυτή υποδηλώνει την πιθανότητα σχηματισμού διακλάδωσης δομές από τις καθιερωμένες σφαίρες.

Α) μικροσκοπική εξέταση της γονικής μονοστιβάδες (ADH) δίπλα στο prostasphere εμπλουτισμένο (SUS) πολιτισμών. ADH καλλιέργειες σε DMEM-FBS εμφανίζουν χαρακτηριστική μορφολογία του επιθηλίου, και είναι σε στενή επαφή με το ένα το άλλο. SUS πολιτισμούς hPCM-PLUS εμφανίσει ετερογενή μορφολογίες, που κυμαίνονται από σφιχτό, στρογγυλό σχήμα σφαιρών (22Rv1 και DU145) σε μεγαλύτερο και πιο ακανόνιστες δομές (LNCaP και PC3). Οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικές των 12 ημερών μονοστρωματική και πρωτογενείς καλλιέργειες σφαίρα. Κλίμακα bar = 200 μm. Β) Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των προσφάτως απομονωμένων γονικής (ADH) και prostasphere (SUS) κύτταρα για την ταυτοποίηση του CD133

+ υποπληθυσμούς. Εκπρόσωπος οικόπεδα dot της ΡΕ-επισημασμένο CD133 + (293C3) κύτταρα

. Ποσοστά που φαίνεται να αντιστοιχεί στο μέσο όρο των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Α) μορφολογικό χαρακτηρισμό πρωτογενών prostaspheres καλλιεργούνται σε hPCM-PLUS. Όλες οι κυτταρικές σειρές προστάτη σχηματίζεται ορατή σφαίρες από την 4η ημέρα της καλλιέργειας. 22Rv1 και DU145 σφαίρες αποτελούνται από μικρότερα και πιο σφιχτά συσκευάζονται μαζί κυττάρων. LNCaP και PC3 κύτταρα φαίνονται μεγαλύτερα και πιο χαλαρά οργανωμένη. Κλίμακα bar = 100 μm. αποτελεσματικότητα Β) σχηματισμού σφαίρας (SFE) των πολιτισμών prostasphere. κύτταρα προστάτη σπάρθηκαν σε πυκνότητα 1×10

3 κύτταρα /ml σε πλάκες 6-φρεατίων εξαιρετικά χαμηλής προσκόλλησης σε hPCM-PLUS και επωάστηκαν για 10 ημέρες. Τα προκύπτοντα prostaspheres μπορούσαν να ανακαλλιεργούνται σειριακά in vitro για μέχρι τρεις γενεές (G1-G3). SFE σφαιρών αυξήθηκε σταθερά σε όλες τις κυτταρικές σειρές προστάτη με κάθε γενιά. Καμία περαιτέρω ενίσχυση επιχειρήθηκε σε αυτό το σημείο. Τρία ανεξάρτητα πειράματα διεξήχθησαν, το καθένα εις τριπλούν. Κλίμακα bar = 100 μm. (*

σ

& lt? 0,05)

Η

CD133

+ prostasphere κύτταρα επιδεικνύουν αυξημένη ικανότητας κλωνισμού τόσο προσκολλημένη και ημιστερεά κυττάρων προσδιορισμούς σχηματισμού αποικιών (CFC)

Η αποτελεσματικότητα σχηματισμού αποικίας (CFE) των γονικών καλλιεργειών καθώς και τα κύτταρα prostasphere προερχόμενα προσδιορίστηκαν παράλληλα σε ημιστερεά (Σχήμα 3Α) και προσκολλημένα (Σχήμα 3C) δοκιμασίες CFC. CFE τιμές για μονοστοιβάδας και prostasphere καλλιέργειες ήταν παρόμοια μεταξύ των προσδιορισμών αλλά παρατηρήσαμε μια σταθερά υψηλότερο αριθμό μεμονωμένων αποικιών σε ημιστερεό (Σχήμα 3Β) σε σύγκριση με προσκολλημένα συνθήκες (Εικ 3D). Και οι τέσσερις prostasphere εμπλουτισμένο κυτταρικές γραμμές που εμφανίζονται υψηλότερες κλωνογονικότητας σε αμφότερες τις δοκιμασίες σε σύγκριση με μη εμπλουτισμένο αντίστοιχά τους (

ρ

& lt? 0,05). PC3 κύτταρα εμφάνισαν την υψηλότερη κλωνογονικότητας για τα προσκολλημένα και ημιστερεά δοκιμασίες. τιμές CFE ήταν σταθερά υψηλότερα σε CD133

+ κύτταρα (

σ

& lt? 0,05) σε σύγκριση με τη γονική και μικτές κύτταρα prostasphere για όλες τις κυτταρικές σειρές, εκτός από την κυτταρική σειρά LNCaP. Εμείς δεν ήταν σε θέση να τηρήσει μια στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ CD133

+ κυττάρων και μικτές prostaspheres (

σ

& lt? 0,05) στη δοκιμασία προσκολλημένη CFC. Ωστόσο, CD133

+ LNCaP κύτταρα φάνηκε να είναι πιο κλωνογονικού από αδιαχώριστα prostaspheres όταν χρησιμοποιούν την παραλλαγή αναστολή της δοκιμασίας.

Α) Εκπρόσωπος μικρογραφίες των αποικιών αναστολή από γονική (ADH) και CD133

+ κύτταρα. Β) ημισκληρά κυττάρων σχηματισμού αποικίας (CFC) δοκιμασίας. Parental (ADH) και prostasphere (SUS) καλλιέργειες διαχωρίστηκαν κατά την ημέρα 12 της καλλιέργειας. CD133

+ κύτταρα απομονώθηκαν μέσω MACS χρησιμοποιώντας το αντίσωμα 293C3. 1×10

3 κύτταρα από κάθε συνθήκη σπάρθηκαν σε τρυβλία Petri 35 mm με StemXVivo μεθυλοκυτταρίνη συμπύκνωμα αναμιγνύεται με DMEM-FBS ή hPCM-PLUS. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσοι όροι ± StdDev. (*

σ

& lt? 0,05). Γ) Εκπρόσωπος μικρογραφίες των προσκολλημένων αποικιών από γονική (ADH) και CD133

+ κύτταρα. Δ) Τα προσκολλημένα κυττάρων σχηματισμού αποικίας (CFC) δοκιμασίας. Τα κύτταρα υπέστησαν επεξεργασία όπως περιγράφεται προηγουμένως για ημιστερεές δοκιμασία CFC. Στη συνέχεια, 1×10

3 κύτταρα σπάρθηκαν σε τρυβλία Petri 35 mm με DMEM-FBS ή hPCM-PLUS. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσοι όροι ± StdDev. (*

σ

& lt? 0,05).

Η

Prostasphere κουλτούρες είναι πιο ανθεκτικά στο χημειοθεραπευτικό φάρμακο Docetaxel

ΚΕΠ υπέθεσε ότι είναι υπεύθυνη για την αντίσταση του προστάτη σε χημειοθεραπευτικά ναρκωτικά. Εκτιμήσαμε το βασικό χημειοαντίσταση των γονικών κυττάρων μονοστοιβάδας με επώαση όλες τις κυτταρικές σειρές με αυξανόμενες συγκεντρώσεις docetaxel (0,625 – 10 μg /ml) για 24 ώρες (Σχ 4Α). Η βιωσιμότητα των κυττάρων μειώθηκε σταθερά, αλλά 22Rv1 και LNCaP κύτταρα παρουσίασαν μεγαλύτερη ευαισθησία στο φάρμακο. Παρατηρήσαμε μια διαφορική απόκριση στα 5 και 10 μg /ml docetaxel? Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήσαμε αυτές τις συγκεντρώσεις για την περαιτέρω αξιολόγηση της χημειοαντίσταση της prostaspheres. Χημειοαντίσταση στις δύο συγκεντρώσεις Docetaxel αυξήθηκε σημαντικά (

ρ

& lt? 0,05) από ότι παρατηρήθηκε στις γονικές κυτταρικές σειρές σε όλα tumorsphere καλλιέργειες (Σχήμα 4Β). Prostasphere προερχόμενα κύτταρα DU145, ειδικότερα, έδειξε την υψηλότερη κυτταρική βιωσιμότητα και στις δύο συγκεντρώσεις: 85,58% ± 7,32% στα 10 μg /ml, και 91.35% ± 8,74% στα 5 μg /ml. Καμία στατιστικά σημαντική διαφορά δεν βρέθηκε μεταξύ CD133-διαλογή και χωρίς διαλογή prostasphere πολιτισμούς.

Α) Ίδρυση της βασικής ευαισθησία της γονικής πολιτισμών στη docetaxel. 1×10

4 κύτταρα από 12-ημερών καλλιέργειες μονοστοιβάδας old επωάστηκαν με 100 μΐ DMEM-FBS σε τελική συγκέντρωση 10, 5, 2.5, 1.25, και 0.625 μg /ml docetaxel. 22Rv1 και LNCaP κύτταρα συσσωρεύονται μαζί και παρουσιάζουν υψηλότερη ευαισθησία στο φάρμακο σε σύγκριση με DU145 και τα κύτταρα PC3. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσοι όροι ± StdDev. Β) Αξιολόγηση της χημειοαντίσταση της γονικής και prostasphere κύτταρα. 1×10

4 κύτταρα από προσκολλημένα (Α) και prostasphere (S) καλλιέργειες επωάστηκαν με 100 μΐ DMEM-FBS ή μέσων hPCM-PLUS, σε μια τελική συγκέντρωση των 5 και 10 μg /ml docetaxel. κύτταρα Prostasphere εμφανίζουν σημαντική αύξηση χημειοαντίσταση με docetaxel. Το σχήμα δείχνει το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων σε σχέση με τον έλεγχο μη επεξεργασμένων. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσοι ± StdDev (*

ρ

& lt? 0,05).

Η

CD133

+ prostasphere κύτταρα εμφανίζουν αυξημένη επιθετική πιθανότητα σε σχέση με τη γονική καλλιέργειες μονοστοιβάδας in vitro

για προχωρημένους του προστάτη έχει την τάση να εξαπλώνεται στους κόμβους των οστών και των λεμφαδένων. Ως εκ τούτου, εκτελέσαμε μία δοκιμασία εισβολής Transwell για τον προσδιορισμό του μεταστατικού δυναμικού των γονικών και εμπλουτισμένες καλλιέργειες. Μετά την επώαση για 48 ώρες, οι αριθμοί των κυττάρων που εισέβαλαν μέσω του ενθέτου Transwell ήταν σημαντικά υψηλότερο για τα prostaspheres ό, τι για τα γονικά κύτταρα μονοστοιβάδας (

ρ

& lt? 0,05) (Σχήμα 5Α). Στη συνέχεια, θα εξεταστεί περαιτέρω ο ρόλος των + κυττάρων CD133

στη μετανάστευση των κυττάρων του προστάτη και ως εκ τούτου, την καθιέρωση μεταστατικών βλαβών. Το CD133

+ κυττάρων σε όλες τις κυτταρικές σειρές ήταν σημαντικά πιο επεμβατική από τα μη ταξινομημένα prostaspheres (

σ

& lt? 0,05). Είναι ενδιαφέρον, CD133

+ DU145 κύτταρα παρουσίασαν την υψηλότερη επεμβατική δυναμικό (416,55 ± 40,161 /πεδίο). Σχήμα 5Β δείχνει αντιπροσωπευτικές μικροφωτογραφίες των τυχαίων πεδίων με εισβολή κυττάρων από προσκολλημένα, prostasphere, και

+ κύτταρα CD133.

Α) δοκιμασία εισβολή Transwell. 1×10

5 γονική (ADH), prostasphere (SUS), και CD133

+ κύτταρα σπάρθηκαν σε 200 μΙ ελεύθερο ορού DMEM-F12 χωρίς ερυθρό φαινόλης σε ένθετα Transwell καλύπτονται με 50 ml Geltrex LDEV χωρίς μειωμένη παράγοντα ανάπτυξης μήτρα βασικής μεμβράνης. Τα κύτταρα αφέθηκαν να εισβάλλουν μέσω της μήτρας για 24 ώρες. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσοι όροι ± StdDev. (*

σ

& lt? 0,05). Β) Εκπρόσωπος εικόνες της Transwell ένθετα που δείχνει εισβάλλοντας κύτταρα χρωματίζονται με διάλυμα κρυσταλλικού ιώδους.

Η

Αναγνώριση υπερεκφράζεται γονιδίων σε καλλιέργειες prostasphere εμπλουτισμένο και CD133

+ κύτταρα

προφίλ γονιδιακής έκφρασης των ιστών του καρκίνου έχει τη δυνατότητα να βελτιώσει τις τρέχουσες διαγνωστικές και προγνωστικές ταξινομήσεις, και να αποκαλύψει εικόνα για την υποκείμενη παθοφυσιολογία CSC. Εδώ, έχουμε ως στόχο να προσδιορίσει υπερεκφράζεται γονίδια σε μαγνητικά ταξινομημένο και μη ταξινομημένα κύτταρα PC3 prostasphere, σε σύγκριση με τη γονική μονοστρωματικές καλλιέργειες. δεδομένων γονιδιακής έκφρασης υποβλήθηκε για την έκφραση του γονιδίου Omnibus αποθετήριο από το NCBI και μπορεί να έχει πρόσβαση στην ιστοσελίδα GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) με τον αριθμό προσχώρησης GSE67248. Ο Πίνακας 1 παραθέτει απορυθμίζεται μεταγραφές (αναλογία & gt? 1.5) στο CD133 + διαλογή και χωρίς διαλογή κυττάρων prostasphere (Βλέπε Πίνακα A στο S1 αρχείου για το σύνολο των δεδομένων). Το σχήμα 6Α δείχνει την ιεραρχική συσταδοποίηση των σχετικών μεταβολών φορές στα 244 γονίδια που αναλύθηκαν, σε όλες τις 12 ημέρες καλλιέργειας. Αυτή η γραφική παράσταση δείχνει πώς οι συνθήκες καλλιέργειας να προκαλέσει παγκόσμιες αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση μέσα στο χρόνο. Λειτουργική σχολιασμό ομαδοποίηση των απορυθμίζεται γονιδίων με παρόμοια βιολογική λειτουργία περιλαμβάνονται: πρωτεΐνες που περιέχουν προβλεπόμενες θέσεις γλυκοζυλίωσης και αλληλουχίες στόχευσης τους στο εκκριτικό μονοπάτι, συνδεδεμένη με μεμβράνη πρωτεΐνες, πρωτεΐνες που συμμετέχουν στην κυτταρική προσκόλληση και την οργάνωση δομή κυτταρικής επιφάνειας, και πρωτεΐνες με δραστικότητα κινάσης τυροσίνης.

Α) χάρτης θερμότητας που δείχνει πολλαπλές μεταβολές στη γονιδιακή έκφραση από prostaspheres την ημέρα 4 (Ρ2), ημέρα 8 (Ρ3), ημέρα 12 (Ρ4), και απομονωμένων CD133

– (P4_N) και CD133

+ (P4_P) κλάσματα σε σχέση με τη γονική καλλιέργειες την ημέρα 0. οι τιμές αντιστοιχούν στο Log2 μετασχηματισμένο αναλογίες του μέσου (n = 3). Το σχήμα δείχνει την συμπεριφορά των 244 γονιδίων δοκιμάστηκαν σε όλο το χρονικό διάστημα τα κύτταρα διατηρούνται σε καλλιέργεια. Β) Gene Ontology (GO) ανάλυση των απορυθμίζεται μεταγραφές στο CD133

+ κύτταρα. GO βιολογικές διαδικασίες εμπλουτισμένο με CD133

+ κύτταρα είναι όλα σχετίζονται με αναπτυξιακά μονοπάτια (

σ

* & lt? 0,01). Το πλάτος άκρη αντανακλά τη σχετική επικάλυψη μεταξύ των κόμβων (% μοιράζεται γονίδια). Το χρώμα άκρη κωδικοποιεί τον αριθμό των κοινών μελών μεταξύ ολόκληρης της κατηγορίας GO και ορίζεται από το χρήστη φόντο (CodeSets). μέγεθος Sphere είναι σε σχέση με τον αριθμό των γονιδίων που σχετίζονται με την εν λόγω κατηγορία. Γ) μοριακές αλληλεπιδράσεις της μεταγραφικής ρυθμιστικής ΔNp63α με απορυθμίζεται γονίδια ανιχνεύονται σε CD133

+ κύτταρα.

ATM

,

TP63

,

IGFBP3

,

Notch1

,

BRCA2

,

IL1A

και em

οι TOP2

γονιδίων απορυθμίζεται σε CD133

+ κυττάρων και φαίνεται να μεσολαβήσει στην κατάντη ενεργοποίηση των αναπτυξιακών μοριακών οδών. Το τετραμερές ΔNp63α εμφανίζεται στο κέντρο του σχήματος είναι γνωστό ότι αλληλεπιδρά φυσικά με αυτά τα γονίδια.