Αφηρημένο

microRNA 130β (miR-130b) είναι σημαντικά απορυθμίζεται σε διάφορους τύπους ανθρώπινου όγκου. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία μικροσυστοιχιών, χαρακτηρίσαμε την προς τα πάνω ρύθμιση του miR-130b έκφρασης σε καρκίνο του παχέος εντέρου δείγματα (CRC). Ωστόσο, υπάρχει περιορισμένη γνώση σχετικά με τους ρόλους της ανώμαλης miR-130b έκφραση στο CRC. Οι μελέτες μας σε κύτταρα CRC έδειξε ότι miR-130b μειώνει σημαντικά τη μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή, αλλά δεν έχει προφανώς αποτελέσματα επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και την απόπτωση. Στην κύτταρα miR-130Β CRC και τα δείγματα CRC υπερέκφραση, παρατηρήσαμε μια μειωμένο επίπεδο ιντεγκρίνης πρωτεΐνη β1, η οποία θεωρείται ως βασικό μόριο που εμπλέκονται στην κυτταρική κινητικότητα. Η στόχευση της περιοχής 3′-UTR του γονιδίου ιντεγκρίνης β1 με miR-130β αποκαλύφθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης. Η ρύθμιση της ιντεγκρίνης β1 από miR-130b αποδείχθηκε περαιτέρω με τη χρήση των miR-130b μιμείται και τον αναστολέα του miR-130b. Η μειωμένη κινητικότητα του miR-130 Β κυττάρων υπερέκφραση ανακτάται εν μέρει από την έκφραση των β1 ιντεγκρίνης λείπει η 3′-UTR. Επιπλέον, η knockdown του β1 ιντεγκρίνης προκαλεί επίσης μια μείωση στην κυτταρική μετανάστευση και την εισβολή, το οποίο είναι παρόμοιο με το εμποδίζεται κινητικότητα λόγω υπερέκφραση του miR-130b σε κύτταρα CRC. Επιπλέον, οι αντίστροφο εκφράσεις του miR-130b και β1 ιντεγκρίνης παρατηρήθηκαν σε δείγματα CRC. Συνοπτικά, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι το miR-130 Β ρυθμίζει προς τα κάτω στόχος-ιντεγκρίνης β1 του, που οδηγεί στην μειωμένη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων CRC

Παράθεση:. Zhao Υ, Miao G, Li Υ, Isaji Τ, Gu J , Li J, et al. (2014) microRNA 130β Καταστέλλει τη μετανάστευση και την διείσδυση των κυττάρων του καρκίνου του παχέος εντέρου μέσω Ελάττωση της ιντεγκρίνης β1. PLoS ONE 9 (2): e87938. doi: 10.1371 /journal.pone.0087938

Επιμέλεια: Xin Yuan-Γκουάν, το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Κίνα

Ελήφθη: 7 Νοεμ του 2013? Αποδεκτές: 3 Δεκεμβρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 3, Φεβρουαρίου του 2014

Copyright: © 2014 Zhao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας Grant 81101859, Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας Grant 81270379, Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας Grant 81070231 και στο Πεκίνο Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών 5102039. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, η συλλογή και ανάλυση δεδομένων, απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τα microRNAs (miRNA) είναι μικρή μη κωδικοποίησης RNAs από 24 έως 25 νουκλεοτίδια που διαμεσολαβούν μέσω γονιδιακής σίγησης ατελής υβριδοποίηση σε 3 ‘μη μεταφραζόμενη περιοχή (3’-UTR) σε mRNAs στόχο [1]. MiRNAs παίζουν σημαντικούς ρόλους σε όλες σχεδόν τις βιολογικές δραστηριότητες σε θηλαστικά και άλλους πολυκύτταρους [2] οργανισμούς. Επιπλέον, έχει αναφερθεί ότι miRNAs επηρεάζουν πολυάριθμες καρκίνο σχετικών διεργασιών όπως η μετανάστευση, ο πολλαπλασιασμός. Το πιο σημαντικό, microRNA μόρια ήδη εισέρχονται στην κλινική ως διαγνωστικοί και προγνωστικοί βιοδείκτες για τη διαστρωμάτωση των ασθενών και επίσης ως θεραπευτικοί στόχοι και παράγοντες [3]. Πρόσφατα, miR-130 Β αποκαλύπτεται ως ένα από τα νέα miRNAs όγκων που σχετίζονται και έχει απορυθμίζεται σημαντικά σε όγκους από ένα ολοκληρωμένο μετα-ανάλυση των miRNA συνόλων δεδομένων μικροσυστοιχιών έκφρασης, που περιλαμβάνει 33 συγκρίσεις και σχεδόν 4.000 δείγματα όγκων και των αντίστοιχων nontumors [4]. Κατά συνέπεια, miR-130β έχει βρεθεί ρυθμίζεται αυξητικά σε διάφορους τύπους καρκίνου: γαστρικού καρκίνου [5], [6], δερματικό κακόηθες μελάνωμα [7], κεφαλής και λαιμού καρκίνωμα από πλακώδες επιθήλιο [8] και καρκίνου της ουροδόχου κύστης [9]. Μαζί, έχει υπολογιστεί ότι το miR-130b παίζει βασικό ρόλο κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης.

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η τρίτη πιο συχνά διαγιγνώσκεται καρκίνος στους άνδρες και η δεύτερη στις γυναίκες σε όλο τον κόσμο. Περίπου 608.000 θάνατοι από καρκίνο του παχέος εντέρου εκτιμάται σε όλο τον κόσμο, καθιστώντας την τέταρτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο [10]. Επί του παρόντος, ένα από τα εμπόδια στη θεραπεία του καρκίνου είναι το υψηλό ποσοστό της μετάστασης του όγκου. Η μεταστατική διαδικασία ακολουθεί μια σειρά βημάτων: πρώτα, τα καρκινικά κύτταρα εντός του πρωτογενούς όγκου ξεφύγει από γειτονικά κύτταρα και να εισβάλουν τη βασική μεμβράνη. Αυτή η τοπική εισβολή μπορεί συχνά να προκληθεί από τα συμφραζόμενα σήματα τα οποία προκαλούν τα καρκινικά κύτταρα να υποβληθούν σε επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) [11]. Μετά ενδαγγείωση, τα κύτταρα θα μπορούσαν να εξαγγειώνονται από την κυκλοφορία στον περιβάλλοντα ιστό, όπου μπορούν να παραμείνουν αδρανείς ή να αρχίσει και να διατηρήσει την ανάπτυξη για να σχηματίσει αγγειογενετική μεταστάσεων [12], [13]. Η μετάσταση είναι η κύρια αιτία θανάτου σε πολλές μορφές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων CRC [14] – [16]. Ως εκ τούτου, η καλύτερη κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν τη μετάσταση είναι απαραίτητη για να διευκολυνθεί η ανάπτυξη αποτελεσματικών θεραπευτικών στρατηγικών για ασθενείς με CRC.

Στη μελέτη μας, συγκρίναμε την έκφραση των miRNAs σε δείγματα από ασθενείς CRC χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες microRNA και παρατηρήθηκε η σημαντική αυξητική ρύθμιση των miR-130b που εκφράζονται στα δείγματα CRC. Να αποκτήσουν γνώσεις σχετικά με τους ρόλους του miR-130b στη CRC, μελετήσαμε τα αποτελέσματα των miR-130b στα κύτταρα CRC και δείγματα CRC. Τα στοιχεία μας πρότεινε ότι ιντεγκρίνης β1 είναι ένα γονίδιο στόχος του miR-130b και η καταστολή της ιντεγκρίνης β1 από miR-130b οδηγεί στην μειωμένη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων CRC.

Πειραματικές Διαδικασίες

Κλινική δείγματα

Καρκίνος του παχέος εντέρου και των παρακείμενων δείγματα ιστών ελέγχου ελήφθησαν από 33 ασθενείς στο Νοσοκομείο του Πεκίνου, Υπουργείο Υγείας (Πεκίνο, Κίνα) μετά από χειρουργική εκτομή. Οι ιστοί του όγκου και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο μετά την εκτομή. Κανένας ασθενής στην τρέχουσα μελέτη έλαβαν χημειοθεραπεία ή ακτινοβολία πριν από τη χειρουργική επέμβαση. Όλοι οι ασθενείς παρέχεται γραπτή συγκατάθεση για τη χρήση των ιστών τους, σύμφωνα με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι. Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Πεκίνου Ινστιτούτου Γηριατρικής, Υπουργείο Υγείας.

microRNA μικροσυστοιχιών ανάλυση

Μικρές RNAs απομονώθηκαν από τους ιστούς του όγκου και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών. Οι διαδικασίες ελέγχου ποιότητας, σήμανσης, υβριδισμού και σάρωσης διεξήχθησαν από CapitalBio (Πεκίνο, Κίνα), με τη χρήση GeneChip miRNA σειρά τσιπ V1.0 του Affymetrix του. Διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια μεταξύ ιστών όγκου και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό SAM 3.02. MiRNAs που πληρούσαν τα κριτήρια της τιμής q (%) ≤5 και διπλώστε την αλλαγή ≥2 ή να πάει πάσο αλλαγή ≤0.05 μεταξύ των ομάδων θεωρήθηκαν ότι είναι σημαντικά διαφορετική. χάρτης θερμότητας πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Cluster 3,0 πακέτο λογισμικού. Τα στοιχεία που παρουσιάζονται στην παρούσα μελέτη έχουν κατατεθεί στο National Center for Biotechnology Information (NCBI) έκφραση γονιδίων Omnibus (GEO) και είναι προσβάσιμη μέσω του αριθμού ένταξη GEO GSE53592.

Κυτταρική καλλιέργεια

Η ανθρώπινου ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές σειρές SW-480 και SW-620 αγοράστηκαν από το κινητό Resource Center, IBMS, ΚΑΜΕΡΕΣ /PUMS και πέρασε σε λιγότερο από 6 μήνες. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 (Gibco, Paisley, UK) με 10% FBS (Gibco, Paisley, UK) και 2 mmol /L Ε-γλουταμίνη (Gibco, Paisley, UK), 100 U /ml πενικιλλίνης (Gibco, Paisley, UK), και 100 μg /ml θειικής στρεπτομυκίνης (Gibco, Paisley, UK).

Pri-miR-130b κλωνοποίηση, φακοϊού παραγωγή και μεταγωγή

Το ανθρώπινο γονίδιο 130β πρωτογενή microRNA (PRI-miR-130β) ενισχύθηκε με PCR από ανθρώπινο γονιδιωματικό DNA χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές: 5′-Forward ATATTCTCGAGGGGGATCTCCC-3 ‘και αντίστροφη 5′-ATATCGGATCCTCTTACCCCAG-3’, και στη συνέχεια υποκλωνοποιήθηκε στον φορέα pLVX-IRES-Hyg ( TaKaRa, Dalian, Κίνα) για να δημιουργήσει pLVX-miR-130b. Τα σωματίδια του ιού συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση pLVX-miR-130Β σε κύτταρα ΗΕΚ-293Τ χρησιμοποιώντας το μείγμα συσκευασιών Lenti-ΗΤ (Takara, Dalian, Κίνα). Τα κύτταρα SW480 μολύνθηκαν με το ανασυνδυασμένο συγκομίζονται φακοϊού με την παρουσία 6 μg /ml Polybrene (Sigma, St Louis, USA). Τα κύτταρα SW480 διατηρήθηκαν σε πλήρες μέσο ανάπτυξης με την παρουσία 1 mg /ml υγρομυκίνη (Roche Applied Science, Mannheim, Germany). Η PCR αμπλικόνιο των pri-miR-130b επίσης υποκλωνοποιήθηκε στον φορέα λεντοϊού pWPI (Addgene, Cambridge, MA, USA) για να δημιουργήσει pWPI-miR-130b. Το κενό φορέα pWPI, που κωδικοποιεί πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP), χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Τα σωματίδια του ιού συλλέχθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Τα κύτταρα SW620 σταθερώς εκφράζουν GFP επιλέχθηκαν από φθορίζον-ενεργοποιημένων κυττάρων διαλογής (FACS), με τη χρήση ενός ταξινομητή κυττάρων Vantage SE Diva (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA).

RNA αντιστραφεί μεταγραφή και ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR) ανιχνεύσεις

Το συνολικό RNA, συμπεριλαμβανομένων των μικρών RNAs, εξήχθη από τις κλινικά δείγματα ή από τα κύτταρα CRC με miRVana microRNA κιτ απομόνωσης (Invitrogen, Carlsbad, USA) και υποβλήθηκε σε αντίστροφη μεταγραφή. qRT-PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας με το μίγμα SYBR Πρόμιγμα Εχ Taq (Takara, Dalian, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, και τα δείγματα τρέχουν σε ένα iQ5 Πολύχρωμο σύστημα πραγματικού χρόνου PCR ανίχνευσης (Bio-Rad, Hercules, USA) . Χρησιμοποιήθηκαν Θερμική κύκλοι αντιδράσεως 95 ° C για 30 s, και 45 επαναλήψεις των 95 ° C για 5 s και 60 ° C για 20 s. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ως εξής: HSA-miR-130β Forward 5′-GCCGCCAGTGCAATGATGAA-3 ‘HSA-miR-130β Reverse 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′? U6 Forward 5’-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3 ‘? U6 αντίστροφη 5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3 ‘

λουσιφεράσης ανταποκριτής δοκιμασία

Το πλήρους μήκους 3′-αμετάφραστη περιοχή (3′-UTR) θραύσματα του γονιδίου ιντεγκρίνης β1 ενισχύθηκαν με PCR από ανθρώπινου γενωμικού DNA χρησιμοποιώντας εκκινητές 5′-Forward GTACTGCCCGTGCAAATCCCACAAC-3 ‘και αντίστροφη 5’-TGCTTTTCCTCAACTTCTTTAATC-3, και κλωνοποιήθηκαν σε ένα φορέα pMD18-T (Takara, Dalian, Κίνα). Η

Sac

I-

Sal

Ι-χωνευμένο προϊόντα κλωνοποιήθηκαν σε ένα pmirGlo Dual-έκφραση λουσιφεράσης miRNA Target (Promega, Madison, USA) για να σχηματίσουν 3′-UTR-λουσιφεράσης φορέα αναφοράς . Τα κύτταρα SW480 συνεπιμολύνθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων με χρήση Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, USA) με 3′-UTR-λουσιφεράσης φορέα αναφοράς και τις υποδεικνυόμενες miRNAs. Εικοσιτέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, πυγολαμπίδας και δραστηριότητες λουσιφεράσης Renilla μετρήθηκαν διαδοχικά χρησιμοποιώντας δοκιμασία διπλής λουσιφεράσης (Promega, Madison, USA), σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Αρνητικός έλεγχος φορέα παρήχθησαν με κλωνοποίηση του ίδιου 3′-UTR του γονιδίου ιντεγκρίνης β1 σε αντίστροφο προσανατολισμό. Η δραστικότητα των δειγμάτων μετρήθηκε σε ένα GloMax 20/20 φωτόμετρο (Promega, Madison, USA). Η δραστηριότητα της λουσιφεράσης της πυγολαμπίδας ομαλοποιήθηκε με δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla για την αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης.

διαμόλυνσης κυττάρων

Το πλασμίδιο που χρησιμοποιείται για την έκφραση της ιντεγρίνης β1 λείπει το 3′-UTR (β1-ORF) περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Χρησιμοποιήσαμε διάνυσμα pWPI ως έλεγχος. Οι μιμείται HSA-miR-130 Β, αναστολέας HSA-miR-130b (αντι-miR-130b), μιμείται τον έλεγχο και siRNA εναντίον β1 ιντεγκρίνης [18] συντέθηκαν από Ribobio (Guangzhou, Κίνα). Οι αλληλουχίες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ως ακολούθως: μιμείται HSA-miR-130β, 5′-CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAU-3 ‘? HSA-miR-130β αναστολέα, 5’-AUGCCCUUUCAUCAUUGCACUG-3 ‘? ιντεγρίνης β1 siRNA, (με νόημα) 5’-GGAACAGCAGAGAAGCUCA-3 ‘[18]? Τα κύτταρα SW480 επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας RNAiMax (Invitrogen, Carlsbad, USA) ή Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

δοκιμασία μετανάστευσης κυττάρων και εισβολής δοκιμασία

Η κυτταρική μετανάστευση δοκιμασία αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας θαλάμους Transwell (8-μm, BD Bioscience, San Jose, ΗΠΑ). 5 × 10

5 κύτταρα τοποθετήθηκαν εντός του άνω θάλαμο κάθε ενθέματος, και 500 μΐ πλήρους μέσου προστέθηκαν στον πυθμένα καλά. Τα κύτταρα που δεν μετανάστευσαν απομακρύνθηκαν από τις άνω επιφάνειες των φίλτρων χρησιμοποιώντας μπατονέτες, και τα κύτταρα που είχαν μεταναστεύσει στα κάτω επιφάνειες των φίλτρων σταθεροποιήθηκαν με διάλυμα παραφορμαλδεΰδης 4% και χρωματίστηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες. Εικόνες τριών τυχαίων πεδίων συλλήφθηκαν από κάθε μεμβράνη, και ο αριθμός των μεταναστευτικών κυττάρων μετρήθηκε. Παρόμοια ένθετα επικαλυμμένα με Matrigel χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί η επεμβατική δυναμικό.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μια ένωση τετραζολίου [3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -5- (3-καρβοξυμεθοξυφαινυλ) -2- (4-σουλφοφαινυλ) -2Η-τετραζόλιο, εσωτερικό άλας (MTS) (Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού CellTiter 96 υδατικά μη ραδιενεργού Κυττάρου) (Promega, Madison, USA), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή . Εν συντομία, στους χρόνους που υποδεικνύονται, οι προσδιορισμοί εκτελούνται με την προσθήκη της CellTiter 96 Υδατικό Αντιδραστήριο Ένα διάλυμα απευθείας σε φρεάτια καλλιέργειας, επώαση για 2 ώρες και στη συνέχεια την καταγραφή της απορρόφησης στα 490 nm με έναν αναγνώστη πλάκας 96-φρεατίων.

Western blotting

οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη PVDF (Millipore, Billerica, USA). Η μεμβράνη μπλοκαρίστηκε με 5% μη λιπαρό γάλα και επωάστηκαν με αντι-ιντεγρίνης β1 (1/2500, BD Biosciences, San Jose, ΗΠΑ), αντι-Ε-καδερίνης ποντικού (1/2000, BD Biosciences, San Jose, USA), αντι-κασπάσης 3 (1/1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA), αντι-κασπάση 8 (1/800, Millipore, Billerica, USA) ή ποντικού αντι-GAPDH (1/10000, Sigma , St Louis, USA) αντισώματα.

η στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± sd Η στατιστική σημαντικότητα μεταξύ των ομάδων αξιολογήθηκε από Φοιτητών

t-test

. Η τιμή του

P

n = 4).

D

, κηλίδος Western αναλύσεις της κασπάσης-3 και κασπάσης-8 έκφραση σε κύτταρα Lenti-ελέγχου και Lenti-miR-130Β κύτταρα από τρία ανεξάρτητα πειράματα. GAPDH χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

MiR-130β καταστέλλει ιντεγκρίνης β1 έκφρασης μέσω του 3′-UTR

της

Εμείς διερευνηθεί περαιτέρω ο μηχανισμός με τον οποίο miR-130b επηρεάζει την κινητικότητα των κυττάρων CRC . προηγούμενες μελέτες μας είχε δείξει ότι η μετα-μεταφραστική τροποποίηση διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην διαμεσολαβούμενη από ιντεγκρίνη μετανάστευση [17], [19], [20]. Οι ιντεγκρίνες είναι μια οικογένεια μορίων προσκόλλησης κυττάρου που περιλαμβάνει 18α και 8β υπομονάδες που συνδυάζουν σε τουλάχιστον 24 ετεροδιμερή. Το πιο σημαντικό, η κυτταροπλασματική περιοχή ιντεγκρίνης β1 μετάγει αμφίδρομα σήματα από το εσωτερικό του κυττάρου με τη ρύθμιση των διάπλαση και συνδέτη συγγένειες της εξωκυττάριας περιοχής (σηματοδότηση μέσα-έξω), ενώ μεσολαβούν κατάντη σηματοδότησης και τις αλληλεπιδράσεις με το κυτταρικό σκελετό (έξω-in σηματοδότηση) [ ,,,0],21] – [23]. Έτσι, ιντεγκρίνης β1 είναι ένας βασικός ρυθμιστής που εμπλέκονται στη μετάσταση

in vitro

και

in vivo

[24] – [27]. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι η έκτοπη έκφραση του miR-130b σε κύτταρα SW480 καταλήγει σε μία μείωση της ενδογενούς ιντεγκρίνης β1 επίπεδο πρωτεΐνης τεσσάρων Lenti-miR-130β αποικίες κατά προσέγγιση 50%, σε σύγκριση με εκείνη των Lenti-φορέα κύτταρα ( Σχ. 3Α). Η συνεπής αποτέλεσμα παρατηρήθηκε σε SW-620 κυττάρων με υπερέκφραση του miR-130β (Εικ. 3Β). Ωστόσο, δεν υπάρχει καμία αλλαγή στο επίπεδο έκφρασης της Ε-καδερίνης (Εικ. 3C), η οποία είναι ένα βασικό μοριακό εμπλέκονται στην EMT. Και όπως προαναφέρθηκε, ΕΜΤ είναι το πρώτο βήμα στη μετάσταση. Εξετάσαμε επίσης την έκφραση του ιντεγκρίνης β1 στα 3 ζεύγη δειγμάτων υποβάλλεται στη μικροσυστοιχία φαίνεται στο Σχ. 1Α. Σε συμφωνία με τα δεδομένα στο Σχ. 3Α και το σχ. 3C, η ιντεγκρίνη β1 έκφραση πρωτεΐνης μειώνεται στους ιστούς του όγκου σε σύγκριση με τα αντίστοιχα γειτονικά φυσιολογικούς ιστούς (Σχ. 3D (α)), ενώ καμία προφανής αλλαγή της έκφρασης Ε-καδερίνης ανιχνεύθηκε (Εικ. 3D (β)) . Είναι αξιοσημείωτο ότι το μειωμένο επίπεδο ιντεγκρίνης πρωτεΐνη β1 ανιχνεύθηκε στην υπερέκφραση κύτταρα miR-130b CRC (Lenti-miR-130 Β κύτταρα) και τα δείγματα CRC, καθώς και. Ως εκ τούτου, επιδιώξαμε να διερευνήσει κατά πόσον miR-130b μπορεί να ρυθμίσει ιντεγκρίνης β1

Μια

,

Άνω πάνελ

:. Κηλίδα Western αναλύσεις της ιντεγκρίνης β1 έκφραση της πρωτεΐνης σε Lenti ελέγχου κύτταρα και κύτταρα Lenti-miR-130β (SW480 κύτταρα) από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Κάτω πίνακα

: Ανάλυση Πυκνότητας των δεδομένων των Δυτικών κηλίδα ομαλοποιηθεί με ΟΑΡϋΗ (Μέσος ± Τ.Α .; n = 3? *,

P

n = 3? *,

P

n = 3? *, Ρ n = 3? *,

P

n = 3? *,

P

& lt? 0,05). Αντιπροσωπευτικά εικόνες μετανάστευσαν κύτταρα εμφανίζονται. Lenti-miR-130b + φορέα ελέγχου: τα κύτταρα Lenti-miR-130b επιμολυσμένα με φορέα ελέγχου. Lenti-miR-130β + β1-ORF: οι Lenti-miR-130Β κύτταρα επιμολυσμένα με φορέα β1-ORF. ORF:. Ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης

Η

Στη συνέχεια ανέστειλε ιντεγκρίνης β1 έκφραση χρησιμοποιώντας ένα ειδικό siRNA [18] στα κύτταρα SW-480 (Σχήμα 6Α.). Βρήκαμε ότι η κυτταρική μετανάστευση (Εικ. 6Β) και την εισβολή (Εικ. 6C) είναι σημαντικά μειωμένη μέσω αναστολής της ιντεγκρίνης β1 έκφραση με ένα ειδικό siRNA. Ως εκ τούτου, η μείωση της κινητικότητας των κυττάρων επιτυγχάνεται μέσω της καταστολής της ιντεγκρίνης β1 έκφρασης. Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά έδειξαν ότι miR-130β καταστέλλει την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή, τουλάχιστον εν μέρει, μέσω της προς τα κάτω ρύθμιση της ιντεγκρίνης β1 σε κύτταρα CRC.

A

, την τεχνική Western blot αξιολόγησε την πρωτεΐνη επίπεδο ιντεγκρίνης β1 σε κύτταρα SW480 διαμολυσμένα με siRNA κατά β1 ιντεγκρίνης (β1 siRNA) ή αρνητικό μάρτυρα siRNA (Scramble) στα 20 ηΜ και 50 ηΜ αντιστοίχως. Κάθε δοκιμασία ανεξάρτητα επαναλήφθηκε τρεις φορές.

Β, Γ

, Transwell μετανάστευση (

Β

) και εισβολή (

C

) δοκιμασίες των κυττάρων SW480 επιμολυσμένα με β1 siRNA ή αγωνίζομαι στα 50 nM (γραμμή κλίμακας = 100 μm? μέση τιμή ± SD? n = 3? **,

P

& lt? 0,01). Εκπρόσωπος εικόνες της μετανάστευσαν κυττάρων (

Β

) και εισέβαλε κύτταρα (

C

) εμφανίζονται.

Η

αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ του miR-130b και ιντεγκρίνης β1 έκφραση στο CRC δείγματα

Για να ελέγξετε περαιτέρω τη συσχέτιση μεταξύ β1 ιντεγκρίνης και miR-130 Β, επεκτείναμε την ανάλυσή μας σε μία ομάδα από 33 ταιριάζουν ζεύγη των κλινικών γειτονικούς ιστούς κανονική (Ν) και του παχέος όγκου (Τ). Αναλύσαμε την έκφραση του miR-130b με qRT-PCR και το επίπεδο έκφρασης της ιντεγκρίνης β1 με κηλίδα Western. Όπως φαίνεται στο Σχ. 7, με τη σύγκριση των όγκων στους κανονικούς ιστούς, ένας αντίστροφος συσχετισμός μεταξύ miR-130Β και ιντεγκρίνης β1 έκφραση βρέθηκε σε 23 από 33 (69,7%) ζεύγη κλινικά δείγματα. Από τα 23 ζεύγη, 12 ζεύγη έδειξε την αυξημένη miR-130b και το μειωμένο ιντεγκρίνης β1? 11 ζεύγη έδειξαν την μειωμένη miR-130Β και τον αυξημένα β1 ιντεγκρίνης.

Η έκφραση του miR-130b μετρήθηκε με qRT-PCR, η έκφραση ιντεγκρίνης β1 μετρήθηκε με ανάλυση στυπώματος Western σε μία ομάδα από 33 συμφωνημένα -pairs γειτονικών κανονική (Ν) και του όγκου (Τ) ιστούς. Η σχετική αναλογία έκφραση του miR-130b (κανονικοποιημένη σε U6) σε Τ διάρκεια N (T /N) εκπροσωπήθηκε ως πλάσια διαφορά (στήλες σε σκούρο γκρι). Η σχετική αναλογία έκφραση της ιντεγκρίνης β1 (κανονικοποιημένη σε GAPDH) στο T πάνω από Ν (Τ /Ν) εκπροσωπήθηκε ως πλάσια διαφορά (στήλες με ανοιχτό γκρι χρώμα). Μέσος ± Τ.Α. Κάθε δοκιμασία ανεξάρτητα επαναλαμβάνεται τρεις φορές.

Η

Συζήτηση

microRNA 130β (miR-130b) είναι σημαντικά απορυθμίζεται σε πολλούς ανθρώπινους τύπους όγκων. Ωστόσο, ο ρόλος του miR-130b σε CRC δεν είναι καλά κατανοητός. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την έκφραση microRNA σε ορθοκολικό καρκίνο (CRC) με τη χρήση μικροσυστοιχιών microRNA χαρακτηριστικών των όγκων και γειτονικό φυσιολογικό δείγματα ιστών. Εντοπίσαμε 48 σημαντικά διαφορικά εκφρασμένων miRNAs που σχετίζονται με CRC. MiR-130b είναι ένας από τους απορυθμίζεται miRNAs. Τα δεδομένα αυτά επιβεβαιώθηκε περαιτέρω από qRT-PCR. Για να ελέγξετε τις πιθανές ρόλους της αυξημένης έκφρασης του miR-130b στη CRC, πραγματοποιήσαμε λειτουργικές δοκιμασίες μετά την κατασκευή κυτταρική σειρά CRC με σταθερή υπερέκφραση του miR-130b. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι miR-130β ασκεί σημαντική ανασταλτική επίδραση στην κινητικότητα των κυττάρων CRC (Σχ. 2), αλλά δεν έχει επίδραση επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και την απόπτωση. Έχει αναφερθεί ότι στο

TAp63

μοντέλο knockout ποντικού, ρύθμιση προς τα κάτω του miR-130β από την απώλεια των αποτελεσμάτων TAp63 σε αύξηση μετάσταση όγκου [28]. Η καταστολή του miR-130β από ένα μεταλλαγμένο ρ53 έχει ως αποτέλεσμα την ενίσχυση της ZEB1 εξαρτώμενη ΕΜΤ και κυτταρική διείσδυση σε ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα [29]. Όλα αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν την αντι-μεταστατική ρόλο του miR-130b. Επιπλέον, η ρύθμιση προς τα κάτω του miR-130b παρέχει πολυανθεκτικά φαινοτύπου σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών [30]. Ωστόσο, μια άλλη έκθεση έχει προταθεί ότι η υπερέκφραση του miR-130b στο CD133 (+) κύτταρα του ήπατος ογκογενή αυξάνει την ικανότητα αυτο-ανανέωσης και χημειοαντίσταση [31]. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι miR-130b μπορεί να έχει μια διπλή λειτουργία ως καταστολέας όγκου ή ένα ογκογονίδιο, το οποίο εξαρτάται από τον τύπο του καρκίνου και κυτταρικό περιβάλλον.

Σε αυτή τη μελέτη, εντοπίσαμε ότι ιντεγκρίνης β1 είναι μια νέα στόχος του miR-130b. Ένα μειωμένο επίπεδο ιντεγκρίνης πρωτεΐνη β1 παρατηρήθηκε λόγω υπερέκφραση του miR-130b σε δείγματα CRC (Εικ. 3D) και σε κύτταρα CRC (Εικ. 3Α και 3Β), καθώς και. Η δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης έδειξαν ότι miR-130b συνδέεται με το 3′-UTR του β1 ιντεγκρίνης και καταστέλλει την έκφραση του (Εικ. 4). Μια αύξηση στην miR-130b με miR-130b μιμείται επιμόλυνση οδηγεί στην μειωμένη έκφραση της ιντεγκρίνης β1, ενώ νοκ ντάουν miR-130b με miR-130β αποτελέσματα αναστολέα σε αυξημένη ιντεγκρίνης β1 έκφρασης. Επιπλέον, η μειωμένη κινητικότητα του miR-130b κυττάρων υπερέκφραση διασώζεται εν μέρει από την έκφραση των β1 ιντεγκρίνης λείπει το 3′-UTR (Εικ. 5). Επιπλέον, η knockdown του β1 ιντεγκρίνης προκαλεί επίσης μια μείωση στην κυτταρική μετανάστευση και εισβολή (Εικ. 6). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι miR-130β καταστέλλει την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή των κυττάρων CRC, τουλάχιστον εν μέρει, μέσω της προς τα κάτω ρύθμιση της ιντεγκρίνης β1. Επιπλέον, η αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ miR-130Β έκφρασης και ιντεγκρίνης β1 έκφραση βρέθηκε σε 23 από 33 ζευγάρια (69,7%) του CRC κλινικά δείγματα. Η αναστολή της μετανάστευσης και της εισβολής των κυττάρων CRC μέσω της άμεσης στόχευσης της ιντεγρίνης β1 είναι συνεπής με την αντι-μεταστατική ρόλος που προτείνεται για miR-130β [28], [29]. Ένα μεγάλο σώμα των πειραματικών αποδείξεων που υποστηρίζονται ουσιαστικό ρόλο για ιντεγκρίνης β1 κατά την επαγωγή όγκου και εισβολής [32] – [36].