Αφηρημένο

Ιστορικό

Αν και Sox2 έκφρασης έχει βρεθεί σε διάφορους τύπους καρκίνου, δεν έχει ακόμη χρησιμοποιηθεί για την αναγνώριση ή την απομόνωση ΚΕΠ σε σωματικά καρκίνωμα.

Μέθοδοι

SiHa και C33A κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με ένα πλασμίδιο που περιέχει ανθρώπινη Sox2 μεταγραφικά στοιχεία οδήγησης της ενισχυμένης πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (EGFP) ρεπόρτερ ταξινομήθηκαν στην Sox2-θετικά και τα αρνητικά Sox2-πληθυσμούς με FACS, και έκφραση Sox2 ανιχνεύθηκε με κηλίδα western και ανοσοϊστοχημεία. Οι ικανότητες διαφοροποίησης, αυτο-ανανέωση και σχηματισμού όγκου, όπως επίσης και η έκφραση του βλαστική ικανότητα και τα συναφή EMT γονίδια της Sox2-θετικών και των αρνητικών Sox2-τραχήλου καρκινικά κύτταρα χαρακτηρίστηκαν

in vitro

και

in vivo

.

Αποτελέσματα

Ένα σύστημα /EGFP pSox2 χρησιμοποιήθηκε για το διαχωρισμό του Sox2-θετικά και τα αρνητικά Sox2-κύτταρα από καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές, SiHa και κύτταρα C33A. Σε σύγκριση με τις Sox2-αρνητικά κύτταρα, τα Sox2 θετικά SiHa και C33A κύτταρα παρουσίασαν μεγαλύτερη ικανότητες για την αυτο-ανανέωση, τη διαφοροποίηση και σχηματισμό όγκων. Επιπλέον, Sox2-θετικά SiHa και C33A κύτταρα εξέφρασαν υψηλότερα επίπεδα βλαστική ικανότητα που σχετίζονται με γονίδια, όπως Sox2 /Bmi-1 /Oct4 /ΑΙ_ϋΗ1, και ΕΜΤ-συναφή γονίδια, όπως βιμεντίνη /σαλιγκάρι /β-κατενίνης. Στο σύνολό τους, όλα αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα κύτταρα που εκφράζουν ενδογενή Sox2 είναι ΚΕΠ σε καρκινώματα του τραχήλου.

Συμπέρασμα

Αυτή η μελέτη είναι η πρώτη να καθιερωθεί μια λειτουργική σχέση μεταξύ ενδογενούς έκφρασης Sox2 και ΚΕΠ σε καρκινώματα του τραχήλου . Επιπλέον, αυτή η μελέτη απέδειξε ότι είναι εφικτό να αναπτύξει ένα εργαλείο για την απομόνωση ΚΕΠ από σωματικά όγκους με βάση την έκφραση του ενδογενούς πρωτεΐνης Sox2 αντί δεικτών κυτταρικής επιφάνειας πυρηνικής

Παράθεση:. Liu XF, Yang WT, Xu R, Liu JT, Zheng PS (2014) του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας κύτταρα με Θετικές Sox2 Έκφραση εκδηλώνουν τις ιδιότητες του καρκίνου βλαστικών κυττάρων. PLoS ONE 9 (1): e87092. doi: 10.1371 /journal.pone.0087092

Συντάκτης: Eric Asselin, Πανεπιστήμιο του Κεμπέκ στο Trois-Rivieres, Καναδάς

Ελήφθη: 23 του Ιουλίου, 2013? Αποδεκτές: 18η, Δεκεμβρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 28 Ιανουαρίου, 2014

Copyright: © 2014 Liu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια γενική επιχορήγηση από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας με τον καθηγητή Peng-Sheng Zheng (Νο 30571951), μια ειδική επιστημονική Διακεκριμένος επιχορήγησης Νέων Επιστημόνων Ταμείο (Νο 30725043). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος των βλαστικών κυττάρων (CSC), η υπόθεση προτείνει ότι μπορεί να προκύψουν μάζες όγκου από ένα και μόνο των καρκινικών κυττάρων με ιδιότητες των βλαστικών παρόμοια. Αυτά τα ΚΕΠ τεκμηριωθεί ότι έχει τις ικανότητες της αυτο-ανανέωσης και της διαφοροποίησης, και μπορούν να αναγεννηθούν της μάζας του όγκου και όλους τους τύπους των κυττάρων του όγκου που βρίσκονται μέσα. Πειραματικές ενδείξεις που υποστηρίζουν την υπόθεση παράχθηκε για πρώτη φορά το 1997 από ομάδα Dick, ο οποίος απέδειξε ότι η ανθρώπινη λευχαιμία οδηγείται από έναν μικρό πληθυσμό των λευχαιμικών βλαστικών κυττάρων ικανό να μεταφέρει την ασθένεια σε NOD /SCID ποντικούς [1]. Αυτή η ιδέα επεκτάθηκε σε συμπαγείς όγκους από Clarke και Wicha, ο οποίος απέδειξε ότι το ανθρώπινο καρκίνο του μαστού περιλαμβάνει έναν υποπληθυσμό των κυττάρων με ιδιότητες των βλαστικών σαν φέρει το επιφανειακούς δείκτες CD44

+ /CD24

– /lin

– [ ,,,0],2]. Στη συνέχεια, οι ΚΕΠ έχουν ταυτοποιηθεί και μελλοντικά απομονωθούν από μια ποικιλία κακοηθειών, συμπεριλαμβανομένου του εγκεφάλου καρκίνων [3], ο καρκίνος του προστάτη [4], το μελάνωμα [5], του πολλαπλού μυελώματος [6], ο καρκίνος του παχέος εντέρου [7], [8], του παγκρέατος καρκίνος [9] και της κεφαλής και του τραχήλου [10]. Ωστόσο, ΚΕΠ δεν έχουν εντοπιστεί σε καρκινώματα του τραχήλου.

Πιο δοκιμασίες καρκίνο βλαστικών κυττάρων έχουν μέχρι στιγμής εξαρτάται από μια ποικιλία διαφορετικών δεικτών κυτταρικής επιφάνειας, συμπεριλαμβανομένων των CD133, CD44, CD166, CD24 και. Χρησιμοποιώντας αυτούς τους δείκτες επιφάνειας, ΚΕΠ από πρωτογενείς ιστούς όγκου μπορεί να εμπλουτιστεί με χρήση τεχνολογίας FACS, και τον πολλαπλασιασμό τους μπορούν να ελεγχθούν σε ποντικούς με ανοσοανεπάρκεια. Ωστόσο, δείκτες επιφάνειας μπορούν να χρησιμοποιηθούν μόνο για να απομονωθούν τα πιο κοινά ΚΕΠ, και αυτοί οι δείκτες είναι συχνά ασταθείς σε πολλές σωματικές καρκίνους [11]. ΚΕΠ εμπλουτισμένο από πρωτογενείς καλλιέργειες με βάση την σειριακή διέλευση ξενομοσχεύματος

in vivo

έχουν αναφερθεί ότι περιέχουν μια ασυνεπή υποπληθυσμός μετά την απομόνωση με τη χρήση των δεικτών επιφανείας CD133 και CD44 [12]. Επιπλέον, τα αποτελέσματα που λαμβάνονται με ΚΕΠ απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το ίδιο επιφανειακό σημειωτή δεν είναι συνεπείς μεταξύ εργαστηρίων. Έτσι, καθίσταται αναγκαία η αναζήτηση για κυτοπλασμική ή πυρηνικά κατασκευαστές που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την απομόνωση των ΚΕΠ [13].

Σε προηγούμενη μελέτη, αναγνωρίσαμε την έκφραση του παράγοντα μεταγραφής κυττάρου-ειδικό εμβρυϊκά βλαστικά Sox2 στην πρωτοβάθμια τραχήλου ιστούς και tumorspheres σχηματίζονται από κύτταρα πρωτογενούς τραχηλικού καρκινώματος του καρκίνου, και βρήκαμε ότι λειτουργίες Sox2 ως ένα ογκογονίδιο στην αυχενική καρκινογένεση με την προώθηση της ανάπτυξης των κυττάρων και ογκογονικότητα [14], [15]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι Sox2 μπορεί να είναι ένας πιθανός δείκτης για την αυχενική ΚΕΠ. Επιπλέον, Sox2 ελέγχει την πλειοδυναμίας, αυτο-ανανέωση και τον πολλαπλασιασμό των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων. Έχει δειχθεί ότι τα κύτταρα ποντικού και ανθρώπινων εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων και νευρικών βλαστικών έχουν υψηλή δραστηριότητα Sox2 [16], [17], [18], και αυξημένη έκφραση Sox2 έχει επίσης βρεθεί στο μητρικό και γλοιοβλάστωμα πληθυσμούς CSC [19], [ ,,,0],20]. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι Sox2 είναι μια πυρηνική δείκτης υποψήφιος για ΚΕΠ.

Στην παρούσα μελέτη, έχουμε σταθερά επιμολυσμένα δύο τραχήλου καρκινικές κυτταρικές σειρές, SiHa και C33A, με ένα πλασμίδιο που περιέχει τα ανθρώπινα Sox2 μεταγραφικά στοιχεία οδήγησης EGFP έκφραση. Έχουμε αποδείξει ότι Sox2 θετικά του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα μοιράζονται όλα τα χαρακτηριστικά των ΚΕΠ.

Υλικά και Μέθοδοι

Γραμμές κυττάρων και συνθήκες καλλιέργειας

Το ανθρώπινο καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές SiHa, HeLa, C33A, και CaSki ήταν όλα αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC? Manassas, VA). SiHa, HeLa, και C33A κύτταρα διατηρήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ? Sigma-Aldrich, St Louis, ΜΟ) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό απενεργοποιημένο με θερμότητα (FBS? Invitrogen, Carlsbad, CA). CaSki κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο McCoy 5Α (Sigma-Aldrich) με 10% FBS.

Κατασκευή pSox2 /EGFP

Ο ~11.5 kb ανθρώπινο προαγωγέα Sox2 ενισχύθηκε με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR ) από SiHa γονιδιωματικό DNA με τους ακόλουθους εκκινητές: προς τα εμπρός, 5′-gctagcgaccacatctggctgcttgtatatttaac-‘3 και αντίστροφη, 5’-catgcggggcgctgtgcgcg-‘3. Επιπρόσθετα, η 3 ‘αμετάφραστη περιοχή (3’UTR), πολυ (Α) ουρά, και βελτιωτή 3′ του Sox2 επίσης ενισχύθηκαν με PCR με τους ακόλουθους εκκινητές: προς τα εμπρός, 5’-tgagggccggacagcgaac-‘3 και αντίστροφη, 5’- gtcgacatgagaggtgagtgcagtgcaattac-‘3. Ο φορέας αλληλουχία ενδιαφέροντος, συμπεριλαμβανομένου του ανεξάρτητου SV40 προαγωγό καθοδηγείται κασέτα ανθεκτικότητας σε νεομυκίνη, και η αλληλουχία EGFP ενισχύθηκαν επίσης από τον φορέα pIRES2-EGFP (Invitrogen). Στη συνέχεια, αυτά τα θραύσματα κλωνοποιήθηκαν σε φορείς ΤΟΡΟ (Invitrogen), και η ακρίβεια της αλληλουχίας DNA επιβεβαιώθηκε με αλληλούχιση. Η σωστή ανθρώπινο προαγωγέα Sox2, UTR /ενισχυτή, EGFP, και ο φορέας στη συνέχεια κλωνοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια εις Fusion PCR Cloning Kit, και το προκύπτον φορέας ονομάσθηκε phSox2 /EGFP (Takara Bio Inc, Dalian, Κίνα).

Ανοσοϊστοχημεία και ανοσοκυτταροχημεία

η ανοσοϊστοχημεία πραγματοποιήθηκε σε 4-μm τμήματα ιστούς παραφίνης. τμήματα του όγκου του ιστού διαδοχικά αποπαραφινοποιήθηκαν και επανυδατώνονται πριν από την προαγωγή με 10 mM νάτριο ρυθμιστικό ανάκτησης κιτρικό αντιγόνου (pH 6,0) σε μια χύτρα ατμού. Μετά από επεξεργασία με 3% Η

2O

2, οι ακόλουθες αντισώματα επωάστηκαν με τα τμήματα όλη τη νύκτα στους 4 ° C: αντι-Sox2 (1:100), αντι-Κί67 (1:500), αντι-ΑΙ_ϋΗ1 (BD Biosciences, 1:50), αντι-Bmi1 (1:100), αντι-Oct4 (1:100), αντι-Nanog (1:100), αντι-Κί67 (1:80), αντι-βιμεντίνη (1 :200), αντι-σαλιγκάρι (1:150), αντι-β-κατενίνης (1:250), και αντι-Ε-καδερίνης (1:200). Όλα τα αντισώματα ελήφθησαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) εκτός αν ορίζεται διαφορετικά. Οι τομές του ιστού στη συνέχεια επωάστηκαν με βιοτινυλιωμένο ανοσοσφαιρίνη G (IgG) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την πλύση, οι τομές επωάστηκαν σε σύμπλοκο στρεπταβιδίνης-υπεροξειδάσης για 30 λεπτά, και ανοσοχρώση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας 0,05% 3′-διαμινοβενζιδίνη ακολουθούμενη από αντικηλίδωση με αιματοξυλίνη. Οι οροί από μη ανοσοποιημένα κατσίκες ή ποντικοί χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι.

Επιπλέον, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες για 48 ώρες, σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 20 λεπτά, και διαπερατά με 0,3% Triton Χ-100 για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα επίπεδα έκφρασης των διαφορετικών πρωτεϊνών σε αυτά τα κύτταρα προσδιορίστηκαν με ανοσοκυτταροχημεία όπως περιγράφεται παραπάνω.

TUNEL Δοκιμασία

εγκλεισμένα σε παραφίνη πλάκες ιστού παρασκευάστηκαν από τους όγκους ξενομοσχεύματος. χρώση TUNEL ανιχνεύθηκε με το κιτ προσδιορισμού TUNEL (Roche) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αποπτωτικών πυρήνων αναλύθηκαν μετρώντας τον συνολικό αριθμό των TUNEL θετικών πυρήνων, με εξαίρεση τα κύτταρα που υφίστανται μίτωση σε 10 τυχαία πεδία.

Western Blotting

Τα κυτταρολύματα διαχωρίστηκαν με 10% δωδεκυλοθειικό νάτριο (SDS ) ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν πάνω σε φθοριούχο πολυβινυλιδένιο (PVDF) μεμβράνες. Μετά τον αποκλεισμό με 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε ρυθμισμένο με Τπδ αλατούχο διάλυμα, τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για western αποτύπωση: anti-Sox2 (1:500), αντι-ΑΙ_ϋΗ1 (BD Biosciences, 1:500), αντι-Bmi1 (1 :500), αντι-Oct4 (1:500), αντι-Nanog (1:500), αντι-βιμεντίνη (1:500), αντι-σαλιγκάρι (1:500), αντι-β-κατενίνης (1:500) , αντι-Ε-καδερίνης (1:500), και αντι-β-ακτίνης (1:1000) όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Όλα τα αντισώματα ελήφθησαν από την Santa Cruz Biotechnology, εκτός αν ορίζεται διαφορετικά. Μετά την πλύση, τα δεσμευμένα αντισώματα κατέστησαν ορατά χρησιμοποιώντας υπεροξειδάση αρμορακίας συζευγμένη με αντι-κατσίκας, μυρμήγκι-κουνέλι ή αντι-ποντικού IgG (Thermo Fisher Scientific Inc., New York, ΝΥ) και η Immobilon Western χημειοφωταύγειας HRP Substrate (Millipore, Billerica, ΜΑ) και στη συνέχεια απεικονίζονται σε ταινίες ακτίνων Χ [21]

κυτταρομετρίας ροής και ο διαχωρισμός των EGFP

+ και EGFP

-. πληθυσμοί με FACS

κυτταρικές σειρές καρκίνου του τραχήλου της μήτρας ήταν καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με pSox2 /EGFP. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε πέψη και επαναιωρήθηκαν σε PBS συμπληρωμένο με 2% FBS, και το ποσοστό των EGFP

+ κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ).

Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου διεξήχθη χρησιμοποιώντας FACS σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και σταθεροποιήθηκαν σε 70% για όλη τη νύχτα αιθανόλη στους 4 ° C. Τριάντα λεπτά πριν από την ανάλυση FACS, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με RΝάση Α και στη συνέχεια βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ, Sigma-Aldrich). κατανομή του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με κυτταρόμετρο ροής ΡΑΟδΟαΙΐβιΐΓ χρησιμοποιώντας Mod-Fit λογισμικό LT

Για να αποκτήσετε το EGFP

+ και EGFP

-. πληθυσμοί, SiHa και C33A κύτταρα επιμολυσμένα με pSox2 /EGFP πλασμιδίου χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen). Επιλογή διεξήχθη χρησιμοποιώντας πρότυπο μέσο καλλιέργειας με 1 mg /mL G418. Η παραγωγή των καλλιεργειών απλού κυττάρου προερχόμενου πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα FACSAria (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Οι πύλες διαλογής καθιερώθηκαν ως το υψηλότερο και το χαμηλότερο 10% των κυττάρων EGFP που εκφράζουν. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM /F12 με 1χ Β-27 χωρίς ορό συμπλήρωμα (Invitrogen), 20 ng /mL επιδερμικού αυξητικού παράγοντα [22], και βασικό αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών (PeproTech Inc., Rocky Hill, NJ).

Tumorsphere Δοκιμασία σχηματισμού

Τα ταξινομημένα κύτταρα διατηρήθηκαν σε βλαστικών κυττάρων μέσα που αποτελούνται από μέσο ϋΜΕΜ /F12 βασική, Ν2 και συμπληρώματα Β27 (Invitrogen), 20 ng /mL ανθρώπινου ανασυνδυασμένου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF) και 20 ng /ml βασικό ινοβλαστικό αυξητικό παράγοντα (bFGF? PeproTech Inc., Rocky Hill, NJ)

Για την δοκιμασία σχηματισμού tumorsphere, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πυκνότητα 200 κύτταρα /φρεάτιο σε 24 φρεατίων ultra. -Low πλάκες στερεώσεως ή σε πυκνότητα 1 κυττάρου πλάκες /φρεάτιο σε 96 φρεατίων και διατηρήθηκαν σε βλαστοκυττάρων μέσα ενημέρωσης. Tumorspheres που προέκυψε μέσα σε 2 εβδομάδες καταγράφηκαν. Για δοκιμασίες σειριακή σχηματισμός tumorsphere, οι σφαίρες συλλέχθηκαν, αναλυτικά με 0,25% θρυψίνη /ΕϋΤΑ, διηθείται μέσω ενός πλέγματος 40 μm και την εκ νέου επιστρώθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω.

Real-time PCR

Σύνολο RNA εκχυλίστηκε από την υψηλότερη και τη χαμηλότερη του 10% του EGFP-κυττάρων που εκφράζουν με αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen). Η συγκέντρωση του RNA προσδιορίστηκε, και το συνολικό cDNA χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα για ενίσχυση PCR. Πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν για κάθε σετ εκκινητών χρησιμοποιώντας ένα iQ5 Πολύχρωμο Real-Time PCR σύστημα ανίχνευσης (Bio-Rad, Hercules, CA). Το πρωτόκολλο για PCR πραγματικού χρόνου ήταν 1 κύκλος των 95 ° C για 30 δευτερόλεπτα που ακολουθείται από 40 κύκλους των 95 ° C για 5 δευτερόλεπτα και 60 ° C για 30 δευτερόλεπτα με ένα επακόλουθο στάδιο διαστάσεως. Η τιμή κατωφλίου κύκλου προσδιορίστηκε ως το σημείο στο οποίο ο φθορισμός υπερέβη ένα προκαθορισμένο όριο που καθορίζεται από το λογισμικό του οργάνου.

Δοκιμασία ξενομοσχεύματος όγκου

Έξι εβδομάδων θηλυκά NOD /χρησιμοποιήθηκαν ποντίκια SCID να αξιολογήσει τις ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων

in vivo

. Τα κύτταρα εγχύθηκαν στο υποδόριο στη ράχη με ένα μείγμα 1:01 Matrigel. Ο όγκος του όγκου (V) προσδιορίστηκε με το μήκος (α) και το πλάτος (β) ως V = ab

2/2. Τα πειραματικά πρωτόκολλα αξιολογήθηκαν και εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Φροντίδας Ζώων και Χρήση της Ιατρικής Σχολής του Xi’an Jiaotong Πανεπιστημίου.

Η ανάπτυξη των κυττάρων και κυττάρων Βιωσιμότητας Αναλύσεις

Τα κύτταρα (2 × 10

4) καλλιεργήθηκαν εις τριπλούν σε τρυβλία καλλιέργειας 35-mm για 7 ημέρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν κατά μήκος και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα αιμοκυτταρόμετρο και ένα ελαφρύ μικροσκόπιο. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας 3- (4,5-διμεθυλοθειαζολο-υλ) -2,5-διφαινυλ τετραζόλιο (ΜΤΤ, Sigma-Aldrich) βαφής σύμφωνα με ένα πρότυπο πρωτόκολλο. Ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων προσδιορίστηκε με μέτρηση της απορρόφησης στα 490 nm.

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση έγινε με SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Η δίπλευρη chi-square test χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η σημασία των διαφορών μεταξύ συμπαράγοντες. t δοκιμή Student χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η στατιστική σημασία όταν συγκρίθηκαν δύο ομάδες. Να εξετάσει τη σχέση μεταξύ δύο ποσοτικών μεταβλητών, πραγματοποιήθηκε ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης κατά Pearson. Σε όλες τις δοκιμές, σ & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Ανάπτυξη της EGFP εκφράζουν πλασμίδιο Καθοδηγείται από τα ανθρώπινα Sox2 μεταγραφικά στοιχεία

Για να απομονώσετε την ξεχωριστή ενδογενή Sox2. εκφράζοντα υποπληθυσμό και να κρίνει αν έχει τα χαρακτηριστικά των ΚΕΠ, κατασκευάσαμε το πλασμίδιο pSox2 /EGFP, το οποίο περιέχει 11,5 kb της αλληλουχίας του ανθρώπινου Sox2 υποκινητή τοποθετημένο προ του ρεπόρτερ EGFP. Αυτό το πλασμίδιο περιέχει επίσης τον ανθρώπινο Sox2 3’UTR, 3 ‘πολυ (Α) ουρά, και βελτιωτή 3’ τοποθετημένη κατάντη του ρεπόρτερ EGFP. Επιπλέον, μια ανεξάρτητη SV40 προαγωγό καθοδηγείται νεομυκίνη κασέτα αντίσταση χρησιμοποιήθηκε για να επιτρέψει για τη θετική επιλογή των κυττάρων που απέκτησε το πλασμίδιο ανεξάρτητα από την ικανότητά τους να ενεργοποιούν τον υποκινητή Sox2 (Εικ. 1).

Σχηματική της pSox2 /συστήματος αναφοράς EGFP. Ο υποκινητής hSox2 και μεταγραφικά στοιχεία, συμπεριλαμβανομένου του 3’UTR, πολυ (Α) ουρά, και βελτιωτή 3 ‘κλωνοποιήθηκαν στον φορέα pEGFP.

Η

Διαλογή Living ενδογενής Sox2 εκφράζουν τον καρκίνο του τραχήλου Κύτταρα Χρησιμοποιώντας τη pSox2 /συστήματος EGFP

έκφραση Sox2 χαρακτηρίστηκε σε τέσσερα ανθρώπινου κολπικού καρκινικές κυτταρικές σειρές (HeLa, SiHa, CaSki και C33A) χρησιμοποιώντας το σύστημα pSox /EGFP καθώς Western blot και ανοσοκυτταροχημική ανάλυση (Σχ. 2Α). Sox2 ήταν ορατό ως πυρηνική χρώση με ανοσοχημεία σε μονές ή συγκεντρωμένα SiHa και C33A κύτταρα (Σχ. 2Β). Ωστόσο, Sox2 δεν ήταν ανιχνεύσιμη σε κύτταρα HeLa ή CaSki με κηλίδα western ή ανοσοχημική ανάλυση (Σχ. 2Α και 2Β). Όταν pSox2 /EGFP διαμολύνθηκε παροδικά σε τέσσερις ανθρώπινου κολπικού καρκινικές κυτταρικές σειρές, 6,31% και 4,10% του EGFP-θετικών κυττάρων ήταν ανιχνεύσιμα με FACS στα επιμολυσμένα κύτταρα SiHa και C33A, αντίστοιχα (Σχ. 2C). Ωστόσο, μόνο το 0,84% και 0,69% του EGFP-θετικών κυττάρων ήταν παρατηρήσιμες στα επιμολυσμένα κύτταρα HeLa και CaSki, αντίστοιχα (Σχ. 2C). EGFP-θετικών κυττάρων που αποτελείται λιγότερο από το 0,2% από κάθε μη επιμολυσμένα ελέγχου καρκίνου του τραχήλου κυτταρική γραμμή (Σχ. 2C), υπονοώντας ότι οι περισσότεροι EGFP-θετικών κυττάρων σε pSox2 τραχήλου καρκινικά κύτταρα /EGFP-επιμολυσμένα ήταν ενδογενή Sox-εκφράζοντα κύτταρα. Συνολικά, τα αποτελέσματα που λαμβάνονται με χρήση του συστήματος /EGFP pSox2 ήταν σύμφωνα με τα αποτελέσματα της έκφρασης Sox2 από western blot και ανοσοκυτταροχημική ανάλυση σε όλα τα τέσσερα τραχήλου καρκινικές κυτταρικές σειρές. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ο /EGFP πλασμιδίου σύστημα pSox2 είναι κατάλληλο για την απομόνωση της ενδογενούς τραχήλου καρκινικών κυττάρων Sox2 εκφράζουν. Επιπλέον, επειδή περισσότερο SiHa και C33A κύτταρα ενδογενώς εκφράζονται Sox2 σύγκριση με τα κύτταρα HeLa και CaSki, οι κυτταρικές σειρές SiHa και C33A επιλέχθηκαν για να αξιολογηθεί κατά πόσον ενδογενών κυττάρων Sox2 εκφράζουν είναι CSCs σε καρκινώματα του τραχήλου.

έκφραση πρωτεΐνης Sox2 ήταν ανιχνεύθηκαν με western blot (Α) και ανοσοϊστοχημεία (Β) στην αυχενική καρκινικές κυτταρικές σειρές HeLa, SiHa, CaSki και C33A. (Γ) Η αφθονία των καρκινικών κυττάρων EGFP θετικών σε καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές επιμολύνθηκαν με το pSox2 /EGFP ανταποκριτή. (D) Ανοσοϊστοχημική ανάλυση της EGFP

+ και EGFP

– κύτταρα. (Ε) την έκφραση της πρωτεΐνης Sox2 σε μονοστιβάδα, tumorsphere κύτταρα, και ταξινομημένο EGFP

+ και EGFP

– κύτταρα

Η

Για να αποκτήσετε ζωντανά κύτταρα Sox2 εκφράζουν, SiHa και C33A κύτταρα. επιμολυσμένα με τον pSox2 /EGFP πλασμίδιο. Μετά από επιλογή σε καλλιέργεια με 1.000 μg /mL G418 για δύο εβδομάδες, όλα τα κύτταρα ανθεκτικά στο G418 συλλέχθηκαν και διαλογή χρησιμοποιώντας ένα FACSAria Ι? τα κύτταρα που έπεσαν στην & lt? 10

ου και & gt? 90

ου εκατοστημόρια της έκφρασης EGFP ήταν ταξινομημένο και εισπράττονται σε δύο ξεχωριστούς σωλήνες. Ο πρώτος σωλήνας, ο οποίος περιείχε τα κύτταρα με την υψηλότερη έκφραση EGFP, βρέθηκε να περιέχει περισσότερο από 90% όλων των κυττάρων που εκφράζουν EGFP-και αναφέρεται ως η EGFP-θετικό πληθυσμό. Ο δεύτερος σωλήνας, ο οποίος περιείχε τα κύτταρα στο χαμηλότερο 10% της έκφρασης EGFP, μόνο περιείχε EGFP-μη-εκφράζοντα κύτταρα και αναφέρεται ως η EGFP-αρνητικού πληθυσμού (Σχ. 2D). Επιπλέον, Western Blot και ανοσοκυτταροχημική ανάλυση έδειξε ότι μόνο EGFP

+ SiHa και EGFP

+ κύτταρα C33A εξέφρασε Sox2 πρωτεΐνη? EGFP

– SiHa και EGFP

– κύτταρα C33A δεν περιείχε ανιχνεύσιμη Sox2 πρωτεΐνη (Σχήμα 2Ε.). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το σύστημα pSox2 /EGFP μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την επιτυχή είδος ζωντανά κύτταρα που εκφράζουν ενδογενώς Sox2 από καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές.

ΕΟΡΡ- θετικά κύτταρα έχουν μεγαλύτερη ικανότητα για ογκογονικότητα από ΕΟΡΡ- αρνητικά κύτταρα

Ένα από τα πιο σημαντικά χαρακτηριστικά της ΚΕΠ είναι ισχυρό ικανότητά τους να σχηματίζουν όγκους. Για να δοκιμαστεί η ικανότητα σχηματισμού όγκου των EGFP + τραχήλου καρκινικά κύτταρα, τα EGFP θετικών και EGFP- κυτταρικών πληθυσμών ταξινομούνται από αμφότερες τις κυτταρικές σειρές SiHa και C33A εγχύθηκαν υποδορίως σε NOD ποντίκια /SCID. Όταν 10

5 κύτταρα εμβολιάστηκαν σε NOD ποντίκια /SCID, τόσο EGFP + και EGFP- πληθυσμούς SiHa και κύτταρα C33A που σχηματίζονται όγκους. Ωστόσο, οι όγκοι που σχηματίζεται από το SiHa-EGFP

+ κύτταρα αναπτύχθηκαν πολύ γρηγορότερα (Σχήμα 3Α.) Και ήταν πολύ μεγαλύτερη (σχήμα 3Β και 3C.) Από εκείνα που σχηματίζονται από την SiHa-EGFP

– κύτταρα (Σχ. 3Α, Β, και Γ? ρ & lt? 0,05). Ομοίως, η C33A-EGFP

+ κύτταρα σχημάτισαν όγκους που αναπτύχθηκαν πολύ πιο γρήγορα και ήταν πολύ μεγαλύτερες από εκείνες που σχηματίζονται από C33A-EGFP

– κύτταρα (Σχ 3D, Ε και F? Ρ. & Lt? 0,05). Ο σχηματισμός όγκου ως συνάρτηση του εμβολιασμού διαφορετικές αραιώσεις του EGFP

+ και EGFP

– SiHa και C33A κύτταρα συνοψίζεται στον Πίνακα 1. Η συχνότητα ογκογενή του SiHa-EGFP

+ κυττάρων ήταν 1/402 , το οποίο ήταν 17,7 φορές υψηλότερη από εκείνη των SiHa-EGFP

– κύτταρα (1/7114? ρ & lt? 0.001). Η συχνότητα ογκογενή του C33A-EGFP

+ κυττάρων ήταν 1/3058, η οποία ήταν 23,8 φορές υψηλότερη από εκείνη των C33A-EFGP

– κύτταρα (1 /72.860? Ρ & lt? 0,001), υποδεικνύοντας ότι EGFP θετικών SiHa και πληθυσμό C33A περιείχε περισσότερα ΚΕΠ από EGFP-αρνητικού πληθυσμού. Περαιτέρω, ο ρυθμός κυτταρικής απόπτωσης /πολλαπλασιασμός αξιολογήθηκε σε ξενομόσχευμα (χρώση TUNEL /Ki67) για να αποκλείσει την πιθανότητα ότι μειωμένη ανάπτυξη του όγκου κατά EGFP- κυττάρων οφείλεται σε μια λιγότερο βιωσιμότητα του κυττάρου, τα TUNEL και Ki67 χρώση αποτελέσματα στους ιστούς ξενομοσχεύματος από SiHa και C33A κύτταρα φαίνεται στο Σχ 3G και συνοψίζονται στο Σχ. 3Η. Δεν υπάρχει καμία διαφορά σε TUNEL και Ki67 ποσοστό θετικών κυττάρων σε ιστούς ξενομοσχεύματος που σχηματίζεται από τα Sox2-θετικών και αρνητικών SiHa και C33A κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει τη μειωμένη ανάπτυξη του όγκου κατά EGFP- κύτταρο δεν οφειλόταν σε λιγότερο κυτταρικής βιωσιμότητας. Λαμβανόμενα μαζί, όλα αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η ενδογενής Sox2 εκφράζουν τραχήλου καρκινικά κύτταρα έχουν σημαντικά ενισχυμένη ικανότητα σχηματισμού όγκου, επειδή η EGFP + SiHa και κύτταρα C33A περιείχε περισσότερα ΚΕΠ από EGFP- κύτταρα.

καμπύλες ανάπτυξης όγκου (Α) και του όγκου βαρών (Β, Γ) της NOD ποντίκια /SCID εμβολιάζονται με SiHa-EGFP

+ και SiHa-EGFP

– κύτταρα (1 × 10

5 κύτταρα). καμπύλες ανάπτυξης όγκου (D) και τα βάρη των όγκων (Ε, F) του NOD ποντίκια /SCID που εμβολιάστηκαν με C33A-EGFP

+ και C33A-EGFP

– κύτταρα (1 χ 10

5 κυττάρων). Το ποσοστό κυτταρικής απόπτωσης /πολλαπλασιασμός αξιολογήθηκε με προσδιορισμούς Tunel και χρώση Ki67 σε ξενομόσχευμα (G και Η) του EGFP + και EGFP- κύτταρα. Μπαρ = SE. *, P & lt? 0,05. ns, p & gt?. 0.05

Η

EGFP-θετικά κύτταρα εμφανίζουν μεγαλύτερη ικανότητα για αυτο-ανανέωση και διαφοροποίηση από EGFP-αρνητικά κύτταρα

Εκτός από την ικανότητα σχηματισμού όγκων, ΚΕΠ μοιράζονται δύο κρίσιμες ιδιότητες με βλαστικά κύτταρα: αυτο-ανανέωσης και της διαφοροποίησης. Η δοκιμασία σχηματισμού tumorsphere αναγνωρίζεται ως κλασική δοκιμασία για την αυτο-ανανέωση. EGFP θετικών και EGFP-αρνητικά κύτταρα SiHa και C33A καρκίνο του τραχήλου καλλιεργήθηκαν σε απαλλαγμένο από ορό μέσο κάτω από συνθήκες που ήταν ιδανικοί για την καλλιέργεια tumorspheres. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Α, EGFP-θετικά κύτταρα απομονώθηκαν από τις κυτταρικές σειρές SiHa και C33A δημιουργούνται κλασική tumorspheres, ενώ τα EGFP-αρνητικά κύτταρα σχηματίζονται κάποια συσσωματώματα κυττάρων, αλλά δεν σχηματίζουν tumorspheres. Για να αποκλεισθεί η επιδράσεις της συσσωμάτωσης των κυττάρων, η οποία μπορεί να συμβεί σε καλλιέργειες χαμηλής πυκνότητας, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πυκνότητα 1 κυττάρου /φρεάτιο μετά μονοκύτταροι διαλογή με FACS για τη δοκιμή της ικανότητάς τους για tumorsphere σχηματισμό σε πλάκες 96 φρεατίων. Περίπου 6% του EGFP-θετικών κυττάρων SiHa σχηματίζονται tumorspheres, η οποία ήταν σημαντικά υψηλότερο από το ποσοστό του EGFP-αρνητικών κυττάρων SiHa που σχηματίσθηκε tumorspheres (περίπου 1,6% tumorsphere σχηματισμός? Ρ & lt? 0,05). Παρομοίως, περισσότερο EGFP-θετικά κύτταρα C33A που σχηματίζεται tumorspheres (περίπου 12%) σε σύγκριση με τα κύτταρα ΕΟΡΡ- αρνητικά C33A (περίπου 3%) (Εικόνα 4Β? Ρ. & Lt? 0,05). Επιπλέον, και οι δύο EGFP θετικών SiHa και C33A κύτταρα ήταν σε θέση να σχηματίσουν tumorspheres σε τρεις συνεχόμενες χωρία tumorsphere πολιτισμούς, και αυτά τα κύτταρα που σχηματίζονται πολλές περισσότερες tumorspheres από EGFP-αρνητικά κύτταρα σε κάθε πέρασμα καλλιέργειας (Σχ 4C? Ρ. & Lt? 0,05). Περαιτέρω, ο ρυθμός κυτταρικής απόπτωσης /πολλαπλασιασμός αξιολογήθηκε σε tumorsphere (χρώση TUNEL /Ki67) για να αποκλείσει την πιθανότητα ότι μειωμένη ανάπτυξη του όγκου κατά EGFP- κύτταρα οφείλεται στη μικρότερη κυτταρική βιωσιμότητα. TUNEL και Κί67 χρώση οδηγεί σε tumorspheres με SiHa και κύτταρα C33A δείχθηκε στο Σχήμα 4D και συνοψίζονται στο Σχ. 4Ε, στην οποία δεν υπάρχει τυχόν διαφορές σε TUNEL και Ki67 θετικό ποσοστό κυττάρων στις tumorspheres μεταξύ του Sox2-θετικών και αρνητικών SiHa και κύτταρα C33A, υποδηλώνοντας ότι η μειωμένη ικανότητα σχηματισμού tumorsphere από EGFP- κύτταρα δεν οφειλόταν στην λιγότερο κυτταρικής βιωσιμότητας . Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι η ενδογενής Sox2 εκφράζουν SiHa και C33A κύτταρα ενδεχομένως να περιέχουν περισσότερα κύτταρα που έχουν την ικανότητα αυτο-ανανέωσης.

(Α, Β) φωτογραφίες δοκιμασία σχηματισμού Tumorsphere και ο αριθμός των tumorspheres σχηματίζεται από SiHa και τα κύτταρα C33A σε καλλιέργειες χαμηλής πυκνότητας. δοκιμασία σχηματισμού (C) Tumorsphere της EGFP

+ κυττάρων κατά τη διάρκεια της διόδου του πολιτισμού μετά από μονοκύτταρους διαλογή με FACS. Το ποσοστό κυτταρικής απόπτωσης /πολλαπλασιασμός αξιολογήθηκε με προσδιορισμούς Tunel και χρώση Ki67 σε ξενομόσχευμα (D και Ε) του EGFP + και EGFP- κύτταρα. Μπαρ = SE. *, P & lt? 0,05. ns, p & gt? 0,05

Η

Για να προσδιοριστεί η ικανότητα αυτο-ανανέωσης

in vivo

, ο προσδιορισμός σειριακό μεταμόσχευση έγιναν με 10

2 του θετικού Sox2 και. αρνητικά κύτταρα SiHa και C33A, αντίστοιχα. Οι Sox2-θετικά SiHa και C33A κύτταρα θα μπορούσαν να αποτελέσουν τους όγκους σε σειριακή τρία περάσματα πειραμάτων μεταμόσχευσης. Ωστόσο, 10

2 των αρνητικών κυττάρων Sox2 δεν μπορούσε να σχηματίσει οιουδήποτε όγκου στο πρώτο πείραμα μεταμόσχευση. Ως εκ τούτου, η Sox2 θετικά SiHa και κύτταρα C33A έχουν περισσότερη ικανότητα αυτο-ανανέωσης από ό, τι τα αρνητικά κύτταρα

in vivo

. Περαιτέρω, η πρωτεΐνη Sox2 ανιχνεύθηκε με ανοσοϊστοχημική χρώση σε ιστούς ξενομοσχεύματος όγκου που σχηματίζεται από EGFP-θετικά και EGFP-αρνητικά κύτταρα SiHa και C33A (Σχήμα 5Α). Τόσο οι Sox2-θετικών και Sox2-αρνητικά κύτταρα βρέθηκαν στα ξενομοσχεύματα όγκου που σχηματίζεται από τα EGFP-θετικά κύτταρα. Ωστόσο, μόνο Sox2-αρνητικά κύτταρα μπορούσαν να ανιχνευθούν στους ιστούς του όγκου που σχηματίζεται από τα Sox2-αρνητικά τραχήλου καρκινικά κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν περαιτέρω ότι οι Sox2 θετικά SiHa και C33A κύτταρα δεν έχουν μόνο τη δυνατότητα αυτο-ανανέωση για να αναπαράγουν τις Sox2-θετικά κύτταρα, αλλά επίσης έχουν την ικανότητα διαφοροποίησης να παράγουν τα Sox2-αρνητικά κύτταρα

in vivo

.

(Α) έκφραση Sox2 ανιχνεύθηκε από την IHC σε ιστούς ξενομοσχεύματος που σχηματίζεται από SiHa-EGFP +, SiHa-EGFP-, C33A-EGFP + και C33A-EGFP- κύτταρα. (Β) Τα ποσοστά των κυττάρων EGFP + στην πρώτη, δεύτερη και τρίτη διόδους σε μέσο διαφοροποίησης. Μπαρ = SE. *, Ρ & lt?. 0.05

Η

Όταν οι EGFP θετικών SiHa και C33A κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FBS, το ποσοστό των EGFP-θετικών κυττάρων SiHa μειώθηκε από 95,78% κατά το πρώτο πέρασμα στην 77,16% κατά το δεύτερο πέρασμα και 34,82% για το τρίτο πέρασμα. Ομοίως, το ποσοστό των κυττάρων C33A EGFP θετικών μειώθηκε από 90,32% κατά το πρώτο πέρασμα σε 44,56% και 12,01% για τη δεύτερη και τρίτη διόδους σε μέσα διαφοροποίησης, αντίστοιχα (Εικ. 5Β). Επιπλέον, EGFP-αρνητικά SiHa και κύτταρα C33A θα μπορούσε να δημιουργήσει μόνο EGFP-αρνητικά κύτταρα και δεν θα μπορούσε να παράγει κανένα EGFP-θετικά κύτταρα (Σχ. 5Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι μόνο τα ενδογενή Sox2 εκφράζουν τραχήλου καρκινικά κύτταρα έχουν την ικανότητα διαφοροποίησης in vitro.

EGFP θετικών τραχηλικά κύτταρα καρκίνου εκφράζουν Περισσότερες Stem κυτταρικές πρωτεΐνες που σχετίζονται με ό, τι ΕΟΡΡ- αρνητικά κύτταρα

Sox2, Oct4, Bmi1 και Nanog αναγνωρίζονται ως βλαστικών κυττάρων αυτο-ανανέωση παράγοντες που συνδέονται με την πυρηνική μεταγραφή. Συγκρίναμε την έκφραση αυτών των παραγόντων μεταγραφής σε EGFP-θετικά κύτταρα, EGFP-αρνητικά κύτταρα, και ξενομοσχεύματα όγκου. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6, σε πραγματικό χρόνο PCR (Σχ. 6Α), ανάλυση κηλίδος western (Σχ. 6Β και C), και ανοσοϊστοχημική ανάλυση (σχ. 6D) αποκάλυψε ότι EGFP-θετικά κύτταρα SiHa και οι όγκοι που σχηματίζονται από αυτά τα κύτταρα εξέφρασαν υψηλότερα επίπεδα των πρωτεϊνών Bmi1, Oct4 και Sox2 από EGFP-αρνητικά κύτταρα SiHa τόσο στο μεταγραφικό επίπεδο (Σχ. 6Α) και το μεταφραστικό επίπεδο (Σχ. 6Β, Γ και Δ). Ωστόσο, η έκφραση της πρωτεΐνης Nanog ήταν αμετάβλητη

(Α) Διαφορική έκφραση πολλών γονιδίων βλαστικών κυττάρων που σχετίζονται με SiHa-EGFP

+ και SiHa-EGFP

-. Κλάσματα επικυρωθεί από qPCR. (Β) Ανίχνευση των παραγόντων βλαστικών κυττάρων που σχετίζονται με διαλογή SiHa-EGFP

+ και SiHa-EGFP

– κύτταρα με κηλίδα western. (C) Ημι-ποσοτική ανάλυση των παραγόντων που σχετίζονται με κυτταρικό στέλεχος σε σχέση με β-ακτίνης. (D) Stem γονιδιακής έκφρασης των κυττάρων που σχετίζονται με ξενομοσχεύματα όγκου ανιχνεύθηκε με ανοσοϊστοχημεία. ΑΙ_ϋΗ1 ανιχνεύθηκε με ανοσοϊστοχημεία (Ε), στύπωμα Western (F), και ημι-ποσοτική ανάλυση (G) σε SiHa-EGFP

+ και SiHa-EGFP

– όγκους. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης για RT-PCR και κηλίδωση Western. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν S.D. (N = 3). * P & lt?. 0.05

Η

Επιπλέον, τα τελευταία χρόνια, ένας αυξανόμενος αριθμός μελετών έχουν δείξει ότι ΑίϋΗ-θετικά κύτταρα αντιπροσωπεύουν ΚΕΠ σε πολλά σωματικά όγκους [23]. Στην παρούσα μελέτη, ανοσοχημική χρώση (Σχ. 6Ε, αριστερά) και τη δυτική δοκιμασίες κηλίδος (Σχ. 6F και G) απέδειξαν ότι EGFP-θετικά κύτταρα εξέφρασαν ΑΙ_ϋΗ, ενώ EGFP-αρνητικά κύτταρα δεν το έκανε. Ανοσοϊστοχημική ανάλυση έδειξε επίσης ότι οι ιστοί του όγκου που σχηματίζεται από EGFP-θετικά κύτταρα SiHa, όχι εκείνα που σχηματίζονται με EGFP-αρνητικά κύτταρα SiHa, βάφτηκαν με αντίσωμα ΑΙ_ϋΗ1 (Σχ. 6Ε, δεξιά). Σε κύτταρα C33A, οι σχετικές γονίδια βλαστικών κυττάρων Bmi1, Oct4 και Nanog ανιχνεύθηκαν επίσης με western blot. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι C33A-EGFP + κύτταρα υποπληθυσμός εκφράζεται πολύ ισχυρότερη από ό, τι C33A-EGFP- κύτταρα, αναμένουμε Nanog, η οποία ήταν παρόμοια με τα κύτταρα SiHa (σχήμα S1, Α και Β). Επιπλέον, ΑΙ_ϋΗ1 ήταν ανιχνεύσιμη σε κύτταρα EGFP + αλλά όχι σε EGFP- κύτταρα με κηλίδα western και IHC (Σχήμα S1, A-C). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η EGFP-θετικά τραχήλου καρκινικά κύτταρα εκφράζουν επίσης ορισμένες κυτταρικές παράγοντες που συνδέονται με στέλεχος, όπως Oct4, Bmi1, και ΑΙ_ϋΗ1.

EGFP θετικών τραχήλου της μήτρας Cancer Cells παρουσίασαν περισσότερο ΕΜΤ δυνατότητες από EGFP- αρνητικά κύτταρα

επαγωγή EMT έχει αναφερθεί για τη δημιουργία κυττάρων με βλαστικά-όπως ιδιότητες [24], και ΚΕΠ μοιραστώ κάποιες ιδιότητες με τα κύτταρα που υποβάλλονται σε EMT [25], [26]. Εδώ, εκτιμήσαμε την κατάσταση των δεικτών EMT σε Sox2-θετικά κύτταρα, Sox2-αρνητικά κύτταρα, και ιστοί όγκου που σχηματίζεται από αυτά τα κύτταρα (Εικ. 7). Σε SiHa-EGFP

+ κύτταρα και ιστούς όγκων, σε πραγματικό χρόνο PCR έδειξαν ότι οι πρωτεΐνες μεσέγχυμα όπως βιμεντίνη, σαλιγκάρι, και β-κατενίνης ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω στο επίπεδο του mRNA (εικ. 7Α). Ομοίως, κηλίδα Western (Εικ. 7Β), ανοσοκυτοχημική (Σχ. 7C), και ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις (εικ. 7D) απέδειξαν ότι είχαν επίσης ρυθμίζεται προς τα πάνω στο επίπεδο της πρωτεΐνης. Σε αντίθεση, η Ε-καντερίνη, ένα πολύ γνωστό επιθηλιακών δείκτη, ήταν προς τα κάτω σε EGFP-θετικά κύτταρα SiHa και αυξορρυθμίζεται EGFP-αρνητικά κύτταρα και ξενομοσχεύματα όγκων (Σχ. 7Α-D). Βρήκαμε επίσης ότι τα γονίδια EMT σχετίζονται, βιμεντίνη και β-κατενίνης, εκφράστηκαν σε υψηλότερο επίπεδο σε EGFP-θετικά κύτταρα C33A από εκείνο στο EGFP-αρνητικά κύτταρα με κηλίδα Western και ανοσοκυτταροχημική χρώση. Η επιθηλιακή δείκτης Ε-καδερίνης ήταν ανιχνεύσιμη σε C33A-EGFP- κύτταρα, αλλά όχι σε C33A-EGFP + κύτταρα. Ωστόσο, η πρωτεΐνη σαλιγκάρι δεν εκφράστηκε και στις δύο EGFP-θετικών και EGFP-αρνητικά κύτταρα. (Εικόνα S2).