Abstract

Cellular κινητικότητα είναι η βάση για τον καρκίνο των κυττάρων εισβολή και μετάσταση. Στην περίπτωση του καρκίνου του μαστού, ο πιο κοινός τύπος καρκίνου μεταξύ των γυναικών, η μετάσταση αποτελεί την πιο καταστροφική στάδιο της νόσου. Ο κεντρικός ρόλος της κυτταρικής κινητικότητας στην ανάπτυξη καρκίνου υπογραμμίζει τη σημασία της κατανόησης των ειδικών μηχανισμών που εμπλέκονται στη διαδικασία αυτή. Στο πλαίσιο αυτό, η ανάπτυξη του όγκου και των μεταστάσεων θα ήταν η συνέπεια της απώλειας ή βλάβης των μηχανισμών που ελέγχουν κυτταροσκελετού αναδιαμόρφωση. Profilin μου ανήκει σε μια οικογένεια μικρών πρωτεϊνών δέσμευσης ακτίνης που πιστεύεται ότι βοηθούν στην επιμήκυνση ακτίνης στην αιχμή της που μεταναστεύουν κύτταρα. Παραδοσιακά, Profilin Ι έχει θεωρηθεί ότι είναι ένα ουσιώδες στοιχείο ελέγχου για τον πολυμερισμό της ακτίνης και την κυτταρική μετανάστευση. Η έκφραση του Profilin Ι ρυθμίζεται προς τα κάτω στο στήθος και διάφορες άλλες καρκινικά κύτταρα. Σε ΜΟΑ-ΜΒ-231 κύτταρα, μία κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού, περαιτέρω αναστολή της έκφρασης Profilin Ι προάγει υπερκινητικότητα και μεταστατική εξάπλωση, ένα εύρημα που έρχεται σε αντίθεση με τον προτεινόμενο ρόλο της στην ενίσχυση της Profilin πολυμερισμού. Στην έκθεση αυτή, έχουμε πάρει πλεονέκτημα της ανάκτησης φθορισμού μετά φωτολεύκανση (FRAP) της GFP-ακτίνης να ποσοτικοποιηθούν και να συγκρίνουν τη δυναμική της ακτίνης στην ηγετική ακραίο επίπεδο τόσο του καρκίνου και μοντέλα μη καρκινικό κύτταρο. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι (i) υψηλό επίπεδο δυναμικής ακτίνης (δηλαδή, ένα μεγάλο κινητό κλάσμα νημάτια ακτίνης και ένα γρήγορο κύκλο εργασιών) είναι ένα κοινό χαρακτηριστικό ορισμένων καρκινικών κυττάρων? (Ii) τον πολυμερισμό της ακτίνης δείχνει ένα υψηλό βαθμό ανεξαρτησίας από την παρουσία εξωκυτταρικών παραγόντων ανάπτυξης? και (iii) τα αποτελέσματά μας επιβεβαιώνουν επίσης το ρόλο των Profilin Ι στη ρύθμιση του πολυμερισμού της ακτίνης, όπως η αύξηση των ενδοκυτταρικών επιπέδων του Profilin Ι μείωσε την αναλογία κινητό κλάσμα νημάτια ακτίνης και επιβραδύνθηκε ρυθμού πολυμερισμού τους? Επιπλέον, τα αυξημένα επίπεδα Profilin οδήγησε επίσης σε μείωση των ατομικών ταχύτητα των κυττάρων και κατευθυντικότητα

Παράθεση:. Lorente G, Syriani Ε, ο Μοράλες Μ (2014) ακτίνη νημάτων που βρίσκονται στην αιχμή της καρκινικά κύτταρα χαρακτηρίζονται από υψηλής Mobile κλάσμα και τον κανονισμό Κύκλος εργασιών κατά Profilin Ι PLoS ONE 9 (1): e85817. doi: 10.1371 /journal.pone.0085817

Επιμέλεια: Γιούλια Κομάροβα, Πανεπιστήμιο του Ιλινόις στο Σικάγο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 30, 2013? Αποδεκτές: 3 Δεκεμβρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 17η, Ιανουαρίου, 2014

Copyright: © 2014 Lorente et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το ισπανικό Υπουργείο Έρευνας (SAF2010-16024? BFU 2012 έως 17.537? ONCE το 2010 και το 2011) και τα κεφάλαια Fundación Rioja. GL ήταν κάτοχος υποτροφίας του Universidad de Barcelona. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Cellular κινητικότητα είναι μια πολύπλοκη διαδικασία που λαμβάνει χώρα σε όλους τους τύπους κυττάρων [1]. Μετανάστευση πάνω από μια επίπεδη επιφάνεια περιλαμβάνει την προεξοχή μιας λεπτής μεμβράνης μανδύα, όπου το έλασμα, το οποίο συμπληρώνεται με ένα περίπλοκο ακτίνη διακλαδισμένο δίκτυο. Η δύναμη για την προεξοχή μεμβράνης και επέκταση παρέχεται με πολυμερισμό ελεγχόμενη και περιορισμένη ακτίνης στην πλησιέστερη ακμή της μεμβράνης, τη λεγόμενη προπορευόμενη ακμή. Κατά τη διάρκεια της επιμήκυνσης, οι νημάτια ακτίνης πολωμένο με αγκαθωτό άκρο τους (ή συν άκρο) προς την κατεύθυνση της μεμβράνης [2], η οποία ωθείται από τις ίνες, αναγκάζοντας την επέκταση του ελάσματος. Η επέκταση έλασμα, ως εκ τούτου, είναι αυτό που καθορίζει την κατευθυντικότητα και την κίνηση του κυττάρου [3]. Κλείσιμο ρύθμιση της κυτταρικής μετανάστευσης είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη, την επούλωση των πληγών και ανοσολογικές αποκρίσεις, ενώ αποκλίνον και ανεξέλεγκτη κυτταρική κινητικότητα είναι ένα επαναλαμβανόμενο χαρακτηριστικό σε διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων.

Ένας αριθμός μελετών δείχνουν ότι Profilin Ι (PfnI) , ένα ουσιαστικό πρωτεΐνη πρόσδεσης ακτίνης, μπορεί να παίζουν ένα σημαντικό ρυθμιστικό ρόλο στη διαδικασία της κυτταρικής κινητικότητας. Έτσι,

Dictyostelium αμοιβάδες

μεταλλάξεις για PfnI παρουσιάζουν κινητικότητα και ελαττώματα κυτοκίνησης [4], όπως και η «chickadee», τη μηδενική μετάλλαξη για την ομόλογο της PfnI στο

Drosophila

[5]. Ομοίως, φίμωση PfnI σε ανθρώπινα αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα επάγει την αναστολή της κινητικότητας και ελαττωμάτων σε προεξοχή μεμβράνη [6]. Επιπλέον, PfnI νοκ-άουτ έχει αποδειχθεί ότι οδηγεί σε πρώιμη εμβρυϊκή θάνατο των κυττάρων σε ποντίκια

Από τα μέλη της οικογένειας Profilin (PfnI να PFN IV) [7]., PfnI είναι το πιο ευρέως εκφράζεται. Αρχικά αναγνωρίστηκε ως G-ακτίνης πρωτεΐνη εγκλεισμού [8], και από τότε, έχει ανατεθεί αρκετές άλλες λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένης της πυρηνικής κυτταρόπλασμα κυκλοφορία ακτίνης με σύνδεση προς exportin 6 [9], ματίσματος mRNA [10], καθώς και φυσαλιδώδη ενδοκύτωση αλληλεπιδρώντας με κλαθρίνη και πρωτεΐνη valosin που περιέχει [11]. Σήμερα, είναι κοινώς αποδεκτό ότι ο κύριος ρόλος του είναι να προωθήσει τον πολυμερισμό της ακτίνης καταλύοντας την ανταλλαγή της ADP για την ATP σχετικά με το μονομερές G-ακτίνη [12]. Επιπλέον, η δομή του PfnI περιέχει ένα πεδίο σύνδεσης πολυπρολίνη (PLP) [13], [14] και δύο θέσεις πρόσδεσης φωσφοϊνοσιτιδίου [15] – [17]. Δυνάμει του πρώτου, PfnI αλληλεπιδρά με μια πληθώρα πλούσια σε προλίνη πρωτεΐνες. Μεταξύ άλλων, συνδέεται άμεσα με Ena /VASP [18], Ν-WASP [19], WAVE [20] και η ακτίνη συγκεντρώσεως οικογένεια formins [21]. Όλες αυτές οι πρωτεΐνες προσλαμβάνουν PfnI στις ζώνες δυναμικής αναδιαμόρφωσης της ακτίνης, όπως η προπορευόμενη ακμή του ελασματοπόδια. Η ενδοκυτταρική εντόπιση του PfnI επιβεβαιώνει τη σύνδεσή της με περιοχές έντονης τον πολυμερισμό της ακτίνης, και έτσι PfnI βρίσκεται σε ρΤΚ2 μικρονημάτια από μαρσιποφόρο ινοβλάστες [22], βδέλλα νευρωνική κώνους ανάπτυξης [23], Bovine δοκιδωτού ελάσματα [24], που προεξέχουν περιοχές αρουραίου ινοβλαστών [25], και κοντά στο άκρο προώθηση των ενδοθηλιακών κυττάρων [26].

Ένα θεμελιώδες χαρακτηριστικό της εισβολής καρκινικών κυττάρων και τη μετάσταση είναι μία αυξημένη κινητικότητα και μετανάστευση ικανότητα των κυττάρων. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα επίπεδα έκφρασης του PfnI ρυθμίζονται προς τα κάτω σε διάφορες επεμβατικές μαστού, του παγκρέατος και ηπατική τύπους καρκινικών κυττάρων [27] – [31]. Περαιτέρω μείωση των επιπέδων PfnI με φίμωση αποτελέσματα της έκφρασής του σε ακόμα υψηλότερο κινητικότητα [29], [32] και την εξέλιξη του όγκου [33]. Το αντίθετο είναι επίσης αληθές: αύξηση των επιπέδων PfnI μειώνει κυτταρική διεισδυτικότητα και κινητικότητα, ακολουθούμενη από μια ρύθμιση προς τα πάνω του στρες-ινών και εστιακή προσκόλληση [27], [29]. Επιπλέον, PfnI υπερέκφραση καταστέλλει τόσο έκτοπη και ορθοτοπική ογκογονικότητα και μικρο-μετάσταση [32]. Για να συμβεί δραστηριότητα καταστολή του όγκου μέσω αυτού του μηχανισμού, τόσο οι θέσεις της ακτίνης και δεσμευτική φωσφοϊνοσιτίδιου σε PfnI πρέπει να είναι λειτουργική [30], [32], [34]. Επιπλέον, PfnI υπερέκφραση έχει αναφερθεί ότι αυξάνει την έκφραση της ΡΤΕΝ, ως εκ τούτου, έμμεσα, καταστέλλοντας Akt δραστηριότητας από τον έλεγχο της παραγωγής φωσφοϊνοσιτιδίου [35].

Η δέσμευση της PfnI φωσφατιδυλοϊνοσιτολικής είναι πιο σημαντική από ό, τι αναμενόταν προηγουμένως. Η οικογένεια Ena /VASP των πρωτεϊνών uncaps τα ελεύθερα άκρα αγκαθωτό ακτίνης, επιτρέποντας προοδευτική επιμήκυνση τους [36]. Lamellipodin (LPD) δεσμεύει Ena /VASP μέσω ενός τομέα EVH1, και συγκεκριμένα αλληλεπιδρούν με PI (3,4) P

2. Με τον τρόπο αυτό, ο στόχος μεμβράνη του LPD είναι ικανή πρόσληψη Ένα /VASP στη μεμβράνη. Μια σειρά από πρόσφατα ευρήματα δείχνουν ότι PfnI περιορίζει τη διαθέσιμη πισίνα του PI (3,4) P

2. Με τον τρόπο αυτό, θα PfnI ρυθμίζουν αρνητικά επίπεδα φωσφοϊνοσιτιδίου στη μεμβράνη, όσο και έμμεσα να περιορίσουν LPD-Ena /VASP στόχευση στην μεμβράνη [37]. Σε MDA-MB-231 κύτταρα, η εξάντληση PfnI ρυθμίζει LPD συσσώρευση, έμμεσα αυξάνοντας τη συγκέντρωση Ena /VASP στην αιχμή, και, κατά συνέπεια, την προώθηση του πολυμερισμού της ακτίνης και την αναφερόμενη υπερκινητικότητας μετά την εξάντληση PfnI [38]. Ωστόσο, απομένει να διευκρινιστεί ότι οι υποκείμενες συνέπειες αυτών των PfnI κατασταλτικών ενεργειών επί του κύκλου εργασιών της ακτίνης. Πειραματική απόδειξη δεικνύει ότι ένα λειτουργικό πεδίο σύνδεσης ακτίνης των PfnI είναι ζωτικής σημασίας για τη μείωση του καρκίνου κυτταρική κινητικότητα και φαινοτύπου του όγκου [29], [30]. Δεδομένης της πληθώρας των πειραματικές αποδείξεις που υποστηρίζουν τη σημασία της PfnI στη ρύθμιση του πολυμερισμού της ακτίνης και η κυτταρική μετανάστευση, είναι αινιγματικός πόσο χαμηλά επίπεδα έκφρασης του PfnI συνδέονται με αυξημένη κυτταρική κινητικότητα και πώς ακτίνη treadmilling μπορεί να ρυθμιστεί.

η έκθεση αυτή, ο κύκλος εργασιών της lamellipodial ακτίνης εξετάστηκε χρησιμοποιώντας την ανάκαμψη φθορισμού μετά φωτολεύκανσις (FRAP) [39]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ο κυτταροσκελετός στην αιχμή των καρκινικών κυττάρων είναι πολύ πιο δυναμική από αυτή των μη νεοπλασματικά κύτταρα. Επιπλέον, αύξηση των επιπέδων PfnI σε καρκινικά κύτταρα οδηγεί σε μειωμένη treadmilling ακτίνη και διαταραγμένη κυτταρική κινητικότητα. Τέλος, βρήκαμε επίσης στοιχεία που δείχνουν ότι η treadmilling ακτίνης σε καρκινικά κύτταρα είναι ευαίσθητα στην εξωκυττάρια ρύθμιση από αυξητικούς παράγοντες.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταροκαλλιέργειες

MDA-MB-231 ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές όγκου μαστού καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ F12-Ham μεσαίες και 10% FBS (Sigma). Η ανθρώπινη μαστική επιθηλιακή κυτταρική γραμμή ΜΟΡ10Α αναπτύχθηκε στο ακόλουθο μέσο καλλιέργειας: HEPES 15 mM, ορό ίππου 5%, EGF 20 ng /ml, υδροκορτιζόνη 0,5 mg /ml, η τοξίνη της χολέρας 100 ng /ml, η ανθρώπινη ινσουλίνη 10 mg /ml, 50 mg /ml πενικιλίνη και 50 U /ml στρεπτομυκίνη σε DMEM F12 ΗΑΜ (όλα παρέχονται από τη Sigma). Το ανθρώπινο πνεύμονα κυτταρική γραμμή όγκου Α549, MEF εμβρυϊκών ινοβλαστών ποντικού και HeLa ανθρώπινο τράχηλο κυτταρική γραμμή όγκου καλλιεργήθηκαν σε DMEM, συμπληρωμένο με 50 mg /ml πενικιλλίνη, 50 U /ml στρεπτομυκίνη και 10% FBS (Sigma Aldrich). MDA-MB-231 αγοράστηκαν από την ΑΤΤΟ (USA? Ref ΗΤΒ-26.). κύτταρα ΜΟΡ10Α, διέλευση 8, ήταν μια γενναιόδωρη δωρεά από το LP Saucedo (CNIO, Μαδρίτη, Ισπανία). Α549 και κύτταρα HeLa, απόσπασμα 10, ήταν μια γενναιόδωρη μορφή δώρου Η Aguilar (ICO, Βαρκελώνη, Ισπανία). ΥΠΟΙΟ κύτταρα, η διέλευση 6, ήταν γενναιόδωρη δωρεά από Α Angulo (IDIBAPS, Βαρκελώνη).

Ανοσοκυτοχημεία και την εικόνα ανάλυσης

Εν συντομία, για ανοσοκυτταροχημικές αναλύσεις, κυτταρικές καλλιέργειες ξεπλύθηκαν με PBS και καθορίζεται για 15 λεπτά σε 4% παραφορμαλδεΰδη /PBS. Οι καλυπτρίδες ακολούθως πλένονται τρεις φορές σε PBS και επωάστηκαν για 30 λεπτά σε διάλυμα αποκλεισμού (2% ορό κατσίκας, 2% αλβουμίνη ορού, 0.1% Triton Χ-100 σε PBS). Αντισώματα αραιώθηκαν σε κατάλληλη συγκέντρωση εντός διαλύματος αποκλεισμού. Οι καλυπτρίδες επωάστηκαν για 60 λεπτά στο διάλυμα αντισώματος. Τα δείγματα στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές και επωάστηκαν για 30 λεπτά με τα κατάλληλα δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με φθορισμό. Τέλος, καλυπτρίδες πλύθηκαν πέντε φορές και τοποθετείται με Mowiol. εικόνες φθορισμού ελήφθησαν με ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Olympus IX70), χρησιμοποιώντας ένα ΕΩΣ μονοχρωμάτορα ως πηγή φωτός. Ελήφθησαν εικόνες με ένα συνημμένο ψύχεται κάμερα CCD (Orca II-ER, Hamamatsu)

Χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα αντισώματα:. Αντι-βινκουλίνης μονοκλωνικό αντίσωμα (. Chemicon, ref MAB3574) και αντι-Profilin πολυκλωνικά και μονοκλωνικά αντισώματα (Cell Signaling, ref. 3237 και Synaptic σύστημα, ref. 308 011). Δευτερογενή αντισώματα, Όρεγκον πράσινο Φαλλοϊδίνη και Φαλλοϊδίνη-Alexa Fluor® 594 αγοράστηκαν από την Invitrogen. Εικόνα J λογισμικό ανάλυσης (National Institutes of Health) χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση διάδοση και εστιακή πρόσφυση.

μετρήσεις περιοχή τηλέφωνα και εστιακών συμφύσεων ποσοτικοποίηση

Εν συντομία, έως 10000 κύτταρα σπάρθηκαν σε καλυπτρίδες 12 χιλιοστά σε 24 φρεάτια πλακών. Μετά την αντίστοιχη θεραπεία, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε 4% PFA και χρωματίζονται με Oregon-πράσινο φαλλοειδίνη ή φαλλοειδίνη-Alexa Fluor® 594. Παρά την έλλειψη ινών στρες, χρώση Φαλλοϊδίνη επέτρεψε τη μέτρηση της συνολικής επιφάνειας των κυττάρων. περιοχή κυττάρου ποσοστώθηκε με ανάλυση ψηφιακό κατώφλι χρησιμοποιώντας το λογισμικό Image J.

Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη

Σε μερικά πειράματα, τα ενδοκυτταρικά επίπεδα Profilin τροποποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα διαπερατή μεμβράνη εκδοχή του PfnI [24], [ ,,,0],40]. PTD4-Profilin (21 kDa) δημιουργήθηκε με σύντηξη ενός τομέα μεταγωγής, pTD4 [41], για να Profilin. Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη εκφράστηκε σε

E. Coli

και καθαρίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [40]. Εν συντομία, οι αρμόδιες

Ε. Coli BL21

-plys μετασχηματισμένο με τον φορέα pRSETA-pTD4-pFN Ι προκλήθηκαν με την προσθήκη 1 mM IPTG (Sigma) στους 37 ° C για 6 ώρες. Τα βακτηριακά σφαιρίδια υποβλήθηκαν σε λύση με κατάψυξη και απόψυξη πρωτόκολλο σε υγρή N

2, που ακολουθείται από κατεργασία με υπερήχους σε πάγο με την παρουσία ϋΝΑση και ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεΐνης (Sigma). Κυτταρολύματα διαχωρίστηκαν με φυγοκέντρηση, και η διαλυτή πρωτεΐνη απομονώθηκε με χρήση στηλών ρητίνης-συσκευασμένα Νί-ΝΤΑ (Quiagen). πλύση πρωτεϊνών και η έκλουση διεξάγεται με υψηλές συγκεντρώσεις ιμιδαζολίου. ανταλλαγή ρυθμιστικού και η συγκέντρωση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκαν με φυγοκέντρηση σε Amicon Ultra-15 10000 MWCO φυγόκεντρος φίλτρα (Millipore), αντικαθιστώντας το μέσο έκλουσης με PBS. Οι πρωτεΐνες καταψύχθηκαν σε υγρό Ν

2 και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C σε 10-15% γλυκερόλη-PBS. Βακτήρια και πρωτεΐνες αντιμετωπίζονται σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές ασφαλείας για το προσωπικό των εργαστηρίων Εργασία με Trans-Ενεργοποίηση Μεταγωγή (ΤΑΤ) Πρωτεΐνη Μεταγωγή Τομείς.

Η επιμόλυνση

Η επιμόλυνση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ αντιδραστηρίου επιμόλυνσης Efectene από Qiagen , ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αρκετοί φορείς έκφρασης χρησιμοποιήθηκαν: CMV-GFP, CMV-GFP-ακτίνης και CMV-MembraneCherry ευγενώς από τον Dr. Ρ Tebar (University of Barcelona, ​​Spain), και CMV-GFP-PfnI ευγενώς από τον Dr. Hitomi Μϊππιγο (Πανεπιστήμιο Tokyo, Japan).

Σταθερές κυτταρικές γραμμές

Σταθερές κυτταρικές γραμμές παρήχθησαν από MDA-MB-231 κυτταρική σειρά καρκίνου επιμολυσμένα με πλασμίδια που εκφράζουν GFP-ακτίνη, GFP-PfnI, MembraneCherry-PfnI και GFP υπό τον έλεγχο ενός CMV προαγωγού (όλες οι εργασίες εκτελέστηκε με κύτταρο αποσπάσματα από 6 έως 8). Οι επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν με αντιδραστήριο Efectene Transfection (Qiagen), όπως περιγράφεται στο πρωτόκολλο. Τα επιμολυσμένα κύτταρα επιλέχθηκαν με τρεις εβδομάδες επώασης σε γενταμικίνη 1 mg /ml (Sigma). FACS χρησιμοποιήθηκε για το διαχωρισμό υψηλής και χαμηλής εκφράζουν GFP-ακτίνης κυττάρων. Το διάλυμα διαλογής ρυθμιστικό κύτταρο που χρησιμοποιήθηκε αποτελείτο από 5 mM EDTA, 25 mM HEPES ρΗ 7.0, 1% FBS (απενεργοποιημένο με θερμότητα) και PBS χωρίς Ca

2 + /Mg

2+. Σχετικά επίπεδα έκφρασης ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης αναλύθηκαν με κηλίδα Western.

Η κυτταρική κινητικότητα

δοκιμασία

MDA-MB-231 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων (Nunc) σε 40% συρροή και επισημαίνονται με DRAQ5, ένα κύτταρο-διαπερατό μακρινού κόκκινη βαφή φθορισμού του DNA, για 5 λεπτά (Cell Signaling Technology). Οι πλάκες καλλιέργειας τοποθετήθηκαν στη σκηνή ενός Leica DMITCS SL σάρωσης με λέιζερ συνεστιακό μικροσκόπιο φασματική (Leica Microsystems Χαϊδελβέργη, GmbH) που συνδέεται με ένα Leica DMIRE2 ανεστραμμένο μικροσκόπιο εφοδιασμένο με σύστημα επώαση με θερμοκρασία και CO

2 ελέγχου. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν στους 35 ° C και 5% CO

2. Για την απεικόνιση των DRAQ5 βάφονται πυρήνων, εικόνες αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν αντικειμενικό φακό 40 × (NA 1.32) και ενθουσιασμένοι με μια γραμμή λέιζερ 633 nm. Η συνεστιακή pinhole ορίστηκε σε 4,94 μονάδες Airy να ελαχιστοποιηθεί η απώλεια φθορισμού. Ελήφθησαν εικόνες κάθε 5 λεπτά για 8 ώρες. Εικόνα J λογισμικό ανάλυσης (ΝΙΗ) χρησιμοποιήθηκε για την ταχύτητα και την κατευθυντικότητα ποσοτικοποίηση. δεδομένων κατευθυντικότητα παρουσιάστηκε ως η γραμμική απόσταση (End) διαιρούμενο με το συνολικό μήκος απόσταση κατά τη διάρκεια 8 ώρες, όπως περιγράφεται από Pankov et al., 2005 [42].

ανάκτησης φθορισμού μετά φωτολεύκανση (FRAP)

πειράματα FRAP διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα protocol:10 ενιαίο σαρώσεις (προ-λεύκανση) αποκτήθηκαν σε διαστήματα των 300 ms, που ακολουθούνται από 20 σαρώσεις λευκαντικό σε πλήρη ισχύ λέιζερ χρησιμοποιώντας μια τετράγωνη περιοχή των 24 μm

2. Κατά την περίοδο μετά την λεύκανση, 30-60 σαρώσεις αποκτήθηκαν κατά διαστήματα 300 ms, ακολουθούμενη από 100 εικόνες που αποκτήθηκαν σε 5 s διαστήματα, αυτό το χρονικό διάστημα ήταν αναγκαίο να επιτραπεί ο φθορισμός να φτάσει σε ισορροπία. Για να επιλυθεί το αρχικό γρήγορη ανάκαμψη, ορισμένα πειράματα πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του Leica πετάξει απόκτηση mode? λεύκανση πραγματοποιήθηκε κατά τη διάρκεια της προόδου σάρωσης Χ μύγα χρησιμοποιώντας 100% της ισχύος λέιζερ, και κατά τη διάρκεια της προς τα πίσω σάρωσης, ο φθορισμός διαβάστηκε με ένταση λέιζερ ρυθμιστεί σε τιμές απεικόνισης (185 ms εικόνες του διαστήματος), ενώ αποκτήθηκαν εικόνες μετά λεύκανσης (30-60 s) κατά το ίδιο χρονικό διάστημα. Για να αποφευχθούν σημαντικές φωτολεύκανση, η ένταση διέγερσης μειώθηκε στο περίπου 5% της ισχύος του λέιζερ κατά τη διάρκεια της απόκτησης εικόνας. ανάκτηση φθορισμός ποσοτικά με τη χρήση επεξεργασίας εικόνας Leica Ομοεστιακή λογισμικού. φθορισμός υποστρώματος μετρήθηκε σε μια τυχαία πεδίο έξω από το κύτταρο και αφαιρείται από όλες τις μετρήσεις. Το σήμα φθορισμού που μετράται στην περιοχή ενδιαφέροντος (ROI), διορθώθηκε για την απόκτηση φωτολεύκανση και τις διακυμάνσεις ολόκληρων φθορισμού μετά από μια μέθοδο διπλής εξομάλυνση, καθορίζεται ως εξής: Irel = Η /I0 * Τ0 /Tt, όπου είναι η μέση ένταση σε ROI σε χρόνο t? I0 είναι η μέση ένταση του ROI κατά τη διάρκεια της περιόδου προ-λεύκανση? Τ0 είναι η ένταση κατά τη διάρκεια της προ-λεύκανση του μη λευκασμένο περιοχή (συνήθως, μια γειτονική κύτταρο ή το πυρηνικό περιοχή)? και Tt είναι η ένταση σε χρόνο t αυτής της περιοχής. Η εισαγωγή του συντελεστή διόρθωσης (Τ0 /Tt) ευθύνεται για πιθανές μικρές διακυμάνσεις στη συνολική ένταση φθορισμού που προκαλείται από το ίδιο το λευκαντικό, και δίνει μια πιο ακριβή εκτίμηση του μετρούμενου φθορισμού στο ROI [43], [44].

Η καθαρή ανάκαμψη φθορισμού (κινητό κλάσμα? Mf) μετράται στην περιοχή ενδιαφέροντος προσδιορίστηκε ως εξής: Mf = Fend-Fpost /Fpre-Fpost, όπου Fend είναι ROI μέση ένταση στη σταθερή κατάσταση? Fpost αντιπροσωπεύει ένταση ROI μετά φωτολεύκανση? και Fpre είναι η μέση προ-λεύκανση ένταση ROI. Η σταθερά χρόνου αποκατάστασης (τ) ελήφθη με προσαρμογή καμπύλης χρησιμοποιώντας Prism Software (GraphPad), υποθέτοντας μια one-εκθετικό μοντέλο (κάτω, τότε η αύξηση στην κορυφή).

Η ενδοκυτταρική ποσότητες ανασυνδυασμένου Profilin

Υπολογισμός των ενδοκυτταρικών ποσοτήτων pTD4-PfnI έγινε με πυκνομετρία Western blot. Εν συντομία, τα κύτταρα αναπτύσσονται σε 25 cm

2 φιάλες πλύθηκαν πέντε φορές, επεξεργασία με θρυψίνη, και πλύθηκαν σχολαστικά με φυγοκέντρηση για να μειωθεί η εξωκυττάρια συγκέντρωση πρωτεΐνης. Κυτταρολύματα έτρεξαν σε ένα SDS-πολυακρυλαμιδίου. Μειωμένα ποσά καθαρισμένου ανασυνδυασμένου pTD4-PfnI, φορτώθηκαν στο ίδιο φρεάτια. Και οι δύο πρωτεΐνες, ενδογενή Profilin και pTD4-PfnI ήταν εύκολα διακρίνονται από τα μοριακά βάρη τους και ανιχνεύθηκαν με μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι Profilin I.

Στατιστικά

Όλα τα στοιχεία αντιπροσωπεύονται ως μέσοι ± SEM και ήταν αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Prism (έκδοση 4.0 και 6.0, Graphpad). Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση t-test του Student, όταν απαιτείται. Σημασία επίπεδα σημειώθηκαν ως εξής: α. * ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01, και *** ρ & lt? 0.001

Αποτελέσματα

Η δυναμική ακτίνη των καρκινικών κυττάρων χαρακτηρίζεται από υψηλό κινητό κλάσμα και σύντομο χρόνο αποκατάστασης

για να μελετήσουμε τη δυναμική του κυτταροσκελετού της ακτίνης στην αυξανόμενη αιχμή των καρκινικών κυττάρων, έχουμε επιλέξει ο καρκίνος του μαστού κυτταρική σειρά MDA-MB-231. Αυτή η κυτταρική γραμμή φέρει το

KRAS

G13D και τις

BRAF

μεταλλάξεις G464V [45] και είναι ιδιαίτερα κατάλληλο για προ-κλινικές μελέτες, καθώς είναι εξαιρετικά επιθετική, τόσο

in vitro

και

in vivo

[46]. MDA-MB-231 κύτταρα σε καλλιέργεια παρουσιάζουν μια συνεχή και υψηλής κινητικότητας επέκταση έλασμα, παρουσιάζοντας πολλά βολάν κατά μήκος της μεμβράνης, γεγονός που καθιστά αυτό το είδος κυττάρου ένα εξαιρετικό υποψήφιο για να μελετήσει τον κύκλο εργασιών της lamellipodial ακτίνης χρησιμοποιώντας FRAP. Προκειμένου να διευκολυνθούν οι πειράματα απεικόνισης, είχαμε προηγουμένως δημιουργείται ένα σταθερό διαμολυσμένη κυτταρική σειρά MDA-MB-231 που εκφράζουν τον GFP-ακτίνης κατασκευή. Το σχετικό επίπεδο της έκφρασης GFP-ακτίνης εξετάστηκε με Western-κηλίδος και συγκρίθηκε με GFP που εκφράζεται κυτταρική γραμμή ως έλεγχος, κατά μέσο όρο, η έκφραση της πρωτεΐνης φθορισμού οδήγησε σε 5,2% του συνόλου Profilin (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Το χαρακτηριστικό αιχμή του MDA-MB-231 είναι μια ευρεία δομή 2 μm εμπλουτισμένο σε GFP-ακτίνη και εύκολα αναγνωρίσιμα από φαλλοειδίνη-Alexa χρώσης 594 (Σχήμα 1Α). Μια ορθογώνια περιοχή αρκετά μεγάλη για να καλύψει το σύνολο προπορευόμενη ακμή (4 μm και μήκους 6 μm) Φωτολεύκανση [39] (Εικόνα 1Β). Όπως φαίνεται στην Εικόνα 1Γ, MDA-MB-231 κύτταρα παρουσίασαν ανάκτηση του φθορισμού κοντά σε ένα 70% μετά από 15 s. Η κινητική ανάκτηση περιγράφηκε από δύο συστατικών εκθετική καμπύλη που αποδεικνύουν αρχική ταχεία συνιστώσα ακολουθείται από μια δεύτερη πιο αργή συνιστώσα. Το αρχικό συστατικό είχε ένα χρόνο ανάκτησης κοντά στο 500 ms, παρόμοια με την τιμή που λαμβάνεται όταν η ανάκαμψη εξετάστηκε σε μονομερή GFP-επιμολυσμένα κύτταρα (tau 100-200 ms? Σχήμα S1). Αυτό είναι πιο πιθανό να οφείλεται στην ταχεία διάχυση του GFP-ακτίνης μονομερή. Η αρχική ταχεία συνιστώσα ανιχνεύθηκε μόνο όταν ένας ταχύς πρωτόκολλο απόκτηση χρησιμοποιήθηκε, και ως εκ τούτου παραμεληθεί στις περισσότερες των πειραμάτων. Το δεύτερο συστατικό βραδύτερη οδηγήθηκε από τον πολυμερισμό της ακτίνης [47], [48], η οποία επιβεβαιώθηκε με την προσθήκη 90 ηΜ κυτοχαλασίνης D (a αναστρέψιμη αγκαθωτό-άκρο blocker) στο μέσο καλλιέργειας πέντε λεπτά πριν το πείραμα FRAP. Με την παρουσία κυτοχαλασίνης D, GFP-ακτίνης φθορισμός απέτυχε να ανακτήσει (Σχήμα 1C), επιβεβαιώνοντας ότι ο πολυμερισμός της ακτίνης οδηγεί την ανάκτηση του φθορισμού. Κατά μέσο όρο, το κινητό κλάσμα μετρήθηκε 30 δευτερόλεπτα μετά το χρόνο της μέγιστης λεύκανση εκτιμήθηκε να είναι 71,5 ± 4%? Αυτό το δεύτερο συστατικό ήταν εφοδιασμένο με μια one-εκθετική καμπύλη με μια μέση τιμή tau 4 ± 0,3 δευτερόλεπτα (κόκκινη διακεκομμένη γραμμή στο Σχήμα 1 C).

Α) MDA-MB-231 κύτταρα επιμολυσμένα με GFP-ακτίνη, διπλή χρώση με Φαλλοϊδίνη-Alexa 594 (α). φθορισμό ακτίνης συσσωρεύεται κυρίως στην κορυφαία περιοχή άκρη. μπαρ κλίμακα 5 μm. Παρατηρήστε ότι MDA-MB-231 κύτταρα έχουν μια εμφανή έλλειψη ακτίνης ίνες στρες. Rigth: Λεπτομερής τμήμα του πρόσθιου άκρου, που δείχνει την συσσώρευση της GFP-ακτίνης (β) και νημάτια ακτίνης (γ). Κλίμακα bar 2 μm. Β) Εκπρόσωπος κορνίζες από διαδοχικές πειράματα FRAP. Πριν FRAP (προ-λεύκανση), μετά κατά την αρχική φάση της ανάκτησης (5 s) υψηλής έντασης έκθεσης λέιζερ (λεύκανση), και στο τέλος της σταθερής μέρος της καμπύλης (30 s). Η λευκανθεί κορυφαία περιοχή άκρη υποδεικνύεται από το λευκό πλαίσιο (4 × 6 μm). Γ) Παράδειγμα ενός πειράματος FRAP? φθορισμού ανακτά σε μια μέση τιμή 71,5 ± 4% μετά από μονοεκθετικό χρονική πορεία (ταιριάζει απεικονίζεται με μια κόκκινη διακεκομμένη γραμμή). Επώαση με κυτοχαλασίνη D (90 nM) αναστέλλει την ανάκαμψη φθορισμού (CytD). Δ) Περίληψη γράφημα των μέσων κινητής κλάσματα από MDA-MB-231 κύτταρα. Σταθερό επιμολυσμένα κύτταρα (s, n = 44), η υψηλή GFP-ακτίνης εκφραστές (υψηλή, η = 10), χαμηλής GFP-ακτίνης εκφραστές (χαμηλή, η = 10) και παροδικά επιμολυσμένα κύτταρα (231t, n = 6). Οι μέσες τιμές των κινητών κλάσμα δεν παρουσιάζουν στατιστικά σημαντικές διαφορές σε καμία πειραματικές συνθήκες σε σύγκριση με το σταθερό επιμολυσμένα κυτταρική σειρά (έλεγχος τ).

Η

Στη συνέχεια ρωτήθηκε αν οι παρατηρούμενες τιμές κινητής κλάσμα εξαρτώνται από επίπεδα έκφρασης GFP-ακτίνης. Για το σκοπό αυτό, αναλύσαμε τα επίπεδα ανάκτησης για τρεις διαφορετικές συνθήκες: τα κύτταρα με υψηλά ή χαμηλά επίπεδα έκφρασης GFP-ακτίνης (πληθυσμοί διαχωρίστηκαν με κυτομετρία από την παραγόμενη σταθερή GFP-ακτίνης κυτταρική γραμμή) και μετά από παροδική διαμόλυνση για 48 ώρες. Τα αποτελέσματα, που συνοψίζονται στην Εικόνα 1D, έδειξε ότι η μέση κλάσμα κινητό ήταν παρόμοια και για τις τρεις προϋποθέσεις, που υποστηρίζουν την υπόθεση ότι το ποσοστό ανάκτησης ακτίνης δεν εξαρτιόταν από την ενδοκυτταρική GFP-ακτίνης συγκέντρωση.

Για να διερευνήσουν κατά πόσον αυτό το εύρος ακτίνης ανάκτησης είναι ειδικό για τα κύτταρα MDA-MB-231 ή είναι ένα κοινό χαρακτηριστικό των περισσότερων καρκίνων επιθηλιακής προέλευσης, δύο επιπλέον καρκινικές κυτταρικές γραμμές μελετήθηκαν. Έτσι, η δυναμική ακτίνη στην αιχμή των HeLa και Α549 κύτταρα, ένας τράχηλο και ενός ανθρώπινου πνευμονικού αδενοκαρκινώματος αντίστοιχα [49], [50], εξετάστηκαν μετά από παροδική επιμόλυνση με GFP-ακτίνης (Σχήμα 2Α). Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές παρουσίασαν ένα μεγάλο κλάσμα κινητό μετά από 30 δευτερόλεπτα, με μέσες τιμές παρόμοιες με αυτές των κυττάρων MDA-MB-231 κύτταρα (τιμών από 62 έως 64%? Σχήμα 2Β) και οι χρόνοι αποκατάστασης ποικίλλει εντός παρόμοιο φάσμα, από 2 έως 5 δευτερόλεπτα (Σχήμα 2C). Παρεμπιπτόντως, τα κύτταρα Α549 εμφάνισε την ταχύτερη ανάκαμψη, με τιμή tau κοντά σε 2 δευτερόλεπτα (Σχήμα 2C).

Α) Δύο παραδείγματα μεμονωμένων ανάκτηση φθορισμού της GFP-ακτίνης που λαμβάνονται από Α549 και κύτταρα HeLa. Β) Μπαρ γραφική παράσταση της μέσης κινητής κλάσμα συγκρίνοντας MDA-MB-231, κύτταρα HeLa και Α549. Οι υπολογισθείσες μέσες τιμές ήταν 62,4 ± 4,2% για το HeLa (n = 12) και 64,7 ± 4,3% για Α549 (n = 10). Δεν βρέθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές σε σύγκριση με MDA-MB-231 κύτταρα. Γ) Οι μέσες τιμές από τις εκθετικές τιμές tau που λαμβάνονται από τις καμπύλες ανάκαμψη τοποθέτηση. MDA-MB-231 κύτταρα που ανακτήθηκαν με τιμή tau 4,1 ± 0,6 s, ενώ τα κύτταρα HeLa επέδειξε tau 5,5 ± 1,7 s. κύτταρα Α549 έδειξε την ταχύτερη ανάκαμψη απ ‘όλα, με ταυ 1,9 ± 0,35, η οποία ήταν στατιστικά διαφορετικό από το χρόνο αποκατάστασης MDA-MB-231 (ρ & lt? 0.005, Student t-test).

Η

από MDA-MB-231 κύτταρα καρκίνου του μαστού έχουν επιθηλιακής προέλευσης, συγκρίναμε επίσης τη δυναμική ακτίνη τους με εκείνη ενός κυτταρικής γραμμής μη καρκινικών του ΜΟΡ10Α, μια ανθρώπινη επιθηλιακή κυτταρική γραμμή μαστικού επιμολυσμένα με GFP-ακτίνης. Τα αποτελέσματα (που συνοψίζονται στο Σχήμα 3) έδειξαν ότι ο κυτταροσκελετός της ΜΟΡ10Α είχαν χαμηλότερο ακτίνης κλάσμα κινητό από εκείνη του ομολόγου κυτταρική σειρά καρκίνου (50% έναντι 70%: Σχήμα 3Α-Β). Ο χρόνος αποκατάστασης ήταν επίσης διαφορετική, με μέση τιμή κοντά στο 7 δευτερόλεπτα. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν όταν εξετάστηκαν ινοβλαστών κύτταρα ενός μη συνδεδεμένα προέλευσης. Ποντικού εμβρυϊκούς ινοβλάστες (ΠΜΑ) είχε τιμή κινητής κλάσμα κοντά στο 40%, με χρόνο αποκατάστασης της τάξης του 8 δευτερόλεπτα (Σχήμα 3Α-C). Συνοπτικά, τα πειραματικά δεδομένα δείχνουν ότι τα καρκινικά κύτταρα δοκιμάστηκαν δείχνουν μια πολύ πιο δυναμική κυτταροσκελετό από μη καρκινικά κύτταρα.

Α) Δύο παραδείγματα μεμονωμένων καμπυλών ανάκτησης ακτίνης στην αιχμή μετά φωτολεύκανση του GFP-ακτίνης από ΜΟΡ10Α (ανθρώπου) και κύτταρα MEF (ποντικού). Η ανάκτηση του MDA-MB-231 κυττάρων σχεδιάζεται ως μια κόκκινη διακεκομμένη γραμμή για σύγκριση. Β) συνοπτικά δεδομένα των κινητών κλάσματα ΠΜΑ (39 ± 4,2%, η = 18) και ΜΟΡ10Α (51,7 ± 1%, η = 6) σε σύγκριση με MDA-MB-231 κύτταρα όγκου. Κάθε τύπος κυττάρου δείχνει στατιστικά σημαντικές διαφορές σε σύγκριση με την ανάκτηση κινητό κλάσμα MDA-MB-231 (ρ & lt? 0.005, Student t-test). Τα κινητά κλάσματα ΜΟΡ10Α και MEF κύτταρα δεν ήταν στατιστικά διαφορετικό (t-test του Student). Γ) Οι χρόνοι ανάκτησης των δύο ΠΜΑ (tau = 7.5 ± 1.6 s) και κύτταρα ΜΟΡ10Α (tau = 6,5 ± 0,4 s) ήταν στατιστικά διαφορετική από εκείνη των κυττάρων MDA-MB-231 κύτταρα (ρ & lt? 0.005 και ρ & lt? 0,05? T του Student -τεστ).

η

MDA-MB-231 δυναμική ακτίνη είναι ανεξάρτητη από την παρουσία της εξωκυττάριας αυξητικών παραγόντων

κεκτημένα ανεξαρτησία από εξωκυττάριο σηματοδότηση αυξητικού παράγοντα είναι ένα τυπικό χαρακτηριστικό των κυττάρων καρκίνου του μαστού [51]. Σε κυτταρικές σειρές μη-καρκίνο, κυτταρική κινητικότητα και η πόλωση οδηγούνται από μια τοπική συσσώρευση PIP

3? κυρίως λόγω της ενεργοποίησης PI3K ή τοπική ενεργοποίηση ιντεγκρίνης. Στην πραγματικότητα, παρεκκλίνουσα σηματοδότηση ΡΙ3Κ είναι ένα επαναλαμβανόμενο θέμα τόσο στην έναρξη και την πρόοδο μιας ποικιλίας καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού [45]. Είμαστε δίπλα ήθελαν να δοκιμάσουν την εξάρτηση της δυναμικής της ακτίνης στην αιχμή στον εξωκυττάριο παρουσία αυξητικών παραγόντων. Για το σκοπό αυτό, μελετήσαμε τη δυναμική ακτίνη του καρκίνου και κυτταρικές σειρές μη καρκινικών μετά από μια 16-ωρών περίοδο στέρησης ορού. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι MDA-MB-231 κινητό κλάσμα ήταν ανεπηρέαστη από την κατάσταση στέρησης ορού (Εικόνα 4Α), με μέση κινητή αξία κλάσμα 58 ± 3%, και μία μέση tau ανάκτησης των 6,6 δευτερόλεπτα, το οποίο δεν ήταν στατιστικά διαφορετική από τις τιμές που λαμβάνονται με την παρουσία του ορού (Σχήμα 4Β και D). Μία άμεση συνέπεια της απουσίας των αυξητικών παραγόντων είναι η μείωση του PIP

3 σηματοδότηση στο επίπεδο της μεμβράνης. Για να επιβεβαιώσετε την επιρροή της PIP

3 στην διαμόρφωση της ακτίνης, η δυναμική ακτίνη που βρίσκονται στην αιχμή αναλύθηκε 30 λεπτά μετά την επεξεργασία των κυττάρων με τον αναστολέα ΡΙ3Κ LY294002 (20 μΜ). Το κινητό κλάσμα έδειξε μία μέση τιμή 57 ± 2%, και τον φθορισμό ανακτάται με μια σταθερά χρόνου 4,2 δευτερόλεπτα, το οποίο δεν ήταν στατιστικά διαφορετική από εκείνη κάτω από τον έλεγχο ή τον ορό συνθήκες λιμοκτονίας (Σχήμα 4Β και D).

Α) Παράδειγμα ανάκτησης φθορισμού μετά FRAP κάτω από συνθήκες ελέγχου (10% FBS, FBS οικοπέδου) και στέρηση ορού για 16 ώρες (Πεινασμένοι οικόπεδο). Β) Συνοπτική παρουσίαση των δεδομένων του μέσου κλάσματος κινητό σε MDA-MB-231 κύτταρα. Η μέση κλάσμα κινητό υπό συνθήκες FBS ήταν 62 ± 5,2% (n = 6), σε σύγκριση με 58 ± 3% μετά από 16 ώρες από την πείνα και 57 ± 2% (n = 6) μετά ΡΙ3Κ αναστολή με LY294002 (n = 6) . Θα πρέπει να σημειωθεί ότι έχουμε συμπεριλάβει νέα κύτταρα ελέγχου, αυξάνεται παράλληλα και αναλύθηκαν την ίδια ημέρα και υπό τις ίδιες συνθήκες? Ως εκ τούτου, ο μέσος κινητός κλάσμα έχει μια ελαφρώς διαφορετική τιμή ώστε το συνολικό αριθμητικός μέσος (70% έναντι 65%). Γ) Η κινητή κλάσμα των μη καρκινικών κυττάρων υπό συνθήκες άνευ ορού μειώθηκε σε 27 ± 5,2% (η = 10) σε ινοβλαστών ποντικού και σε 28 ± 2,4% σε ΜΟΡ10Α (n = 6), (ρ & lt? 0,05? Του Student t-test). Δ) Ο χρόνος αποκατάστασης περίληψη γράφημα. MDA-MB-231 αναπτύσσονται σε FBS έτειναν να δείχνουν ταχύτερη δυναμική (4,14 ± 0,6 s) δεν είναι στατιστικά σημαντική από εκείνη των κυττάρων πέθαναν (6.6 ± 1.7 s). Η χρήση της LY 294002, ενός χημικού αναστολέα της PI3K, δεν επηρέασε το χρόνο αποκατάστασης (4.2 ± 1.0 s). Ε) Σε αντίθεση, ασιτία ορού επηρεάζεται το χρόνο αποθεραπείας των μη καρκινικών κυττάρων, αυξάνοντας τη σταθερά χρόνου από 8,2 ± 0,2 s έως 9,5 ± 0,1 s για ΠΜΑ (ρ & lt? 0,05) και 6,5 ± 0,4 s έως 8,0 ± 1,2 s για ΜΟΡ10Α κυττάρων (ρ & lt? 0,05? t-test του Student)

η

σε αντίθεση, τα κινητά κλάσμα των κυττάρων ΜΟΡ10Α μειώθηκε υπό συνθήκες στέρησης ορού (μέση τιμή 28 ± 2,4% σε σύγκριση με το 51% κάτω από συνθήκες ελέγχου. ? Σχήμα 4C). Παρόμοια εξάρτηση της εξωκυττάριας ορού παρατηρήθηκε σε ΠΜΑ, των οποίων τα κινητά κλάσμα μειώθηκε από μία τιμή κοντά στο 40% σε μια τιμή γύρω στο 27% (Σχήμα 4C). Ο χρόνος αποκατάστασης επηρεάστηκε επίσης, σε κύτταρα ΜΟΡ10Α αυξήθηκε από 6,5 ± 0,4 δευτερόλεπτα για να 8,0 ± 1,2 δευτερόλεπτα ενώ σε MEF κύτταρα αυξήθηκε από 8,2 ± 0,2 έως 9,5 ± 0,1 δευτερόλεπτα (Σχήμα 4Ε).

Από τα αποτελέσματα που ελήφθησαν σε αυτή την ενότητα, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι το MDA-MB-231 κύτταρα, τόσο η ακτίνη κινητό κλάσμα και η χρονική πορεία της ανάκαμψης δεν επηρεάζονται από την παρουσία της εξωκυττάριας αυξητικούς παράγοντες και ρύθμιση της μεμβράνης της PIP

3 επίπεδα.

PfnI πάνω ρύθμιση αυξάνει το μέγεθος των κυττάρων και τον αριθμό των ΕΧΟ

αρκετές πρωτεΐνες που δεσμεύονται ακτίνης είναι απορυθμισμένη σε καρκινικές κυτταρικές γραμμές [28], [52], μεταξύ των οποίων Profilin (PfnI), που προτάθηκε ως πρωτεΐνη καταστολής όγκου [27], [30]. επίπεδα έκφρασης PfnI είναι σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε διάφορους τύπους κυττάρων αδενοκαρκινώματος.