Αφηρημένο

Ιστορικό

Χειρουργική δείγματα έχουν χρησιμοποιηθεί από καιρό ως σημαντικά θέματα για την έρευνα για τον καρκίνο . Σύμφωνα με μια αύξηση της εισαγωγικής θεραπείας, δείγματα βιοψίας έχουν πρόσφατα γίνει επιτακτική ανάγκη για μεταγραφικό καρκίνο. Από την άλλη πλευρά, τόσο βιοψίας και χειρουργικών δείγματα είναι διαθέσιμα για έκφραση προφίλ για την πρόβλεψη του κλινικού αποτελέσματος με επικουρική θεραπεία? Ωστόσο, εξακολουθεί να είναι ασαφές κατά πόσον προφίλ έκφρασης χειρουργική δείγμα είναι χρήσιμες για την πρόβλεψη μέσω δειγμάτων βιοψίας, γιατί λίγα έχουν γίνει για τη συγκριτική γονιδιακής έκφρασης μεταξύ των δύο ειδών δειγμάτων.

Μεθοδολογία και Ευρήματα

Ένα σύνολο 166 δειγμάτων (77 βιοψίας και 89 χειρουργικές) φυσιολογικών και κακοηθών βλαβών του οισοφάγου αναλύθηκαν με μικροσυστοιχίες. προφίλ γονιδιακής έκφρασης συγκρίθηκαν μεταξύ βιοψίας και χειρουργικές δείγματα. Τεχνητά προκληθείσα επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης (aiEMT) βρέθηκε στα χειρουργικά δείγματα, και επίσης εμφανίστηκαν σε οισοφαγικό στρώματα των επιθηλιακών κυττάρων ποντικού υπό ισχαιμική κατάσταση. Προσδιορισμός των κλινικά σημαντικές υποομάδες θεωρήθηκε να διαταραχθεί από τη διαταραχή του προφίλ έκφρασης μέσα από αυτό το aiEMT.

Συμπέρασμα και τη σημασία

Αυτή η μελέτη θα προκαλέσει τη θεμελιώδη παρερμηνεία συμπεριλαμβανομένης υποτίμηση του προγνωστική δύναμη αξιολόγηση των δεικτών από υπερεκτίμηση των EMT στο παρελθόν έρευνα για τον καρκίνο, και θα παρέχει κάποιες συμβουλές για το εγγύς μέλλον ως εξής: 1) η κατανόηση του πόσο καιρό οι ιστοί είχαν την ισχαιμική κατάσταση. 2) Η επικράτηση των δειγμάτων βιοψίας για

in vivo

έκφραση προφίλ με χαμηλό προκαταλήψεις σχετικά με τη βασική και κλινική έρευνα. 3) Έλεγχος του περιεχομένου των καρκινικών κυττάρων και κανονικοποιείται ή νεκρωτικό ιστό-μόλυνσης σε δείγματα βιοψίας για επικράτηση

Παράθεση:. Aoyagi K, Minashi Κ, Igaki Η Tachimori Υ, Nishimura Τ, Hokamura Ν, et al. (2011) η τεχνητή Τα επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση στην Χειρουργική Θέματα: Επιπτώσεις της στην κλινική και Βασική Έρευνα του Καρκίνου. PLoS ONE 6 (4): e18196. doi: 10.1371 /journal.pone.0018196

Επιμέλεια: Ειρήνη Oi Lin Ng, Το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 24 του Δεκεμβρίου, 2010? Αποδεκτές: 22 Φλεβάρη, 2011? Δημοσιεύθηκε: 21 του Απριλίου, 2011

Copyright: © 2011 Aoyagi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Πρόγραμμα για την προώθηση των θεμελιωδών Σπουδών στις Επιστήμες Υγείας του Εθνικού Ινστιτούτου Βιοϊατρικής Καινοτομίας? μια Grant-in-Aid για τον Τρίτο Περιεκτική 10-Year στρατηγική για τον έλεγχο του καρκίνου από το Υπουργείο Υγείας, Εργασίας και Πρόνοιας της Ιαπωνίας? Princess Τακαμάτσου Cancer Research Fund, και Ίδρυμα Προώθησης Έρευνας για τον Καρκίνο (RR: Τ.Ν.). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση που έλαβε για την παρούσα μελέτη

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος είναι μια σημαντική αιτία των θανάτων ανθρώπων σε. πολλές χώρες. προφίλ γονιδιακής έκφρασης από μικροσυστοιχίες DNA είναι εξατομικευμένη και χρήσιμα στην διάγνωση και την πρόγνωση ασθενειών [1]. Αν και μερικοί τεχνητά παράγοντες όπως ισχαιμία, υποξία, hyponutrition, και το κρύο άγχος πιθανώς συμβούν κατά τη διάρκεια χειρουργικής εκτομής και τη μεταφορά του δείγματος (Σχήμα S1), χειρουργικά δείγματα έχουν χρησιμοποιηθεί από καιρό ως σημαντικά θέματα για την κλινική και βασική έρευνα του καρκίνου. Σύμφωνα με μια αύξηση του εισαγωγική θεραπεία (στο κεφάλι και το λαιμό, του οισοφάγου, του πνεύμονα, του παγκρέατος, του προστάτη, και καρκίνου του μαστού), δείγματα βιοψίας έχουν πρόσφατα γίνει επιτακτική ανάγκη για μεταγραφικό καρκίνο. Από την άλλη πλευρά, τόσο βιοψίας και χειρουργικών δείγματα είναι διαθέσιμα για έκφραση προφίλ για την πρόβλεψη του κλινικού αποτελέσματος με επικουρική θεραπεία (σε καρκίνους του στομάχου, του παχέος εντέρου, του ήπατος, της ουροδόχου κύστης, του παγκρέατος, του εγκεφάλου, των νεφρών, των ωοθηκών, του τραχήλου της μήτρας, και του μαστού). Οι στόχοι για ανάλυση μικροσυστοιχίας είχαν, για τα τελευταία δέκα χρόνια, ως επί το πλείστον χειρουργική samplesfrom η ανάπτυξη και η επικράτηση των δύο τύπων μικροσυστοιχιών: ολιγονουκλεοτιδίου [2], [3] και cDNA [4], [5]. Ωστόσο, αν ένας τεράστιος αριθμός των συσσωρευμένων προφίλ έκφρασης χειρουργική δείγμα είναι χρήσιμες για την πρόβλεψη με τη χρήση δειγμάτων βιοψίας από προεπεξεργασμένα ασθενείς είναι ακόμα ασαφής, επειδή ελάχιστα έχουν γίνει για τη συγκριτική γονιδιακής έκφρασης μεταξύ των δύο ειδών δειγμάτων.

Χημειοραδιοθεραπεία (CRT) που ακολουθείται από χειρουργική επέμβαση είναι η τυπική θεραπεία για καρκίνο του οισοφάγου στις δυτικές χώρες. Στην Ιαπωνία, εισαγωγική χημειοθεραπεία που ακολουθείται από χειρουργική επέμβαση και οριστική CRT είναι οι καθιερωμένες θεραπείες [6], καθώς και για τοπικά προχωρημένο οισοφάγου καρκίνους (Στάδιο ΙΙ ή ΙΙΙ), η χειρουργική επέμβαση ήταν η τυπική θεραπεία εκεί περίπου πριν από 5 χρόνια [7]. Αυτό μας δίνει τη δυνατότητα να αποκτήσουν τόσο βιοψίας και χειρουργικά δείγματα από ασθενείς με καρκίνο του οισοφάγου και να συγκρίνουν τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης μεταξύ αυτών των δύο ειδών δειγμάτων. Εδώ αναφέρουμε ότι τεχνητά επαγόμενη επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης (aiEMT) συμβαίνει σε χειρουργική δείγματα. Η παρουσία του εκεί έχει ενδεχομένως παρέμβει όχι μόνο με microarray- ή immunohistochemistory με βάση την κλινική έρευνα, αλλά και με τη βασική έρευνα.

Αποτελέσματα

Σύγκριση των προφίλ έκφρασης μεταξύ βιοψία και χειρουργικά δείγματα όγκων του οισοφάγου Λαμβάνεται από διαφορετικές περιπτώσεις

πρώτη σύγκριση της έκφρασης των γονιδίων μεταξύ 35 φρέσκα δείγματα βιοψίας που δεν περιέχει νεκρωτικές βλάβης και 66 χειρουργικές δείγματα οισοφάγου όγκων, τα οποία λαμβάνονται από ένα περιθώριο του όγκου μετά από έκθεση για 4-7 ώρες υπό ισχαιμική κατάσταση , από ανεξέλεγκτους ομαδοποίηση με 3.126 επεξεργασία γονίδια (Υλικά και Μέθοδοι). Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην κλινική ή παθολογική κατανομή στάδιο μεταξύ αυτών των δύο συνόλων οισοφάγου καρκίνων διότι τοπικά προχωρημένο όγκων (Σταδίου II ή III) είναι σημαντικοί στόχοι τόσο χημειοραδιοθεραπεία και χειρουργική [8] ​​- [10]. Εξήντα από τα 66 χειρουργικά δείγματα (90,9%) και 29 από τους 35 δειγμάτων βιοψίας (82,9%) εμφανίστηκε σε ένα (αριστερά) και σύμπλεγμα Β (δεξιά) του δείγματος, αντίστοιχα (Σχήμα 1Α). Για να διερευνηθεί ο αριθμός των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων μεταξύ αυτών των δύο ειδών δειγμάτων με δυνατότητα αναπαραγωγής, συγκρίναμε τα προφίλ έκφρασης μεταξύ τριών ανεξάρτητων σύνολα δειγμάτων (Α, Β, και C): ένα άλλο δείγμα 20 βιοψίας που έναντι τρεις χειρουργικές σύνολα δειγμάτων (Α, Β, και Γ) που περιέχει 20 τυχαία επιλεγμένες περιπτώσεις από τις 66 περιπτώσεις (Σχήμα 1Β, άνω). Ο αριθμός των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων που επιλέγονται από u-test (ρ & lt? 0,01) ήταν 2, 295, 2328, και 2, 245 σε σύνολα Α, Β, και C, αντίστοιχα. Μεταξύ αυτών των 3 σετ, 1.495 γονίδια (65,1% στο Α, 64,2% στη Β και 66,6% σε C) έχουν συνήθως εντοπίζονται (Εικόνα 1Β, άνω). Ως εκ τούτου, περισσότερο από το 20% (1495/6000, 24,9%) των γονιδίων που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ βιοψίας και χειρουργικών δειγμάτων επειδή ο μέσος αριθμός των ανιχνεύσιμων γονιδίων σε κάθε περίπτωση ήταν περίπου 6.000. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι υπάρχει μεγάλη διαφορά μεταξύ της βιοψίας και χειρουργικά δείγματα.

(Α) Ανεξέλεγκτη ομαδοποίηση με 3.126 επεξεργασία γονίδια. Χειρουργικά (α) και βιοψία συστάδες δείγμα (β) απεικονίζεται. (Β) Σύγκριση του προφίλ έκφρασης μεταξύ τριών ανεξάρτητων συνόλων (A, B, και C): μία τυχαία επιλεγμένα 20-βιοψία δείγματος καθορίστηκαν έναντι τρεις χειρουργικές σύνολα δειγμάτων (Α, Β, και C) που περιέχει 20 ανεξάρτητες περιπτώσεις. Ο αριθμός των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων που επιλέγονται από u-test (ρ & lt? 0,01): 2, 295 στο σύνολο Α, 2328 στο σύνολο Β, και 2, 245 στο σύνολο C (Άνω). Ο αριθμός των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων με αλλαγή 3 φορές μεταξύ δύο μέσος εντάσεις σήματος: 297, 273, και 300. Ομαδοποίηση αποτελέσματα με αυτά τα σύνολα γονίδιο (Κάτω). (C) Up-ρυθμιζόμενα γονίδια σε χειρουργική ή δείγματα βιοψίας. Με την χρήση όλων των προφίλ υπό αυστηρές συνθήκες επιλογής (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι), 38 και 219 γονιδίων ταυτοποιήθηκαν ως up-ρυθμιζόμενα γονίδια στη βιοψία και χειρουργικών δειγμάτων, αντίστοιχα.

Η

Από το 1495 γονίδια, επιλέξαμε περαιτέρω διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων μεταξύ των 3 σετ που είχε μια 3-φορές αλλαγή μεταξύ δύο μέσες εντάσεις σήματος του κάθε γονιδίου μεταξύ του βιοψίας και χειρουργικών δειγμάτων. Από τα σύνολα Α, Β, και Γ, 297, 273, και 300 γονίδια εντοπίστηκαν, αντίστοιχα (Εικόνα 1Β, χαμηλότερα). Περισσότερο από το 80% αυτών των γονιδίων ήταν υπερ-εκφράζεται σε χειρουργικά δείγματα, γεγονός που υποδηλώνει μια προτιμησιακή παρουσία των τεχνητών παραγόντων ή μόλυνση από κανονικές μερίδες.

Για να αντιμετωπιστεί το σκεπτικό για τη διαφορά, μπορούμε τελικά επιλεγμένων γονιδίων που εκφράζονται κατά προτίμηση σε όλα τα 35 βιοψία ή χειρουργική 66 δείγματα υπό αυστηρές συνθήκες με u-test (ρ & lt? 0,01), μεταθέσεως δοκιμή, και ένα 2-φορές αλλαγή, κλπ (Υλικά και Μέθοδοι). Με αυτή τη διαδικασία, 38 και 219 γονιδίων ταυτοποιήθηκαν ως up-ρυθμιζόμενα γονίδια στη βιοψία και χειρουργικές δείγματα, αντίστοιχα (Πίνακας S1 και το Σχήμα 1 C). Είναι ενδιαφέρον ότι, στα χειρουργικά δείγματα, πολλοί δείκτες ΕΜΤ βρέθηκαν να εκφράζονται κατά προτίμηση και συχνά. Τα αποτελέσματα μικροσυστοιχιών 13 αντιπροσωπευτικών δεικτών EMT συμπεριλαμβανομένων φιμπρονεκτίνης (FN), βιμεντίνη (VIM) και κολλαγόνα (στήλες) που φαίνεται στο Σχήμα 2Α. Επιπλέον, μετατροπείς σήματος μεμβράνης όπως κυτοκίνη, χημειοκίνη, και υποδοχείς βρέθηκαν επίσης να είναι επάνω ρυθμισμένη στα χειρουργικά δείγματα. Εκπρόσωπος των μικροσυστοιχιών και τα αποτελέσματα RT-PCR του

IL8

,

CXCR4

,

CXCL9

,

PDGFRB

,

CCL5

, και

TLR2

, αντίστοιχα παρουσιάζονται στα Σχήματα 2Β και 2C. Σε αντιστοιχία με EMT, E-cadherin (

Cdh1

) βρέθηκε να είναι κάτω-ρυθμίζονται στα χειρουργικά δείγματα (Σχήμα 2Α, δεξί χαμηλότερη).

(Α) πρότυπα έκφρασης ενός επιθηλιακού κυτταρικό δείκτη E-cadherin (

Cdh1

) και τυπικά δείκτες EMT συμπεριλαμβανομένων φιμπρονεκτίνης (

FN

), βιμεντίνη (

VIM

), και κολλαγόνα (

στήλες

). (Β) πρότυπα έκφρασης των μετατροπέων σήματος 6 μεμβράνη: μία κυτοκίνη (

IL8

), δύο χημειοκίνες (

CXCL9

και

CCL5

), και τρεις υποδοχείς τύπου μεμβράνης (

CXCR4

,

PDGFRB

, και

TLR2

). (C) Ημι-ποσοτική RT-PCR αποτελέσματα αυτών των 6 μετατροπέων μεμβράνης σε αντιπροσωπευτικά δείγματα.

Η

Σύγκριση των προφίλ έκφρασης μεταξύ των δειγμάτων βιοψίας και χειρουργικά δείγματα όγκων εκτομή του οισοφάγου Λαμβάνεται από πανομοιότυπες υποθέσεις

Με τον ίδιο παραπάνω τρόπο, συγκρίναμε τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης μεταξύ 18 βιοψίας και 18 χειρουργικά δείγματα οισοφάγου όγκων, και επιλέγονται 41 και 716 γονίδια που ταυτοποιήθηκαν ως up-ρυθμιζόμενα γονίδια στα δύο είδη δειγμάτων, αντίστοιχα (Πίνακας S2 και το Σχήμα 3). Σύμφωνα με τα παραπάνω αποτελέσματα από διαφορετικές περιπτώσεις, πολλοί δείκτες ΕΜΤ και μορφοτροπείς σήματος μεμβράνη βρέθηκαν επίσης να ρυθμίζεται προς τα πάνω συχνά στα χειρουργικά δείγματα (Σχήμα 4Α). Το πιο σημαντικό, δύο ρυθμιστές EMT,

ZEB1

και

ZEB2

, και μερικές EMT που σχετίζονται με παράγοντες μυογονικές μεταγραφής συμπεριλαμβανομένων των

MEOX2

και

MEF2C

ήταν σε θέση να να επιλεγούν ως up-ρυθμιζόμενα γονίδια στο χειρουργικό δείγματα (Σχήματα 4Α). Ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR επιβεβαίωσε υπερέκφραση του

ZEB1

,

ZEB2, FN, και VIM

στο 18 χειρουργικές δειγμάτων με τις ίδιες περιπτώσεις (Εικόνα 4Β). Η υπερ-έκφραση του

ZEB1

και

ZEB2

βρέθηκε επίσης στα 66 χειρουργικές δείγματα διαφορετικές περιπτώσεις (Εικόνα S2), αν και αυτές οι δύο ρυθμιστές EMT δεν μπορούσαν να εξαχθούν από τα προφίλ έκφρασης υπό τον πάνω από αυστηρές προϋποθέσεις. SNAI1 /σαλιγκάρι, SNAI2 /γυμνοσάλιαγκας, ZEB1 /ZFHX1A, ZEB2 /SIP1 /ZFHX1B, TWIST1 /TWIST και TWIST2 είναι αντιπροσωπευτικά ρυθμιστές EMT [11], [12]. Μεταξύ αυτών,

TWIST1

καθώς και δύο

ZEBs

ήταν υπερ-εκφράζεται σε δύο σειρές οισοφαγικού όγκων (Σχήμα S3). Για να διερευνήσουν κατά πόσον aiEMT στα επίπεδα του mRNA επηρεάζει ανοσοϊστοχημεία (IHC), θα πραγματοποιηθεί IHC σε ένα τυπικό μεσεγχυματικά vimentin δείκτη σε βιοψία και χειρουργικών δειγμάτων με τις ίδιες περιπτώσεις. Πρώτα προσδιορίζεται συνθήκες υπό τις οποίες δεν θα μπορούσαν να βάφονται φυσιολογικά επιθηλιακά στρώματα κυττάρων, αλλά τα καρκινικά κύτταρα με EMT θα μπορούσε να είναι (Σχήματα 5Α, 5Β), επειδή έχουν αδιαφοροποίητο στρώματα (βασική και παραβασικών) έχουν αναφερθεί ότι εκφράζουν ΕΜΤ-συναφή γονίδια συμπεριλαμβανομένων

VIM

[4]. Σε 3 από τα 5 ζεύγη των δειγμάτων που εξετάστηκαν, οι βλάβες του όγκου ενός χειρουργικού δείγματος βρέθηκαν να βάφονται πιό ιδιαίτερα από εκείνες ενός δείγματος βιοψίας (Σχήματα 5C-H)? Ωστόσο, τα υπόλοιπα 2 ζεύγη δεν έδειξαν τέτοια διαφορά (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ως εκ τούτου, η aiEMT που σημειώθηκαν κατά τις χειρουργικές δειγμάτων στο επίπεδο του mRNA πιστεύεται ότι επηρεάζουν μόνο ένα υποσύνολο των χειρουργικών δειγμάτων στο επίπεδο της ΕΜΤ-σχετικών πρωτεϊνών.

Με αυστηρές επιλογής (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι), 41 και 716 γονίδια ταυτοποιήθηκαν ως up-ρυθμιζόμενα γονίδια στα βιοψίας και χειρουργικά δείγματα, αντίστοιχα.

η

(Α) πρότυπα έκφρασης των 2 εκπρόσωπο των ρυθμιστικών αρχών EMT (

ZEB1

και

ZEB2

), 8 τυπικό δείκτες EMT συμπεριλαμβανομένων φιμπρονεκτίνης (

FN

), βιμεντίνη (

VIM

), 3 κολλαγόνα (

ΟΟΙ_1Α2

,

COL3A1

και

COL14A1

),

FBN1

,

ΜΥΗ11

, και

ACTC1

, και 2 μυογενή παράγοντες μεταγραφής EMT που σχετίζονται με (

MEOX2

και

MEF2C

). (Β) Ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR αποτελέσματα των

ZEB1, ZEB2, FN, και VIM

. Κλειστό κουτί: χειρουργική δείγμα? Ανοικτό κιβώτιο:. Βιοψίας δείγμα

Η

IHC της βιμεντίνης σε μια πρόσθετη χειρουργική δείγμα, το οποίο περιείχε κανονικές μερίδες, έδειξε ότι φυσιολογικό οισοφαγικό επιθηλιακά κύτταρα δεν χρωματίστηκαν, αλλά τα κύτταρα όγκου ήταν επεμβατική (Α, Β). Σε 3 από τα 5 ζεύγη βιοψίας και χειρουργικών δειγμάτων, η υπερ-έκφραση της βιμεντίνης παρατηρήθηκε στα χειρουργικά δείγματα. (Βιοψία: C, E, G? Χειρουργική: D, F, Η)

Η

υπερέκφραση του

ZEB1

,

ZEB2

, και

TWIST1

σε χειρουργικά Κανονική ιστοί

Έχουμε λάβει 4 δείγματα βιοψίας και 5 χειρουργικές δείγματα των μη -cancerous ιστούς, και σε σύγκριση με τα προφίλ έκφρασής τους. Με τον ίδιο τρόπο με τις παραπάνω προφίλ έκφρασης των ιστών του όγκου (Σχήματα 2, 4, S2, S3 και), τρεις ρυθμιστές ΕΜΤ (

ZEB1

,

ZEB2

, και

TWIST1

) και δύο τυπικών δεικτών EMT (

VIM

και

FN

) βρέθηκαν να υπερ-εκφράζεται στις 5 χειρουργικές δείγματα (Σχήμα 6Α). προηγούμενη έκθεσή μας δείχνει τη συμμετοχή των ZEB2 και TWIST1 στην EMT των φυσιολογικών και κακοήθων επιθηλιακών κυττάρων του οισοφάγου [9] υποστηρίζει την παρουσία εκεί των τεχνητή EMT.

(Α) Πάνω-έκφραση της EMT-ρυθμιστές (

ZEB1

,

ZEB2

, και

TWIST1

) και EMT-δείκτες (

VIM

και

FN

) σε χειρουργικά κανονική οισοφάγου βλεννογόνο. (Β) Επαγωγή του ποντικιού

Zeb1

,

Zeb2

,

Vim

, και

Fn

κάτω από ισχαιμική κατάσταση. Μετά την εκτομή του οισοφάγου ποντίκι, μπορούμε να διατεθεί στην PBS για 0 ​​ή 4 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου (υπό μία ισχαιμική κατάσταση), έκανε αμέσως κατεψυγμένα τμήματα, κατέλαβε την επιθηλιακό στρώμα κυττάρων (άνω) μέσω μικροδιατομής λέιζερ, ενισχύεται mRNA με TALPAT [24] – [28], και έλαβε προφίλ έκφρασης με τη χρήση του ποντικιού έκφραση Array 430 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, CA). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε 3 ποντικούς. Η

Zeb1

,

Zeb2

,

Vim

, και

Οι Fn

γονιδίων που προκαλείται από 4 ώρες μετά την εκτομή (Lower). *

P

& lt? 0,05. (C) Ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR του

Zeb1

,

Zeb2

,

Vim

, και

Fn

. Υπερέκφραση του

Zeb1

,

Zeb2

,

Vim

, και

Fn

, φαίνεται από μικροσυστοιχιών, επιβεβαιώθηκε.

Η

Τέλος, για να διερευνήσει κατά πόσον αυτά τα 5 γονίδια που επάγεται σε επιθηλιακά κύτταρα από χειρουργική εκτομή που σχετίζονται με ισχαιμία, έχουμε εκτομή μια οισοφάγο του ποντικιού, και το τοποθέτησε στο PBS για 0 ​​ή 4 ώρες, και αμέσως έκανε κατεψυγμένα τμήματα που ακολουθείται από λέιζερ κατέλαβε μικροδιατομής των κυτταρικών στρωμάτων επιθηλιακών (Εικόνα 6Β, άνω). προφίλ έκφρασης των στρωμάτων των κυττάρων του επιθηλίου του ποντικιού σε 0 ή 4 ώρες μετά την εκτομή του αποκάλυψε ότι το ποντίκι

Zeb1

,

Zeb2

,

Vim

, και

Fn

επάχθηκαν 4 ώρες μετά την εκτομή (Σχήμα 6Β, χαμηλότερα). Ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR επιβεβαίωσε υπερέκφραση του

Zeb1

,

Zeb2

,

Vim

, και

Fn

μετά την εκτομή (Σχήμα 6C) . Από συνολική ευαισθησία συστοιχίες Affymetrix ποντικού είναι γνωστό ότι είναι χαμηλότερο σε σχέση με τους ανθρώπους, και η χρήση μιας μικρής ποσότητας RNA όπως λέιζερ σταματούν υποκείμενα είναι επίσης γνωστό ότι μειώνουν την ευαισθησία των μικροσυστοιχιών,

Twist1

ίδια mRNA δεν μπορούσε να ανιχνευθεί σε αυτό το πείραμα ποντικού (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

για να διερευνηθεί αν aiEMT στα επίπεδα mRNA επηρεάζει IHC, εκτελέσαμε IHC σε μια τυπική μεσεγχυματικά βιμεντίνη δείκτη 8 ώρες μετά την εκτομή. Εδώ καθορίζεται προϋποθέσεις υπό τις οποίες βάφονται φυσιολογικά επιθηλιακά στρώματα των κυττάρων. Σε όλες τις 3 ανεξάρτητα δείγματα που εξετάστηκαν, η κανονική στρώματα επιθηλιακών κυττάρων δεν βρέθηκαν να βάφονται πολύ 8 ώρες μετά την εκτομή (Σχήματα 7Α-C). Η διαφορά μεταξύ του επιπέδου του mRNA και το επίπεδο της πρωτεΐνης μπορεί να εξηγηθεί από τους δύο ακόλουθους λόγους: 1) αν και αδιαφοροποίητη στρωμάτων (βασική και παραβασικών) έχουν αναφερθεί για να εκφράσουν τα γονίδια EMT που σχετίζονται συμπεριλαμβανομένων των

VIM

[4], τους τα επίπεδα έκφρασης ήταν πολύ χαμηλότερα από ό, τι του όγκου (Σχήμα 5Β). 2) μπορεί επίσης να είναι δύσκολο να δείξει την κατά προσέγγιση 2-φορές αλλαγή στο επίπεδο mRNA (Σχήματα 6Β, Γ) ως προς το επίπεδο πρωτεΐνης με IHC, επειδή IHC είναι κατώτερη από RT-PCR σε αμφότερα την ευαισθησία και ποσοτικοποίηση.

Μετά την εκτομή του οισοφάγου ποντίκι, μπορούμε να διατεθεί στην PBS για 0, 4, 8 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου (υπό μία ισχαιμική κατάσταση), γίνονται αμέσως παγωμένες τομές, και IHC της βιμεντίνης διεξήχθη υπό πιο ευαίσθητα όρους σε σχέση με το Σχήμα 5 . τα πειράματα διεξήχθησαν σε 3 ποντικούς (Α-Γ). Υπερ-έκφραση της βιμεντίνης στο ποντίκι οισοφαγικό επιθήλιο δεν παρατηρήθηκε ακόμη και μετά από 8 ώρες έκθεσης υπό ισχαιμική κατάσταση. Arrow: βιμεντίνη-θετικά λείου μυός, βέλος κεφαλής:. Ποντίκι στρωματοποιημένη οισοφάγου επιθηλιακών κυτταρικών στιβάδων

Η

Όλα τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η EMT, ειδικά στο επίπεδο mRNA, επάγεται τεχνητά και σε φυσιολογικά και κακοήθη επιθηλιακά κύτταρα με χειρουργική εκτομή γεγονότα που σχετίζονται με (επαγόμενη από ισχαιμία και υποξία hyponutrition, και υποξία-επαγόμενη φλεγμονή, κ.λπ.).

τεχνητά προκληθείσα EMT (aiEMT) με χειρουργική εκτομή Εμποδίζει βάσει μικροδιάταξης Ταυτοποίηση υποομάδα

Προσδιορισμός των κλινικά σημαντικών υποομάδων είναι πολύ σημαντική για την εξατομικευμένη ιατρική και για την ανάπτυξη φαρμάκων κατά δυσεπίλυτο περιπτώσεις. Όταν χρησιμοποιούνται τα προφίλ έκφρασης των 35 δειγμάτων βιοψίας που λαμβάνεται από ασθενείς που έλαβαν από χημειοακτινοθεραπεία [8], χωρίς επίβλεψη ομαδοποίηση με 5.570 επεξεργασία γονίδια (Υλικά και Μέθοδοι) προσδιόρισε μια καλή ομάδα ανταπόκρισης που αποτελείται από 9 ασθενείς (7/9, 78% δείχνει πλήρη απόκριση προς χημειοακτινοθεραπεία) από το 35 (Σχήμα 8Α, αριστερά). Ωστόσο, όταν χρησιμοποιήθηκαν τα προφίλ των 66 χειρουργικών δειγμάτων, χωρίς επίβλεψη ομαδοποίηση με 2.016 επεξεργασία γονίδια δεν θα μπορούσε να εντοπίσει οποιαδήποτε υποομάδα (Σχήμα 8Α, δεξιά). Έτσι, προφίλ έκφρασης βιοψία δείγματος φάνηκε να είναι πιο αποτελεσματική στην ταυτοποίηση υποομάδα από εκείνες των χειρουργικών δειγμάτων. Στην πραγματικότητα, έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι τα προφίλ έκφρασης δείγμα βιοψίας μπορεί να διακρίνει μακροπρόθεσμα ή βραχυπρόθεσμα επιζώντες από την οριστική χημειοακτινοθεραπεία [8]? Ωστόσο, η χειρουργική προφίλ έκφρασης του δείγματος δεν προσδιορίζονται κακής πρόγνωσης υποομάδες με μεγάλη μετάσταση στους λεμφαδένες [10]. Επιπλέον, στις χειρουργικές δείγματα, EMT επιταχύνθηκε σε 36 (85.7%) από τα 42 οισοφάγου καρκίνων [9]. Αυτό το υψηλό ποσοστό φαίνεται να προκαλείται από aiEMT.

(Α) Ανεξέλεγκτη ομαδοποίηση των 35 βιοψίας και 66 χειρουργικά οισοφάγου δείγματα όγκων με 5.570 και 2.016 επεξεργασία γονίδια, αντίστοιχα. Ένα σύμπλεγμα δείγμα με 2.971 γονίδια που εμφανίζεται μόνο στα δείγματα βιοψίας. (Β) Σύγκριση του αριθμού των επεξεργασμένων γονίδια για ανεξέλεγκτους ομαδοποίηση μεταξύ βιοψίας και χειρουργικές δείγματα. Ο αριθμός των μεταποιημένων γονιδίων και συνήθως επιλεγμένα γονίδια ενδείκνυται. (Γ) Κατανομή συχνοτήτων για το ποσοστό των δειγμάτων τελικά επεξεργασία-γονιδίου σύνολα. ενδείκνυται Κάθε διανομή των 5, 570 γονίδια σε δείγματα βιοψίας (αριστερά) και 2.016 γονίδια στα χειρουργικά δείγματα (Δεξιά).

Η

Για την αντιμετώπιση του λόγο υποομάδα είναι δύσκολο στη χειρουργική δείγματα, συγκρίναμε τον αριθμό και διανομή του καθενός από τα επεξεργασμένα γονίδια, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν για ανεξέλεγκτους ομαδοποίηση. Έχουμε επιλέξει πρώτα γονίδια με ένταση σήματος πάνω από 1.000 σε περισσότερο από το 10% των δειγμάτων. Από 35 βιοψίας και 66 χειρουργικές δείγματα, 6551 και 4797 γονίδια, αντιστοίχως, επιλέχθηκαν. Από αυτά τα γονίδια, τελικά επιλέγεται περισσότερο από 3-φορές άλλαξε γονίδια συγκρίνοντας τη μέση ένταση του σήματος του κάθε γονιδίου σε περισσότερο από το 10% των δειγμάτων. Στα δείγματα 35 βιοψίας, το 85% (5570) του 6551 την πρώτη επεξεργασία των γονιδίων παραμένει, ενώ ο αριθμός των τελικών επεξεργασία γονιδίων μειώθηκε από 4,797 πρώτη επεξεργασία των γονιδίων σε 2.016 (42%) (Σχήμα 8Β, άνω). Από τους 2016 τελικά επεξεργασμένα γονίδια στα χειρουργικά δείγματα, 1724 (86%) συμπεριλήφθηκαν στις 5570 τελικά επεξεργασμένα γονίδια στα δείγματα βιοψίας? Ωστόσο, 3.846 (69%) του 5570 γονίδια ήταν μοναδική για τα δείγματα βιοψίας (Σχήμα 8Β, χαμηλότερα). Επιπλέον, η κατανομή συχνοτήτων (για το ποσοστό των δειγμάτων) αυτών των δύο τελικά μεταποιημένα-γονίδιο σύνολα δείχνει ότι περίπου το 60% των 2016 μεταποιημένων γονίδια στα χειρουργικά δείγματα εκφράζουν μόνο σε ένα περιορισμένο αριθμό περιπτώσεων (0-10%) (Σχήμα 8C) . Κατά συνέπεια, aiEMT σε χειρουργικές δείγματα μπορεί να μειώσει τον αριθμό των επεξεργασμένων γονίδια χρήσιμα για την ταυτοποίηση της υποομάδας.

Συζήτηση

Έχουμε αναφερθεί πρόσφατα την παρουσία στιχομυθία μεταξύ Hedgehog (Hh) και EMT σηματοδότησης σε φυσιολογικά και κακοήθη επιθηλιακά κύτταρα του οισοφάγου [9]. Στην εν λόγω έκθεση,

ZEB2

φάνηκε να είναι ένας μεταγενέστερος γονίδιο τόσο πρωταρχικό μεταγραφικό μετατροπέα GLI1 σε ΗΗ σηματοδότηση και ενός άλλου ρυθμιστή EMT, TWIST1, και ότι ZEB2 περαιτέρω up-ρυθμίζονται 5 χημειοκινών ή υποδοχείς αυξητικών παραγόντων,

PDGFRA

,

EDNRA

,

CXCR4

,

VEGFR2

, και

TRKB

(Σχήμα S4). Το μπλοκ σήμα ΗΗ ανέστειλε οισοφάγου διαφοροποίηση των κερατινοκυττάρων και των καρκινικών κυττάρων εισβολή και την ανάπτυξη. Κατά συνέπεια, η υπερέκφραση του

ZEB2

και

TWIST1

σε χειρουργικές δείγματα και των δύο φυσιολογικών και καρκινικών ιστών μπορεί να προκαλέσει EMT, με αποτέλεσμα την υπερ-έκφραση των αντιπροσωπευτικών δεικτών EMT

VIM

,

FN

, και

COLS

(Σχήματα 2, 4, 6, S2 και S3) και μετατροπείς σήματος μεμβράνης

IL8

,

CXCL4

,

CCL5

,

CXCR4

,

PDGFRB

, και

TLR2

(Σχήμα 2). Υπερ-έκφραση της μεμβράνης μετατροπείς σήματος μπορεί να ενεργοποιήσει περαιτέρω κατάντη καταρράκτες. Αυτός είναι ένας σημαντικός λόγος για τη μεγάλη διαφορά του προφίλ έκφρασης μεταξύ βιοψίας και χειρουργικών δειγμάτων (Σχήματα 1 και 3).

Εκτεταμένη μόλυνση κανονικών τμημάτων μεσεγχυματικών σε χειρουργικά ιστούς όγκου μπορεί επίσης να εξηγήσει την υπερ-έκφραση εκείνων EMT ρυθμιστές και ΕΜΤ-συναφή γονίδια, αν και εκπαιδευμένο παθολόγοι αποκόπηκε προσεκτικά δείγματα χύμα ιστού από τον κύριο όγκο, αφήνοντας ένα σαφές περιθώριο από τον περιβάλλοντα φυσιολογικό ιστό (Υλικά και Μέθοδοι). Ωστόσο, η υπερέκφραση παρατηρήθηκε επίσης σε χειρουργικά φυσιολογικό στοιβάδες ιστών και κυττάρων τα επιθηλιακά ποντίκι 4 ώρες μετά την εκτομή (Σχήμα 6). Ως εκ τούτου, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι τεχνητά επαγόμενη EMT, που ονομάζεται aiEMT, συνέβη και σε φυσιολογικά και κακοήθη επιθηλιακά κύτταρα από τις χειρουργικές γεγονότα που σχετίζονται με εκτομή (επαγόμενη από ισχαιμία υποξία, ισχαιμία που προκαλείται hyponutrition, και υποξία-επαγόμενη φλεγμονή, κ.λπ.) (Σχήμα S1 ).

Πρόσφατα, οι υποξία παράγοντες (HIF-1A ή HIF-2Α) έχουν αναφερθεί να ρυθμίσει άμεσα TWIST1 [13], [14] και LOXL2, η οποία φέρεται να σταθεροποιηθεί ένα ρυθμιστή EMT, SNAI1 /σαλιγκαριών, με φυσική αλληλεπίδραση με τον τομέα Slug και τα κατάλοιπα λυσίνης χελώνας K98 και K137 [15]. Η θέση πρόσδεσης SNAI1 βρέθηκε επίσης στην περιοχή προαγωγέα 5 ‘του

ZEB2

[16]. Υπερ-έκφραση και των δύο

HIF1A

και

LOXL2

παρατηρήθηκε μόνο στα χειρουργικά καρκινικούς ιστούς που λαμβάνονται από διαφορετικές περιπτώσεις (Σχήμα S5). Επιπλέον, άλλα

HIF1

οικογένειες (

HIF1B

και

HIF2A

) δεν ήταν ποτέ υπερεκφράζεται σε κάποιο από τα χειρουργικά δείγματα. Ως εκ τούτου, διαλεύκανση των μοριακών μηχανισμών του aiEMT σε χειρουργικές δείγματα παραμένει για μελλοντικές μελέτες. Ωστόσο, σημειώνεται ότι η προκαλούμενη από ισχαιμία υποξίας ή /και της φλεγμονής έχει αναφερθεί να απελευθερώσει καταστολή του ΝΡκΒ [17], η οποία ρυθμίζει

ZEB1

,

ZEB2

, και

TWIST1

[18], [19] και ότι η σηματοδότηση του ΤΟΡ-β μπορεί να εμπλέκεται σε aiEMT, επειδή η υπερ-έκφραση του

NFKB1

και

TGFBR2

βρέθηκε σε χειρουργική δείγματα (Σχήμα S6).

όπως αναφέρθηκε στην εισαγωγή, η χειρουργική δείγματα έχουν χρησιμοποιηθεί ως σημαντικά θέματα για την κλινική και βασική έρευνα για τον καρκίνο για πολλά χρόνια. Ως εκ τούτου, aiEMT σε χειρουργικές δείγματα μπορεί ενδεχομένως να παρεμποδίσει ή να προληφθούν όχι μόνο microarray- ή ανοσοϊστοχημεία με βάση την κλινική έρευνα (ταυτοποίηση διαγνωστικό δείκτη, υποομάδα, καθιστώντας παράγοντες πρόβλεψης και αξιολόγησης πρόγνωση, κλπ), αλλά και της βασικής έρευνας (κάνει ένα χάρτη πορείας σήμα , θεραπευτικός ταυτοποίησης στόχου, κ.λπ.). Η μελέτη αυτή είναι πιθανό να προκαλέσει θεμελιώδη παρερμηνεία συμπεριλαμβανομένων υποτίμηση του προγνωστική δύναμη αξιολόγηση των δεικτών από την υπερεκτίμηση των EMT στο παρελθόν έρευνα για τον καρκίνο, και θα παρέχει μερικές συμβουλές για το εγγύς μέλλον ως εξής: 1) Η κατανόηση του πόσο καιρό οι ιστοί είχαν την ισχαιμική κατάσταση ( από την έναρξη της εκτομής σε απόθεμα ή το παρασκεύασμα RNA). Το συνολικό ποσό του χρόνου δεν πρέπει να υπερβεί 4 ώρες. 2) Η επικράτηση των δειγμάτων βιοψίας για

in vivo

έκφραση προφίλ με χαμηλό προκαταλήψεις σχετικά με τη βασική και κλινική έρευνα? για παράδειγμα, για την πρόβλεψη του κλινικού αποτελέσματος όχι μόνο εισαγωγική αλλά και επικουρική χημειοθεραπεία, ακτινοθεραπεία, και χημειοραδιοθεραπεία όπως σε προηγούμενες εκθέσεις [8], [20] – [23]. 3) Έλεγχος του περιεχομένου των καρκινικών κυττάρων και κανονικοποιείται ή νεκρωτικό ιστό-μόλυνσης σε δείγματα βιοψίας για την επικράτηση. Σε δειγματοληψία από μια βιοψία βελόνα, τμήματα του όγκου (2 χιλιοστά Χ 2 χιλιοστά), θα πρέπει να ληφθεί από ένα περιθώριο (περιφέρεια) του όγκου με αποκλεισμό της κεντρικής νεκρωτικές βλάβες κάτω από την ενδοσκόπηση. Αν νεκρωτικές βλάβες σοβαρά μολυσμένα στα δείγματα, τα δείγματα αυτά θα πρέπει να εξαιρεθούν από την ποσοτική και ποιοτική RNA. Αν τα δείγματα περιείχαν εκτεταμένες κανονικές βλάβες, όπως τα δείγματα μπορούν να αποκλειστούν από τη μέθοδο βαθμολόγησης προφίλ με βάση την έκφραση χρησιμοποιώντας κανονικές ή /και όγκου συγκεκριμένων γονιδίων.

Υλικά και Μέθοδοι

δείγματα ιστών

Όλα καρκίνο του οισοφάγου (καρκινώματα πλακωδών κυττάρων) και μη-καρκινικούς ιστούς δόθηκαν από τον Κεντρικό Νοσοκομείο ή Ανατολή Νοσοκομείο στο Εθνικό Κέντρο καρκίνου μετά από γραπτή συγκατάθεση από τον κάθε ασθενή και την έγκριση από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Κέντρου.

Όλα χειρουργικές δείγματα ελήφθησαν από ασθενείς χωρίς εισαγωγική θεραπεία, και όλα τα δείγματα βιοψίας ελήφθησαν πριν από τη θεραπεία. Για τις χειρουργικές δείγματα, εκπαιδευμένοι παθολόγοι αποκόπηκε προσεκτικά δείγματα χύμα ιστού από τον κύριο όγκο, αφήνοντας ένα σαφές περιθώριο από τον περιβάλλοντα φυσιολογικό ιστό. Έτσι, λαμβάνεται χειρουργικά δείγματα από ένα περιθώριο (περιφέρεια) του όγκου. Για τα δείγματα βιοψίας βελόνα, τμήματα του όγκου (2 mm χ 2 mm) ελήφθησαν υπό ενδοσκόπηση από ένα περιθώριο του όγκου από τον αποκλεισμό οποιουδήποτε κεντρικού νεκρωτικές αλλοιώσεις. Αν τα δείγματα σοβαρά μολυνθεί από νεκρωτικές βλάβες, αυτά τα δείγματα εξαιρέθηκαν από την ποσοτική και ποιοτική RNA. Αν τα δείγματα περιείχαν εκτεταμένες αλλοιώσεις κανονική, αποκλείσαμε τέτοια δείγματα με τη μέθοδο βαθμολόγησης προφίλ που βασίζονται έκφρασης χρησιμοποιώντας κανονικές ή /και όγκου ειδικά γονίδια (σε προετοιμασία).

Η συνολική διαδικασία μιας οισοφαγικού λειτουργία καρκίνου απαιτεί πολύ χρόνο . Ως εκ τούτου, η χειρουργική δείγματα αποκόπηκαν από ένα περιθώριο του όγκου από εκπαιδευμένους παθολόγους μετά από έκθεση για 4-7 ώρες υπό ισχαιμική κατάσταση, και καταψύχθηκαν αμέσως στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Αντίθετα, τα δείγματα βιοψίας βελόνα εκτομή υπό ενδοσκόπηση καταψύχθηκαν αμέσως στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Κλινικοπαθολογοανατομικές πληροφορίες δίνονται στους πίνακες S3, S4, S5.

μικροανατομίας λέιζερ που ακολουθείται από RNA Εκχύλιση και ενίσχυση

Κρυοστάτης τμήματα (8 μm) των κατεψυγμένων δειγμάτων οισοφαγικού ποντικό λέιζερ-μικροτομή με το MMI CellCut σύστημα (MMI Inc., Rockledge, Φλόριντα). Ολικό RNA απομονώθηκε με αιώρηση των κυττάρων σε ένα ρυθμιστικό ISOGEN λύσης (Nippon Gene, Toyama, Japan) που ακολουθείται από καταβύθιση με ισοπροπανόλη. RNA ενισχύθηκε με μια αποτελεσματική μέθοδος ενίσχυσης mRNA υψηλής πιστότητας, που ονομάζεται TALPAT (Τ7 RNA πολυμεράσης υποκινητή εγγεγραμμένων, προσαρμογέας απολίνωση μεσολάβηση, και ενίσχυση PCR ακολουθούμενη από

in vitro

Τ7-μεταγραφή) [24-28 ]

μικροσυστοιχιών Ανάλυση

προφίλ γονιδιακής έκφρασης ελήφθησαν από 166 δείγματα:. σύνολα όγκου (διαφορετικές περιπτώσεις) των ανεξάρτητων 35 και 20 δείγματα βιοψίας και 66 χειρουργικές δείγματα, ένα άλλο όγκων που (όμοια περίπτωση) 18 δείγματα βιοψίας και 18 χειρουργικές δείγματα, ένα κανονικό σετ των 4 δειγμάτων βιοψίας και 5 χειρουργικών δειγμάτων. Ολικά RNAs που εξάγονται από τα δείγματα χύμα ιστό ήταν επισημασμένα με βιοτίνη και υβριδοποιήθηκε σε μικροδιατάξεις ολιγονουκλεοτιδίων υψηλής πυκνότητας (Human Genome U95Av2 ή U133PLUS2.0 Array, Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για λέιζερ κατέλαβε οισοφάγου στρώματα επιθηλιακών κυττάρων ποντικού, χρησιμοποιήθηκε Mouse Genome 430 2.0 Array. Τα σαρωμένα δεδομένα των συστοιχιών υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Affymetrix Microarray Suite έκδοση 4.0 ή 5.0, το οποίο κλιμακώνεται τη μέση ένταση όλων των γονιδίων σε κάθε συστοιχία σε ένα σήμα στόχο 1000 για σύγκριση με αξιοπιστία μεταβλητή πολλαπλές συστοιχίες. Όλα τα δεδομένα μικροσυστοιχιών έχουν κατατεθεί σε μια βάση δεδομένων συμβατή MIAME, GEO? ο αριθμός ένταξη SuperSeries GSE22954.

γονίδιο επιλογής από μικροσυστοιχιών δεδομένων και Ιεραρχική Ομαδοποίηση

Ιεραρχική ομαδοποίηση χρησιμοποιείται ευρέως ως ένας από τους ανεξέλεγκτους μεθόδους μάθησης. Ιεραρχική ομαδοποίηση των δεδομένων μικροσυστοιχιών έγινε με τη χρήση του GeneSpring (Agilent Technologies Ltd., CA, USA), το Microsoft Excel, και Σμήνος & amp? λογισμικό TreeView [29] .Για ανεξέλεγκτους ομαδοποίησης (Σχήματα 1Α και 8Α), επιλέξαμε πρώτα γονίδια με ένταση σήματος πάνω από 1.000 σε περισσότερο από το 10% των δειγμάτων, και από αυτά τα γονίδια, τελικά επιλέγεται περισσότερο από 3-φορές αλλαγμένο γονίδια συγκρίνοντας τη μέση ένταση του σήματος του κάθε γονιδίου σε περισσότερο από το 10% των δειγμάτων. Για υπερεκφράζεται γονίδια στα χειρουργικά ή δειγμάτων βιοψίας, επιλέξαμε πρώτα γονίδια από u-test (ρ & lt? 0,01), μετάθεση δοκιμή, και 2- ή 3-φορές αλλαγή μεταξύ των μέσων εντάσεων σήματος των δύο σύνολα δειγμάτων, και από το πρώτα επιλεγμένα γονίδια τελικά επιλεγμένων γονιδίων με περισσότερους από 1.000 κατά μέσο όρο ένταση σήματος.

ημι-ποσοτικών και ποσοτική RT-PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε με αιώρηση των κυττάρων σε ρυθμιστικό λύσης Isogen (Nippon Gene, Toyama, Japan) που ακολουθείται από καταβύθιση με ισοπροπανόλη.