Αφηρημένο

Πολλοί όγκοι είναι πιο σκληρή από ό, τι περιβάλλοντα ιστό τους. Αυτή η αύξηση στην ακαμψία έχει αποδοθεί, εν μέρει, σε Rho-εξαρτώμενη αύξηση του ελαφριάς αλυσίδας μυοσίνης φωσφορυλίωσης II. Για τον περαιτέρω χαρακτηρισμό αυτού του μηχανισμού, μελετήσαμε μυοσίνης κινάσης της ελαφριάς αλυσίδας (MLCK), το κύριο ένζυμο που φωσφορυλιώνει την μυοσίνη ΙΙ ελαφριές αλυσίδες. Εμείς Αναμένεται ότι αυξήσεις στην έκφραση και δραστικότητα MLCK θα συμβάλει στην αύξηση της ακαμψίας των καρκινικών κυττάρων. Ωστόσο, βρίσκουμε ότι MLCK mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης είναι σημαντικά μικρότερες σε καρκινικά κύτταρα και ιστούς από ότι στα φυσιολογικά κύτταρα. Συνεπής με αυτήν την παρατήρηση, τα καρκινικά κύτταρα σύμβαση 3D κολλαγόνο μήτρες πολύ πιο αργά από ό, τι τα φυσιολογικά κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον, αναστέλλοντας MLCK ή Rho κινάση δεν επηρεάζει τις συσπάσεις 3D gel ενώ blebbistatin μερικώς και κυτοχαλασίνη D μέγιστη ανέστειλε συστολές. Ζωντανά απεικόνιση κυττάρου των κυττάρων σε πηκτώματα κολλαγόνου έδειξε ότι κυτοχαλασίνη D ανέστειλε filopodia-όπως προεξοχές που σχηματίζονται μεταξύ των κυττάρων, ενώ ένας αναστολέας MLCK δεν είχε καμία επίδραση σε αυτές τις προεξοχές. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η φωσφορυλίωση της μυοσίνης II είναι περιττή όσον αφορά τη ρύθμιση των μηχανικών ιδιοτήτων των όγκων

Παράθεση:. Yu H-J, Serebryannyy LA, Fry Μ, Greene Μ, Chernaya O, Hu W-Y, et al. (2013) Tumor Δυσκαμψία είναι άσχετη με ελαφριά αλυσίδα μυοσίνης φωσφορυλίωση σε καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 8 (11): e79776. doi: 10.1371 /journal.pone.0079776

Συντάκτης: Michael F Olson, Beatson Ινστιτούτο για την Έρευνα του Καρκίνου Γλασκόβη, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 11 του Ιουνίου του 2013? Αποδεκτές: 25 Σεπτεμβρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 4 Νοεμβρίου, 2013

Copyright: © 2013 Yu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Υποστηρίζεται σε μέρει με επιχορηγήσεις από το Northwestern University Φυσικών Επιστημών Ογκολογικό Κέντρο (CA143869) υπο-βραβείο για pDel, από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας για να SG (CA113975), GP (ES018758, ES02207 και CA172220) και ZS (ARRA HD044713), η λευχαιμία και λέμφωμα Κοινωνία (White Plains, Νέα Υόρκη, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής), Η αμερικανική Γαστρεντερολογική σύνδεσης και UIC του γαστρεντερικού συστήματος και η νόσος του ήπατος ταμείο για την SG, τους τομείς των Βραβείο αριστείας από το Γραφείο του Αντιπροέδρου καγκελαρίου για την Έρευνα, UIC να NM και ένα American Heart Association υποτροφία (13PRE17050060) για να LAS. Οι συγγραφείς βεβαιώνουν ότι δεν έχουν ανταγωνιστικά οικονομικά συμφέροντα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Πολλοί τύποι όγκων μπορεί να ανιχνευθεί με ψηλάφηση, επειδή είναι πιο σκληρή ή σκληρότερα από τον περιβάλλοντα ιστό. Οι μηχανικές ιδιότητες ενός όγκου καθορίζεται από τις συνδυασμένες επιπτώσεις και τις αλληλεπιδράσεις των πολλαπλών παραμέτρων [1]. Το στρώμα, η σύνθεση και η ακαμψία της εξωκυττάριας μήτρας, ιντεγκρίνης απολίνωση, αυξημένη αγγείωση, συσσώρευση υγρού και η παρουσία των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος όπως τα μακροφάγα συμβάλλουν στη συνολική ακαμψία του όγκου [1-3]. Τα φυσικά χαρακτηριστικά των μετασχηματισμένων κυττάρων, τα οποία μπορούν να επηρεαστούν από την γενετική υπογραφή των καρκινικών κυττάρων [4] και το μικροπεριβάλλον [5,6] παίζουν επίσης ρόλο στον καθορισμό ακαμψία του όγκου. Κυττάρων δυσκαμψία καθορίζεται κυρίως από ακτίνης-μυοσίνης αλληλεπιδράσεις II [7,8]. Η αλληλεπίδραση ακτίνης μυοσίνης II σε μη μυϊκά κύτταρα ρυθμίζεται από την φωσφορυλίωση του φωτός μυοσίνης αλυσίδων (MLC) [9]. Ακτίνης και φωσφο-μυοσίνης II περιλαμβάνουν το μοριακό μοτέρ που μετατρέπει ΑΤΡ σε μηχανικό έργο σε λείο μυ και μη μυϊκά κύτταρα [9-11] και μια αύξηση στη φωσφορυλίωση MLC έχει ενοχοποιηθεί για τον προσδιορισμό της ακαμψίας του όγκου [1,2].

υπάρχουν δύο κύριες οδούς που ρυθμίζουν φωσφορυλίωση MLC. Μία οδός περιλαμβάνει μυοσίνης κινάσης της ελαφριάς αλυσίδας (MLCK). MLCK είναι μια εξαρτώμενη από το ασβέστιο-καλμοδουλίνη ένζυμο που φωσφορυλιώνει την κανονιστική ελαφριάς αλυσίδας των λείων μυών και μη μυών μυοσίνης II [9,10]. Σε αντίθεση με άλλες πρωτεΐνες κινάσες που φωσφορυλιώνουν πολλαπλά υποστρώματα, MLC φαίνεται να είναι ο μοναδικός υπόστρωμα για MLCK. φωσφορυλίωση MLC /αποφωσφορυλίωσης ρυθμίζει σύσπαση των λείων μυών [9] και πολλές άλλες διαδικασίες που εξαρτώνται από την ενέργεια, συμπεριλαμβανομένης της κυτταρικής διαίρεσης [10] και την κυτταρική κινητικότητα [11,12]. Επειδή τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και μεταστατικές αποικισμός είναι δύο από τις πιο ολέθριες πτυχές του καρκίνου, είναι λογικό να προβλέψουμε ένα σημαντικό ρόλο για MLCK στην ανάπτυξη του όγκου και τη μεταστατική αποικισμού. Προς υποστήριξη αυτής της ιδέας, MLCK έχει εμπλακεί στην επιβίωση των κυττάρων [13,14] και αναστολής MLCK έχει δειχθεί ότι διεγείρει απόπτωση [13,15] και να μειώσει την ανάπτυξη του όγκου [15]. Μειωμένη φωσφορυλίωση MLC έχει επίσης εμπλακεί σε αποτυχία κυτοκίνηση στα καρκινικά κύτταρα [16].

Η δεύτερη οδός περιλαμβάνει την Rho ΟΤΡάσης Α μεσολάβηση της ενεργοποίησης του Rho κινάσης ή ROCK. Ενώ η φωσφορυλίωση της MLC με ROCK έχει αναφερθεί, ROCK φαίνεται να αυξάνει φωσφορυλίωση MLC κυρίως με φωσφορυλίωση και αδρανοποίηση ενός μυοσίνης φωσφατάσης [17]. Επειδή το επίπεδο της φωσφορυλίωσης MLC αντιπροσωπεύει μια ισορροπία μεταξύ των ενζύμων που φωσφορυλιώνουν και αποφωσφορυλιώνει MLC, αναστέλλοντας μυοσίνης φωσφατάση αυξάνει την ενδοκυτταρική επίπεδο φωσφορυλίωσης MLC [17]. Η οδός Rho /ROCK παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην επικοινωνία εξωκυτταρικά σήματα που επηρεάζουν την φύση του κυτταροσκελετού, ειδικά σήματα από το εξωκυτταρικό πλέγμα που οδηγούν σε αυξημένη ένταση κυττάρου [18]. Αυτή η οδός είναι επίσης κεντρική στη ρύθμιση κυτταρική κινητικότητα και τη μετάσταση του καρκίνου [12]. Αποκλεισμός ROCK έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλουν την ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου [2] και, ακόμη και αν Rho Α δεν είναι ένα ογκογονίδιο, μια αύξηση στην Rho Α έκφραση ανιχνεύεται στον καρκίνο και το μονοπάτι Rho A /ROCK έχει εμπλακεί σε Ras-διαμεσολαβούμενη μεταμόρφωση [ ,,,0],4].

Έτσι, υπάρχει μια πληθώρα στοιχείων που αποδεικνύουν ότι η φωσφορυλίωση MLC είναι ένα κομβικό σημείο στη διαδικασία μετασχηματισμού, η απόκριση των καρκινικών κυττάρων στην εξωκυττάρια μήτρα και στον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων. Για να κατανοήσουμε τη σημασία των δύο μεγάλων οδών σηματοδότησης που ρυθμίζουν φωσφορυλίωση MLC, μελετήσαμε την έκφραση της MLCK σε καρκινικά κύτταρα. Η υπόθεσή μας ήταν μια αύξηση στην έκφραση MLCK σε καρκινικά κύτταρα θα μπορούσε να οδηγήσει σε αύξηση της έντασης του κυτταροσκελετού και κυτταρικής συσταλτικές αποκρίσεις. Προς έκπληξή μας, ανακαλύψαμε ότι ιστοί και κύτταρα καρκίνου εκφράζουν λιγότερο από το κανονικό MLCK αντίστοιχά τους και την κανονική πήγματα 3D κολλαγόνου κύτταρα σύμβαση ταχύτερα από τα καρκινικά κύτταρα. Επιπλέον, το κλείδωμα MLCK ή ROCK δεν έχει καμία επίδραση στις συσπάσεις 3D gel ενώ κυτταροχαλασίνης D, η οποία διαταράσσει νημάτια ακτίνης, μπλοκάρει αυτές τις συσπάσεις.

Μέθοδοι

κυττάρων και ιστών καλλιέργεια

μονοπύρηνα κύτταρα (MNC) (& lt? 1,077 g /ml) ελήφθησαν με φυγοκέντρηση πυκνότητας σε Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare Bio-Sciences ΑΒ, Uppsala, Sweden) όπως περιγράφεται προηγουμένως [19]. Ανθρώπινα ινοβλάστες μήτρας (κύτταρα HUF) απομονώθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Η ακόλουθη ανθρώπινα κύτταρα, που λαμβάνονται από το εμπόριο (πηγή και αριθμός καταλόγου περιλαμβάνεται), χρησιμοποιήθηκαν επίσης: HeLa τραχήλου καρκινικά κύτταρα (ATCC, CCL-2), ECC-1 ενδομητρίου επιθηλιακά αδενοκαρκινώματος κύτταρα (ATCC, CRL-2923), πρωτογενών επιθηλιακών κυττάρων του προστάτη (1 ° προστάτη) από τους άνδρες ελεύθερη νόσου, LNCaP κύτταρα καρκίνου του προστάτη (Lonza, CC-25555), ο καρκίνος του κόλου HCT116 κύτταρα (ATCC, CCL-247), ΜΟΡ10Α μη μετασχηματισμένα επιθηλιακά κύτταρα μαστού (ATCC, CRL-10317), MCF-7 (ATCC, ΗΤΒ-22) και T47D (ATCC, CRL-2865) μαστικά καρκινικά κύτταρα, H520 πλακώδη πνεύμονα καρκινικά κύτταρα (ATCC, ΗΤΒ-182), Hec-1A κύτταρα αδενοκαρκινώματος του ενδομητρίου (ATCC, ΗΤΒ-113), ΗΕΚ293Τ αθανατοποιημένα κύτταρα νεφρού (ATCC, CRL-11268), Beas-2Β μετασχηματισμένα πνεύμονος βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα (ATCC, CRL-9609), ανθρώπινα ομφάλια φλεβικά ενδοθηλιακά κύτταρα (HUVEC) (Lonza, CC-2517), ανθρώπινη ενδοθηλιακών κυττάρων πνευμονικής αρτηρίας ( HPAEC) (Lonza, CC-2530), η ανθρώπινη φυσιολογική πνευμονική αρτηρία λείων μυϊκών κυττάρων (HPASMC) (Lonza, CC-2581) και η ανθρώπινη φυσιολογική πνευμονική μικροαγγείωση ενδοθηλιακά κύτταρα (HLMEC) (Lonza, CC-2527). Χρησιμοποιήσαμε κύτταρα ΜΟΡ10Α και Beas-2Β ως μάρτυρες, επειδή, ενώ αναπτύσσονται συνεχώς σε καλλιέργεια, δεν σχηματίζουν όγκους όταν εγχέονται σε ανοσοανεπαρκείς ποντικούς [21,22]. Πέντε ζεύγη ανθρώπινων ιστών καρκίνου (ουροδόχου κύστης, του παχέος εντέρου, του πνεύμονα, των ωοθηκών και της μήτρας) και περιβάλλοντα φυσιολογικό ιστό αποκτήθηκαν από το Cooperative Human Tissue Network, Midwest Division (Columbus, ΟΗ) και αποθηκεύτηκαν κατεψυγμένα στους υγρό άζωτο. Κάθε ζεύγος ιστών ήταν από τον ίδιο ασθενή.

Απομόνωση RNA και PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε από κύτταρα και ιστούς χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ όπως συνιστάται από τον κατασκευαστή (Invitrogen, Carlsbad, CA). RNA μεταγράφηκε αντίστροφα με SuperScript III ανάστροφης μεταγραφάσης (Invitrogen, Carlsbad, CA) και RT-PCR πραγματοποιήθηκε με χρήση 2 μΐ cDNA και 0,5 μΜ, το καθένα, του 3bf εμπρός εκκινητή και το 3aR προς τα πίσω εναρκτήρα που περιγράφεται από Brand-ARPON εκ et al . [23]. Ποσοτική PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι εκκινητές για το σύνολο MLCK P4610 (5 ‘AGG AGC CCG AGG TTG ΑΤΤ AC 3’) και R4762 (5 ‘ACT CTG TCC CCC AGA CTT ΤΤ 3’) εξώνια στόχος 26 και 27. Η ειδικότητα των εκκινητών επικυρώθηκε από μια καμπύλη διαστάσεως ανάλυση και η πτυχή μεταβολή στην έκφραση του κάθε γονιδίου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ΔΔCt, με H3F3A ως εσωτερικός έλεγχος.

αναλύσεις Western Blot

κομμάτια καθενός από τα κατεψυγμένα όγκου και κανονικό ιστό ήταν αποκόπτεται ενώ κατεψυγμένα, ομογενοποιούνται σε 10Χ w /v καυτό ρυθμιστικό διάλυμα δειγμάτων SDS και θερμαίνεται σε λουτρό ζέοντος ύδατος για 5 λεπτά. Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση και 10 μΙ από κάθε δείγμα εφαρμόστηκαν σε 4-20% γέλες SDS πολυακρυλαμιδίου βαθμίδωσης και μεταφέρθηκαν σε νιτροκυτταρίνη. Το άνω ήμισυ του κάθε στύπωμα ανιχνεύθηκε με ένα αντίσωμα συγγένεια καθαρισμένο κουνελιού MLCK [24] και το κάτω μέρος ανιχνεύθηκε με ένα αντίσωμα προς GAPDH. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, αιωρήθηκαν σε PBS, επωάστηκαν με 2 mM φθοροφωσφορικό διισοπροπύλιο για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και εκχυλίστηκε σε 9Μ ουρία, 50 mM DTT, 50 mM Tris, ρΗ 6.8. Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση, οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας Δοκιμασία Bradford και 10 μ§ πρωτεΐνης ανά δείγμα εφαρμόστηκαν σε 4-20% γέλες SDS πολυακρυλαμιδίου βαθμίδωσης και μεταφέρθηκαν σε νιτροκυτταρίνη.

Μέτρηση της MLC Φωσφορυλίωσης

φωσφορυλίωση MLC προσδιορίστηκε ποσοτικά στα κύτταρα HUF και HeLa χρησιμοποιώντας πηκτώματα ουρίας /γλυκερίνης όπως περιγράφεται από Chew et al. [25] με ελαφρές τροποποιήσεις. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με αναστολείς για 2 ώρες, πλύθηκαν σε ισοτονικό σακχαρόζη 2Χ και εκχυλίζεται το 9Μ ουρία, 5 mM DTT, 20 mM Tris, ρΗ 6.8. Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση, οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν και 100 μg του κυτταρικού εκχυλίσματος HUF και 225 μg του κυτταρικού εκχυλίσματος HeLa διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας PAGE γλυκερόλης-ουρία. Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε νιτροκυτταρίνη, τα ΗΕ και φωσφορυλιωμένες μορφές της MLC ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας αντίσωμα για MLC και τη στοιχειομετρία της φωσφορυλίωσης (mol ΡΟ

4 /mol MLC

20) υπολογίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26] .

το κολλαγόνο Δοκιμασία gel Συρρίκνωση και Φαρμάκων Θεραπεία

Για να προετοιμάσετε το διάλυμα πηκτής κολλαγόνου, μέσο ανάπτυξης των κυττάρων συμπληρώθηκε με 1 mg /ml κολλαγόνου τύπου 1 ουράς αρουραίου κολάζ (BD Biosciences), εξουδετερώθηκε με 1 Ν ΝαΟΗ σε ρΗ 7,5 και ρυθμισμένο με 10 mM HEPES, συνδυάστηκε με μέσο καλλιέργειας ιστού και διατηρείται επί πάγου. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, μετρήθηκαν και 5X10

5 κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 200 μΙ διαλύματος κολλαγόνου και εφαρμόζεται σε μεμονωμένα φρεάτια ενός 48 φρεατίων (Fisher Scientific, Pittsburg, ΡΑ). Τα πηκτώματα επωάστηκαν στους 37 ° C σε CO

2 εκκολαπτήριο για 15-20 λεπτά μέχρι να στερεοποιηθεί και στη συνέχεια αποκολλήθηκαν από τα τοιχώματα των φρεατίων με ρύγχη πιπετών. Το μέσο ανάπτυξης (200 μΐ) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και οι πηκτές αφέθηκαν να επικοινωνήσουν για 18 ώρες ή όπως προδιαγράφεται. Όλα τα πήγματα φωτογραφήθηκαν πριν και μετά τη συστολή. Οι περιοχές των πηκτωμάτων μετρήθηκαν σε Image J και το ποσοστό του μεγέθους πηκτή μετά συστολή, κανονικοποιημένη προς την περιοχή εγκάρσιας διατομής του φρεατίου, υπολογίσθηκε.

φαρμακευτικές θεραπείες του κολλαγόνου Κύτταρα

ML-7, Υ 27632 και blebbistatin αγοράστηκαν από την EMD Biosciences και κυτοχαλασίνη D αγοράστηκε από Enzo Επιστημών ζωής. Φάρμακα αραιώθηκαν σε μέσο ανάπτυξης και προστέθηκαν σε πηκτώματα. Οι συγκεντρώσεις του φαρμάκου υπολογίστηκαν με βάση το συνολικό όγκο των μέσων και γέλη κολλαγόνου. Τα μη επεξεργασμένα κύτταρα και κύτταρα επεξεργασμένα με DMSO χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες.

Ζωντανές-Cell Απεικόνιση 3D Collagen Τζελ

κύτταρα HeLa επιμολύνθηκαν παροδικά με ηλεκτροπόρωση χρησιμοποιώντας έναν BioRad Gene Pulser Xcell είτε με με pLL7. 0 mCherry-LifeAct (δώρο του Dr. Robert Wysolmasky) ή pEGFP-LifeAct (δώρο από τον Alexander Bershadsky), η οποία συνδέεται με F-ακτίνη [27]. Εν συντομία, ένα δίσκο των 10 εκ των 95% συρρέοντα κύτταρα Hela έγινε επεξεργασία με θρυψίνη και επαναιωρήθηκαν σε 10 ml μέσο ανάπτυξης. Τα κύτταρα περιδινήθηκαν στα 2000 Xg για 5 λεπτά και επαναιωρήθηκαν σε 400 μΐ Opti-MEM® Ι μειωμένου ορού μέσο συμπληρωμένο με 4 υΐ 1 Μ Hepes, 1 ug του είτε LifeAct πλασμιδίου και 10 ug του διασπασμένο DNA Salmon Sperm. Η ηλεκτροδιάτρηση έγινε σε μία κυψελίδα 4 mm (BioRad χρησιμοποιώντας την ακόλουθη ρύθμιση (Τάση = 240 V, χωρητικότητα = 950uF, αντίσταση = ∞) Α. 1: 1 αναλογία του mCherry-LifeAct και ΕΟΡΡ- LifeAct επιμολυσμένα κύτταρα HeLa αναμίχθηκαν μαζί και ένα συνολικά 2,5 χ 106 κύτταρα αναμίχθηκαν με 1 ml 1 mg /ml κολλαγόνου [28]. το κολλαγόνο-κύτταρα διάλυμα προστέθηκε στο φρεάτιο ενός πυθμένα γυάλινο Mat Tek πιάτο απεικόνισης (P35G-1,5-14-C), στερεοποιήθηκε για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και 2 ml μέσου ανάπτυξης προστέθηκε για να καλύψει τη μήτρα κύτταρο-gel και τοποθετούνται στον επωαστήρα 5% CO2. Κατάλληλη αναστολείς προστέθηκε στα μέσα ενημέρωσης και τα κύτταρα απεικονίστηκαν σε Nikon Α1 σάρωσης λέιζερ συνεστιακού μικροσκοπίου, χρησιμοποιώντας Αρο 100×1. 45 στόχος NA, εξοπλισμένα με Tokai περιβαλλοντικό θάλαμο.

Δήλωση Ηθικής

Οι ιστοί ελήφθησαν από τη Συνεργατική Ανθρώπινο Δίκτυο ιστών, Midwest Division (το Ohio State University, Columbus, OH), μια ΝΟΙ που χρηματοδοτείται αποθετήριο ιστού (https://htrn.osu.edu). Άλλοι ερευνητές μπορεί να λάβει δείγματα από τα ίδια θέματα. Ανθρώπινο αίμα ομφάλιου λώρου αποκτήθηκε από το Κέντρο Αίματος της Νέας Υόρκης (New York, NY, http: /nybloodcenter.org) σύμφωνα με το Institutional Review Board (IRB) κατευθυντήριες γραμμές. Πρωτόκολλα για την απομόνωση των CD34 κυττάρων ανθρώπινου CB + από NM εγκρίθηκαν από το IRB του Πανεπιστημίου του Ιλινόις στο Σικάγο. κύτταρα HUF απομονώθηκαν από τα peritalis φθαρτό αποκόπηκαν από πλακούντα μεμβράνες μετά την κανονική κολπικό τοκετό στο όρος από ZS με προηγούμενη έγκριση της IRB στο Πανεπιστήμιο του Ιλινόις στο Σικάγο. δεν χρησιμοποιήθηκαν ζώα.

Αποτελέσματα

Το γονίδιο MYLK βρίσκεται στο χρωμόσωμα 3q21 (αριθμός πρόσβασης GenBank U48959) σε ανθρώπους. Το γονίδιο MYLK ανοίγματα & gt? 272 kb, περιέχει τουλάχιστον 34 εξώνια και κωδικοποιεί για 3 πρωτεΐνες [29]: nmMLCK (~ 210 kD), smMLCK (~ 150 kD) και μία μικρή πρωτεΐνη που ονομάζεται telokin. Ανθρώπινα nmMLCK και smMLCK μεταγράφονται από τα εξόνια 1-34 [23] και 18-34 [30], αντίστοιχα. Ανάλυση της δομής εξονίου-ιντρονίου στο γονίδιο ανθρώπινης MYLK αποκάλυψε παραλλαγές ματίσματος του nmMLCK που έχουν μοναδικά σχέδια εντοπισμό σε επιθηλιακά κύτταρα [30]. Τουλάχιστον τέσσερις μη μυός MLCK ισομορφές (MLCK2, 3α, 3β και 4) που είναι το αποτέλεσμα της παραλλαγές εναλλακτικού ματίσματος ενός πρόδρομου mRNA έχουν περιγραφεί [31]. Σε αντίθεση, smMLCK, που κωδικοποιείται από εξώνια 18-34 [29], εκφράζεται κυρίως σε κύτταρα λείου μυός και τα χαμηλά επίπεδα smMLCK ανιχνεύονται σε επιθηλιακά και ενδοθηλιακά κύτταρα (βλέπε παρακάτω). Παρά το γεγονός ότι smMLCK και nmMLCK είναι δομικά διαφορετικά, τόσο προφανώς φωσφορυλιώνει μόνο το ρυθμιστικό ελαφριά αλυσίδα των λείων μυών και μη μυών μυοσίνης II [9].

Χρησιμοποιήσαμε εκκινητών περιγράφεται από Brand-ARPON εκ et al. [23] για την ανάλυση της έκφρασης του MYLK σε ανθρώπινους ιστούς και κύτταρα. Έχουμε λάβει ιστού από ανθρώπινους όγκους και τον περιβάλλοντα ιστό, έτσι ώστε θα μπορούσαμε να συγκρίνουμε την έκφραση της MYLK. Ποσοτική PCR, χρησιμοποιώντας εκκινητές που στοχεύουν αλληλουχίες στα εξώνια 26 και 27 και να αναγνωρίσουν όλες τις μορφές MLCK, αποκάλυψαν τα επίπεδα mRNA MLCK αισθητά μειωμένη σε ουροδόχου κύστης, του παχέος εντέρου, του πνεύμονα, των ωοθηκών και της μήτρας καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με το φυσιολογικό ιστό (Εικόνα 1Α). Ομοίως, qPCR σε ένα ευρύ φάσμα φυσιολογικών ανθρώπινων (ινοβλάστες ανθρώπινης μήτρας, ενδοθηλιακά κύτταρα, επιθήλιο προστάτη και μονοπύρηνα κύτταρα), μη μετασχηματισμένα ή μετασχηματισμένα κύτταρα αποκάλυψε επίσης χαμηλότερα επίπεδα του συνολικού mRNA MLCK (Σχήμα 2Α) σε καρκινικά κύτταρα. Τα δεδομένα στο Σχήμα 2Α κανονικοποιήθηκαν προς το επίπεδο έκφρασης MYLK σε κύτταρα HeLa. Τα περισσότερα φυσιολογικά κύτταρα (HUF, ΗΡΑΕΟ, HUVEC, 1 ° του προστάτη) και μη ογκογόνα Beas-2Β κύτταρα είναι πάνω από ενώ τα περισσότερα καρκινικά κύτταρα, με την εξαίρεση του ΕΚΚ-1 κύτταρα, είναι κάτω από το επίπεδο της έκφρασης MYLK σε κύτταρα HeLa.

Ποσοτική PCR (Α) και Western blot (Β) των αναλύσεων φυσιολογικών και καρκινικών ιστών. RNA απομονώθηκε από διάφορους φυσιολογικούς και καρκινικούς ιστούς και συνολική MLCK (Α), συμπεριλαμβανομένων όλων των παραλλαγών ματίσματος του nmMLCK και smMLCK, ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας εκκινητές που στοχεύουν εξώνια 26 και 27. Το γονίδιο για H3F3A χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος σε όλα τα πειράματα. Τα δεδομένα στον Πίνακα Α απεικονίζουν το μέσο όρο των qPCR αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν την τυπική απόκλιση. Πάνελ Β δείχνει ανάλυση στυπώματος Western χρησιμοποιώντας αντισώματα καθαρισμένα με συγγένεια προς MLCK. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Ποσοτική PCR για την ανίχνευση συνολικού MLCK (Α) και Western Blot (Β) αναλύσεις των φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων σε καλλιέργεια. RNA και πρωτεΐνης απομονώθηκαν από διάφορα κύτταρα και αναλύθηκαν όπως περιγράφεται στο Σχήμα 1. Τα δεδομένα στον πίνακα Α απεικονίζουν το μέσο όρο των qPCR αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Η

επόμενο προσδιορίζεται εάν η έκφραση της πρωτεΐνης συσχετίστηκε με τα επίπεδα mRNA . έκφραση πρωτεΐνης MLCK σε κανονικούς και καρκινικού ιστού και των κυττάρων προσδιορίστηκε με διεξαγωγή κηλίδες Western χρησιμοποιώντας αντίσωμα καθαρισμένο με συγγένεια προς MLCK [24]. Κανονική ουροδόχου κύστης, του παχέος εντέρου και της μήτρας ιστούς εκφράζεται τόσο μη-μυών και ομαλή ισομορφές των μυών του MLCK ενώ κανονικό πνευμονικό ιστό εκφράζεται μόνο smMLCK (Σχήμα 1C). Ομοιόμορφα, όλους τους ιστούς του καρκίνου που εκφράζονται κυρίως smMLCK και nmMLCK ήταν δύσκολο να απεικονίσει σε αυτούς τους ιστούς. Είναι ενδιαφέρον ότι, το πρότυπο έκφρασης πρωτεΐνης MLCK είναι πολύ παρόμοια σε φυσιολογικά και καρκίνο του πνεύμονα ιστούς, αν και το επίπεδο του mRNA μειώνεται σε ιστό καρκίνου του πνεύμονα (Σχήμα 1). Ανάλυση των κυττάρων καλλιέργειας ιστού έδειξε ότι ινοβλάστες ανθρώπου μήτρας (κύτταρα HUF) εκφράζουν μεγάλες ποσότητες των δύο μορφών MLCK ενώ ανθρώπινης μη μυϊκά κύτταρα (ενδοθηλιακά, επιθηλιακά και το καλώδιο μονοπύρηνα κύτταρα του αίματος) εκφράζουν κυρίως το μεγαλύτερο, nmMLCK (Σχήμα 2Β). Το μοτίβο έκφρασης σε κύτταρα καρκίνου, ωστόσο, είναι περίπλοκη. Τα καρκινικά κύτταρα (HeLa κύτταρα καρκίνου του τραχήλου, ο καρκίνος του μαστού T47D κύτταρα, LNCaP κύτταρα καρκίνου του προστάτη και κυττάρων προμυελοκυτταρικής HL60), εκφράζουν smMLCK. Είναι ενδιαφέρον ότι η αύξηση στην έκφραση smMLCK σε καρκινικά κύτταρα φαίνεται να συνοδεύουν μια μείωση στην έκφραση του nmMLCK σύγκριση με τα φυσιολογικά αντίστοιχά τους (π.χ. συγκρίνουν LNCaP και 1 ° προστάτη). Συνεπής με τα δεδομένα PCR, είναι προφανές από το Σχήμα 2Β ότι το συνολικό επίπεδο της έκφρασης MLCK μειώνεται σε καρκινικά κύτταρα συγκριτικά με τον έλεγχο. (Δηλαδή φυσιολογικά) κύτταρα

εξερευνήσει τις λειτουργικές συνέπειες μειωμένη έκφραση MLCK από την αυξανόμενη φυσιολογικά και τα καρκινικά κύτταρα σε 3D γέλες και συγκρίνοντας την ικανότητά τους να συμβληθούν των πηκτωμάτων. Υγρό κολλαγόνο που περιέχει ίσους αριθμούς κυττάρων εφαρμόσθηκαν σε 24 φρεατίων και αφέθηκαν να σκληρύνουν στους 37 ° C. Αυτά στη συνέχεια απελευθερώνεται από τις πλευρές των φρεατίων και φωτογραφήθηκαν σε καθορισμένα χρονικά διαστήματα. Το Σχήμα 3 δείχνει ότι HUF και 1 ° προστατικά κύτταρα σύμβαση των πηκτωμάτων ταχέως. Η αύξηση της συγκέντρωσης κολλαγόνου σε 2 mg /ml μείωσε το ρυθμό και την έκταση της συστολής και 3 mg /ml απέτρεψε συστολή (Σχήμα S1). κύτταρα HeLa και κύτταρα ΜΟΡ10Α συμβατική πήγματα στο ενδιάμεσο επίπεδο ενώ MCF7, Τ47ϋ και κυττάρων LNCaP συρρικνώθηκε μόλις τα πηκτώματα (Εικόνα 3 και Εικόνα S1).

HeLa, LNCaP, MCF7, ΜΟΡ10Α, HUF και πρωτογενή κύτταρα του προστάτη σπάρθηκαν σε 24 φρεατίων σε υγρό κολλαγόνο. Μετά το κολλαγόνο σκληρύνει, οι πηκτές που απελευθερώνεται από τις πλευρές των φρεατίων και αφήνεται να συσταλεί για 24 ώρες. Τα φρεάτια φωτογραφηθεί από πάνω στους χρόνους που φαίνονται. Σημειώστε ότι το HUF και πρωτογενή κύτταρα προστάτη σύμβαση των πηκτωμάτων σε μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι τα κύτταρα HeLa και LNCaP και ότι τα κύτταρα MCF 10Α συμβόλαιο περισσότερο από τα κύτταρα MCF-7. Μπάρα κλίμακας = 2 mm.

Η

Στη συνέχεια διερευνήθηκε αν οι συσπάσεις θα μπορούσε να μπλοκαριστεί από μικρού μορίου αναστολείς του κυτταρικού σκελετού. Μελετήσαμε κύτταρα HUF και HeLa επειδή συρρικνώθηκε τα τζελ. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ML-7, ένας αναστολέας MLCK [32], Y27632, ένας αναστολέας Rho κινάσης [33], blebbstatin, έναν αναστολέα μυοσίνης II [34] και κυτοχαλασίνη D, η οποία εμποδίζει τον πολυμερισμό της ακτίνης [35]. ML-7 δεν είχε επίδραση στην συστολή γελών που περιέχουν HUF ή κύτταρα HeLa (Εικόνα 4). Y27632 και blebbistatin είχε ελάχιστη, αν και στατιστικά-σημαντική, επιπτώσεις στην συρρίκνωση του τζελ που περιέχει κύτταρα HUF. Y27632 δεν είχε στατιστικά σημαντική επίδραση στην συρρίκνωση των κυττάρων HeLa, ενώ blebbistatin είχε μια πιο έντονη, στατιστικά σημαντική επίδραση σε πήγματα από κύτταρα HeLa. Είναι ενδιαφέρον, κυτοχαλασίνη D είχε την πιο έντονη επίδραση επί των συστολών γέλη και σχεδόν πλήρως ανέστειλε τις συστολές και από τους δύο τύπους κυττάρων (Εικόνα 4). Εκπλύνοντας τη κυτοχαλασίνη D είχε σαν αποτέλεσμα ταχεία συστολή των πηκτωμάτων με τους δύο τύπους κυττάρων (δεν φαίνεται).

HUF (αριστερά) και (δεξιά) κύτταρα HeLa αναπτύχθηκαν σε 3D καλλιέργειες και θεραπεία με αναστολείς όπως περιγράφεται. Τα πηκτώματα φωτογραφήθηκαν 24 ώρες αργότερα και το εμβαδόν επιφανείας των επιμέρους γελών ποσοτικοποιήθηκε. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή + SEM. Ένας τρόπος ANOVA * = τιμή p & lt? 0,05, *** = ρ τιμή & lt? 0.001.

Η

Για να αποδείξουν ότι ML-7 και Y27632 ήταν στην αναστολή MLCK και Rho κινάσης και μειώνοντας φωσφορυλίωση MLC πραγματικότητα, χρησιμοποιήσαμε τζελ γλυκερίνη για την ποσοτικοποίηση των αλλαγών στη φωσφορυλίωση MLC20. Έδειξαν ότι η φωσφορυλίωση MLC20 μειώνεται σε HeLa κυττάρων σε σύγκριση με κύτταρα HUF και ότι ML-7 και Y27632 μείωση MLC20 φωσφορυλίωση (Σχήμα 5). Παραδόξως, blebbistatin και κυτοχαλασίνη D μειώνουν επίσης την φωσφορυλίωση MLC20 κάπως.

Το φωσφορυλιωμένο και μη φωσφορυλιωμένη MLC διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση γέλης ουρίας-γλυκερόλη, στυπώθηκαν σε νιτροκυτταρίνη και ταυτοποιείται με χρήση ενός αντισώματος το 20 kD MLC.

επίσης χρησιμοποιήσαμε την απεικόνιση ζωντανών κυττάρων για την παρατήρηση των κυττάρων εντός των τζελ. Αυτές οι γέλες δεν απελευθερώθηκαν από την πλευρά των φρεατίων, διότι η κίνηση εισάγεται από τη συστολή της γέλης κατέστησε αδύνατη την εικόνα τα κύτταρα. Σχήμα 6 και η ταινία S1 δείχνουν ότι χωρίς θεραπεία κυττάρων είναι καλά εξάπλωση και να επεκτείνει τΊΙοροάίβ, τα οποία είναι πλούσια σε ακτίνη, ότι προσεγγίσει και να αγγίξει ο ένας τον άλλον. Κύτταρα κατεργασμένα με ML-7 ή Y27632 παρέμειναν εξαπλωθεί και συνέχισε να επεκτείνει filopodia. Κύτταρα κατεργασμένα με κυτοχαλασίνη D παρέμεινε εξαπλωθεί και να επεκταθεί πολύ μεγαλύτερα, ψευδοπόδια δομές που μοιάζουν παρά filopodia. Είναι σημαντικό ότι η ακτίνη σε αυτά τα κύτταρα φαίνεται να συνενώνονται σε μεγάλα συσσωματώματα στο εσωτερικό των κυττάρων.

κύτταρα HeLa επιμολύνθηκαν με Lifeact mCherry (κόκκινο) ή Lifeact-GFP και αναπτύχθηκαν σε γέλες κολλαγόνου. Αυτές οι γέλες δεν απελευθερώθηκαν από τα τοιχώματα των φρεατίων για την πρόληψη αντικείμενα κίνηση. Πίνακας Α δείχνει (χωρίς θεραπεία) κύτταρα ελέγχου επέκταση filapodia αυτή την επαφή γειτονικά κύτταρα (βλέπε επίσης ταινία στο σχήμα S2). Πάνελ Β & amp? C δείχνουν τα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με 20 μΜ ML-7 (Β) ή 6 μΜ κυτοχαλασίνης D (C). Τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με ML-7 συνεχίσει να επεκτείνει ενεργά filopodia. Κύτταρα κατεργασμένα με κυτοχαλασίνη D σταματήσει την επέκταση filopodia και η ακτίνη σε αυτά τα κύτταρα φαίνεται να συγκεντρώσει σε μεγάλα συσσωματώματα. Τα ένθετα είναι ups χτύπημα των εγκιβωτισμένες περιοχές. Μέγεθος bar = 10 μm.

Η

Συζήτηση

Οι όγκοι μπορεί να ψηλαφάται επειδή αισθάνονται πιο δύσκολο από τον περιβάλλοντα ιστό και πολλοί παράγοντες, όπως περιγράφεται στην εισαγωγή, μπορεί να συμβάλει στην ακαμψία της ένας όγκος. Ένας από αυτούς τους παράγοντες είναι η συσταλτική κατάσταση των καρκινικών κυττάρων εντός ενός όγκου. Μία από τις βασικές υποθέσεις μας όταν ξεκινήσαμε αυτές τις μελέτες ήταν ότι τα καρκινικά κύτταρα θα ρυθμίζουν προς τα πάνω εξαρτήματα της συσκευής συσταλτικής. Αυτό βασίστηκε σε αναφορές ότι ακτομυοσίνης συσταλτικότητα [2] και η έκφραση των πρωτεϊνών rho [4], μυοσίνης II [36,37] και MLCK [38] είναι αυξημένη σε ανθρώπινους όγκους σε σχέση με φυσιολογικούς μάρτυρες. Επιπλέον, όταν τα κύτταρα του όγκου μεταστάσεις θα πρέπει να κάνουν το δρόμο τους μέσα από ένα δάσος των ινών κολλαγόνου και είναι λογικό ότι θα χρειαστεί περισσότερο ενεργοποιείται συσταλτικές πρωτεΐνες για να ωθήσει μέσω της εξωκυττάριας ουσίας.

Ωστόσο, μια πιο προσεκτική εξέταση της βιβλιογραφίας δείχνουν το αντίθετο. Πειράματα με τη χρήση μικροσκοπίου δύναμη έλξης έχουν βρει μια αντίστροφη σχέση μεταξύ της παραγωγής δύναμης και της μεταστατικής ικανότητας [39]. Μηχανική φαινοτυπική χρησιμοποιώντας μικροσκοπία ατομικής δύναμης [40-42] και άλλες μεθόδους [43,44] έχουν δείξει ότι τα καρκινικά κύτταρα είναι πιο ήπια από ό, τι τα φυσιολογικά κύτταρα. Επιπλέον, μια πρόσφατη μελέτη έχει προτείνει ότι μειώθηκε ακαμψία μπορεί να βελτιώσει την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων στην κυκλοφορία [45]. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι υπερ-εκφράζουν ένα ενεργό μορφή MLCK αυξάνει φωσφορυλίωση MLC και ακαμψία σε ινοβλάστες [46]. Έτσι, η παρατήρηση μας για μια μείωση στην έκφραση MLCK είναι πολύ συνεπής με μείωση της ακαμψίας σε μετασχηματισμένα κύτταρα αναφέρονται από άλλα εργαστήρια [39-44].

Το Σχήμα 2 δείχνει ότι η έκφραση MLCK μειώνεται σε κύτταρα όγκου που αναπτύσσονται σε Πολιτισμός. Παρ ‘όλα αυτά, οι όγκοι δεν είναι ομοιογενή και, εκτός από τα καρκινικά κύτταρα, περιέχουν κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, μυοϊνοβλάστες και άλλων τύπων στρωματικά κύτταρα που θα μπορούσαν να έχουν αυξημένα επίπεδα MLCK και με τον τρόπο αυτό συμβάλλουν στη συνολική ακαμψία του όγκου. Ωστόσο, ιστοί όγκου αναλύθηκαν στην Εικόνα 1 και τα δεδομένα αντικατοπτρίζουν τις συνεισφορές του συνόλου των κυτταρικών τύπων μέσα σε κάθε όγκο. Αν και τα δεδομένα αποδεικνύουν σαφώς μειώσεις στην έκφραση MLCK σε σύγκριση με τον περιβάλλοντα φυσιολογικό ιστό, δεν μπορούμε να εξαλειφθεί η πιθανότητα ότι η αυξημένη συσταλτικότητα των μη καρκινικών κυττάρων που συμβάλλουν στην ακαμψία των όγκων. Μία προσέγγιση για την αντιμετώπιση αυτής της δυνατότητας είναι για τη χρώση του ιστού του όγκου με αντισώματα προς MLCK και να ποσοτικοποιηθεί το επίπεδο της χρώσης σε καρκινικά κύτταρα συγκριτικά με φυσιολογικά κύτταρα που περιβάλλουν ιστό και μη καρκινικά εντός της μάζας του όγκου. Αυτή τη στιγμή, για καθορισμό των μεθόδων για τη διενέργεια τέτοιων πειραμάτων.

Ο μηχανισμός που είναι υπεύθυνος για την προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης MLCK σε καρκινικά κύτταρα δεν είναι σαφής. Brand-ARPON εκ et al. [23] έχουν αναφέρει την παρουσία ενός ψευδογονιδίου (pMYLK) στη θέση του χρωμοσώματος 3ρ21 που βρέθηκαν μόνο σε ανθρώπους, χιμπατζήδες, γορίλλες και ουραγκοτάγκοι, αλλά όχι gibbons ή μπαμπουίνους ή άλλα είδη. Έδειξαν επίσης ότι η pMYLK περιέχει μία διαγραφή 73 bp και χρησιμοποιήθηκε PCR για τη διαφοροποίηση μεταξύ της έκφρασης των MYLK (667 bp) και pMYLK (594 bp). Χρησιμοποιώντας τους ίδιους εκκινητές, Han et al. [47] ανέφεραν ότι η έκφραση του pMYLK αυξάνεται σε καρκινικά κύτταρα και η αύξηση στην έκφραση του pMYLK είναι υπεύθυνη για την μειωμένη έκφραση MLCK. Χρησιμοποιήσαμε τα ίδια εναύσματα για να αναλυθεί η έκφραση του MLCK και pMYLK σε ανθρώπινους ιστούς και κύτταρα. Ενώ βλέπουμε καθαρά μια μείωση MLCK mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης σε καρκινικά κύτταρα και τους ιστούς, δεν ήμασταν σε θέση να ανιχνεύσει με συνέπεια έκφραση pMYLK σε καρκινικά κύτταρα ή την απουσία έκφρασης σε φυσιολογικά κύτταρα. Κατά συνέπεια, η ρύθμιση της έκφρασης MLCK σε μετασχηματισμένα κύτταρα παραμένει ασαφής επί του παρόντος.

Η παρατήρηση ότι οι συσπάσεις gel 3D δεν εμποδίζονται από ML-7 και Y27632 δικαιολογεί επίσης σχόλιο. Μια αύξηση στην φωσφορυλίωση MLC είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση της ενεργοποιημένης actin- δραστικότητα ΑΤΡάσης των λείων μυών και μη μυών μυοσίνες [9-11]. Η μερική αναστολή από blebbistatin υποδηλώνει ότι μυοσίνη ΙΙ εγκάρσιων γεφυρών παίζουν ένα ρόλο σε αυτές τις συσπάσεις. Ωστόσο, η αδυναμία του ML-7 και Y27632 να μπλοκάρουν αυτές τις συσπάσεις υποδηλώνει ότι η φωσφορυλίωση MLC είναι περιττή. Αντίθετα, η δυναμική ακτίνη φαίνεται να διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο στην συσπάσεις 3D gel. Αυτή η παρατήρηση είναι σύμφωνη με την έκθεση ότι η διακοπή των ακτίνης μπλοκ κυτταροσκελετού όλα τα είδη των συστολών τζελ κολλαγόνου [48]. Επιπλέον, το πιο σημαντικό χαρακτηριστικό σε ζωντανά κύτταρο απεικόνιση των κυττάρων στις γέλες κολλαγόνου (Σχήμα 6) είναι η παρουσία του ιδιαίτερα δυναμικό filopodia ακτίνης. Vonna et al. [49] μελέτησαν τη σύλληψη του παθογόνου από τα μακροφάγα και εκτιμάται ότι τΊΙοροάίβ μπορεί να δημιουργήσει εκατοντάδες ρη της δύναμης πάνω από 10 μm αποστάσεις. Μια άλλη μελέτη η οποία χαρακτηρίζεται filopodia ως «φαγοκυτταρικά πλοκάμια» που υποχωρούν τα σωματίδια προς το σώμα κυττάρου [50]. Οι συγγραφείς αυτοί βρήκαν το μέγεθος του βήματος των συστολών ήταν 36 + 13 nm, η οποία αποκλείει μυοσίνης II ως η πιθανή οχημάτων [50]. Αν και δεν ήταν σε θέση να εμπλέκουν οποιαδήποτε μυοσίνης σε filopodial ανάκληση, αποπολυμερισμού των νημάτων ακτίνης με latrunculin Μια μπλοκάρει επίσης τις filopodial συσπάσεις [50]. Στο σύνολό τους, η βιβλιογραφία και τα δεδομένα μας δείχνουν ότι οι συσπάσεις gel 3D κολλαγόνου που προκαλείται από ακτίνης μέσω τΊΙοροάίβ ανεξάρτητα από μυοσίνη ΙΙ.

Εν περιλήψει, τα στοιχεία μας αποδεικνύουν σαφώς ότι η έκφραση MLCK, φωσφορυλίωση MLC και συστολή gel 3D είναι χαμηλότερες σε καρκινικά κύτταρα και ιστούς από ότι στα φυσιολογικά αντίστοιχά τους. Επιπλέον, διαπιστώνουμε ότι η μείωση φωσφορυλίωση MLC, με αναστολή MLCK ή κινάση Rho, δεν έχει καμία επίδραση επί συστολών 3D γέλη από φυσιολογικά ή μετασχηματισμένα κύτταρα. Αντίθετα, αναστέλλοντας μυοσίνη ΙΙ είχε μια μερική αποτέλεσμα και αποπολυμερισμό ακτίνης ουσιαστικά κατάργησε τη συστολή. Περαιτέρω, η απεικόνιση ζωντανών κυττάρων προτείνει ότι filopodia παίζουν κεντρικό ρόλο σε 3D συστολές. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν έντονα ότι η ακαμψία του όγκου, η υποκείμενη βάση του αυτο-ανίχνευση των όγκων, είναι ανεξάρτητη από τη φωσφορυλίωση της μυοσίνης II. Οι παρατηρήσεις μας συνάδουν με πρόσφατες μελέτες που έχουν δείξει ότι τα καρκινικά κύτταρα είναι λιγότερο άκαμπτο από τα μη-μετασχηματισμένα κύτταρα [40-44]. Τέλος, έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι η αναστολή MLCK προκαλεί απόπτωση in vitro και ενισχύει τις επιδράσεις των αντικαρκινικών φαρμάκων να επάγουν απόπτωση και αναστέλλουν την ανάπτυξη του όγκου in vivo [17]. τρέχουσα απόδειξη μας ότι η έκφραση MLCK μειώνεται σε καρκινικά κύτταρα υποδηλώνει ένα παράθυρο στόχευσης για ειδικά επαγωγή απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα και προκαλεί περαιτέρω διερεύνηση MLCK ως δυνητικό θεραπευτικό στόχο.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Σχήμα S1.

Περίληψη των δοκιμασιών συρρίκνωση τζελ κολλαγόνου. Οι γέλες επωάστηκαν για 24 ώρες, φωτογραφήθηκαν από ψηλά και την επιφάνεια που υπολογίζεται όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Πίνακας Α δείχνει ότι HUF και τα πρωτογενή κύτταρα του προστάτη συρρικνωθεί τα πηκτώματα περισσότερο από κύτταρα HeLa και LNCap. ΜΟΡ10Α κύτταρα καρκίνου του μαστού συστέλλεται επίσης τα πήγματα περισσότερο από τα πιο επιθετική καρκινικά κύτταρα MCF7 και T47D.