Αφηρημένο

Ένα χαρακτηριστικό των μικροπεριβάλλον του όγκου είναι διακύμανση οξυγόνο, το οποίο προκύπτει από υπερ-πολλαπλασιασμό και ανώμαλο μεταβολισμό των κυττάρων του όγκου, καθώς και αποδιοργανωμένη νεο-αγγείωση. Επανοξυγόνωση των όγκων μπορεί να προκαλέσει οξειδωτικό στρες, η οποία οδηγεί σε βλάβη του DNA και γενωμική αστάθεια. Αν και οι κυτταρικές αποκρίσεις στην υποξία είναι καλά γνωστές, λίγα είναι γνωστά σχετικά με την δυναμική απόκριση κατά την επανοξυγόνωση. Προκειμένου να διερευνηθούν οι μεταγραφικές αποκρίσεις προσαρμογής του όγκου σε επανοξυγόνωση, MCF-7 κύτταρα καρκίνου του μαστού καλλιεργήθηκαν υπό 0,5% οξυγόνο επί 24 ώρες και ακολούθησε 24 ώρες επανοξυγόνωση σε νορμοξία. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν στις 0, 1, 4, 8, 12, και 24 ώρες κατά τη διάρκεια επανοξυγόνωση. Το μεταγραφικό προφίλ των κυττάρων MCF-7 κατά την επανοξυγόνωση εξετάστηκε χρησιμοποιώντας Illumina Human-6 v3 BeadChips. Εντοπίσαμε 127 διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια, εκ των οποίων 53,1% ήταν ρυθμίζονται up-and 46,9% ήταν κάτω-ρυθμίζονται κατά την επανοξυγόνωση. ανάλυση Pathway αποκάλυψε ότι η HIF-1-άλφα δίκτυο παράγοντα μεταγραφής και επικυρωμένων στόχων της ενεργοποίησης της μεταγραφής c-myc ήταν σημαντικά εμπλουτισμένη σε αυτά διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων. Μεταξύ αυτών των γονιδίων, ένα υποσύνολο των γονιδίων ενδιαφέροντος περαιτέρω επικυρωθεί με ποσοτική ανάστροφης μεταγραφής PCR. Ειδικότερα, η ανθρώπινη Ν-MYC κάτω-ρυθμίζονται γονίδιο 1 (

NDRG1

) ήταν ιδιαίτερα καταστέλλεται κατά την επανοξυγόνωση. NDRG1 συνδέεται με μια ποικιλία από στρες και κυττάρων συνθήκες ανάπτυξης ρυθμιστικών. Για να καθοριστεί εάν

NDRG1

παίζει ρόλο στην επανοξυγόνωση, NDRG1 πρωτεΐνη υπερεκφράζεται σε κύτταρα MCF-7. Κατά την επανοξυγόνωση, η υπερέκφραση του

NDRG1

ανέστειλε σημαντικά την κυτταρική μετανάστευση. Τα αποτελέσματά μας αποκάλυψε τη δυναμική φύση της γονιδιακής έκφρασης σε κύτταρα MCF-7 κατά την επανοξυγόνωση και απέδειξε ότι

NDRG1

εμπλέκεται στην προσαρμογή του όγκου με επανοξυγόνωση

Παράθεση:. Lai LC, Su YY, Τσεν KC , Tsai MH, Sher YP, Lu TP, et al. (2011) κάτω ρύθμιση των

NDRG1

Προωθεί τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων κατά τη διάρκεια της επανοξυγόνωση. PLoS ONE 6 (8): e24375. doi: 10.1371 /journal.pone.0024375

Συντάκτης: Eric J. Bernhard, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 7 Ιούλη, 2011? Αποδεκτές: 5 Αυγούστου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 30, Αυγούστου του 2011

Copyright: © 2011 Lai et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε εν μέρει με επιχορηγήσεις από την Κίνα Ιατρικό Πανεπιστήμιο, την Ταϊβάν (δεν χορηγούν 97F008-119?. 99F008-308? https://english.cmu.edu.tw/) και το Κέντρο Γονιδιωματική Ιατρική, Εθνικό Πανεπιστήμιο της Ταϊβάν (δεν χορηγούν . 99R81400? https://www.cgm.ntu.edu.tw/chinese2007/eng_index.asp), και το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο (Grant Νο 98-2320-Β-002-044-my3, http: //web1. nsc.gov.tw/mp.aspx?mp=7). Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση ελήφθη για τη μελέτη αυτή. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

πληθυσμούς των όγκων πρέπει να ξεπεραστούν τα εμπόδια διακριτές μικροπεριβάλλον πριν από μεταστάσεις σε άλλα όργανα. Διηθητικού καρκίνου, ως εκ τούτου, θα μπορούσε να θεωρηθεί ως μια σειρά από προσαρμογές στο φαινότυπο σε μικροπεριβάλλοντα τους. Όλα τα μικροπεριβάλλοντα όγκου χαρακτηρίζεται από θρεπτικά συστατικά στέρηση, χαμηλό pH, και υποξία [1]. Οι αλλαγές αυτές συνδέονται με την αιμάτωση των ελλειμμάτων σε συμπαγείς όγκους, η οποία προήλθε από την ταχεία ανάπτυξη του όγκου και βαθιά αποδιοργανωμένο αγγειακό σύστημα [2]. Έχει προταθεί ότι το μικροπεριβάλλον του όγκου είναι ένα μοναδικό περιβάλλον για την εξέλιξη του όγκου, η οποία απαιτεί γενετική προσαρμογές σε καρκινικά κύτταρα για περαιτέρω επιβίωση και πολλαπλασιασμό. τονίζει κυττάρων που προκαλείται από το μικροπεριβάλλον, ειδικά υποξία [3], [4] και επανοξυγόνωση [5], [6], θα μπορούσαν να προκαλέσουν αυτές τις γενετικές αλλαγές.

Περιφέρειες της υποξίας είναι ένα κοινό χαρακτηριστικό σε συμπαγείς όγκους. Το οξυγόνο είναι ένας περιοριστικός παράγοντας, λόγω της ανισορροπίας μεταξύ O

2 παροχή και κατανάλωση [7]. Το O

ανεπάρκεια 2 αποδίδεται στην ανεπαρκή αγγειώσεις και μείωση του οξυγόνου σε διαδοχικά στρώματα κυττάρων περιφερικά στον αυλό του αγγείου? ταυτόχρονα, υπάρχει μια αύξηση στην O

2 κατανάλωση λόγω του υψηλού μεταβολικού ρυθμού των κυττάρων του όγκου. Πολλές μελέτες έχουν αναφέρει ότι υποξικές όγκοι ήταν περισσότερο κακοήθεις και ανθεκτικές στη θεραπεία, και έτσι είχε μια χειρότερη πρόγνωση [8]. Αυτό το φαινόμενο έχει αποδειχθεί σε πολλούς τύπους όγκων [9], [10].

Επιπλέον, η συγκέντρωση του οξυγόνου εντός μιας υποξική περιοχή είναι εξαιρετικά μεταβλητή. Δεδομένου αγγειώσεις όγκων είναι άκρως αναποτελεσματική και ασταθής, τα ερυθρά αιμοσφαίρια ροή προς τις υποξικές περιοχές, με αποτέλεσμα την επαναιμάτωση ή επανοξυγόνωση [11]. Επανοξυγόνωση όχι μόνο αυξάνει την παροχή οξυγόνου, αλλά επίσης προκαλεί το οξειδωτικό στρες στα κύτταρα. Αυτό το οξειδωτικό στρες μπορεί να προκαλέσει βλάβη στα κυτταρικά μακρομόρια και να οδηγήσει σε αυξημένη γενωμική αστάθεια [12]. Εάν τα καρκινικά κύτταρα επιβιώνουν μετά από έκθεση σε προσβολές υποξία /επανοξυγόνωση, μπορούν επιδεικνύουν αυξήσεις στην κακοήθεια [13], το DNA πάνω-ενίσχυσης [14], αντοχή φαρμάκου [15], και μεταστατικό δυναμικό [16].

Κινητή προσαρμογή στην υποξία είναι καλά τεκμηριωμένη, αλλά λίγα είναι γνωστά για προσαρμοστικών μηχανισμών για την επανοξυγόνωση. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήσαμε μικροσυστοιχίες έκφρασης γονιδιώματος-ευρεία ώστε να διερευνήσει τις δυναμικές του μεταγραφικού προφίλ κατά τη διάρκεια επανοξυγόνωση στο MCF-7 κύτταρα καρκίνου του μαστού. αποτελέσματα μικροσυστοιχιών μας έδειξαν ότι η Ν-MYC κάτω-ρυθμίζονται γονίδιο 1 (

NDRG1

) είχε τη μέγιστη απόκριση μετά από επανοξυγόνωση. Ως εκ τούτου, εστιάσαμε στη διερεύνηση λειτουργικό ρόλο της στην επανοξυγόνωση. Οι λειτουργικές δοκιμασίες αποκάλυψαν ότι κυττάρου μετανάστευση των κυττάρων καρκίνου του μαστού κατά τη διάρκεια της επανοξυγόνωση οδηγήθηκε από κάτω ρύθμιση

NDRG1

. Τέλος, το κανονιστικό μοντέλο της

NDRG1

χρησιμοποιώντας το

in silico

ανάλυση προτάθηκε για περαιτέρω έρευνα.

Αποτελέσματα

Αναγνώριση γονιδίων ανταποκρίνεται στην επανοξυγόνωση

MCF-7 ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού επωάζονται υπό υποξία (0,5% O

συγκέντρωση 2) ​​για 24 ώρες και στη συνέχεια μετατοπίζεται προς νορμοξία. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε 0 αντίστοιχα (έλεγχος υποξία), 1, 4, 8, 12 και 24 ώρες μετά επανοξυγόνωση. Κάθε φορά σειρά είχε ανεξάρτητα διεξάγεται εις τριπλούν. Μετά την εκχύλιση ολικού RNA, Illumina Human-6 V3 BeadChips χρησιμοποιήθηκαν για να εξεταστεί η δυναμική των μεταγραφικών προφίλ κατά την επανοξυγόνωση. σήματα φόντο προσαρμοσμένο ομαλοποιήθηκαν με ποσοστημόριο αλγόριθμο κανονικοποίησης. Για τον εντοπισμό γονιδίων που εκφράζονται διαφορικά, έλεγχος τ χρησιμοποιήθηκε για να εξεταστούν τα επίπεδα έκφρασης του κάθε χρονικό σημείο μετά επανοξυγόνωση έναντι αυτής του χρόνου μηδέν. Τα γονίδια που να ανταποκρίνεται στις επανοξυγόνωση επιλέχθηκαν από την επιλογή γονίδια των οποίων η μέση τιμή

P

-τιμή σε ένα δεδομένο χρονικό σημείο ήταν & lt? 10

-4. Συνολικά, εντοπίσαμε 127 γονίδια των οποίων τα επίπεδα μεταγραφής παρεκκλίνει σημαντικά από το χρόνο μηδέν. Μεταξύ αυτών, 53,1% ήταν πάνω ρυθμισμένα και 46.9% ήταν κάτω ρυθμισμένα κατά την επανοξυγόνωση. Τα περισσότερα από αυτά τα γονίδια (n = 112) ταυτοποιήθηκαν μόνο σε ένα χρονικό σημείο, αλλά 13 προσδιορίστηκαν σε δύο χρονικά σημεία, και τα δύο γονίδια εντοπίστηκαν σε περισσότερες από δύο χρονικά σημεία.

Στη συνέχεια, το κύριο συστατικό ανάλυση ( PCA) εφαρμόστηκε για να εξετάσει την αναπαραγωγιμότητα μεταξύ διαφορετικών επαναλήψεων και τους χρόνους όταν ενεργοποιήθηκαν συγκεκριμένων γονιδίων. Όπως φαίνεται στο σχήμα 1α, αναπαράγει το ίδιο χρονικό σημείο αθροίζονται μαζί, υποδεικνύοντας υψηλή επαναληψιμότητα των δεδομένων μας. Επίσης, διαφορετικά χρονικά σημεία διανέμονται διαδοχικά ανάλογα με το ποσό του χρόνου κάτω από επανοξυγόνωση. Τα χρονικά σημεία 8 ώρες, 12 ώρες και 24 ώρες ήταν συγκεντρωμένα μαζί, υποδηλώνοντας παρόμοια πρότυπα γονιδιακής έκφρασης σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία.

(α) ανάλυση Principal συστατικό (PCA) των Ο

2-απόκρισης γονιδίων σε κύτταρα MCF7 κατά την διάρκεια 24 h από επανοξυγόνωση μετά την υποξία. Οι άξονες είναι τα πρώτα δύο κύριες συνιστώσες (PC), η οποία μπορεί να εξηγήσει το μεγαλύτερο μέρος του προφίλ γονιδιακής έκφρασης. Τρία ανεξάρτητα πειράματα έγιναν σε κάθε χρονικό σημείο. Διαφορετικά σχήματα αντιπροσωπεύουν διαφορετικές επαναλήψεις? διαφορετικά χρώματα αντιπροσωπεύουν διαφορετικά χρονικά σημεία. (Β) Αριθμός O

2-γονιδίων που αποκρίνονται σε κάθε χρονικό σημείο κατά τη διάρκεια της επανοξυγόνωση. Τόσο τα επάνω ρυθμισμένη και κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια χαράσσεται ως συνάρτηση του χρόνου. Μαύρες μπάρες δείχνουν τον αριθμό των γονιδίων που εντοπίστηκαν για πρώτη φορά, ενώ γκρι μπάρες δείχνουν τον αριθμό των γονιδίων που εντοπίστηκαν σε προηγούμενα χρονικά σημεία. (Γ) Σχετική προφίλ έκφρασης των O

2-γονιδίων που αποκρίνονται μετά την στροφή προς επανοξυγόνωση. Οι τιμές έκφρασης του κάθε χρονικό σημείο κανονικοποιήθηκαν προς εκείνη του χρόνου μηδέν. Η κλίμακα γραμμή προς τα αριστερά υποδηλώνει 20 γονίδια, ενώ το μπαρ χρώμα στο κάτω μέρος δείχνει το βαθμό της γονιδιακής έκφρασης μεταβολή σε σχέση με το χρόνο μηδέν. (Δ) την επικύρωση ποσοτική RT-PCR από τις κορυφαίες δέκα O

2-γονιδίων που αποκρίνονται σε αντίστοιχους χρόνους τους, της μέγιστης απόκρισης.

Η

Δυναμική απαντήσεις της γονιδιακής έκφρασης κατά την επανοξυγόνωση

για να χαρακτηρίζουν ποσοτικά τα O

2-γονιδίων που αποκρίνονται σε κάθε χρονικό σημείο κατά τη διάρκεια του εγκλιματισμού με επανοξυγόνωση, στατιστική ανάλυση (Student του

t-test

) κάθε χρονικό σημείο ως προς το χρόνο 0 εφαρμόστηκε για κάθε γονίδιο. Ο αριθμός των γονιδίων που ήταν σημαντικά διαφορετικές (

P

& lt? 0,0001) από τον έλεγχο υποξία χαράχθηκαν στο Σχήμα 1β. Οι αριθμοί των O

2 αποκρίνονται γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων τόσο πάνω και κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια, ήταν 0 σε 1 ώρα, 17 στις 4 ώρες, 44 σε 8 ώρες, 49 σε 12 ώρες, και 35 στις 24 ώρες. Σε 8 ώρες, μόνο το 7% των γονιδίων (3/44) είχαν εντοπιστεί στις 4 ώρες, ενώ το 22% των γονιδίων (11/49) σε 12 ώρες είχαν εντοπιστεί σε 4 ή 8 ώρες. Έτσι, αυτό το αποτέλεσμα έδειξε ότι μεταγραφικές αποκρίσεις ενεργοποιήθηκαν μεταξύ 8 και 12 ώρες μετά την επανοξυγόνωση, και στη συνέχεια μειώθηκε στις 24 ώρες μετά από επανοξυγόνωση.

Για να κατανοήσουμε τα προφίλ έκφρασης αυτών O

2-γονιδίων που αποκρίνονται , οι τιμές έκφρασή τους σε κάθε χρονικό σημείο κανονικοποιήθηκαν προς εκείνη του χρόνου 0 (Σχήμα 1γ). Η θερμικός χάρτης έδειξε ότι, σε γενικές γραμμές, η ένταση της επέκτασης ή υποβιβασμού ρυθμιζόμενα γονίδια αυξάνονται ως κύτταρα μείνει πλέον υπό επανοξυγόνωση. Στη συνέχεια, επιλέχθηκαν τα 10 γονίδια με τις μεγαλύτερες αλλαγές έκφρασης κατά την επανοξυγόνωση για την επικύρωση των αποτελεσμάτων των μικροσυστοιχιών χρησιμοποιώντας ποσοτική RT-PCR. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1d, οι τιμές έκφραση αυτών των γονιδίων, εκτός από μία, κατά τα χρονικά σημεία με μέγιστη απόκριση ήταν πολύ συνεπής με τα αποτελέσματα μικροσυστοιχιών.

ανάλυση Pathway γονιδίων αποκρίνεται σε επανοξυγόνωση

για να κατανοήσουμε ποιες οδοί που εμπλέκονται στην προσαρμογή σε επανοξυγόνωση, ανάλυση οδός διεξήχθη χρησιμοποιώντας την αλληλεπίδραση Database NCI-Φύση διαδρομή [17]. Μεταξύ των 127 αναγνωρισθέντων γονιδίων, ανάλυση οδού αποκάλυψε ότι, όπως ήταν αναμενόμενο, η πιο σημαντικά (

P

& lt? 0,01) εμπλουτισμένο οδό ήταν το δίκτυο παράγοντα μεταγραφής HIF-1-άλφα, και η δεύτερη πιο σημαντική οδός ελέγχθηκε στόχοι της μεταγραφικής ενεργοποίησης c-myc (Πίνακας 1). Επιπλέον, για να διερευνήσει ποια οδός ενεργοποιήθηκε σε κάθε χρονικό σημείο, οδός αναλύσεις έγιναν ξεχωριστά χρησιμοποιώντας O

2 αποκρίνονται γονίδια που ταυτοποιούνται σε κάθε χρονικό σημείο. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα γονίδια ενεργοποιούνται σε 8 ώρες ενεπλάκησαν σε επικυρωμένες στόχους της μεταγραφικής ενεργοποίησης c-myc (Πίνακας 1). Γονίδια ενεργοποιούνται σε 12 ώρες ήταν ασχολείται κυρίως στο δίκτυο μεταγραφικού παράγοντα HIF-1-άλφα, κεραμιδιού μονοπάτι σηματοδότησης, και από κοινού ρύθμιση της δράσης του υποδοχέα ανδρογόνων.

Η

κάτω ρύθμιση των NDRG1 προωθεί τη μετανάστευση των κυττάρων κάτω από επανοξυγόνωση

από

NDRG1

, το οποίο ρυθμίζεται από την οδό σηματοδότησης MYC, είχε τη μεγαλύτερη αλλαγή στην έκφραση εξής επανοξυγόνωση, και ότι αυτά τα γονίδια επανοξυγόνωση εμπλουτίστηκαν σε επικυρωμένες στόχους της μεταγραφικής ενεργοποίησης c-myc, εμείς ήθελε να διερευνήσει περαιτέρω την απόκριση του

NDRG1

να επανοξυγόνωση. Δεν ήταν σαφές εάν

NDRG1

θα μπορούσε να επηρεάσει την μεταστατική ικανότητα των κυττάρων του όγκου. Ως εκ τούτου, Transwell δοκιμασίες διεξήχθησαν για την εξέταση της ικανότητας μετανάστευσης των κυττάρων MCF-7 σε διάφορα O

2 συγκεντρώσεις. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, τα επίπεδα μεταγραφής του

NDRG1

ήταν σημαντικά μειωμένη κατά την επανοξυγόνωση (Σχήμα 2α), ενώ η ικανότητα μετανάστευσης των MCF-7 αυξήθηκε σημαντικά (Σχήμα 2Β). Μια κηλίδα western επιβεβαίωσε ότι η C-MYC και Ν-MYC αυξηθεί και NDRG1 μειώθηκε, κάτω από συνθήκες επανοξυγόνωση (Σχήμα 2c). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι

NDRG1

μπορεί να επηρεάσει τη μετανάστευση των μετασχηματισμένων κυττάρων μέσω του μονοπατιού σηματοδότησης MYC.

(α) τα επίπεδα Σχετική έκφραση

NDRG1

κάτω από διαφορετικές O

2 συνθήκες. Τα επίπεδα mRNA του

NDRG1

μετράται με RT-PCR αρχικά κανονικοποιήθηκαν με 18s rRNA, και στη συνέχεια σε σύγκριση με εκείνες σε νορμοξία (*

P

& lt? 0,01). (Β) ικανότητα σχετική μετανάστευση των MCF-7 υπό διαφορετικές O

2 συνθήκες. Μία δοκιμασία transwell χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί MCF-7 μετανάστευση. ικανότητα μετανάστευση εκφράστηκε ως αλλαγές αναδίπλωσης σε σχέση με τη φυσιολογική οξυγόνωση. (Γ) κηλίδες Western HIF1α, C-MYC, Ν-myc, και NDRG1 σε υποξία και επανοξυγόνωση. GAPDH ήταν ο έλεγχος φόρτωσης.

Η

Στη συνέχεια, δεδομένου ότι

NDRG1

ήταν κάτω-ρυθμίζονται κατά την επανοξυγόνωση, υπερεκφράσαμε

NDRG1

στα κύτταρα MCF-7 για να διερευνήσει τις φυσιολογικές του λειτουργία. Για να επιβεβαιωθεί η υπερέκφραση, τα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης NDRG1 εξετάστηκαν με ποσοτική RT-PCR (Σχήμα 3α) και κηλίδωση Western (σχήμα 3β). Τα επίπεδα μεταγραφής και πρωτεϊνών του NDRG1 σε NDGR1-επιμολυσμένα κύτταρα ήταν σημαντικά υψηλότερες από εκείνες σε κύτταρα επιμολυσμένα με τον κενό φορέα ελέγχου. Τα κύτταρα MCF-7 επιμολυσμένα με

NDRG1

ή κενό φορέα μετά ενοφθαλμίστηκαν σε transwells για ένα δεύτερο γύρο δοκιμασιών μετανάστευσης κυττάρων κάτω από επανοξυγόνωση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υπερέκφραση του NDRG1 σημαντικά (

P

& lt? 0.001). Ανέστειλαν μετανάστευση κυττάρου υπό επανοξυγόνωση (Σχήμα 3γ)

(α) ανάλυση Ποσοτική RT-PCR του

NDRG1

υπερέκφραση σε MCF-7. Τα επίπεδα mRNA της

NDRG1

ομαλοποιήθηκαν από 18s rRNA. EV: κενό φορέα. (Β) Western στύπωμα υπερεκφράζεται NDRG1. Πρωτεΐνη από λύματα ολόκληρων κυττάρων κηλιδώθηκε με NDRG1-ειδικό αντίσωμα, και β-ακτίνη ήταν ο έλεγχος φόρτωσης. (Γ) Σχετική ικανότητα μετανάστευση των κυττάρων MCF-7 που υπερεκφράζουν μετά NDRG1. ικανότητα της μετανάστευσης εκφράσθηκε ως φορές αλλάζει σε σχέση με το MCF-7 υπό επανοξυγόνωση.

Η

Πρόβλεψη των μεταγραφικών παραγόντων MYC-συνδέονται και microRNAs υποξία που σχετίζονται με τη ρύθμιση

NDRG1

Η

για να κατανοήσουμε τους μηχανισμούς που ρυθμίζουν

NDRG1

έκφρασης, χρησιμοποιήσαμε βιοπληροφορική εργαλεία και μια έρευνα της βιβλιογραφίας για την πρόβλεψη των δεσμευτικών μοτίβα των παραγόντων μεταγραφής MYC που σχετίζονται με τον υποκινητή του

NDRG1

και τη σύνδεση περιοχές της microRNAs υποξία που σχετίζονται με (miRNAs) στην 3’UTR. Χρησιμοποιώντας MatInspector και κριτήρια που αναφέρονται στα Υλικά και Μέθοδοι, 170 μοτίβα δέσμευσης μεταγραφικών παραγόντων εντοπίστηκαν στον προαγωγό του

NDRG1

. Μεταξύ αυτών των παραγόντων μεταγραφής, επελέγησαν παράγοντες μεταγραφής MYC σχετιζόμενη που αναφέρθηκαν προηγουμένως. Αυτοί οι παράγοντες μεταγραφής που περιλαμβάνονται E2F-MYC ενεργοποιητή, MYC συνδέονται δακτύλους ψευδαργύρου, και παράγοντες δέσμευσης E-box. Τους μοτίβο σύνδεσης, τη θέση, και το λογότυπο αλληλουχία παρατίθενται στον Πίνακα S1. Τα αποτελέσματα αυτά κατηγορούνται

NDRG1

μπορεί να ρυθμίζεται από αυτούς τους παράγοντες μεταγραφής, αν και τα περισσότερα πειράματα δικαιολογημένη.

Τέλος, τα επίπεδα έκφρασης των miRNAs είναι γνωστό ότι αλλάζουν κάτω από υποξία. Να διερευνήσει τη δυνατότητα

NDRG1

να υπόκεινται σε ρύθμιση miRNA κάτω από διαφορετικές O

2 συνθήκες, θέσεις δέσμευσης των miRNAs υποξίας που σχετίζονται με αναζητήθηκαν στην 3’UTR του

NDRG1

. Τα κριτήρια επιτρέπεται μία αναντιστοιχία, ταλάντευση, διαγραφή, ή χάσμα μεταξύ της δεύτερης και της έβδομης νουκλεοτίδια των miRNAs. Όπως φαίνεται στον Πίνακα S2, έξι θέσεις πρόσδεσης για τις περιφέρειες των σπόρων των τεσσάρων υποξία που σχετίζονται με miRNAs-miR-25, miR-93, miR-106a και miR-210-εντοπίστηκαν στο 3 ‘UTR του

NDRG1

, γεγονός που υποδηλώνει ότι

NDRG1

θα μπορούσαν να ρυθμίζονται από αυτές τις τέσσερις miRNAs. Το αποτέλεσμα αυτό θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για να σχεδιάσουν πειράματα διερεύνηση της μετα-μεταγραφική ρύθμιση του

NDRG1 από

miRNAs.

Συζήτηση

Αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει ότι τα καρκινικά κύτταρα εμφανίζουν αυξημένη αντίσταση στα φάρμακα και μεταστατικό δυναμικό μετά από έκθεση σε προσβολές υποξία /επανοξυγόνωση [13], [15]. Αν και κυτταρική προσαρμογές υποξίας είναι καλά τεκμηριωμένες, λίγα είναι γνωστά για προσαρμοστικών μηχανισμών για την επανοξυγόνωση. Εδώ, εξετάσαμε τη δυναμική της γονιδιακής έκφρασης του γονιδιώματος σε όλη τη διάρκεια επανοξυγόνωση, και διαπίστωσε ότι τα διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων που εμπλέκονται στο δίκτυο μεταγραφικού παράγοντα HIF-1-α και η ενεργοποίηση της μεταγραφής c-myc.

Σε αυτή τη μελέτη , ανάλυση κύριων συνιστωσών των γονιδίων οξυγόνο αποκρίνονται έδειξε υψηλή επαναληψιμότητα πάροδο του χρόνου. Με βάση τον αριθμό των Ο

2-γονιδίων που αποκρίνονται σε διαφορετικά χρονικά σημεία, το ενεργό περίοδος της μεταγραφής σε απόκριση επανοξυγόνωση φαίνεται να είναι μεταξύ 8 και 12 ωρών. Επιπλέον, η ανάλυση μονοπατιού αποκάλυψε ότι οι O

2-γονιδίων που αποκρίνονται στις 12 ώρες είχαν εμπλακεί στο δίκτυο παράγοντα μεταγραφής HIF-1-αλφα, το κεραμίδιο μονοπάτι σηματοδότησης, και από κοινού ρύθμιση της ενεργότητας του υποδοχέα ανδρογόνων. Δεν αποτελεί έκπληξη το ότι το δίκτυο παράγοντα μεταγραφής HIF-1-άλφα είχε εμπλακεί σε επανοξυγόνωση, επειδή έχει αναφερθεί σε μια παρόμοια κατάσταση, δηλαδή, την ακτινοβόληση. Μετά ακτινοθεραπεία, επανοξυγόνωση του όγκου οδηγεί στην πυρηνική συσσώρευση του HIF-1 σε απόκριση σε αντιδραστικά είδη οξυγόνου [18]. Ένα από τα γονίδια, δηλαδή

NDRG1

, στο δίκτυο μεταγραφικού παράγοντα HIF-1-άλφα επιστήσει την προσοχή μας, γιατί είχε τη μεγαλύτερη αλλαγή στην έκφραση μετά από επανοξυγόνωση.

NDRG1

εκφράζεται πανταχού εις τους ιστούς διεγείρονται κάτω από μια ευρεία ποικιλία των τάσεων και συνθηκών ανάπτυξης ρυθμιστικών κυττάρων, όπως υποξία [19], [20], βλάβη του DNA [21], την κυτταρική διαφοροποίηση [22], [23], [24], πολλαπλασιασμό και ανάπτυξη σύλληψης [23]. Έχει αναφερθεί ότι το

NDRG1

είναι ισχυρά επάνω ρυθμισμένη κάτω από συνθήκες υποξίας. Ένα ογκογόνο και προαγωγής όγκων ρόλο του

NDRG1

έχει επίσης αναφερθεί, επειδή υπερεκφράζεται σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του πνεύμονα, του εγκεφάλου, του δέρματος, των νεφρών, και καρκίνων του μαστού [25], [26]. Ωστόσο,

NDRG1

λειτουργούσε ως καταστολέας μεταστατικό στον προστάτη και του κόλου [24], [27]. Οι αντιφατικούς ρόλους του

NDRG1

στον καρκίνο παρέμεινε να διευκρινιστεί, αν και θα μπορούσε να εξηγηθεί από πολλαπλές κυτταρικές εντοπίσεις και πολύπλοκη ρύθμιση από διάφορες φυσιολογικές και παθολογικές παράγοντες. Πρόσφατα, Toffoli et al. αναφέρεται ότι

NDRG1

μπορεί να προκληθεί με διαλείπουσα υποξία για την προώθηση της κυτταρικής μετανάστευσης [28]. Αρκετές μελέτες έδειξαν επίσης ότι

NDRG1

επάγεται από την υποξία και συνδέεται με τη μετάσταση, αλλά ο ρυθμιστικός μηχανισμός της

NDRG1

παραμένει άπιαστο και λειτουργία του υπό επανοξυγόνωση είναι ακόμα ασαφής.

NDRG1

είχε τη μέγιστη απόκριση μεταγραφική να επανοξυγόνωση σε αυτή τη μελέτη, η οποία αισθανθήκαμε δικαιολογείται περαιτέρω έρευνα. Παρατηρήσαμε ότι η έκφραση του

NDRG1

είχε αντίστροφη σχέση με τη μετανάστευση των κυττάρων κατά την επανοξυγόνωση. Αυτά τα αποτελέσματα εμπλέκουν NDRG1 ως καταστολέας μετάσταση, σύμφωνα με τα ευρήματα της Maruyama et al. [8]. Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων μας και εκείνων των Toffoli et al. [28] μπορεί να οφείλεται σε διαφορετικό τύπο των κυττάρων και πειραματικές ρυθμίσεις.

Για να κατανοήσουμε πληρέστερα τις πιθανές ρυθμιστικών μηχανισμών του

NDRG1

κάτω από επανοξυγόνωση,

in silico

η ανάλυση της αλληλουχίας διεξήχθη για να προβλέψουμε DNA μοτίβα των παραγόντων μεταγραφής πρόσδεσης στον προαγωγό του

NDRG1

. Μεταξύ των μοτίβων δέσμευσης MYC-συνδέονται εντοπίστηκαν, πρωτεΐνες δακτύλου ψευδαργύρου, E2F-MYC ενεργοποιητή /ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου, και παράγοντες που θα μπορούσαν να επηρεάσουν τη γονιδιακή έκφραση [29] δεσμευτική E-box, [30], [31], [32]. Αυτοί οι παράγοντες υποψήφιος μεταγραφής μπορεί να επικυρωθεί περαιτέρω με την κατασκευή διαφόρων υποκινητών χρησιμοποιώντας δοκιμασίες λουσιφεράσης. Επιπλέον, τα επίπεδα έκφρασης αρκετών miRNAs έχουν δειχθεί να αλλάξει σε υποξία [33], [34], [35]. Ειδικότερα, miR-210 επάγεται κατά την υποξία μέσω ενός HIF1-εξαρτώμενο μηχανισμό, και η έκφραση του miR-210 είχε μια ισχυρή συσχέτιση με την έκφραση του

NDRG1

[34]. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι η έκφραση του

NDRG1

επίσης ρυθμίζεται από miRNAs. Πράγματι, οι θέσεις πρόσδεσης των περιοχών σπόρων των τεσσάρων miRNAs υποξία που σχετίζονται με (miR-106a, miR-93, miR-25, και miR-210) εντοπίστηκαν στην 3’UTR του

NDRG1

. Ως εκ τούτου, έχουμε προτείνει ένα μοντέλο εργασίας με βάση την βιοπληροφορική πρόβλεψη και βιβλιογραφική έρευνα (Σχήμα 4). Το μοντέλο αυτό παρέχει ένα πλαίσιο για τη μελλοντική βιολογικά πειράματα

TSS:. Θέση έναρξης της μεταγραφής. Άσπρο κουτί: θέση δέσμευσης παράγοντα μεταγραφής στο + σκέλος? μαύρο κουτί: θέση δέσμευσης παράγοντα μεταγραφής σε – σκέλος? γκρι κουτί: θέση πρόσδεσης miRNA

Η

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων

Ανθρώπινο καρκινικών κυττάρων του μαστού γραμμή MCF-7 αποκτήθηκε από Bioresource Συλλογή και Ερευνητικό Κέντρο (. Hsiuchu, Ταϊβάν). Τα κύτταρα MCF-7 διατηρήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (DMEM, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) που περιέχει 1.5 g /L διττανθρακικό νάτριο συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) ορό εμβρύου μόσχου (Hyclone, Gibco) και με 1% αντιβιοτικό διάλυμα (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Για υποξικά καλλιέργειες, τα κύτταρα επωάστηκαν σε ένα θάλαμο υποξίας (InVivo

2-200, Ruskinn Technology, Leeds, UK) για 24 ώρες με ένα αέριο μίγμα που περιέχει 5% CO

2, 95% Ν

2 στους 37 ° C. Η συγκέντρωση του οξυγόνου στον θάλαμο υποξίας διατηρήθηκε στο 0,5%. Μετά από 24 ώρες υποξικών ανάπτυξης, τα κύτταρα επωάστηκαν σε ένα καλά υγροποιημένο επωαστή με 5% CO

2 και 95% αέρα δωματίου στους 37 ° C. Έξι δείγματα συλλέχθηκαν αντίστοιχα στους 0, 1, 4, 8, 12 και 24 ώρες μετά επανοξυγόνωση. Τα κύτταρα πλύθηκαν με ψυχρό PBS, φλας-καταψύχθηκαν σε υγρό Ν

2, και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C για μεταγενέστερη απομόνωση RNA. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν.

RNA

εκχύλιση

Ολικό RNA εκχυλίστηκε με το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA) και καθαρίστηκε με RNeasy κιτ Micro καθαρισμού (Qiagen, Valencia, CA ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. συγκέντρωση του RNA και η ποιότητα προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) και ένα Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA), η οποία υπολογίζει έναν αριθμό ακεραιότητα RNA (RIN). Ολικό RNA (500 ng) με ένα

260 /Α

280 = 1.7 – 2.1 και RIN & gt?. 7.0 χρησιμοποιήθηκαν για τη σύνθεση του πρώτου κλώνου cDNA μέσω αντίστροφης μεταγραφής

Illumina ανθρώπινη έκφραση ολόκληρου γονιδιώματος beadchips

το συνολικό RNA σημάνθηκε με ένα Τ7 ολίγο (dT) εκκινητή και ενισχύθηκαν με Illumina TotalPre RNA Amplification Kit (Ambion Inc., Austin, ΤΧ) για να συντεθεί το cDNA που περιέχει αλληλουχία προαγωγέα Τ7. Μετά την πρώτη σύνθεση cDNA κλώνου, δεύτερος κλώνος οϋΝΑ συνετέθη με μετατροπή της μονόκλωνο cDNA σε ένα πρότυπο δίκλωνου DNA (dsDNA) για τη μεταγραφή. Η αντίδραση που χρησιμοποιείται πολυμεράση DNA και RNase Η να υποβαθμίσει ταυτόχρονα το RNA και συνθέσει δευτερόλεπτα cDNA κλώνου. Το δίκλωνο cDNA στη συνέχεια υποβλήθηκε σε καθαρισμό διαδικασία να απομακρυνθεί η περίσσεια του RNA, αστάρια, ένζυμα, και τα άλατα που θα αναστέλλουν in vitro μεταγραφή. Στη συνέχεια, in vitro μεταγραφή διεξήχθη με τη χρήση της διπλής έλικας cDNA ως μήτρα και Τ7 RNA πολυμεράση για να συνθέσει πολλαπλά αντίγραφα του βιοτινυλιωμένου cRNA. Μετά την ενίσχυση, το cRNA αναμίχθηκε με ίσο όγκο ρυθμιστικού διαλύματος υβριδοποίησης και υβριδοποιήθηκε σε Illumina Human-6 v3 BeadChips (Illumina, San Diego, CA) στους 58 ° C για 16 ώρες. Μετά την υβριδοποίηση, το BeadChip πλύθηκε και χρωματίστηκαν με στρεπταβιδίνη Cy3 χρωστική. Η ένταση του φθορισμού του σφαιρίου ανιχνεύθηκε με την Illumina BeadArray Reader, και τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με τη χρήση λογισμικού v3.1 BeadStudio. Όλα τα δεδομένα είναι MIAME συμμορφούμενο και ότι ο ανεπεξέργαστα δεδομένα έχει κατατεθεί σε μια βάση δεδομένων συμβατή MIAME. έχουν τα δεδομένα μικροσυστοιχιών αυτής της μελέτης έχουν υποβληθεί στο GEO (Gene Expression Omnibus) της βάσης δεδομένων (αριθμός ένταξης GSE30019).

Η εξόρυξη δεδομένων και στατιστική ανάλυση

Μετά τη σάρωση, τα δεδομένα της έντασης της Illumina Ανθρωποκεντρική 6 v3 BeadChips αναλύθηκαν από το εμπορικό λογισμικό Partek® (Partek, St. Charles, MO) για την ανάλυση της έκφρασης του mRNA. σήματα φόντο προσαρμοσμένο ομαλοποιήθηκαν με ποσοστημόριο αλγόριθμο κανονικοποίησης, η οποία ομαλοποιηθεί τις εντάσεις καθετήρα με βάση την κατανομή της έντασης ανάμεσα σε όλες τις διαφάνειες. Μετά την κανονικοποίηση, Ανάλυση Κύριων Συνιστωσών (PCA), η οποία μειώνει την υψηλή διαστάσεων δεδομένων σε 2D διάγραμμα, χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση της ομοιότητας των προφίλ γονιδιακής έκφρασης. Για τον εντοπισμό γονιδίων που εκφράζονται διαφορικά, t-tests εξετάζοντας τα επίπεδα έκφρασης του κάθε χρονικό σημείο μετά επανοξυγόνωση έναντι αυτής του χρόνου χρησιμοποιήθηκαν μηδέν. Γονίδια των οποίων η

P

-τιμή από τρεις επαναλήψεις σε ένα ή περισσότερα χρονικά σημεία ήταν & lt? 10

-4 ταυτοποιήθηκαν και ορίζονται ως O

2-αποκριτικών γονιδίων. Το πρόγραμμα Genesis [36] χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργήσει μια οπτική αναπαράσταση του προφίλ έκφρασης. Επιπλέον, NCI-Φύση Διαδρομή Βάση Δεδομένων Αλληλεπίδραση [17] εφαρμόστηκε για τον προσδιορισμό των βιολογικών λειτουργιών των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων.

Η υπερέκφραση του

NDRG1

στο MCF-7

Η ανθρώπινα

NDRG1

γονίδιο εισήχθη μεταξύ του

EcoR Ι

και

ΒθπίΗΙ

περιοχές των ευκαρυωτικών φορέα έκφρασης pcDNA3.1 + (Invitrogen, Carlsbad, CA). MCF-7 κύτταρα /NDRG1 δημιουργήθηκαν με επιμόλυνση των κυττάρων MCF-7 με pCDNA3.1 + κωδικοποιούν το

NDRG1

γονίδιο χρησιμοποιώντας λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). MCF-7 κύτταρα /NDRG1 συνέχεια επελέγησαν με 200 μg /ml του ζεοσίνη για δύο εβδομάδες. Η έκφραση του mRNA της

NDRG1

εξετάστηκε από ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου, και η έκφραση της πρωτεΐνης NDRG1 εξετάστηκε από κηλίδωση western.

Ποσοτική αντίστροφης μεταγραφής PCR

Το συνολικό RNA ήταν εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αντίστροφη μεταγραφή του ολικού RNA πραγματοποιήθηκε με ένα υψηλής χωρητικότητας cDNA RT Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) χρησιμοποιώντας τυχαίων εκκινητών και 1 μg ολικού RNA ως εκμαγείο. Το μίγμα της αντίδρασης επωάστηκε στους 25 ° C για 10 λεπτά, 37 ° C για 2 ώρες και 85 ° C για 5 sec. Real Time PCR ανιχνεύθηκε με SYBR Green (Sigma) και διεξήχθη χρησιμοποιώντας το ΑΒΙ 7300 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Οι αντιδράσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το ακόλουθο πρόγραμμα: 40 κύκλοι μετουσίωσης στους 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα και 1 λεπτό από ανόπτηση και επιμηκύνοντας στους 60 ° C. Για κάθε δείγμα cDNA, ένας εσωτερικός έλεγχος, 18s rRNA, μετρήθηκε επίσης η SYBR Green ανιχνευτή για να εξασφαλίσει συγκρίσιμες ποσότητες cDNA σε όλα τα φρεάτια. Σχετική έκφραση NDRG1 σύγκριση με 18s rRNA σε κάθε δείγμα υπολογίστηκε (△ Ct) και η σχετική έκφραση του NDRG1 μεταξύ δειγμάτων προσδιορίστηκε με τον υπολογισμό της διαφοράς σε △ Ct μεταξύ των δειγμάτων (△△ Ct). Όλες οι μετρήσεις έγιναν εις τριπλούν (5 ng του συνολικού RNA ανά φρεάτιο).

κηλίδωση

ολόκληρου εκχυλίσματα Western κυττάρου παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας RIPA ρυθμιστικού διαλύματος λύσεως συμπληρωμένο με 1% Nonidet Ρ-40 (ΝΡ 40) και Mini Protease Inhibitor Cocktail Tablets (Roche, Mannheim, Germany). Τα κυτταρικά υπολείμματα συλλέχθηκε με φυγοκέντρηση στα 8000 χ g στους 4 ° C για 20 λεπτά. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε με τη μέθοδο δικιγχονινικού οξέος (BCA δοκιμασία), και 20-50 μ§ πρωτεΐνη φορτώθηκαν σε ένα πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου δωδεκυλο θειικού μετουσίωσης του νατρίου 10%. Μετά την ηλεκτροφόρηση, η πρωτεΐνη ηλεκτροφορητικά μεταφέρθηκε σε μεμβράνες PVDF όλη τη νύχτα σε 55 mA. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα Tween-20 (TBST) με 5% άπαχο γάλα σε σκόνη σε θερμοκρασία δωματίου για μία ώρα. Ανίχνευση ειδικών πρωτεϊνών έγινε με ανίχνευση μεμβράνες με πρωτεύοντα αντισώματα σε TBS με 0,1% Tween-20 για 1,5 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Αυτά αντίσωμα συμπεριλαμβάνεται NDRG1 (Abcam, 1:500), HIF1α (Millipore, 1:1000), C-MYC (Millipore, 1:1000), Ν-MYC (Millipore, 1:250), και GAPDH ελέγχου φόρτωσης (GeneTex, 1:10000) ή β-ακτίνης (1:5000). Μετά την επώαση με τα IgG δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση αρμορακίας (1:5000), η ανοσοαντιδραστικότητα οπτικοποιήθηκε με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια με Αντιδραστήριο λουμινόλη (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA).

δοκιμασία μετανάστευσης κυττάρων

δοκιμασίες μετανάστευση διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας 24 φρεατίων transwell θαλάμους μετανάστευσης (Corning, Corning, New York, USA) με 8 μm πόρου μεμβράνες μεγέθους πολυαιθυλένιο. Τα κύτταρα πρώτη πεινασμένο 24 ώρες και συλλέχθηκαν με Accutase (ΠΑΑ Laboratories, Linz, Αυστρία). Οι άνω θάλαμοι εμβολιάστηκαν με 5 × 10

4 κύτταρα φρεάτιο σε 0.1 ml διαλύματος DMEM κύτταρο /χωρίς ορό, και κάτω θάλαμοι πληρώθηκαν με 0.6 ml ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FBS ως χημειοπροσελκυστικό. Τα κύτταρα αφέθηκαν να μεταναστεύσουν για 24 ώρες στους 37 ° C. Για τη μέτρηση της μετεγκατεστημένο κύτταρα, 2 μg /ml Calcein-ΑΜ (Trevigen, Gaithersburg, MD, USA) /Διάλυμα Διαχωρισμού Κυττάρου (Trevigen) προστέθηκε εντός του κατώτερου θαλάμου. Μετά από επώαση στους 37 ° C για 60 λεπτά, τα ένθετα απομακρύνονται και οι πλάκες αναγνώστηκαν στα 485 nm για διέγερση και 520 nm για εκπομπή. Οι αριθμοί των κυττάρων υπολογίστηκαν με σύγκριση της απορρόφησης προς την πρότυπη καμπύλη. κύτταρα MCF-7 επιμολυσμένα με άδειο φορέα χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος για κάθε πείραμα.

Στο silico

ανάλυση των

NDRG1

Η

Για τον εντοπισμό πιθανών δεσμευτικών μοτίβα παραγόντων μεταγραφής MYC-συνδέονται στον προαγωγέα του

NDRG1

, το πρόγραμμα MatInspector χρησιμοποιήθηκε [37]. Δύο προκαθορισμένες ομάδες των παραγόντων μεταγραφής, συμπεριλαμβανομένων των γενικών βασικά στοιχεία υποκινητή και των σπονδυλωτών, αναλύθηκαν στην έκδοση βιβλιοθήκη μήτρα 8,3 χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες παραμέτρους: (1) οι οικογένειες μήτρα συνδυάζονταν αντί των μεμονωμένων ακολουθιών? (2) πυρήνα ομοιότητα ήταν τουλάχιστον 0,75? (3) ομοιότητα μήτρα βελτιστοποιήθηκε. Η περιοχή πυρήνα ορίστηκε ως τέσσερα διαδοχικά νουκλεοτίδια με την υψηλότερη βαθμολογία διατήρησης [38]. Η ομοιότητα πυρήνα και μήτρας υπολογίζεται συγκρίνοντας την αλληλουχία ερωτήματος με την πιο συντηρημένες νουκλεοτιδικές στη μήτρα. Μετά τον εντοπισμό των πιθανών υποψηφίων παράγοντας μεταγραφής, οι παράγοντες μεταγραφής MYC που σχετίζονται με περαιτέρω επιλέγεται με βάση μια έρευνα βιβλιογραφίας.

Για τον προσδιορισμό των θέσεων δέσμευσης των miRNAs υποξία που σχετίζονται με το

NDRG1

3 ‘ UTR αλληλουχία κατεβάσει από το πρόγραμμα περιήγησης UCSC του Γονιδιώματος (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway? GRCh37 συναρμολόγησης /hg19), και ευθυγραμμίστηκε με miRNAs υποξία που σχετίζονται. Τα κριτήρια για την αναζήτηση θέσεις πρόσδεσης της περιοχής σπόρου επιτρέποντας μία αναντιστοιχία, ταλάντευση, διαγραφή, ή χάσμα μεταξύ της δεύτερης και της έβδομης νουκλεοτίδια miRNAs υποξία σχετίζονται.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1.