Abstract

Πρόσφατες αναφορές έχουν προτείνει την εμπλοκή του εντέρου μικροχλωρίδας στην εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC). Χρησιμοποιήσαμε Pyrosequencing βάση ανάλυση των γονιδίων 16S rRNA να καθορίζουν τη συνολική δομή του μικροχλωρίδας σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου και των υγιών μαρτύρων? ερευνήσαμε μικροχλωρίδας του εντερικού αυλού, το καρκινικό ιστό και συμφωνημένα noncancerous φυσιολογικό ιστό. Επιπλέον, μελετήθηκε η προσκολλάται εις τον βλεννογόνο μικροβιακή σύνθεση χρησιμοποιώντας ορθού επιχρίσματα επειδή η δομή του ιστού που προσκολλάται βακτηριακή κοινότητα δυνητικά μεταβάλλεται μετά τον καθαρισμό του εντέρου. Τα ευρήματά μας έδειξαν ότι η μικροβιακή δομή των εντερικό αυλό και καρκινικό ιστό διέφεραν σημαντικά. Phylotypes που ενισχύουν την ενεργειακή συγκομιδή από τη διατροφή ή να εκτελέσει μεταβολική ανταλλαγή με τον ξενιστή ήταν πιο άφθονο στον αυλό. Υπήρχαν πιο άφθονη Firmicutes και λιγότερο άφθονα Bacteroidetes και Πρωτεοβακτηρίων σε αυλό. Οι συνολικές μικροβιακή δομές του καρκινικού ιστού και noncancerous ιστού ήταν παρόμοια? howerer τη μικροχλωρίδα του όγκου εμφάνισαν χαμηλότερα ποικιλομορφία. Οι δομές του αυλού εντερικού μικροχλωρίδα και προσκολλάται εις τον βλεννογόνο μικροχλωρίδας ήταν διαφορετικές σε ασθενείς CRC σε σύγκριση με συμφωνημένα μικροχλωρίδας σε υγιή άτομα. Lactobacillales εμπλουτίστηκε σε καρκινικό ιστό, ενώ

Faecalibacterium

μειώθηκε. Στο βλεννογόνο που προσκολλάται microbiota,

Bifidobacterium, Faecalibacterium

, και

Blautia

μειώθηκαν σε ασθενείς με CRC, ενώ

Fusobacterium

,

Porphyromonas

,

Peptostreptococcus

, και

Mogibacterium

εμπλουτίστηκαν. Στην αυλό, κυρίαρχο phylotypes σχετίζονται με μεταβολικές διαταραχές ή μεταβολική ανταλλαγή με τον ξενιστή, Erysipelotrichaceae, Prevotellaceae, και Coriobacteriaceae αυξήθηκαν σε ασθενείς με καρκίνο. Σε συνδυασμό με τις προηγούμενες εκθέσεις, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η εντερική μικροχλωρίδα συνδέεται με CRC κίνδυνο και ότι εντερικό αυλό μικροχλωρίδα δυνητικά να επηρεάσουν CRC κινδύνου μέσω cometabolism ή μεταβολική ανταλλαγή με τον ξενιστή. Ωστόσο, βλεννογόνο που σχετίζεται με μικροχλωρίδα επηρεάζει δυνητικά CRC κίνδυνο κυρίως μέσω άμεσης αλληλεπίδρασης με τον ξενιστή

Παράθεση:. Chen W, Liu F, Ling Ζ, Tong X, Xiang C (2012) Ανθρώπινα εντερικό αυλό και των βλεννογόνων-Associated μικροχλωρίδας σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 7 (6): e39743. doi: 10.1371 /journal.pone.0039743

Επιμέλεια: Antonio Moschetta, Πανεπιστήμιο του Μπάρι & amp? Consorzio Mario Negri Sud, Ιταλία

Ελήφθη: 12, Γενάρη του 2012? Αποδεκτές: 25 Μαΐου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 28, Ιουνίου του 2012

Copyright: © 2012 Chen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Project 2007CB513001 των κινεζικών Εθνικών προγραμμάτων Βασικής Έρευνας και Ανάπτυξης (973 πρόγραμμα, https://www.973.gov.cn/AreaAppl.aspx). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο ορθοκολικός καρκίνος (CRC) είναι μία από τις πιο κοινές κακοήθεις τύπο όγκου στον κόσμο. Ένας από τους σημαντικούς παράγοντες που σχετίζονται με CRC είναι η εντερική μικροχλωρίδα [1]. Το ανθρώπινο γαστρεντερικό σωλήνα φιλοξενεί περίπου 1.000 είδη βακτηρίων ύψους 10

14 κύτταρα, τα οποία είναι περισσότερο από 10 φορές τον αριθμό των ευκαρυωτικών κυττάρων ανθρώπινου [2]. Εκτός από επηρεάζοντας διατροφή ξενιστή μέσω του μεταβολισμού, η εντερική μικροχλωρίδα επηρεάζει το ανθρώπινο σώμα με τον έλεγχο επιθηλιακά πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης, που επηρεάζουν την ανάπτυξη του ανοσοποιητικού συστήματος και την προστασία κατά των παθογόνων παραγόντων [3].

Συσσωρευμένα στοιχεία δείχνουν ότι το έντερο microbiota συσχετίζεται στενά με την εξέλιξη του ορθοκολικού καρκίνου [1], [4]. Wei

et al

. βρήκε μια αύξηση της τάξης του

Ruminococcus obeum

και

Allobaculum

-όπως τα βακτήρια στα κόπρανα των αρουραίων την ανάπτυξη προκαρκινικών βλαβών του βλεννογόνου [5]. Μια αύξηση του

Prevotella

αναφέρθηκε σε ασθενείς CRC [6]. Wang

et al

. βρήκε μια μείωση σε βακτήρια που παράγουν βουτυρικό στα κόπρανα των ασθενών CRC [7], υποδεικνύοντας το πλεονέκτημα της βακτηριακής μεταβολιτών.

Ωστόσο, το βλεννογόνο που σχετίζεται microbiome στον εντερικό ιστό διαφέρει από τον αυλό του [8], και αυτά τα μικρόβια επίσης να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο. Marchesi και συνεργάτες ανέλυσαν τις βακτηριακές αλληλουχίες 16S rDNA έξι CRC ασθενών και προσδιορίστηκε ότι τα προβιοτικά βακτήρια όπως

Coriobacteria

εμπλουτίστηκαν σε καρκινικό ιστό με την ανάλυση των βακτηριακών αλληλουχιών 16S rDNA του έξι CRC ασθενών [9], υποδηλώνοντας ότι τα προβιοτικά δυνητικά να διαδραματίσουν ιδιαίτερο ρόλο στην εξέλιξη της CRC.

Fusobacterium nucleatum

βρέθηκαν σε ιστό καρκίνου του παχέος εντέρου έχει αναφερθεί να σχετίζεται στενά με CRC [10]. Ωστόσο, η ακριβής σύνθεση της εντερικής μικροχλωρίδας και τη λειτουργία του στην εξέλιξη της CRC είναι παραμένουν άγνωστα, επειδή η συνολική δομή της μικροχλωρίδας σε ασθενείς CRC δεν έχει πλήρως διευκρινιστεί.

Τα βακτήρια ή τα συστατικά της λειτουργίας βακτηρίων με άμεση αλληλεπίδραση με τον ξενιστή ή έμμεση συν-μεταβολισμό ή μεταβολική ανταλλαγή με τον ξενιστή. Van der Waaij

et al

. διαπίστωσε ότι συμβιωτικών βακτηρίων ζουν στην αναστολή εντερικό αυλό και δεν έχουν άμεση επαφή με τα επιθηλιακά κύτταρα [11]. Υποθέσαμε ότι ο βλεννογόνος που σχετίζονται μικροχλωρίδας λειτουργία κυρίως με την άμεση αλληλεπίδραση με τον ξενιστή και ότι αυλού του εντέρου (δηλαδή, κόπρανα) μικροχλωρίδας ενεργούν κυρίως μέσω cometabolism ή μεταβολικής ανταλλαγής. Σε αυτή τη μελέτη εκτελέσαμε Pyrosequencing των γονιδίων 16S rRNA, προκειμένου να αναλυθεί η συνολική δομή του μικροχλωρίδας σε ασθενείς με CRC και σε υγιείς μάρτυρες. Μελετήσαμε την μικροχλωρίδα του εντερικού αυλού, καρκινικό ιστό, και θα συνοδευτεί noncancerous φυσιολογικό ιστό. Επιπλέον, εξετάσαμε την προσκολλάται εις τον βλεννογόνο μικροβιακή σύνθεση με τη χρήση του ορθού επιχρίσματα επειδή η δομή του ιστού που προσκολλάται βακτηριακή κοινότητα δυνητικά μεταβάλλεται ακολουθώντας καθαρισμό του εντέρου [12]. Επιπλέον, προσπαθήσαμε να προσδιοριστούν τα βασικά βακτηριακή phylotypes ή δυνητική βιοδείκτες που πιθανώς παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του CRC.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι ασθενείς και οι Ομάδες Ελέγχου

Ένα σύνολο των 46 ασθενείς με CRC 37-88 ετών επιλέχθηκαν από την Πρώτη Ενταγμένο Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Zhejiang, Κίνα. Μαζέψαμε τα ακόλουθα δείγματα από ασθενείς αυτούς: [21 κοπράνων (STP) δείγματα, μάκτρο (SWP) δείγματα 32 του εντέρου και 27 του κάθε καρκινικού ιστού (γάτα), σε συνδυασμό paracancerous ιστού 2-5 cm από τον καρκινικό ιστό (pa2t), και να συνδυαστούν paracancerous ιστού 10-20 cm από τον καρκινικό ιστό (pa10t)]. Το σκαμνί, πρωκτική μάκτρο, και ιστών δείγματα δεν συλλέχθηκαν από όλους τους ασθενείς CRC για τους ακόλουθους λόγους: υδαρή κόπρανα, κόπρανα πολύ λεπτό για να συλλέξει? δείγματα αποθηκεύονται πάρα πολύ καιρό σε θερμοκρασία δωματίου? ή ο ασθενής αισθάνθηκε άβολα κατά τη διάρκεια της συλλογής του ορθού επιχρίσματα. Επιπλέον, 56 υγιείς εθελοντές, οι οποίοι πληρούν τις απαιτήσεις της έχουν συμφωνημένα φύλου και παρόμοιας ηλικίας με τα δείγματα των ασθενών CRC, και οι οποίοι δεν εμφάνισαν παχέος αδενώματα επιλέχθηκαν ως μάρτυρες? 22 δείγματα κοπράνων (STC) και 34 τολύπια (SWC) συλλέχθηκαν από αυτούς τους εθελοντές (Πίνακας 1). Ορίσαμε μικροχλωρίδας του ιστού, κόπρανα, και μάκτρο όπως microbiota ιστού, αυλό μικροχλωρίδα, και προσκολλάται εις τον βλεννογόνο microbiota, αντίστοιχα. Ορίσαμε τόσο μικροχλωρίδα των ιστών και των βλεννογόνων που προσκολλάται μικροχλωρίδας ως βλεννογόνου που σχετίζεται με μικροχλωρίδας. Δεν υποκείμενα μελέτης είχαν διαβήτη, μολυσματικές ασθένειες, ή συγκεκριμένες δίαιτες. Και ο ΔΜΣ όλων των θεμάτων ήταν μεταξύ 20 και 24. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της First Affiliated Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Zhejiang, Κίνα? τεκμηριωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες στη μελέτη.

Η

Συλλογή των δειγμάτων και του DNA Extraction

Κανένα από τα άτομα έπαιρναν φάρμακα κατά τη στιγμή της συλλογής δειγμάτων, ούτε είχαν χρησιμοποιηθεί τα αντιβιοτικά μέσα τουλάχιστον ένα μήνα από τη συλλογή του δείγματος. Επίχρισμα και δείγματα κοπράνων συλλέχθηκαν από κάθε υποκείμενο πριν την καθαρισμό του εντέρου. Κατά τη διάρκεια της χειρουργικής επέμβασης, εντερικά δείγματα συλλέχθηκαν από καρκινικό ιστό και paracancerous ιστού (δηλαδή, 2-5 cm και 10-20 cm από το καρκινικό ιστό, αντίστοιχα). Όλα τα δείγματα καταψύχθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι περαιτέρω χρήσης.

Γενωμικό DNA εκχυλίστηκε από δείγματα ιστού και μάκτρο με τη χρήση του QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή με μικρές τροποποιήσεις. Τα βακτηριακά κύτταρα σε επιχρίσματα εκτοπίζεται από έντονη ανάδευση σε 1 ml PBS. Τα κύτταρα σβωλοποιήθηκαν με φυγοκέντρηση στα 17.000 g για 10 λεπτά. Τα ιζήματα επαναιωρήθηκαν σε 80 μΐ διαλύματος ενζύμου (22,5 mg σκόνη λυσοζύμη [κατάλογος no.L6876, Sigma] και 40 μονάδες mutanolysine [αρ. Καταλόγου M9901, Sigma] διαλύθηκε σε 80 μΐ ΤΕ ανά δείγμα) [13], και 100 mg προστέθηκαν σφαιρίδια ζιρκονίου (0,1 mm). Τα μίγματα αναδεύονται σε ένα χτυπητήρι mini-σφαιριδίων (FastPrep, Thermo Electron Corporation, USA) τρεις φορές για 40 δευτερόλεπτα κάθε φορά, και στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37 ° C για 40 λεπτά [14]. Τα επόμενα στάδια διεξήχθησαν σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Εντερικούς ιστούς ξεπλύθηκαν εκτεταμένα με αποστειρωμένο νερό, ομογενοποιούνται σε διάλυμα ενζύμου 80 μΐ χρησιμοποιώντας ένα ηλεκτρικό ομογενοποιητή (PRO Scientific, Oxford, Connecticut, USA), επωάστηκαν στους 37 ° C για 40 λεπτά, και στη συνέχεια λύθηκαν εντελώς για 1-3 ώρες στους 56 ° C σε ρυθμιστικό ATL και πρωτεϊνάση Κ Η C στάδιο επώασης 70 ° παρατάθηκε από 10 λεπτά έως 30 λεπτά [8]. Σκαμνί βακτηριακό γονιδιωματικό ϋΝΑ εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας QIAamp DNA Σκαμνί Mini Kit με τις ίδιες τροποποιήσεις, όπως αναφέρονται παραπάνω.

Pyrosequencing

PCR ενίσχυση της περιοχής V1-V3 βακτηριακών 16 S rDNA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας την καθολική εκκινητές (5′-27F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ‘, 5′-533R TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’) ενσωματώνουν τους προσαρμογείς FLX τιτάνιο και μια αλληλουχία barcode δείγμα. Οι παράμετροι κυκλοποίησης ήταν ως εξής: 5 λεπτά αρχική μετουσίωση στους 95 ° C? 25 κύκλους μετουσίωσης στους 95 ° C (30 s), αναδιάταξη στους 55 ° C (30 s), επιμήκυνση στους 72 ° C (30 s)? και τελική επέκταση στους 72 ° C για 5 λεπτά. Τρεις ξεχωριστές αντιδράσεις PCR κάθε δείγματος συνενώθηκαν για Pyrosequencing. Τα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1% και καθαρίστηκαν με χρήση του κιτ εκχύλισης QIAquick Gel (Qiagen). Ίσες συγκεντρώσεις των αμπλικονίων συνενώθηκαν από κάθε δείγμα. Γαλάκτωμα PCR και αλληλούχιση πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή [15].

Όλα Pyrosequencing διαβάζει διηθούνται σύμφωνα με barcode και εκκινητή αλληλουχίες. Οι προκύπτουσες αλληλουχίες υποβλήθηκαν σε περαιτέρω διαλογή και διηθείται για την ποιότητα και το μήκος. Ακολουθίες που ήταν λιγότερο από 150 nt, που περιέχεται διφορούμενη χαρακτήρες, που περιέχονται πάνω από δύο αναντιστοιχίες στους εκκινητές, ή να περιέχεται μονονουκλεοτιδίου επαναλήψεις πάνω από έξι nt απομακρύνθηκαν [16]. Συνολικά 808.008 σειρές υψηλής ποιότητας παρήχθησαν, αντιπροσωπεύοντας το 80,8% των έγκυρων ακολουθιών σύμφωνα με barcode- και αστάρι-ακολουθία φιλτραρίσματος.

βιοπληροφορική ανάλυση

Οι ακολουθίες υψηλής ποιότητας είχαν ανατεθεί δείγματα σύμφωνα με barcodes. Ακολουθίες ευθυγραμμίστηκαν σύμφωνα με SILVA ευθυγράμμιση [17], [18] και συγκεντρωμένα σε επιχειρησιακά ταξινομικές μονάδες (Otus). Otus που έφθασε το επίπεδο ομοιότητας 97% χρησιμοποιήθηκε για τη διαφορετικότητα (Shannon), ο πλούτος (Chao), την κάλυψη Good, και ανάλυση καμπύλης Αραίωση με τη χρήση Mothur (έκδοση 1.5.0) https://schloss.micro.umass.edu/[19 ]. Ταξινομικές εργασίες του Otus παρουσιάζουν 97% ομοιότητα πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση Mothur σύμφωνα με SILVA 106 σε επίπεδο εμπιστοσύνης 80%.

Ο θερμικός χάρτης κατασκευάστηκε με τη χρήση της λειτουργίας heatmap 2 του πακέτου R gplots και γένους πληροφορίες από επτά ομάδες [20]. Μη σταθμισμένος UniFrac ανάλυση απόσταση μετρήσεων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Otus για κάθε δείγμα [21], [22], καθώς και ανάλυση σε κύριες συνιστώσες (PCA) πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μήτρα της απόστασης. Για να επιλέξετε Otus που εκτίθενται σημασία στο διαρθρωτικό διαχωρισμό μεταξύ των ομάδων, μια παραμετρική Μερική ελαχίστων τετραγώνων Διαχωριστική Ανάλυση (PLS-DA) μοντέλο δημιουργήθηκε με τη χρήση Simca-P + 12,0 (https://www.umetrics.com/). PLS-DA χρησιμοποιείται σε μεταβολισμική, μεταγονιδιωματικής και ανάλυση μικροσυστοιχιών, και Otus με μεταβλητό σημασία στην προβολή (VIP) & gt? 1 θεωρήθηκαν συμβάλλουν σημαντικά στο μοντέλο [5], [23], [24], [25] .

Στατιστική Ανάλυση

Το τεστ Mann-Whitney,

t-test

, και μονόδρομη δοκιμή ANOVA πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του SPSS έκδοση 19.0 για Windows.

πρόσβαση στα δεδομένα

Τα στοιχεία της αλληλουχίας 16 S που προέκυψαν από αυτήν τη μελέτη υποβλήθηκαν στον αριθμό πρόσβασης GenBank Sequence Διαβάστε Αρχείο SRP009633.

Αποτελέσματα

Χαρακτηριστικά του Pyrosequencing Αποτελέσματα

ένα σύνολο 808.008 αλληλουχιών υψηλής ποιότητας παρήχθησαν σε αυτή τη μελέτη, με ένα μέσο όρο 4.253 αλληλουχιών ανά δείγμα. Συνοπτικές πληροφορίες που παρουσιάζονται στον Πίνακα 2, και τα λεπτομερή χαρακτηριστικά του κάθε δείγματος παρατίθενται στον πίνακα S1.

Η

Οι εκτιμητές της κοινότητας πλούτο (Chao) και της ποικιλομορφίας (Shannon) παρουσιάζονται στον Πίνακα 2. Υπήρχαν στατιστικά σημαντικές διαφορές των δεικτών Shannon μεταξύ των ομάδων της γάτας και pa10t (3,77 ± 0,67 έναντι 4,13 ± 0,40,

P

= 0,012), αποδεικνύοντας τη σημαντικά μεγαλύτερη πολυμορφία που συναντώνται στις noncancerous φυσιολογικούς ιστούς (δηλαδή, εκείνοι 10-20 cm από καρκινικούς ιστούς) σε σύγκριση με καρκινικούς ιστούς. Λεπτομερείς χαρακτηριστικά κάθε δείγματος που αναφέρονται στον Πίνακα S1. Η ανάλυση αραίωση των επτά ομάδων που φαίνεται στο Σχήμα S1 υποδεικνύει ότι περισσότερο phylotypes είναι πολύ πιθανό να ανιχνευθεί μετά την εξερεύνηση μεγαλύτερο αριθμό αλληλουχιών. κάλυψη της καλής της κάθε ομάδας ήταν πάνω από 97%, υποδεικνύοντας ότι οι 16 S rDNA αλληλουχίες που ταυτοποιούνται σε αυτές τις ομάδες αντιπροσωπεύουν την πλειοψηφία των βακτηρίων που υπάρχουν στα δείγματα αυτής της μελέτης.

Μικροβιακή Δομές του αυλού του εντέρου και της καρκινικό ιστό διέφεραν σημαντικά

Μελετήσαμε το σκαμνί, του ορθού επίχρισμα, και μικροχλωρίδας ιστό των ασθενών με CRC και των κοπράνων και του ορθού μπατονέτα βακτηριακές κοινότητες των υγιών ατόμων. Η συνολική δομή μικροχλωρίδας για κάθε ομάδα σε επίπεδο συνομοταξία φαίνεται στο Σχήμα 1. Η κυρίαρχη φύλα όλων των ομάδων ήταν Firmicutes, Bacteroidetes, και Πρωτεοβακτηρίων. Υπήρχαν 17 φύλα και 13 φύλα σε δείγματα ιστού και μάκτρο, αντίστοιχα, και μόνο 9 φύλα σε δείγματα κοπράνων. Η συνομοταξία ειδικά σχετική αφθονία των αλληλουχιών μικροχλωρίδας αποκάλυψε ότι μπατονέτα μικροχλωρίδας εμφάνισαν μια στενότερη ομοιότητα με ιστό. Ο θερμικός χάρτης ανάλογα με το επίπεδο βακτηριακό γένος έδειξαν επίσης το ίδιο φαινόμενο (Εικόνα S2).

«Άλλοι» αντιπροσωπεύει τις αταξινόμητη βακτήρια, Chloroflexi, Deferribacteres, Chlorobi, Deinococcus-Thermus, Acidobacteria, Planctomycetes, Lentisphaerae, σπειροχαίτες, Synergistetes , Tenericutes, Verrucomicrobia και κυανοβακτήρια. Το πρώτο οκτώ φύλα δεν ήταν εμφανής σε δείγματα κοπράνων, και τα πρώτα τέσσερα φύλα δεν ήταν εμφανείς σε δείγματα μπατονέτα.

Η

Για να συγκριθεί η συνολική δομή μικροχλωρίδας σε ασθενείς με CRC, η μη σταθμισμένη μήτρα απόσταση Unifrac υπολογίστηκε με βάση την Otus κάθε δείγματος [26]. Τα αποτελέσματα του PCA με βάση την απόσταση παρουσίασαν μια σημαντική διαφορά σε βακτηριακά δομή στο εντερικό αυλό (δηλαδή, κόπρανα). Επιπλέον, καρκινικό ιστό, και προσκολλάται εις τον βλεννογόνο microbiota (δηλαδή, μάκτρο) επικαλύπτονται με κάποια αυλού και microbiota ιστού, όπως αποδεικνύεται από τις δύο πρώτες κύριες βαθμολογίες συστατικό, που αντιπροσώπευαν το 30,57% και 9,12% του συνόλου των παραλλαγών (Σχήμα 2Α).

Κάθε σύμβολο αντιπροσωπεύει ένα δείγμα. (Α) ομάδα γάτα, STP και SWP? (Β) ομάδα γάτα, pa2t και pa10t? (C) SWP ομάδα και SWC? (D) ομάδα STP και STC.

Η

Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στη σύνθεση των εντερικό αυλό και καρκινικούς ιστούς σε διάφορα επίπεδα βακτηρίων. Μια αναπαράσταση cladogram της δομής του ιστού και αυλού μικροχλωρίδα και εξέχων βακτήρια τους διεξήχθη με lefse φαίνεται στο Σχήμα 3 [27]? οι μεγαλύτερες διαφορές στα είδη μεταξύ των δύο κοινοτήτων που εμφανίζονται. δεδομένα Pyrosequencing έδειξαν ότι ένας μεγαλύτερος αριθμός φύλα ήταν παρόντες σε ιστό σε σύγκριση με αυλό. Οι τρεις κυρίαρχη φύλα-Firmicutes (50,82% έναντι 77,59%,

P

& lt? 0.001), Bacteroidetes (26,37% έναντι 13,68%,

P

= 0,002), και Πρωτεοβακτηρίων (14,51 % έναντι 5,57%,

P

= 0,004) -όλα παρουσίασαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ καρκινικού ιστού και εντερικό αυλό. Fusobacteria (4,97% έναντι 0,47%,

P

& lt? 0.001) και Synergistetes (0,14% έναντι 0%,

P

= 0,002) και διέφερε μεταξύ των ομάδων. Υπήρχαν 26 στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ καρκινικού ιστού και εντερικό αυλό σε επίπεδο οικογένειας. Η σχετική αφθονία των Bacteroidaceae (16,9% έναντι 8,3%,

P

& lt? 0.001), Streptococcaceae (10,2% έναντι 2,8%,

P

= 0.0029), Fusobacteriaceae (4,57% vs . 0,47%,

P

& lt? 0.001), Peptostreptococcaceae (4,07% έναντι 0,89%,

P

& lt? 0.001), Veillonellaceae (2,87% έναντι 0,68%,

P

= 0.004), και Pasteurellaceae (2,25% έναντι 0,007%,

P

& lt? 0.001) ήταν σημαντικά υψηλότερα σε καρκινικό ιστό σε σύγκριση με τον εντερικό αυλό. Υπήρχε ένα σημαντικά χαμηλότερο επίπεδο της Lachnospiraceae (17,1% έναντι 46,7%,

P

& lt? 0.001), Ruminococcaceae (4,24% έναντι 13,3%,

P

& lt? 0.001), και Lactobacillaceae (0,02% έναντι 2,88%,

P

& lt? 0.001). σε καρκινικό ιστό σε σύγκριση με τον εντερικό αυλό (Πίνακας S2)

(Α) Ταξινομική αναπαράσταση στατιστικά και βιολογικά σταθερές διαφορές μεταξύ καρκινικού ιστού και εντερικό αυλό. Οι διαφορές που αντιπροσωπεύεται από το χρώμα του πιο άφθονο κατηγορία (Κόκκινο υποδεικνύοντας καρκινικό ιστό, κίτρινο μη σημαντική και πράσινο εντερικό αυλό). Η διάμετρος της διαμέτρου του κάθε κύκλου είναι ανάλογη με την αφθονία της ταξινομικής ομάδας του. (Β) Ιστόγραμμα των βαθμολογιών LDA για διαφορικά άφθονη γένη. Cladogram ήταν υπολογίζονται lefse, μια προσέγγιση ανάλυσης μεταγονιδίωμα που εκτελεί τη γραμμική διακριτική ανάλυση μετά τη δοκιμή Wilcoxon Mann-Whitney για την αξιολόγηση του μεγέθους επίδραση του κάθε διαφορικά άφθονη ταξινομική βαθμίδα ή OTU? η cladogram εμφανίζεται σύμφωνα με το μέγεθος της επίδρασης.

Η

Η μικροβιακή σύνθεση ήταν επίσης σημαντικά διαφορετικό σε επίπεδο γένους, με 43 σημαντικά διαφορετικά γένη μεταξύ καρκινικό ιστό και τον εντερικό αυλό.

Bacteroides

,

Streptococcus

,

Prevotella

,

Fusobacterium

,

Peptostreptococcus

,

Haemophilus

,

Gemella

,

Veillonella

,

Granulicatella

,

Morganella

, και

Porphyromonas

, που αποτελούν πάνω από το 1% του συνόλου των βακτηρίων σε καρκινικούς ιστού, επέδειξε μία σχετικά υψηλότερη αφθονία σε καρκινικό ιστό.

Pseudobutyrivibrio

,

Blautia

,

Lactobacillus

,

Roseburia

,

Dorea

και

Coprococcus

, αποτελώντας το οποίο αποτελούν πάνω από 1% του συνόλου των βακτηριδίων στα κόπρανα, ήταν σχετικά πιο πλούσια σε εντερικό αυλό σε σύγκριση με καρκινικό ιστό σε. Πρόσθετες πληροφορίες σχετικά με τις διαφορές μεταξύ αυλού μικροχλωρίδα και καρκινικό ιστό μικροχλωρίδα μπορεί να βρεθεί στον Πίνακα S2.

Η βακτηριακή Κοινότητα σε καρκινικό ιστό και να συνδυαστούν noncancerous Κανονική ιστών

Παρά το γεγονός ότι παρατηρήθηκε χαμηλότερη ποικιλομορφία (Shannon) στην μικροχλωρίδας των καρκινικών ιστών (Πίνακας 2), οι μικροβιακές κοινότητες του όγκου και συμφωνημένα noncancerous φυσιολογικούς ιστούς ήταν παρόμοια (Σχήμα 1, Σχήμα S2). Σύμφωνα με την μη σταθμισμένη ανάλυση Unifrac PCA, οι μικροβιακές κοινότητες του καρκινικού ιστού και noncancerous ιστού είναι παρόμοια, σύμφωνα με PC1 και PC2 (51,37% και 4,35% εξήγησε διακύμανσης, αντίστοιχα) (Σχήμα 2Β), υποδεικνύοντας ότι δεν υπάρχουν σημαντικές διαφορές στη μικροβιακή σύνθεση του όγκου και noncancerous ιστού.

Μια σύγκριση ταξινόμηση που βασίζεται διεξήχθη για να προσδιοριστούν οι διαφορές μεταξύ της μικροχλωρίδας του όγκου και noncancerous ιστού. Υπήρχαν 12, 17, και 14 φύλα και 169, 198, και 198 γένη στα microbiotas της γάτας, pa2t, και pa10t, αντίστοιχα. Αυτό επιβεβαιώθηκε από τον Shannon ανάλυση (ποικιλομορφία). Δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των μικροβιακών κοινοτήτων των καρκινικών και μη καρκινικών ιστών σε επίπεδο συνομοταξία. Alphaproteobacteria, τα οποία αποτελούν λιγότερο από το 1% του συνόλου των βακτηριδίων και στα δύο pa2t και pa10t, ήταν πιο διαδεδομένη στις γάτες. Λιγότερες

Ochrobactrum

μέλη του γένους ήταν παρόντες σε pa2tcompared στη γάτα. Η τάξη βακίλους ήταν άκρως εμπλουτισμένο σε γάτες σε σύγκριση με pa10t. Ωστόσο, το γένος

Bacillus

, στην οποία ανήκουν βακίλους, ήταν λιγότερο διαδεδομένη στη γάτα. Η οικογένεια Ruminococcaceae ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε σύγκριση με τη γάτα pa10t. Γένος

Faecalibacterium

, συνδεδεμένες με Ruminococcaceae, ήταν επίσης ιδιαίτερα εμπλουτισμένη με pa10t σε σύγκριση με τη γάτα. Γένη

Paraprevotella

,

Parabacteroides, Phascolarctobacterium

,

Acidocella

, και

Methylobacterium

παρουσίασαν χαμηλή αφθονία? Ωστόσο, ήταν όλες στατιστικά εμπλουτισμένο σε pa10t σύγκριση με γάτα. Επιπλέον, η σχετική αφθονία των βακτηρίων στα δείγματα αυξάνεται ή μειώνεται σταδιακά σε συνάρτηση με την απόσταση από το καρκινικό ιστό (Πίνακας 3).

Η

Η μεταγονιδίωμα προσέγγιση ανάλυσης lefse εφαρμόστηκε για τον προσδιορισμό των βασικών phylotypes υπεύθυνο για τη διαφορά μεταξύ γάτας και pa10t. Βακίλους (κύριο συστατικό Lactobacillales), η οποία εμπλουτίστηκε με τη γάτα, και

Phascolarctobacterium

, Ruminococcaceae (κύριο συστατικό

Faecalibacterium

), τα οποία εμπλουτίστηκαν με pa10t ήταν τα κυρίαρχα phylotypes που συμβάλλουν στη διαφορά μεταξύ η μικροχλωρίδα του καρκινικού ιστού και noncancerous ιστού.

προσκολλάται εις τον βλεννογόνο μικροχλωρίδας στο CRC ασθενείς και υγιή άτομα

Επειδή η μικροβιακή σύνθεση μπορεί να αλλάξει από εντέρου καθαρισμού πριν από τη χειρουργική επέμβαση, βλεννογόνο προσκολλημένα βακτήρια μελετήθηκε σε δείγματα που συλλέχθηκαν σε πρωκτικά επιχρίσματα. Όπως ήταν αναμενόμενο, η μικροβιακή δομή ήταν κάπως διαφορετική σε σύγκριση με ιστό (Σχήμα 1, Σχήμα 2Α) και ήταν παρόμοια με εντερικό αυλό (μερικά δείγματα επικαλύπτονται σε αγροτεμάχια PCA) λόγω των αναπόφευκτων περιττώματα επί των δειγμάτων μάκτρο.

αστάθμιστος Unifrac PCA με βάση την σχετική αφθονία Otus για κάθε δείγμα επέδειξε διαχωρισμό μεταξύ ασθενών CRC και υγιών ατόμων χρησιμοποιώντας PC1 και PC2 (10,64% και 6,58% των εξηγείται διακύμανσης, αντιστοίχως) (Σχήμα 2C). Οι οικογένειες Porphyromonadaceae (3,86% έναντι 1,41%,

P

= 0,045), Fusobacteriaceae (3,72% έναντι 0,18%,

P

= 0,045), και Peptostreptococcaceae (2,13% έναντι 0,66 %,

P

= 0,03) εμπλουτίστηκαν σε ασθενείς CRC, αλλά Bifidobacteriaceae (0,03% έναντι 0,32%,

P

& lt? 0.001) και Alcaligenaceae (0,39% έναντι 0,63%,

P

= 0.03) ήταν μειωμένη σε ασθενείς με CRC. Γένη

Fusobacterium

(Fusobacteriaceae),

Porphyromonas

(Porphyromonadaceae),

Peptostreptococcus

(Peptostreptococcaceae),

Gemella

,

Mogibacterium,

και

Klebsiella

εμπλουτίστηκαν σε ασθενείς CRC.

Filifactor

,

Catonella

και

Selenomonas

απουσίαζαν από υγιή άτομα.

Faecalibacterium

,

Blautia

,

Lachnospira

,

Bifidobacterium

(Bifidobacteriaceae) και

Anaerostipes

μειώθηκαν σε ασθενείς με CRC, και

Catenibacterium

και

Gardnerella

(Bifidobacteriaceae) απουσίαζαν από τα δείγματα CRC ασθενή (Σχήμα 4).

(Α) γενών διαφορετικές μεταξύ SWP και SWC. (Β) γενών διαφέρουν μεταξύ STP και STC. Η δοκιμή Mann-Whitney χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η σημασία των συγκρίσεων μεταξύ υποδεικνύεται ομάδων. * P & lt? 0.05, ** P & lt?. 0.01

Η

Porphyromonas

(συνδεδεμένες με Porphyromonadaceae),

Fusobacterium

,

Peptostreptococcus,

και

Mogibacterium

εμπλουτίστηκαν σε ασθενείς CRC, ενώ

Faecalibacterium

,

Blautia

, και

Bifidobacterium

είχαν εξαντληθεί σε αυτούς τους ασθενείς. Σύμφωνα με την ανάλυση lefse, αυτά είναι τα βασικά phylotypes που συμβάλλουν στη διαρθρωτική διαχωρισμό του βλεννογόνου που προσκολλάται μικροχλωρίδας σε ασθενείς CRC και υγιή άτομα.

μικροβιακή σύνθεση της εντερικό αυλό στο CRC ασθενείς και υγιή άτομα

Το εντερικό αυλό μικροχλωρίδα των ασθενών CRC θα μπορούσε να διαφοροποιηθεί από υγιή άτομα, σύμφωνα με μη σταθμισμένη ανάλυση Unifrac PCA (Σχήμα 2D). Οι οικογένειες Erysipelotrichaceae (6,09% έναντι 2,42%,

P

= 0.035), Prevotellaceae (1,46% έναντι 1,14%,

P

= 0.035), Coriobacteriaceae (1,19% έναντι 0,74% ,

P

= 0.035), και Peptostreptococcaceae (0,89% έναντι 0,45%,

P

= 0.035) ήταν σημαντικά εμπλουτισμένη σε ασθενείς με CRC. Peptostreptococcaceae επίσης εμπλουτισμένη με επιχρίσματα των ασθενών CRC, ενώ η σχετική αφθονία ήταν υψηλότερο σε σύγκριση με καρκινικούς ιστούς. Γένη

Peptostreptococcus

(Peptostreptococcaceae),

Porphyromonas

,

Mogibacterium

,

Anaerococcus

,

Slackia

,

Anaerotruncus

,

Collinsella

(Coriobacteriaceae),

Desulfovibrio

,

Eubacterium

και

Paraprevotella

ήταν επίσης πιο διαδεδομένη στους ασθενείς σε σύγκριση με τους μάρτυρες (Εικόνα 4Β).

Erysipelotrichaceae, Prevotellaceae, Coriobacteriaceae (

Collinsella

),

Peptostreptococcus

, και

Anaerotruncus

(Clostridiales), τα οποία εμπλουτίστηκαν σε ασθενείς ταξινομήθηκαν ως η κλειδί phylotypes που συμβάλλουν στο διαχωρισμό της εντερικής μικροχλωρίδας δομής αυλού σε ασθενείς με CRC και υγιή άτομα.

Αναγνώριση των βασικών Otus Υπεύθυνος για τα διαρθρωτικά διαχωρισμός του βλεννογόνου που σχετίζεται με μικροχλωρίδα του Καρκίνου και Ελέγχου δείγματα

Sears και Pardoll πρότεινε μια υπόθεση Άλφα-Bug σε μια πρόσφατη έκθεση, ορισμένα μέλη microbiome που διαθέτουν μοναδικά χαρακτηριστικά της τοξικότητας, όπως εντεροτοξιγόνα

Bacteroides fragilis

, δεν είναι μόνο άμεσα pro-ογκογόνο, αλλά είναι σε θέση να την αναδιαμόρφωση της microbiome ως μια ολόκληρη, προάγοντας έτσι βλεννογόνου ανοσολογικές αποκρίσεις και του παχέος αλλαγές των επιθηλιακών κυττάρων και οδηγεί σε καρκίνο του παχέος εντέρου [28]. Υποθέσαμε ότι αυτό το Άλφα-Bug ανήκει πιθανώς στο βλεννογόνο που σχετίζεται με τα βακτήρια κοινότητα. Πρώτον, lefse, μια αυστηρή εργαλείο, χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό κυρίαρχη Otus. Βρήκαμε έξι κυρίαρχη Otus, που ήταν όλοι μειωθεί σε καρκινικό ιστό και αυτά τα βασικά συντελεστές ανήκουν σε

Faecalibacterium

,

Dorea

,

αμόρφωτος Ruminococcus

sp.,

Ruminococcus gnavus

, Lachnospiracea και Peptostreptococcaceae. Δημιουργήσαμε ένα μοντέλο PLS-DA δημιουργήθηκε για να βρείτε περισσότερες Otus που ενδεχομένως συμβάλλουν στο διαχωρισμό. Otus που διαφορικά διανεμήθηκαν επιλέχθηκαν σύμφωνα με μεταβλητή σημασία τους στην προεξοχή (VIP). Ένα σύνολο των 27 Otus με VIP & gt? 2 ταυτοποιήθηκαν ως σχετικά σημαντικό συνεισφέροντες (τέσσερα από αυτά εμπλουτίστηκαν σε γάτα? Οι άλλοι μειώθηκαν). Αυτά ήταν τα μέλη της Lachnospiracea (14), Bacteroidaceae (6), Ruminococcaceae (6), και Peptostreptococcaceae (1)? όλα εμφάνισαν σημαντικές διαφορές μεταξύ γάτας και pa10t (

P

& lt? 0,05, δοκιμή Mann-Whitney). Δύο επιπλέον Otus στενά συνδεδεμένη με

Ruminococcus gnavus

και 4 Otus που ανήκουν στο γένος

Faecalibacterium

βρέθηκαν επίσης να μειωθεί σε καρκινικούς ιστούς.

Επιπλέον, η ανάλυση αυτή έγινε χρησιμοποιώντας προσκολλάται εις τον βλεννογόνο βακτηριακά δείγματα. Δύο κυρίαρχη Otus για κάθε ένα από τα

Peptostreptococcus

sp. και

Parvimonas

sp. εμπλουτίστηκαν πάνω από 100 φορές σε ασθενείς CRC. Ένα OTU που σχετίζονται με

Bacteroides caccae

και ένα σχετικά με

Clostridium

sp. Επίσης εμπλουτίζεται. Δύο Otus που ανήκουν σε

Faecalibacterium

και

Blautia

ήταν σημαντικά μειωμένη σε ασθενείς. Έχουμε επιλέξει 69 Otus με VIP & gt? 2 που ήταν σημαντικοί παράγοντες, σύμφωνα με PLS-DA, και 64 από αυτούς ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των ασθενών CRC και τους ελέγχους. Μεταξύ αυτών, έξι Otus που ανήκουν στο γένος

Faecalibacterium

και έξι Otus που ανήκουν στο γένος

Blautia

μειώθηκαν σε ασθενείς με CRC. Επιπλέον, δύο Otus που σχετίζονται με

Fusobacterium varium

, ένα OTU που σχετίζονται με

Bacteroides xylanisolvens

, και ένα OTU που σχετίζονται με

Dialister pneumosintes

ήταν πολύ εμπλουτισμένο σε ασθενείς με CRC. Δύο επιπλέον Otus που σχετίζονται με

Peptostreptococcus sp.

Και

Parvimonas sp.

Εμπλουτίστηκαν σε ασθενείς με CRC.

Συζήτηση

Πιθανολογείται ότι το mucosa- συνδέονται μικροχλωρίδα δρα κυρίως μέσω άμεσης αλληλεπίδρασης με τον ξενιστή και ότι εντερικό αυλό μικροχλωρίδα δρα κυρίως μέσω cometabolism ή μεταβολική ανταλλαγή με τον ξενιστή. Χρησιμοποιήσαμε γραμμοκώδικα πολυπλεγμένο-454 Pyrosequencing να συγκρίνει την βακτηριακή σύνθεση του καρκινικού ιστού και εντερικό αυλό των ασθενών με CRC με εκείνα των υγιών μαρτύρων. Ερευνήσαμε επίσης το βλεννογόνο που προσκολλάται μικροβιακή σύνθεση με τη χρήση του ορθού επιχρίσματα, επειδή η βακτηριακή κοινότητα δυνητικά μεταβάλλεται ακολουθώντας τον καθαρισμό του εντέρου. Βρήκαμε ότι η δομή των μικροχλωρίδας σε καρκινικό ιστό διαφέρει σημαντικά διαφέρει από εκείνη των εντερικό αυλό. Η σχετική αφθονία των κυρίαρχων φύλα Firmicutes, Bacteroidetes και Πρωτεοβακτηρίων και κυρίαρχο γένη

Bacteroides

,

Streptococcus

, και

Pseudobutyrivibrio

ήταν όλα διαφορετικά. Firmicutes, η οποία έχει αποδειχθεί ότι αυξάνουν την ενέργεια συγκομιδή από τη διατροφή, ήταν ιδιαίτερα εμπλουτισμένο σε εντερικό αυλό [29], [30], [31]. Επιπλέον, το κυρίαρχο γένος

Pseudobutyrivibrio

εκτίθενται βουτυρικού ως κύριο μεταβολίτη, όπως επίσης και γαλακτικό οξύ και μυρμηκικό οξύ [32]. Σε αντίθεση, Bacteroidetes, που είναι εξαιρετικά εμπλουτισμένο σε βλεννογόνο, μπορεί να εμπλέκονται κατά κύριο λόγο σε αλληλεπιδράσεις με το έντερο [33]. Τα υψηλά εμπλουτισμένα μεγάλα Gram-αρνητικά βακτήρια Πρωτεοβακτηρίων σε βλεννογόνο, με μία εξωτερική μεμβράνη που αποτελείται από λιποπολυσακχαρίτες, ενδεχομένως παρουσιάζει άμεση αλληλεπίδραση με εντερικά κύτταρα μέσω βακτηριακά συστήματα έκκρισης όπως T2SS ή T3SS [34], [35]. Επιπλέον, εμπλουτίζεται Fusobacteria και Synergistetes στο βλεννογόνο μολύνει επίσης εντερικό ιστό [36], [37], [38]. Όπως ήταν αναμενόμενο, τα ευρήματά μας έδειξαν ότι η δομή του προσκολλάται εις τον βλεννογόνο μικροχλωρίδας ήταν περισσότερο παρόμοια με μικροχλωρίδας ιστό. Βλεννογόνο προσκολλημένα μικροβιακά δομές εκτίθενται επίσης ομοιότητες με αυλό μικροχλωρίδας? Αυτό οφείλεται εν μέρει στην αναπόφευκτη περιττώματα crossover τα μάκτρα. Εμείς ως αίτημα ότι η μικροχλωρίδα μάκτρο αντιπροσωπεύει ένα συνδυασμό των κοπράνων μικροχλωρίδας και πληθυσμό βλεννογόνο λιγότερο στενά συνδεδεμένα, ενώ η μικροχλωρίδα του ιστού αντιπροσωπεύει στενά αποίκισαν τα βακτήρια. Μη σταθμισμένη ανάλυση Unifrac PCA επιβεβαίωσε αυτό το αποτέλεσμα. Συνολικά μικροβιακή δομές ήταν παρόμοια μεταξύ καρκινικού ιστού και noncancerous ιστού.