Αφηρημένο

Η παρουσία καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με (ΚΕΠ) είναι ένα από τα οι υπεύθυνοι για χημειοαντίσταση που έχει αποτελέσει σημαντικό εμπόδιο προς αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα θεραπεία (LAD) μηχανισμούς. Πρόσφατα, έχουμε εντοπίσει microRNA (MIR) -200b ως βασικός ρυθμιστής της χημειοαντίσταση σε ανθρώπινα docetaxel-ανθεκτικά κύτταρα LAD. Ωστόσο, αν miR-200b έχει επιπτώσεις στη ρύθμιση των ΚΕΠ παραμένει σε μεγάλο βαθμό ασαφής και πρέπει να διευκρινιστεί περαιτέρω. Εδώ, δείξαμε ότι το miR-200b ήταν σημαντικά προς τα κάτω σε CD133

+ /CD326

+ κύτταρα που παρουσίασαν ιδιότητες των ΚΕΠ που προέρχονται από κύτταρα LAD docetaxel ανθεκτικά. Επίσης, αποκατάσταση των miR-200b θα μπορούσε να αναστείλει τη συντήρηση και την αντίστροφη χημειοαντίσταση των ΚΕΠ. Επιπλέον, καταστολέα της Zeste-12 (Suz-12) αναγνωρίστηκε ως άμεσο και λειτουργικό στόχο του miR-200b, και αποσιώπηση της Suz-12 phenocopied τα αποτελέσματα των miR-200b σε ΚΕΠ. Επιπλέον, η υπερέκφραση της ιστόνης δεακετυλάσης (HDAC) 1 ταυτοποιήθηκε ως κεντρικό μηχανισμό που ευθύνεται για miR-200b καταστολή σε ΚΕΠ μέσω μιας πρωτεΐνης ειδικότητα (Sp) 1-εξαρτώμενο μηχανισμό και την αποκατάσταση των miR-200b από HDAC1 καταστολή κατέστειλε σημαντικά το σχηματισμό ΚΕΠ και αντιστραφεί χημειοαντίσταση των ΚΕΠ με τη ρύθμιση της σηματοδότησης Suz-12-E-cadherin. Επίσης, αρνητική ρύθμιση της HDAC1 ή ρύθμιση προς τα άνω του miR-200b μείωσε το

in vivo

ογκογονικότητα των ΚΕΠ. Τέλος, Suz-12 ήταν αντιστρόφως συσχετίζεται με miR-200b, συσχετίζεται θετικά με HDAC1 και πάνω ρυθμισμένα σε docetaxel ανθεκτικά ιστούς LAD σε σύγκριση με docetaxel-ευαίσθητους ιστούς. Στο σύνολό τους, η HDAC1 /miR-200b /σηματοδότηση Suz-12-E-cadherin μπορεί να ευθύνεται για τη συντήρηση των ΚΕΠ και το σχηματισμό των χημειοθεραπεία φαινοτύπου στα κύτταρα LAD docetaxel ανθεκτικά

Παράθεση:. Chen DQ, Huang JY, Feng B, Pan BZ, De W, Wang R, et al. (2014) δεακετυλάσης ιστόνης 1 /Sp1 /microRNA-200b Σηματοδοσίας Λογαριασμών για τη συντήρηση των καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν σε ανθρώπινο πνεύμονα αδενοκαρκίνωμα. PLoS ONE 9 (10): e109578. doi: 10.1371 /journal.pone.0109578

Επιμέλεια: Jin Ερ Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17 Ιουν 2014? Δεκτές: 1 του Σεπτεμβρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 3η Οκτωβρίου 2014

Copyright: © 2014 Chen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Το ερευνητικό έργο χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (https://www.nsfc.gov.cn/) (LBC Όχι . 81272474, BF Νο 81301914). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του πνεύμονα λογαριασμούς για τις πιο σχετίζονται με τον καρκίνο θνησιμότητα σε άνδρες και γυναίκες σε όλο τον κόσμο [1]. Η χημειοθεραπεία είναι ένα σημαντικό συστατικό των θεραπειών πρώτης γραμμής για αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα (LAD) που αποτελεί την πιο κοινή ιστολογική μορφή καρκίνου του πνεύμονα. Ωστόσο, χημειοαντίσταση αντιπροσωπεύει ένα κυρίαρχο εμπόδιο προς χημειοθεραπευτική αγωγή LAD, η οποία οδηγεί σε κακή πρόγνωση των ασθενών. Έτσι, τη διερεύνηση των πιθανών μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην χημειοαντίσταση έχει γίνει ένα βασικό ζήτημα στην κλινική θεραπεία της ανθρώπινης LAD.

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με (ΚΕΠ) ή όγκου έναρξη βλαστικά κύτταρα είναι ένας υπο-πληθυσμός των κυττάρων του όγκου και παίζουν καθοριστικό ρόλο στην έναρξη του καρκίνου, την εξέλιξη, υποτροπής και χημειοαντίσταση [2] – [5]. ΚΕΠ, που προέρχεται από δύο ΚΕΠ και μη-ΚΕΠ, προκαλούν όγκους μέσω της αυτο-ανανέωση και είναι σε θέση να διαφοροποιηθούν σε πολλούς τύπους κυττάρων [6] – [9]. Πολλές θεραπείες καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου χημειοθεραπείες που σκοτώνουν το μεγαλύτερο μέρος των καρκινικών κυττάρων, μπορεί τελικά να αποτύχει επειδή δεν εξαλείφουν ΚΕΠ που στη συνέχεια να προκαλέσει υποτροπή των όγκων [10]. Πρόσφατα, έχει εδραιωθεί ότι ΚΕΠ συνδέονται με επιθηλιακά μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ), μετάσταση, αντοχή φαρμάκου, η πρόοδος και η υποτροπή του καρκίνου του πνεύμονα [11] – [15]. Ως αποτέλεσμα, εκμετάλλευση των ειδικών θεραπειών που στοχεύουν στο ΚΕΠ ήταν ένα κρίσιμο ζήτημα σε χημειοθεραπευτική αγωγή του καρκίνου του πνεύμονα. Τα microRNAs (miRNAs) γονίδιο σιωπή έκφραση με σύνδεση προς το 3 ‘αμετάφραστη περιοχή των γονιδίων στόχων και έχουν αναφερθεί για τη ρύθμιση των ΚΕΠ αυτο-ανανέωση, ογκογονικότητα, μετάσταση, και χημειοαντίσταση σε πολλούς ανθρώπινους καρκίνους [2], [7], [ ,,,0],16]. Για παράδειγμα, miR-34a καταστολή προκαλεί ΚΕΠ του παχέος εντέρου για να εκτελέσει ασύμμετρη κυτταρική διαίρεση και προωθεί θυγατρικά κύτταρα να παραμείνουν ΚΕΠ του παχέος εντέρου με τη ρύθμιση της σηματοδότησης Notch. Ρυθμίζεται προς τα πάνω miR-143 στο ΚΕΠ διαφοροποίηση προωθεί προστάτη καρκινικά κύτταρα μετάσταση διαμορφώνοντας την έκφραση FNDC3B. MiR-21 ρυθμίζει EMT φαινότυπο και υποξία-επαγόμενη έκφραση παράγοντα-1α σε τρίτη σφαίρα που σχηματίζουν τα κύτταρα του καρκίνου του μαστού βλαστικά κύτταρα-όπως. MiR-200b, ένα σημαντικό μέλος της miR-200 οικογένειες, βρίσκεται στο miR-200b σύμπλεγμα /c /429 γονιδίου, δρα ως καταστολέας όγκων σε μία ποικιλία ανθρώπινων συμπαγών όγκων και έχει την ικανότητα αναστολής της ανάπτυξης ΚΕΠ και αντιστροφή της EMT φαινότυπος των ΚΕΠ [17], [18]. Πρόσφατα, έχουμε εντοπίσει miR-200b ως βασικό ρυθμιστή της χημειοαντίσταση και αποκατάσταση του miR-200b αντιστρέφει σημαντικά χημειοαντίσταση της docetaxel (DTX) ανθεκτικών κυττάρων LAD επάγοντας αναστολή του κυτταρικού κύκλου και την ενίσχυση της απόπτωσης [19]. Ωστόσο, αν miR-200b ρυθμίζει ΚΕΠ που προέρχονται από κύτταρα LAD docetaxel ανθεκτικά είναι ακόμη πλήρως κατανοητό και πρέπει να διευκρινιστεί περαιτέρω.

Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε πρώτα ότι το miR-200b λειτουργεί ως καταστολέας των όγκων τόσο

in vitro

και

vivo

στο ΚΕΠ που προέρχεται από ανθρώπινο docetaxel-ανθεκτικά κύτταρα LAD. Επίσης, έχουμε εντοπίσει HDAC1 ως ειδικό ρυθμιστή που εμπλέκονται στην αποσιώπηση του miR-200b μέσω Sp1-εξαρτώμενο μηχανισμό και την αποκατάσταση των miR-200b μεσολάβηση HDAC1 καταστολής καταστέλλει σημαντικά τη συντήρηση των ΚΕΠ και αντιστρέφει χημειοαντίσταση των ΚΕΠ με τη ρύθμιση Suz-12-E -cadherin σηματοδότησης. Για το καλύτερο της γνώσης μας, δεν έχουν υπάρξει αναφορές σχετικά με τις ρυθμιστικές δίκτυο HDAC1 /miR-200b /Suz-12 /E-cadherin στη ρύθμιση ΚΕΠ συντήρηση και χημειοαντίσταση στα ανθρώπινα κύτταρα LAD και την τρέχουσα εργασία θα παράσχει μια νέα στρατηγική για την αντιστροφή χημειοαντίσταση της ανθρώπινης LAD

Υλικά και Μέθοδοι

ηθική δήλωση

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας στην έρευνα της Jinling Νοσοκομείο του Πανεπιστημίου Nanjing (Αριθμός άδειας: 12-027). και εκτελέστηκε σύμφωνα με τη δήλωση του Ελσίνκι. Όλα τα ζώα στεγάστηκαν υπό ειδικές συνθήκες ελεύθερες παθογόνων. Όλες οι πειραματικές διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με το Jinling Νοσοκομείο της Nanjing University Guide για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου.

μικροσφαιρίδια διαλογή

Εν συντομία, 3.0 × 10

7 μονά κύτταρα διέρχεται μέσω 30 μm νάιλον mesh και φυγοκεντρήθηκαν στα 300 χ g για 10 λεπτά. Το υπερκείμενο στη συνέχεια αναρροφάται. Στη συνέχεια, 300 μΙ ρυθμιστικού και 100 μΙ αντιδραστηρίου FcR προστέθηκαν και αναμίχθηκαν. 100 μΙ CD326 Μικροσφαιρίδια προστέθηκαν, αναμίχθηκαν καλά και επωάστηκαν για 30 λεπτά στο ψυγείο (2-8 ° C). Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με προσθήκη 2 mL ρυθμιστικού και φυγοκεντρήθηκε στα 300 χ g για 10 λεπτά. Το υπερκείμενο στη συνέχεια αναρροφάται. Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν με 500 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος. Στη συνέχεια, το αιώρημα κυττάρων εφαρμόστηκε πάνω στη στήλη διαχωρισμού τοποθετείται στο μαγνητικό πεδίο. Η διερχόμενη ροή που περιέχει μη επισημασμένα κύτταρα συλλέχθηκαν. Στη συνέχεια, η στήλη πλύθηκε και απομακρύνεται από το διαχωριστή και τοποθετείται σε ένα κατάλληλο σωλήνα συλλογής. Στη συνέχεια, η κατάλληλη ποσότητα ρυθμιστικού διαλύματος με πιπέτα επί της στήλης και η ροή διαμέσου κύτταρα που περιέχουν CD326 συλλέχθηκε. Επιτέλους, ο κατάλληλος αριθμός των CD326

+ κύτταρα στη συνέχεια κατατάσσονται σύμφωνα με CD133 Μικροσφαιρίδια για τον εμπλουτισμό του CD133

+ /CD326

+ κύτταρα όπως περιγράφεται παραπάνω. Το CD133

+ /CD326

+ ΚΕΠ στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν σε μέσο ΚΕΠ-καλλιέργεια χωρίς ορό: Modified Eagle Medium του Dulbecco (ϋΜΕΜ) /F12 που περιέχει 0.4% BSA, 2% Β27, 4 mg /ml ινσουλίνη και 40 ng /ml EGF.

κύτταρα και συνθήκες καλλιέργειας

το ανθρώπινο LAD κυτταρικές σειρές (SPC-Α1 και Η1299) αγοράστηκαν από τον όγκο των κυττάρων Τράπεζα της κινεζικής Ακαδημίας Ιατρικών Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα). Τα κύτταρα LAD docetaxel ανθεκτικά παρασκευάσθηκαν όπως περιγράφεται στο προηγούμενο έργο μας και διατηρημένα σε 50.0μg /L docetaxel [19]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφεται στην προηγούμενη εργασία μας [20]. Το CD133

+ /CD326

+ κύτταρα ταξινομήθηκαν από τους docetaxel ανθεκτικά LAD κύτταρα με CD133 και μικροσφαιρίδια CD326 (Miltenyi Biotec) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Τα δείγματα ασθενών

Η παρούσα εργασία εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ηθικής του νοσοκομείου μας και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς. LAD ιστοί συγκεντρώθηκαν από τους ασθενείς με LAD σε προχωρημένο στάδιο στο νοσοκομείο μας από το Σεπτέμβριο του 2006 έως το Δεκέμβριο του 2008. Οι ασθενείς πληρούνται όλα τα παρακάτω κριτήρια: ιστολογική διάγνωση του πρωτοπαθούς LAD με τουλάχιστον μία μετρήσιμη βλάβη? κλινικό στάδιο IIIB-IV? χημειοθεραπεία πρώτης γραμμής είτε με docetaxel 75 mg /m

2 και σισπλατίνης 100 mg /m

2 ή docetaxel 75 mg /m

2 και καρβοπλατίνη περιοχή κάτω από την καμπύλη 6 mg /mL /min χορηγείται κάθε 3 εβδομάδες για ένα μέγιστο 5 κύκλων. δείγματα ιστού στη συνέχεια χωρίζονται σε «ευαίσθητες» (πλήρης ή μερική ανταπόκριση) και «αδρανείς» (σταθερή ή προοδευτική νόσο) ομάδες βασίζοντας τις απαντήσεις του ασθενούς αξιολογείται με ανάλυση ιατρικών εικόνων και την ανίχνευση των καρκινικών δεικτών στον ορό μετά από 4 ή 5 κύκλους docetaxel- με βάση τη χημειοθεραπεία.

πλασμίδια και επιμολύνσεις κυττάρων

Πρόσφατες μελέτες έχουν αναφέρει ότι miR-200b έχει δύο λειτουργικές προαγωγούς, που βρίσκεται ~ 4 kb και ~ 2 kb ανοδικά του 5′-stemloop, αντίστοιχα [ ,,,0],21]. Στη συνέχεια, οι δύο βασικές περιοχές, που βρίσκονται CHR1: 1087797000000000-1.088.137000000000 δισεκατομμύρια (341 bp) και CHR1: 1.089.316 με 1.090.354 (1039 bp), αντιστοίχως (UCSC Genome Browser, Μάρτιος 2006) ενισχύθηκαν με PCR και κλωνοποιήθηκε σε pGL3-βασικό φορέα (Promega ) με ΚρηΙ και HindIII θέσεις, που ονομάζεται (pGL3) προαγωγό-1 και προαγωγό-2. Επιπλέον, πολλαπλές θέσεις σύνδεσης Sp1 παρατηρήθηκαν στις δύο βασικές περιοχές. Και, οι θέσεις Sp1 δεσμευτική βρίσκεται CHR1: 1.087.926 έως 1.087.932, CHR1: 1.088.073 με 1.088.079 και CHR1: 1089779000000-1.089.785000000 εκατομμύρια, αντίστοιχα. Στη συνέχεια, τα μεταλλαγμένα διανύσματα ρεπόρτερ Sp1 δέσμευσης-τοποκατευθυνόμενη δομήθηκαν με μετάλλαξη PCR. Λουσιφεράσης ανταποκριτής που περιέχει άγριου τύπου 3′-UTR του Suz-12 (pLuc /Suz-12 /3′-UTR-wt) στα οποία εισήχθησαν εντός του τα νουκλεοτίδια του Suz-12-3′-UTR συμπληρωματική προς miR-200b pLuc φορέα, και δημιουργήσαμε επίσης ένα μεταλλαγμένο ανταποκριτή (pLuc /Suz-12 /3′-UTR-mut), στην οποία μεταλλάχθηκαν τα πρώτα έξι νουκλεοτίδια στο ΜΙΚ-200b περιοχή σπόρος συμπληρωματικές θέσεις. Όλες οι αλληλουχίες εναρκτήρα που απαριθμούνται στον Πίνακα S1. MiR-200b πλασμίδιο έκφρασης (pcDNA /miR-200b), η μακέτα pcDNA-αρνητικού ελέγχου (ροϋΝΑ /miR-NC), miR-200b αναστολέα (Anti-miR-200b) και μη ειδική έλεγχο miRNA (Anti-miR-NC) ήταν που χρησιμοποιείται ως μας που περιγράφηκε προηγουμένως [18]. HDAC1-shRNA (ή control-shRNA), Sp1-shRNA (ή control-shRNA) φορείς ελήφθησαν από GenePharma. Suz-12 πλασμίδιο έκφρασης (pcDNA /Suz-12) δομήθηκε με υποκλωνοποίηση Suz-12 στον φορέα pcDNA 3.0 (Invitrogen) με PCR με τους εκκινητές που παρατίθενται στον Πίνακα S2. Όλοι οι φορείς που επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση DNA. Τα κύτταρα επιμολυσμένα με Lipofectamine 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της CD133

+ /CD326

+ κύτταρα

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της CD133

+ /CD326

+ κυττάρων πραγματοποιήθηκε με CD133-ΡΕ και αντισώματα CD326-FITC (Miltenyi Biotec) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, περίπου 1,0 × 10

6 κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν στα 300 χ g για 10 λεπτά. Το υπερκείμενο στη συνέχεια απορρίπτεται. Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν με 80 μL ρυθμιστικού διαλύματος. 20 μι του FcR Blocking Reagent Στη συνέχεια προστέθηκε στο ρυθμιστικό διάλυμα. 10 μι του αντισώματος CD133 /CD326 προστέθηκαν, αναμίχθηκαν καλά και επωάστηκαν για 10 λεπτά στο σκοτάδι στο ψυγείο (2-8 ° C). Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν με την προσθήκη 1-2 ml ρυθμιστικού διαλύματος και φυγοκέντρηση σε 300 χ g για 10 λεπτά. Το υπερκείμενο στη συνέχεια αναρροφάται. Τέλος, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 400 μΐ ρυθμιστικού για ανάλυση με κυτταρομετρία ροής.

Mammosphere δοκιμασία σχηματισμού

δοκιμασία σχηματισμού Mammosphere διεξήχθη για να αξιολογηθεί η ικανότητα του CSC αυτο-ανανέωση. δοκιμασία σχηματισμού Mammosphere διεξήχθη με επίστρωση εναιωρήματα μονού κυττάρου (1000 κύτταρα /φρεάτιο) σε πλάκες προσκολλημένα εξαιρετικά χαμηλού 6 φρεατίων. Στη συνέχεια, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο καλλιέργειας ΚΕΠ-ελεύθερο ορού και συμπληρώθηκαν με το μέσο κάθε 3 ημέρες. Μετά από 7 ημέρες επώασης, οι πλάκες αναλύθηκαν για μέτρηση των αριθμών mammosphere.

Western blotting

δοκιμασία

Τα πρωτογενή αντισώματα έναντι Ε-καδερίνης, Sox-2 και Oct-4 (Abcam, HongKong ), Bmi-1, HDAC1, Suz-12 (Cell Signaling Technologies) και GAPDH (Santa Cruz Biotechnology) χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Σύνολο λύμα πρωτεΐνη διαχωρίστηκε με 10% δωδεκυλικού νατρίου ηλεκτροφόρηση πηκτής θειικού-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE). Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια μεταφέρθηκαν πάνω σε φθοριούχο πολυβινυλιδένιο (PVDF) μεμβράνες (Millipore). Στη συνέχεια, ανοσοκηλίδωση διεξήχθη και οπτικοποιήθηκε με ένα κιτ χημειοφωταύγειας (Thermo Scientific).

πραγματικού χρόνου ποσοτική αλυσίδα πολυμεράσης ανάστροφης μεταγραφής αντίδραση (qRT-PCR)

Ολικό RNA εξήχθη με ΤΚΙζοΙ αντιδραστήριο (Takara). Αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε με κιτ αντιδραστηρίων PrimeScript RT (Takara) βασίζοντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. qRT-PCR πραγματοποιήθηκε με SYBR PrimeScript RT-PCR κιτ (Takara) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα επίπεδα miR-200b ή mRNA υπολογίστηκαν με το 2

– △△ μέθοδος Ct χρησιμοποιώντας U6 rRNA ή GAPDH mRNA όπως τα γονίδια αναφοράς. Τα επίπεδα έκφρασης μετρήθηκαν σε σχέση με την πολλαπλή μεταβολή των κυττάρων ελέγχου που ορίστηκε ως 1.0. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν. Όλα τα ζεύγη εκκινητών που καταγράφονται στον Πίνακα S3.

ευαισθησία φαρμάκου και η βιωσιμότητα των κυττάρων δοκιμασία

ευαισθησία φαρμάκου και κυτταρική ανάλυση βιωσιμότητας μετρήθηκε με 8-κιτ δοκιμασίας κυττάρων Μετρώντας (CCK-8) ( Dojindo) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για τη δοκιμασία της ευαισθησίας Drug, 3 × 10

3 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Μετά την προσκόλληση, πρόσφατα παρασκευασμένο docetaxel στη συνέχεια προστέθηκε σε διαφορετικές τελική συγκέντρωση. 48 ώρες αργότερα, 10 μί του CCK-8 προστέθηκε και επωάστηκε για 4 ώρες στους 37 ° C. Η απορρόφηση μετρήθηκε κατόπιν σε 450 nm. Για τη δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας, 2.0 × 10

3 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων 24 ώρες μετά τη διαμόλυνση με τους υποδεικνυόμενους φορείς. 12, 24 ή 48 ώρες αργότερα, 10 μί του CCK-8 προστέθηκε και επωάστηκε για 4 ώρες στους 37 ° C. Η απορρόφηση μετρήθηκε κατόπιν σε 450 nm. Όλα πείραμα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

λουσιφεράσης ανταποκριτής

δοκιμασία

Περίπου 2,0 × 10

3 /φρεάτιο ΚΕΠ σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και στη συνέχεια συνεπιμολύνθηκαν με οι ειδικές λουσιφεράσης πλασμίδια αναφοράς, miR-NC ή miR-200b. Renila-TK πλασμίδιο (Promega) συνδιαμολύνθηκαν σε όλα τα δείγματα. 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, λουσιφεράση δραστηριότητες μετρήθηκαν με κιτ Dual-Luciferase Reporter Assay (Promega). Οι δραστικότητες της λουσιφεράσης κανονικοποιήθηκαν με δραστηριότητες λουσιφεράσης Renilla. Τα δεδομένα ήταν σε σχέση με την πολλαπλή μεταβολή των αντιστοίχων ομάδων ελέγχου που ορίστηκε ως 1.0. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

συνανοσοκαθίζησης δοκιμασία

Η δοκιμασία συν-ανοσοκαταβύθιση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ συνανοσοκαθίζησης (Thermo επιστημονική Pierce) στηρίζοντας με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 75 μ§ αντισωμάτων καθαρισμένο με συγγένεια (SP1, HDAC1, Cell Signaling Technologies) συζεύχθηκαν στις στήλες σπιν. λύμα κυττάρων παρασκευάστηκε κατόπιν και προ-εκκαθαρίστηκε με τις ρητίνες αγαρόζης ελέγχου. Στη συνέχεια, το προϊόν λύσης κυττάρου συν-ανοσοκαταβυθίστηκε και εκλούεται. Τέλος, τα δείγματα μετρήθηκαν με κηλίδωση Western δοκιμασία.

χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) δοκιμασία

δοκιμασία ChIP διεξήχθη με ανοσοκατακρήμνιση Δοκιμασία Kits (Millipore) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα σταυροειδείς δεσμούς με 1% φορμαλδεΰδη για 10 λεπτά στους 37 ° C. Τα κύτταρα κατόπιν επαναιωρήθηκαν σε 200 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος λύσεως και επωάζονται επί 10 λεπτά επί πάγου. Το λύμα ψαλιδισμένα σε μήκη μεταξύ 200 και 1000 ζεύγη βάσης με επεξεργασία με υπερήχους. Το υπερκείμενο προ-καθαριστεί με ένα DNA από σπέρμα σολομού /Protein Α αγαρόζης-50% πολτό. Το ανακτημένο υπερκείμενο επωάστηκε με Suz-12 ανοσοκαταβύθιση αντισώματος (Abcam), ιστόνη Η3 τριμεθυλο-λυσίνης 27 (Η3-τριμεθυλ-K27) ανοσοκαταβύθιση αντίσωμα (Millipore), ακετυλο-ιστόνης Η3 (Lys9) (Millipore), ή ένα ισότυπο ελέγχου IgG όλη τη νύκτα στους 4 ° C με περιστροφή. Στη συνέχεια, το σύμπλοκο αντισώματος /DNA συλλέχθηκαν με χρήση DNA από σπέρμα σολομού /πρωτεΐνη Α αγαρόζης κοπριάς για μία ώρα στους 4 ° C με περιστροφή. Το συγκρότημα εκλούστηκε με ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης. Στη συνέχεια, οι διασταυρωμένες συνδέσεις αντιστράφηκαν με 5 Μ NaCl θέρμανση στους 65 ° C για 4 ώρες. Τα δείγματα DNA στη συνέχεια καθαρίστηκαν και μετρήθηκαν με qRT-PCR. Οι εκκινητές που παρατίθενται στον Πίνακα S4.

Ξενομοσχεύματος μεταμόσχευση

BALB /c αθυμικά γυμνά ποντίκια (Άνδρας, SPF, 4-6 εβδομάδες) δόθηκαν από το τμήμα του κέντρου ζώων πειράματος του νοσοκομείου μας . Και η μελέτη in-vivo ήταν ηθικά εγκριθεί και εκτελείται σύμφωνα με τις οδηγίες του ιδρύματος. Για την εκτέλεση ογκογονικότητα σε γυμνούς ποντικούς, ΚΕΠ από κύτταρα /DTX SPC-Α1 σταθερά επιμολυσμένα με miR-200b, miR-NC, SH-έλεγχο ή SH-HDAC1 # 2 φορείς εγχύθηκαν υποδορίως στην δεξιά πλευρά γυμνών ποντικών. Οι όγκοι συλλέχθηκαν ενώ ήταν προφανής. Για να διερευνηθεί η επίδραση του miR-200b έκφραση ή HDAC1 καταστολή στο

in vivo

ρύθμιση των κυττάρων LAD, 3.0 × 10

6 Η1299 /κύτταρα DTX σταθερά επιμολυσμένα με sh-ελέγχου, sh-HDAC1, ΜΙΚ NC ή miR-200b φορείς, μεταφυτεύθηκαν υποδορίως στη δεξιά πλευρά της πλευράς οπίσθιου γυμνών ποντικών. Οι όγκοι των όγκων μετρήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. Ενώ η μέση διάσταση του όγκου έφθασε περίπου 50 mm

3, μια συγκέντρωση 1.0 mg /kg docetaxel (DTX), μία δόση κάθε δεύτερη ημέρα, με τρεις δόσεις συνολικά, χορηγήθηκε μέσω ενδοπεριτοναϊκής έγχυσης [19]. Μετά από 5 εβδομάδες, όλα τα ποντίκια θυσιάστηκαν, και οι ιστοί του όγκου χρησιμοποιήθηκαν για τις επόμενες μελέτες.

Στατιστική ανάλυση

Όλοι στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε SPSS έκδοση προγράμματος 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL , ΗΠΑ). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου, και οι ράβδοι σφάλματος είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Οι μέσες τιμές των δύο ομάδων συγκρίθηκαν με

t

test του Student. Οι διαφορές μεταξύ των πολλαπλών ομάδων αναλύθηκαν με μονόδρομη ανάλυση ANOVA. Όλα

P

τιμές & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

CD133

+ /CD326

+ κύτταρα παρουσιάζουν ιδιότητες των ΚΕΠ

για την καλύτερη κατανόηση των υποκείμενων μηχανισμών που ευθύνονται για χημειοαντίσταση σε LAD, CD133

+ /CD326

+ κύτταρα ταξινομήθηκαν από τους docetaxel ανθεκτικά LAD κύτταρα με CD133 και μικροσφαιρίδια CD326. Η καθαρότητα του CD133

+ /CD326

+ κύτταρα ταξινομούνται από την SPC-Α1 /DTX και Η1299 /DTX ήταν 93,13% ± 4,06% και 92,74% ± 3,12%, αντίστοιχα, και το CD133

+ /CD326

+ κύτταρα θα μπορούσαν να διαφοροποιηθούν με τις docetaxel-ανθεκτικά κύτταρα LAD, ενώ κάτω από συνθήκες διαφοροποίησης (Εικόνα 1Α

1, Α

2 και Α

3). Στη συνέχεια, θα καθοριστεί αν ο CD133

+ /CD326

+ κύτταρα εμφανίζονται ιδιότητες των ΚΕΠ. Κατ ‘αρχάς, αναλύσαμε την ικανότητα σχηματισμού mammosphere του CD133

+ /CD326

+ κύτταρα, και τα στοιχεία έδειξαν ότι ο αριθμός των mammosphere στο CD133

+ /CD326

+ κυττάρων ήταν σημαντικά περισσότερο από ότι στις αντίστοιχες docetaxel-ανθεκτικών κυττάρων LAD (Εικόνα 1Β). Επίσης, το CD133

+ /CD326

+ κύτταρα εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα έκφρασης δεικτών βλαστικών κυττάρων (όπως Sox-2, Oct-4, Suz-12 και ΒΜΙ-1) από το αντίστοιχο docetaxel ανθεκτικά LAD κύτταρα (Σχήμα 1Γ, 1Δ

1 και D

2). Δεύτερον, αναλύσαμε την ογκογόνο ικανότητα του CD133

+ /CD326

+ κυττάρων, και στη συνέχεια για 1,000~100,000 CD133

+ /CD326

+ κύτταρα ή τα αντίστοιχα docetaxel-ανθεκτικά κύτταρα LAD ήταν υποδορίως εμβολιάζεται σε γυμνά ποντίκια. 1000 CD133

+ /CD326

+ κυττάρων ήταν επαρκείς για να σχηματίσουν όγκους σε όλες τις γυμνών ποντικών, ωστόσο, μέχρι 1,0 × 10

5 docetaxel ανθεκτικά κύτταρα LAD δεν ήταν σε θέση να σχηματίσει επιτυχώς όγκους σε κάθε γυμνό ποντίκια, τα οποία έδειξαν ότι η CD133

+ /CD326

+ κύτταρα κατείχαν υψηλότερη δυνατότητα ογκογένεσης από τα γονική docetaxel-ανθεκτικά κύτταρα LAD (Εικόνα 1 Ε). Ως εκ τούτου, το CD133

+ /CD326

+ υποπληθυσμό κυττάρων που εμφανίζονται ιδιότητες των ΚΕΠ.

(Α

1, Α

2, A

3) Ποσοστό CD133

+ /CD326

+ ΚΕΠ, όπως αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής στον υποδεικνυόμενο χρόνο μετά την καλλιέργεια CD133

+ /CD326

+ ΚΕΠ (που αποκτήθηκαν από διαλογή SPC-Α1 /DTX και κύτταρα Η1299 /DTX, αντίστοιχα) υπό συνθήκες διαφοροποίησης. (Β) Mammosphere ικανότητα σχηματισμού των υποδεικνυόμενων κυττάρων (1000 κύτταρα) μετά από 7 ημέρες υπό συνθήκες CSC-καλλιέργεια. ανιχνεύσεως (C) qRT-PCR του σχετικών επιπέδων mRNA των CSC που σχετίζονται με δείκτες στις ενδεικνυόμενες κύτταρα. Τα δεδομένα υπολογίστηκε με την 2

– μέθοδος △△ Ct χρησιμοποιώντας GAPDH RNA ως γονίδιο αναφοράς. Το επίπεδο έκφρασης μετρήθηκε σε σχέση με την πολλαπλή μεταβολή των γονικών ομάδων κύτταρα που ορίστηκαν ως 1.0. (D

1, D

2) Τα επίπεδα πρωτεΐνης της CSC που σχετίζονται με δείκτες στις ενδεικνυόμενες κύτταρα. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. (Ε) εμφάνιση όγκου σε γυμνούς ποντικούς που εγχύθηκαν υποδορίως με τα δεικνυόμενα κύτταρα. Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± SD από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. *

σ

& lt? 0,05, **

σ

& lt?. 0.01

Η

MiR-200b αναστέλλει τον σχηματισμό ΚΕΠ και αντιστρέφει χημειοαντίσταση των ΚΕΠ

Προηγουμένως, έχουμε δείξει ότι η ρύθμιση προς τα πάνω του miR-200b μπορεί να αντιστρέψει χημειοαντίσταση των docetaxel-ανθεκτικά κύτταρα LAD μέσω αναστολής της κυτταρικής ανάπτυξης, επαγωγή διακοπή του κυτταρικού κύκλου και την ενίσχυση της απόπτωσης. Στη συνέχεια, πραγματοποιήσαμε ποσοτικό προσδιορισμό qRT-PCR για την ανίχνευση της έκφρασης του miR-200b σε ΚΕΠ και τις αντίστοιχες docetaxel ανθεκτικά κύτταρα LAD, και έδειξε ότι το σχετικό επίπεδο miR-200b σε ΚΕΠ ήταν χαμηλότερη από ότι στα docetaxel-ανθεκτικά κύτταρα LAD (Εικόνα 2Α). Για να διερευνήσουν περαιτέρω το εάν έχει miR-200b επίδραση στα ΚΕΠ στις docetaxel-ανθεκτικά κύτταρα LAD, pcDNA /miR-200b (ή ροϋΝΑ /miR-NC) ή αντι-miR-200b (ή αντι-miR-NC) ήταν σταθερά ή παροδικά επιμολύνονται σε SPC-A1 /DTX ή Η1299 /κύτταρα DTX. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, το σχετικό επίπεδο έκφρασης του miR-200b ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε κύτταρα LAD docetaxel ανθεκτικά σταθερά επιμολυσμένα με ροϋΝΑ /miR-200b, ενώ σχετικό επίπεδο έκφρασης του ήταν σημαντικά προς τα κάτω σε αυτά τα κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με αντι-ΜΙΚ 200b. Η κυτταρομετρία ροής ανάλυση έδειξε ότι η αυξητική ρύθμιση του miR-200b μείωσε σημαντικά το ποσοστό των CD133

+ /CD326

+ ανάπτυξη ΚΕΠ στις docetaxel-ανθεκτικά κύτταρα LAD και προς τα κάτω ρύθμιση του miR-200b είχε το αντίθετο αποτέλεσμα (Σχήμα 2C). Το παρόμοιο φαινόμενο παρατηρήθηκε σε δοκιμασία την ικανότητα σχηματισμού mammosphere επίσης (Σχήμα 2D). Εν τω μεταξύ, η αποκατάσταση του miR-200b θα μπορούσε να οδηγήσει στη μειωμένη IC

50 αξία των DTX στο ΚΕΠ από SPC-Α1 /DTX ή κύτταρα Η1299 /DTX (Σχήμα 2Ε). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το miR-200b θα μπορούσε να διαδραματίσει έναν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη ΚΕΠ και χημειοαντίσταση της ανθρώπινης LAD.

(Α) ανίχνευση qRT-PCR του miR-200b στα ΚΕΠ. Δεδομένα κανονικοποιήθηκαν σε U6 rRNA και προσδιορίζεται σε σχέση με τις αντίστοιχες ομάδες γονικών κυττάρων. (Β) ανίχνευση qRT-PCR του σχετικού επιπέδου του mRNA του miR-200b σε κύτταρα LAD docetaxel ανθεκτικά μετά από επιμόλυνση με τα υποδεικνυόμενα φορείς. Δεδομένα κανονικοποιήθηκαν σε U6 rRNA και προσδιορίζεται σε σχέση με τις αντίστοιχες ομάδες ελέγχου. (C) Ποσοστό CD133

+ /CD326

+ ΚΕΠ όπως αναλύεται με κυτταρομετρία ροής μετά από επιμόλυνση με τα υποδεικνυόμενα φορείς. (D) Mammosphere ικανότητα σχηματισμού των υποδεικνυόμενων κυττάρων (1000 κύτταρα) μετά την επιμόλυνση των αναφερόμενων φορέων. (Ε) Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με Καταμέτρηση κυττάρων Kit-8 (CCK-8) του προσδιορισμού. Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± SD από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. *

σ

& lt? 0,05, **

σ

& lt?. 0.01

Η

Suz-12 απορυθμίζεται σε ΚΕΠ και ταυτοποιήθηκε ως ένα λειτουργικό στόχο της ΜΙΚ 200b

Suz-12 είναι ένα συστατικό του Polycomb κατασταλτική συγκρότημα 2 (PRC2) και είναι απαραίτητη για PRC2 μεσολάβηση γονιδιακή σίγηση δημιουργώντας trimethylation σε λυσίνη 27 υπόλειμμα της ιστόνης Η3 (H3K27Me3). Στο ΚΕΠ που παράγεται από μετασχηματισμένα επιθηλιακά κύτταρα του μαστού (MCF-10Α), Suz-12 έχει επιβεβαιωθεί ως ένα γονίδιο-στόχο των miR-200b. Ωστόσο, αν miR-200b μπορούν να στοχεύσουν Suz-12 στα ΚΕΠ που προέρχονται από τα docetaxel-ανθεκτικά κύτταρα LAD είναι ασαφής. qRT-PCR και Western blotting δοκιμασίες έδειξαν ότι Suz-12 ήταν ρυθμισμένη σε ΚΕΠ σε σύγκριση με τις αντίστοιχες docetaxel-ανθεκτικά κύτταρα LAD τόσο σε μεταγραφικό και μεταφραστικό επίπεδα (Σχήμα 3Α και Β). Στη συνέχεια, αναλύσαμε τα αποτελέσματα των miR-200b για την έκφραση της Suz-12 στο ΚΕΠ. Προς τα πάνω ρύθμιση του miR-200b οδήγησε στη μειωμένη έκφραση της Suz-12 στο ΚΕΠ της SPC-Α1 /DTX και κύτταρα Η1299 /DTX, ενώ αποσιώπηση του miR-200b οδήγησε στην αυξημένη έκφραση της Suz-12 σε αυτά τα ΚΕΠ (Σχήμα 3C και ΡΕ). Για να αποκτήσετε την περαιτέρω άμεση απόδειξη ότι Suz-12 ήταν ο στόχος του miR-200b, ερευνήσαμε την θέση δέσμευσης του miR-200b με τη σειρά 3′-UTR της Suz-12 mRNA. Κατασκευάσαμε ένα ανταποκριτή λουσιφεράσης (pLuc /Suz-12 /3′-UTR-wt) στην οποία εισάγεται εντός του φορέα pLuc τα νουκλεοτίδια της Suz-12-3′-UTR συμπληρωματική προς miR-200b, και δημιουργήσαμε επίσης ένα μεταλλαγμένο ανταποκριτή (pLuc /Suz-12 /3′-UTR-mut), στην οποία μεταλλάχθηκαν τα πρώτα έξι νουκλεοτίδια στο ΜΙΚ-200b περιοχή σπόρος συμπληρωματικές θέσεις. Η δραστικότητα λουσιφεράσης στο pLuc /Suz-12 /3′-UTR-WT-επιμολυσμένα κύτταρα συν-επιμολυσμένα με ροϋΝΑ /miR-200b ήταν σημαντικά μειωμένη από ότι στα pLuc /Suz-12 /3′-UTR-mut-επιμολυσμένα κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με pcDNA /miR-200b (Σχήμα 3Ε). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι Suz-12 μπορεί να είναι ένας άμεσος στόχος του miR-200b στα ΚΕΠ που προέρχονται από τα docetaxel-ανθεκτικά κύτταρα LAD.

(Α) ανίχνευση qRT-PCR σχετική έκφραση mRNA Suz-12 στην υποδεικνύεται κύτταρα. Δεδομένα κανονικοποιήθηκαν σε GAPDH RNA και προσδιορίζεται σε σχέση με τις αντίστοιχες ομάδες γονικών κυττάρων. (Β) Τα επίπεδα πρωτεΐνης Suz-12 όπως μετράται με κηλίδωση Western στις ενδεικνυόμενες κύτταρα. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. (C) qRT-PCR ανίχνευση του Suz-12 mRNA έκφραση σε ΚΕΠ μετά την επιμόλυνση των αναφερόμενων φορέων. (D) κηλίδωση Western ανίχνευση του Suz-12 έκφραση πρωτεΐνης σε ΚΕΠ μετά την επιμόλυνση με τα υποδεικνυόμενα φορείς. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. (Ε) Η δραστηριότητα της λουσιφεράσης της ΚΕΠ (SPC-A1 /DTX) συν-επιμολύνθηκαν με pcDNA /miR-200b (ή ροϋΝΑ /miR-NC) ή pLuc /Suz-12 /3′-UTR-wt (ή pLuc /Suz -12 /3′-UTR-mut). Τα δεδομένα ήταν μέσες ± SD από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. *

σ

& lt? 0,05, **

σ

& lt?. 0.01

Η

Για να καθοριστεί περαιτέρω εάν Suz-12 που εμπλέκονται στη ρύθμιση των ΚΕΠ, Suz- 12-τα siRNAs (Suz-12-shRNA # 1, # 2 ή # 3) σχεδιάστηκαν και διαμολύνθηκε σε κύτταρα LAD docetaxel ανθεκτικά και η ανασταλτική επίδραση του Suz-12-shRNA3 ήταν μεγαλύτερη (Σχήμα 4Α). Αποσιώπηση του Suz-12 θα μπορούσε να μειώσει σημαντικά την ικανότητα σχηματισμού mammosphere του SPC-A1 /DTX και κυττάρων Η1299 /DTX (Σχήμα 4Β). Επίσης, το ποσοστό των CD133

+ /CD326

+ ανάπτυξη ΚΕΠ σε Suz-12-shRNA3-επιμολυσμένα SPC-Α1 /DTX ή κύτταρα /DTX Η1299 ήταν σημαντικά μειωμένη από ότι στον έλεγχο-shRNA-επιμολυσμένα κύτταρα ( Σχήμα 4C). Στη συνέχεια, αναλύσαμε περαιτέρω οι επιδράσεις της έκφρασης Suz-12 σχετικά με την ογκογονικότητα και χημειοευαισθησίας των ΚΕΠ. Πρώτον, εντοπίσαμε την πρωτεΐνη έκφραση του Suz-12 σε ΚΕΠ από Suz-12-shRNA3 ή ελέγχου-shRNA-επιμολυσμένα κύτταρα /DTX Η1299 SPC-A1 /DTX και, και έδειξε ότι το επίπεδο έκφρασης της Suz-12 πρωτεΐνης σε Suz- 12-shRNA3-επιμολυσμένα κύτταρα ήταν σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη στον έλεγχο-shRNA-επιμολυσμένα κύτταρα (Εικόνα 4D). Λειτουργική ανάλυση έδειξε ότι αποσιώπηση του Suz-12 θα μπορούσε να αναστείλει σημαντικά την

in vitro

ανάπτυξη και

in vivo

ογκογονικότητα του ΚΕΠ (Σχήμα 4Ε και F). Επιπλέον, αποσιώπηση της Suz-12 θα μπορούσε να μειώσει σημαντικά το IC

50 αξία της DTX στο ΚΕΠ (Εικόνα 4G). Έτσι, αποσιώπηση της Suz-12 θα μπορούσε να μιμούνται τις επιδράσεις του miR-200b στην ανάπτυξη ΚΕΠ και χημειοαντίσταση, γεγονός που υποδηλώνει ότι Suz-12 που ασχολούνται με τη ρύθμιση των ΚΕΠ που προκαλείται από miR-200b.

(α) την πρωτεΐνη επίπεδο Suz-12 σε κύτταρα LAD docetaxel ανθεκτικά μετά από επιμόλυνση με τα υποδεικνυόμενα sh-RNA φορείς (sh-RNA-Suz12 # 1, SH-RNA-Suz12 # 2, και SH-RNA-Suz12 3 #). (Β) Mammosphere ικανότητα σχηματισμού των κυττάρων LAD docetaxel ανθεκτικά (1000 κύτταρα) μετά την επιμόλυνση των αναφερόμενων φορέων. (Γ) Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του ποσοστού των CD133

+ /CD326

+ ΚΕΠ, όπως αναλύεται με σε κύτταρα LAD docetaxel ανθεκτικά μετά την επιμόλυνση των αναφερόμενων φορέων. (Δ) Το επίπεδο της πρωτεΐνης του Suz-12 στο ΚΕΠ μετά από επιμόλυνση με το SH-RNA-ελέγχου ή sh-RNA-Suz12 # 3 φορείς. (Ε) CCK-8 ανάλυση κυτταρικής βιωσιμότητας των ΚΕΠ έχουν επιμολυνθεί με τους ενδεδειγμένους φορείς κατά τον προκαθορισμένο χρόνο. (F) Επίδραση της Suz-12 αναστολή για

in vivo

ογκογονικότητα των ΚΕΠ από τα κύτταρα /DTX SPC-Α1. (G) Επίδραση της αναστολής Suz-12 για χημειοαντίσταση των ΚΕΠ. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με CCK-8 δοκιμασίας. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± SD από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. *

σ

& lt? 0,05, **

σ

& lt?. 0.01

Η

Για την περαιτέρω επιβεβαίωση ότι Suz-12 ήταν ένα λειτουργικό στόχο του miR-200b σε η ρύθμιση των ΚΕΠ, pcDNA /Suz-12 ή ροϋΝΑ /ελέγχου μετασκευάστηκε σε ΚΕΠ (SPC-A1 /DTX) σταθερά επιμολυσμένα με ροϋΝΑ /miR-200b ή ροϋΝΑ /miR-NC. 48h μετά την επιμόλυνση, Western δοκιμασία botting διεξήχθη για την ανίχνευση της έκφρασης του Suz-12 πρωτεΐνη, και δείξαμε ότι pcDNA /Suz-12 θα μπορούσε να αντιστρέψει την μειωμένη έκφραση του Suz-12 σε ΚΕΠ από τα κύτταρα /DTX SPC-Α1 που επάγεται από miR -200b αυξορρύθμιση (Σχήμα 5Α). Εν τω μεταξύ, η υπερέκφραση του Suz-12 θα μπορούσε όχι μόνο να αντιστραφεί η μείωση ποσοστό του CD133

+ /CD326

+ ανάπτυξη ΚΕΠ και mammosphere ικανότητα σχηματισμού, αλλά και αντιστραφεί η μειωμένη ικανότητα ανάπτυξης και IC

50 αξία της docetaxel σε τα ΚΕΠ από τα κύτταρα /DTX SPC-Α1 που προκαλείται από miR-200b προς τα πάνω ρύθμιση (Εικόνα 5Β-Ε). Έτσι, η υπερέκφραση του Suz-12 θα μπορούσε να αναστρέψει τα αποτελέσματα της miR-200b προς τα πάνω ρύθμιση σχετικά με τη ρύθμιση των ΚΕΠ, γεγονός που υποδηλώνει ότι Suz-12 ήταν ένα λειτουργικό στόχο του miR-200b στη ρύθμιση των ΚΕΠ από τις docetaxel-ανθεκτικά κύτταρα LAD.

(A) Το επίπεδο της πρωτεΐνης του Suz-12 στα ΚΕΠ από κύτταρα /DTX SPC-Α1 επιμολυσμένα με τις αναφερόμενες φορείς. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. (Β) Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του ποσοστού των CD133

+ /CD326

+ ΚΕΠ σε κύτταρα /DTX SPC-Α1 μετά την επιμόλυνση των αναφερόμενων φορέων. (Γ) Mammosphere ικανότητα σχηματισμού των κυττάρων /DTX SPC-Α1 (1000 κύτταρα) μετά την επιμόλυνση των αναφερόμενων φορέων. *

σ

& lt? 0,05.