Αφηρημένο

PPARs είναι πυρηνικών υποδοχέων που ενεργοποιούνται από συνδέτες. Η ενεργοποίηση του ΡΡΑΚγ οδηγεί σε μείωση της πρόσφυσης και κινητικότητας σε ορισμένα μοντέλα καρκίνου. μεταγραφική δραστικότητα ΡΡΑΚγ μπορεί να ρυθμίζεται αρνητικά από φωσφορυλίωση JNK μεσολάβηση. Εμείς δεδομένο ότι η χρήση παραγόντων μπορεί να αναστέλλουν δραστικότητα JNK θα μπορούσε να αυξήσει την αποτελεσματικότητα των συνδετήρων ΡΡΑΚγ. Αναλύσαμε τα αποτελέσματα της ροσιγλιταζόνης (PPARγ συνδετήρα) και AS601245 (ένας εκλεκτικός αναστολέας JNK) μόνη ή σε συνδυασμό για την προσκόλληση και τη μετανάστευση των Caco-2, ΗΤ29, και SW480 ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα και διερευνήθηκε, μέσω της ανάλυσης των μικροσυστοιχιών, τα γονίδια που εμπλέκονται στην αυτές οι διαδικασίες. Η κυτταρική πρόσφυση και μετανάστευση ήταν έντονα αναστέλλεται από τη ροσιγλιταζόνη και AS601245. Η συνδυασμένη αγωγή με τις δύο ενώσεις οδήγησε σε μεγαλύτερη μείωση της ικανότητας προσκόλλησης και της μετανάστευσης. ανάλυση Affymetrix σε κύτταρα Caco-2 αποκάλυψαν ότι ορισμένα γονίδια τα οποία ήταν ιδιαίτερα διαμορφώνονται από τη συνδυασμένη θεραπεία μπορεί να εμπλέκονται σε αυτές τις βιολογικές αποκρίσεις. Ροσιγλιταζόνη, AS601245 και συνδυασμένη θεραπεία κάτω ρυθμισμένα την έκφραση των αλυσίδων ινωδογόνου σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές. Επιπλέον, η ροσιγλιταζόνη, μόνες ή σε συνδυασμό με AS601245, προκάλεσε μείωση στην απελευθέρωση ινωδογόνου. ARHGEF7 /β-ΡΙΧ γονιδίου ήταν ιδιαίτερα κάτω-ρυθμίζονται από συνδυασμένη θεραπεία, και ανάλυση κηλίδας Western απεκάλυψε ότι β-PIX πρωτεΐνη κάτω διαμορφωμένο σε Caco-2, ΗΤ29 και κύτταρα SW480, επίσης. Η επιμόλυνση των κυττάρων με το γονίδιο β-ΡΙΧ κατήργησε εντελώς την ανασταλτική επίδραση στην κυτταρική μετανάστευση, προσδιορίζεται με ροσιγλιταζόνη, AS601245 και συνδυασμένη θεραπεία. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι β-PIX πρωτεΐνη εμπλέκεται στην αναστολή της κυτταρικής μετανάστευσης και τη διατήρηση της θετικής αλληλεπίδρασης μεταξύ συνδέτες PPARγ και αντι-φλεγμονώδεις παράγοντες σε ανθρώπους

Παράθεση:. Cerbone Α, Toaldo C, Minelli R, Ciamporcero Ε , Pizzimenti S, Pettazzoni P, et al. (2012) Η ροσιγλιταζόνη και AS601245 Μείωση κυτταρικής προσκόλλησης και μετανάστευσης μέσω διαμόρφωσης της εξειδικευμένης γονιδιακής έκφρασης σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. PLoS ONE 7 (6): e40149. doi: 10.1371 /journal.pone.0040149

Επιμέλεια: Frederic Andre, Πανεπιστήμιο Aix-Marseille, Γαλλία

Ελήφθη: 22 του Φλεβάρη του 2012? Δεκτές: 1, Ιουνίου 2012? Δημοσιεύθηκε: 28, Ιουνίου του 2012

Copyright: © 2012 Cerbone et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από Regione Piemonte (https://www.ricerca-sanitaria-finalizzata.it/) και Università degli Studi di Torino (https://www.unito.it/unitoWAR/page/istituzionale/ricerca1/Ricerca_601) . Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. AC και GR απασχολούνται από MerckSerono Ivrea – ΔΒΔ SpA Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα στην ανάπτυξη ή εμπορία προϊόντων να δηλώσει. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

PPARγ ανήκει στην πυρηνικό υποδοχέα υπεροικογένεια αποτελείται μιας ομάδας περίπου 50 μεταγραφικών παραγόντων που εμπλέκονται σε πολλές διαφορετικές βιολογικές διαδικασίες και θεωρείται ως σημαντικούς στόχους για την ανάπτυξη νέων φαρμάκων [1]. Η ενεργοποίηση ΡΡΑΚγ από αγωνιστές ρυθμίζει αποθήκευση λιπιδίων σε adypocytes [2], αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και επάγει την απόπτωση και διαφοροποίηση σε έναν αριθμό καρκινικών κυττάρων [3]. Έτσι, οι συνδετήρες ΡΡΑΚγ έχουν θεωρηθεί ως δυνητικά φάρμακα για διάφορους τύπους καρκίνου. συνδετήρες ενδογενής ΡΡΑΚγ περιλαμβάνουν ακόρεστα λιπαρά οξέα και διάφορα προστανοειδή όπως 15-δεοξυ-προσταγλανδίνη J2 (15d-PGJ2) και 15-υδροξυ-eicosatetranoic οξύ (ΗΕΤΕ), που είναι μεταβολίτες του αραχιδονικού [4] οξύ. Συνθετικό συνδέτες αποτελούνται από την ινσουλίνη-ευαισθητοποιώντας thiazolindinedione (TZD) κλάση (τρογλιταζόνη, πιογλιταζόνη και ροσιγλιταζόνη) που χρησιμοποιούνται για την θεραπεία του σακχαρώδους διαβήτη [5] – [6] και διάφορες μη-στεροειδή αντι-φλεγμονώδη φάρμακα (ΜΣΑΦ), και ιδίως ινδομεθακίνη και ibuprofen, που είναι αδύναμοι αγωνιστές ΡΡΑΚγ σε υψηλές συγκεντρώσεις micromolar [7].

Η ευαισθησία των διαφόρων τύπων κυττάρων για ΡΡΑΚγ συνδέτες κυρίως εξαρτάται από την έκφραση και τη δραστηριότητα ΡΡΑΡγ. Υψηλά επίπεδα έκφρασης ΡΡΑΚγ έχουν αναφερθεί σε λιπώδη και του παχέος εντέρου ιστούς. Η τελευταία είναι η κύρια ιστό που εκφράζει PPARγ σε επιθηλιακούς ιστούς [1]. Παρά αυτήν την παρατήρηση, ο αριθμός των μελέτες που διερευνούν PPARγ σε ανθρώπινα υποκείμενα με καρκίνο του παχέος εντέρου είναι περιορισμένη. Σε δείγματα από ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου, ανοσοϊστοχημική ανάλυση έδειξε μια συσχέτιση μεταξύ ΡΡΑΚγ και μορίων συνδέονται με τον κύκλο των κυττάρων, αλλά καμία συσχέτιση ανιχνεύθηκε μεταξύ PPARγ και την επιβίωση των ασθενών [8]. Πιο πρόσφατα, Ogino και των συνεργατών καταδειχθεί, σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου, ότι η έκφραση του ΡΡΑΚγ συνδέεται με μια καλή πρόγνωση [9], σύμφωνα με τα προηγούμενα δεδομένα που αναφέρθηκαν από Jackson και οι συνεργάτες [10], η οποία κατέδειξε ότι ΡΡΑΚγ (mRNA και ) τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης συμπιέστηκαν σημαντικά σε καρκίνο του παχέος εντέρου σε σύγκριση με κύτταρα συμφωνημένα μη κακοήθη ιστό. Σε μελέτες σε ζώα, μια ανεπάρκεια σε εντερικό PPARγ συσχετίστηκε με αυξημένη ογκογονικότητα στο λεπτό έντερο και κόλον ApcMin /+ ποντικό [11]. Ομοίως, σε μοντέλα ποντικών με καρκίνο του παχέος εντέρου, PPARγ αγωνιστές ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου ή την καρκινογένεση κόλον [12] – [14]. Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν την υπόθεση ότι οι συνδέτες PPARγ μπορεί να αναστέλλει παχέος εξέλιξη της νόσου, μπορεί να είναι ένα σημαντικό θεραπευτικό στόχο.

Α. Επίδραση διαφορετικών δόσεων του ροσιγλιταζόνη (10, 50, 100, 200, 250 μΜ) επί Caco-2, ΗΤ29 και SW480 κυτταρικό πολλαπλασιασμό? B. αποτέλεσμα διαφορετικών δόσεων του AS601245 (0,1, 1, 2,5, 5, 10 μΜ) επί Caco-2, ΗΤ29 και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων SW480. Οι τιμές ανιχνεύονται με μέτρηση της φωταύγειας που απελευθερώνεται από τα μεταβολικά ενεργά κύτταρα. Οι τιμές, που εκφράζονται σε RLUs είναι τα μέσα Τ.Α. τριών ξεχωριστών πειραμάτων.

Η

Ένα από τα πιο σημαντικά στοιχεία στην εξέλιξη του καρκίνου, είναι η απόκτηση του επεμβατική συμπεριφορά, μια διαδικασία πολλών σταδίων η οποία περιλαμβάνει τα καρκινικά κύτταρα προσκόλληση στο ενδοθήλιο vassel και την κινητικότητα μέσω της εξωκυττάρια μήτρα. Έχει αποδειχθεί ότι ΡΡΑΚγ αγωνιστές επηρεάζουν αυτές τις παραμέτρους όχι μόνο στον έλεγχο της κυτταρικής φλεγμονής [15] αλλά επίσης και σε διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων [16], [17].

Εκτός δέσμευση συνδέτη, ΡΡΑΚγ γονιδιωματική δραστηριότητα μπορεί να διαμορφωθεί με διάφορες κυτταρικές διεργασίες.

Πράγματι, μιτογόνο ορμόνες, αυξητικούς παράγοντες και προ-φλεγμονώδη σήματα είναι όλα γνωστό ότι μειώνει την ικανότητα των PPARγ να ανταποκρίνεται σε πρόσδεμα διέγερση. Οι μηχανισμοί που ελέγχουν αυτό κάτω ρύθμιση είναι σύνθετες και περιλαμβάνουν φωσφορυλίωση [18], ουμπικουιτίνωση [19], τροποποίησή της με SUMO [20] και κυτταροπλασματική παλινδρόμηση [21]. Ένας βασικός μηχανισμός κάτω ρύθμιση συνεπάγεται φωσφορυλίωση από διάφορα ενεργοποιημένου μιτογόνο κινάσες (MAPKs), οι οποίες είναι κεντρικές συνιστώσες σηματοδότηση στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, επιβίωσης διαφοροποίηση, αντίδραση στο στρες και της απόπτωσης [22]. Ειδικότερα, έχει αναφερθεί ότι η c-Jun-τερματικής κινάσης (JNK) φωσφορυλιώνει PPARγ και αρνητικά ρυθμίζει την μεταγραφική δραστικότητα του [23]. Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις μας υπόθεση ότι η χρήση παραγόντων μπορεί να αναστέλλουν δραστικότητα JNK θα μπορούσε να αυξήσει την αποτελεσματικότητα των συνδετήρων ΡΡΑΚγ. AS601245 [1,3-βενζοθειαζολ-2-υλ- (2 – {[2- (3-πυριδινυλ) αιθυλ] αμινο} -4-πυριμιδινυλο) ακετονιτρίλιο? JNK αναστολέα V] έχει επιλεγεί ως ένας ισχυρός και εκλεκτικός αναστολέας JNK με αντι-φλεγμονώδεις ιδιότητες [24], και έχει χρησιμοποιηθεί στην παρούσα εργασία να αξιολογήσει τη συμμετοχή του με αντι-καρκινογόνες επιδράσεις εμφανίζονται από τη ροσιγλιταζόνη σε καρκινικά κύτταρα κόλου. Πιο συγκεκριμένα, εξετάσαμε τα αποτελέσματα της ροσιγλιταζόνης και AS601245, μόνα τους ή σε συνδυασμό, για την προσκόλληση και τη μετανάστευση των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου, και διερεύνησε τα γονίδια που εμπλέκονται στις διαδικασίες αυτές, μέσω της ανάλυσης των μικροσυστοιχιών (Affimetryx GeneChip).

αποτέλεσμα διαφορετικών δόσεων της ροσιγλιταζόνης (0,01, 0,1, 1, 10, 50 μΜ), AS601245 (0,01, 0,1, 1, 10, 50 μΜ) και συνδυασμένη θεραπεία επί Caco-2, ΗΤ-28 και SW480 για προσκόλληση κυττάρου σε HUVECs. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή ή όχι με τα φάρμακα για 24 ώρες, συλλέχθηκαν και επωάστηκαν για 1 ώρα σε HUVEC μονοστοιβάδες. Τα δεδομένα εκφράζονται ως ποσοστό της αναστολής προσκόλλησης έναντι μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου. Η τιμή ελέγχου της πρόσφυσης ήταν περίπου 55 ± 6 κυττάρων ανά πεδίο μικροσκοπίου (n = 6) για όλες τις κυτταρικές σειρές. Οι τιμές είναι ο μέσος όρος ± SD, 3 διαχωρίζονται πειράματα. ανάλυση διακύμανσης: *

σ

BIOMAP SNC, Μιλάνο Ιταλία) επικαλυμμένα με 0,1 μl /ml Matrigel (BD Matrigel ™ μήτρας? BD Biosciences, Οξφόρδη , UK). Εν συντομία, μέσο που περιέχει 20% FCS ως ένα χημειοελκτικό τοποθετήθηκε στα κατώτερα φρεάτια. Αρχικά, Caco-2, ΗΤ29 και SW480 κυττάρων (σε τελική συγκέντρωση 5 χ 10

4 κύτταρα /ml) εναιωρήθηκαν στα ανώτερα φρεάτια (περίπου 4000 κύτταρα /φρεάτιο για ΗΤ29 και 8000 κυττάρων /φρεάτιο για SW480 και CaCo- 2) σε μέσο χωρίς ορό συμπληρωμένο με φάρμακα σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (από 0,1 μΜ έως 50 μΜ για τις δύο ουσίες) και με τη σύνδεση των φαρμάκων σε διαφορετικές συγκεντρώσεις. Η μετανάστευση των μη επεξεργασμένων κυττάρων ελέγχου, των κυττάρων που εκτίθενται στο όχημα (1% DMSO) και του ελέγχου και τα επεξεργασμένα κύτταρα εκτέθηκαν σε μιτομυκίνη C (50 μg /ml) (Sigma) αναλύθηκε επίσης. Ο θάλαμος επωάσθηκε στους 37 ° C υπό 5% CO

2 για 24 ώρες. Η χημειοταξία προσδιορίσθηκε ποσοτικά με απαρίθμηση των χρωματισμένων κυττάρων που μετανάστευσαν προς την κατώτερη πλευρά του φίλτρου χρησιμοποιώντας ένα οπτικό μικροσκόπιο (μεγέθυνση χ 100). Τα χρωματισμένα κύτταρα μετρήθηκαν ως ο μέσος αριθμός κυττάρων ανά 5 τυχαία πεδία για κάθε δοκιμασία. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ποσοστό της αναστολής της κατεργασμένων κυττάρων έναντι της μετανάστευσης μετράται σε κύτταρο εκτίθεται σε 1% DMSO. Αυτές οι συνθήκες διατηρήθηκαν για επιμολυσμένα κύτταρα, επίσης.

Η

Το ινωδογόνο Τύπου Προσδιορισμός

Το ινωδογόνο (FBG) απελευθέρωση σε μέσο καλλιέργειας αναλύθηκε με τη χρήση του AssayMax ανθρώπινου ινωδογόνου (FBG) ELISE Kit από Assaypro (St. Charles, ΜΟ, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

κύτταρα Caco-2 αναπτύχθηκαν σε φιάλες και σπάρθηκαν σε συγκέντρωση 4 χ 10

6 /φιάλη. Κύτταρα, που εκτίθενται σε ροσιγλιταζόνη (50, 10 και 1 μΜ), AS601245 (0,1 μΜ) ή και των δύο ουσιών (50 μΜ ροσιγλιταζόνη και 0,1 μΜ AS601245), συλλέχθηκαν μετά από 24 ώρες από την έναρξη του πειράματος και φυγοκεντρήθηκε. Τα συλλεχθέντα υπερκείμενα επωάστηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων επικαλυμμένη με ένα πολυκλωνικό αντίσωμα ειδικό για την ανθρώπινη FBG. FBG σε δείγματα στριμώχνεται από το ακινητοποιημένο πολυκλωνικό αντίσωμα και βιοτινυλιωμένο πολυκλωνικό αντίσωμα ειδικό για την ανθρώπινη FBG, το οποίο αναγνωρίζεται από ένα συζυγές στρεπταβιδίνης-υπεροξειδάσης. Όλα μη δεσμευμένο υλικό αποπλύθηκε και προστέθηκε ένα ένζυμο υπεροξειδάσης υπόστρωμα. Η ανάπτυξη χρώματος διακόπηκε και η ένταση του χρώματος μετρήθηκε σε αναγνώστη μικροπλακών σε μήκος κύματος 450 nm.

Η

RNA Εκχύλιση και Array υβριδισμός

Caco-2 κύτταρα κατεργάστηκαν με όχημα (1% DMSO) ή 50 μΜ ροσιγλιταζόνη ή 0,1 μΜ AS601245 ή ροσιγλιταζόνη συν AS601245 για 24 ώρες, και το συνολικό RNA από 3 βιολογικό επαναλήψεων για κάθε επεξεργασία απομονώθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Μιλάνο, Ιταλία). Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DNase ώστε να αποφευχθεί οποιαδήποτε γενωμική μόλυνση. Η ποιότητα της προκύπτουσας RNA προσδιορίστηκε με τη χρήση της Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). Το περιεχόμενο RNA ομαλοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη Thermo Scientific NanoDrop ™ ND-1000 φασματοφωτόμετρο. RNA δείγματα από κάθε επανάληψη αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Affymetrix GeneChip Ανθρώπινου Γονιδιώματος U133A συν 2,0 μάρκες (Affymetrix). ενίσχυση RNA, σύνθεση cDNA διπλής έλικας και την παραγωγή του επισημασμένου με βιοτίνη cRNA με in vitro μεταγραφή (IVT) διεξήχθησαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας Affymetrix κιτ. Το τελικό cDNA ελέγχθηκε για την ποιότητα και την ποσότητα πριν από τον κατακερματισμό και τσιπ υβριδισμού. Κάθε τσιπ στη συνέχεια πλύθηκε και χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα σταθμό ρευστών 450 (Affymetrix). ένταση φθορισμού για κάθε τσιπ συνελήφθη με ένα σαρωτή Affymetrix GeneChip 3000 (Affymetrix). GCOS έκδοση λογισμικού 1.2 (Affymetrix) χρησιμοποιήθηκε για να καθορίσει το κύτταρο ανιχνευτή και υπολογίζει την ένταση για κάθε κελί. CEL αρχεία που δημιουργούνται, περιέχει την περίληψη εντάσεις για κάθε ανιχνευτή, αναλύθηκαν μέσω των ακόλουθων βιοπληροφορικής προσεγγίσεις. Έχουμε καταρχάς αξιολόγησε τη συνολική ποιότητα των δεδομένων χρησιμοποιώντας R /Bioconductor. Στη συνέχεια, θα φορτωθεί το σύνολο δεδομένων στο Rosetta Αναλυτής για την κανονικοποίηση των δεδομένων, την παραγωγή των αξιών της έκφρασης, καθώς και στατιστική ανάλυση. Οι τιμές έκφρασης όλων των ομάδων θεραπείας ελήφθησαν ως λόγος έναντι του αρνητικού ελέγχου (1% DMSO). Διαφορική ανάλυση μεταξύ των ζευγών των ομάδων έγιναν με 1-τρόπος ANOVA που ακολουθείται από την Benjamini-Hochberg πολλαπλές διόρθωση δοκιμών (False Discovery Rate-FDR cut-off του 1%) και Student-Newman-Keuls post hoc ανάλυση. Τέλος, διαφορικά εκφρασμένα γονίδια αναλύθηκαν στην έκδοση λογισμικού Ingenuity Διαδρομή Ανάλυση 7.5 (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com).

Η

Σε πραγματικό χρόνο RT-PCR

Για την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων Affymetrix , επιλέξαμε 5 γονίδια που είχαν δείξει & gt? 2-φορές μεταβολή στην έκφραση για περαιτέρω μελέτη με πραγματικού χρόνου PCR σε ένα ξεχωριστό πείραμα. Δύο από αυτές (GANAB και MT2A) βρέθηκαν να αυξηθεί σε ανάλυση Affymetrix, ενώ οι άλλοι δύο βρέθηκαν να μειωθεί (FGA και FGFR2). Τέλος, ένα γονίδιο (ARHGEF7) βρέθηκε να είναι άκρως μειωθεί σε συνδυασμένη θεραπεία, μόνο. Επιπλέον, αναλύσαμε την έκφραση των τριών αλυσίδων του ινωδογόνου σε Caco-2, ΗΤ29 και SW480 κυττάρων. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1% DMSO ως όχημα ή με 50 μΜ ροσιγλιταζόνη, 0.1 μΜ AS601245, ή ροσιγλιταζόνη συν AS601245 για 24 ώρες? ολικού RNA από 3 βιολογικό επαναλήψεων για κάθε επεξεργασία απομονώθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Μιλάνο, Ιταλία), στη συνέχεια το ολικό RNA ποσοτικοποιήθηκε με μια (επιστημονική Thermo) φασματοφωτόμετρο NanoDrop για τη μέτρηση της συγκέντρωσης του RNA και αναλύθηκαν σε ένα Agilent 2100 Bioanalyser να παρακολουθούν την ποιότητα του RNA και ακεραιότητα. Ολικό RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA σε μία αντίδραση 20 μΐ χρησιμοποιώντας το TaqMan® υψηλής χωρητικότητας cDNA Reverse Transcription Kit που παρέχονται από την Applied Biosystems. 500 ng ολικού RNA χρησιμοποιήθηκε ως το υλικό εκκίνησης από το κάθε δείγμα. Για κάθε αντίδραση RealTime PCR, η αντίστροφη μεταγραφεί δείγμα χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο. Για να δοκιμαστεί γραμμικότητα δοκιμασία, μία πισίνα cDNA αρχικά αραιώνεται εν σειρά. Οι αντιδράσεις διεξήχθησαν με την παρουσία των εμπορικών δοκιμασίες έκφρασης TaqMan® Gene και 1 × συγκέντρωση του TaqMan® καθολική PCR Master Mix (Applied Biosystems). mRNA στόχος ποσοτικά χρησιμοποιώντας ένα ΗΤ Fast σύστημα πραγματικό χρόνο PCR ΑΒΙ 7900 (Applied Biosystems). Εκκινητές αγοράστηκαν από την Applied Biosystems: GANAB (γλυκοσιδάση, α? Ουδέτερο ΑΒ, Hs00929274_m1), MT2A (μεταλλοθειονίνη 2Α, Hs02379661_g1), FGA (άλφα αλυσίδα του ινωδογόνου, Hs00241027_

m1), FGB (ινωδογόνο βήτα αλυσίδα Hs00905942_

m1 ) FGG (ινωδογόνο γάμα αλυσίδα Hs00241037_

m1) FGFR2 (αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών υποδοχέα 2, Hs01552926_m1) και ARHGEF7 (Rho παράγοντα ανταλλαγής νουκλεοτιδίων γουανίνης (GEF) 7, Hs00388776_m1). Οι ανιχνευτές TaqMan σημάνθηκαν με μια «βαφή ρεπόρτερ (FAM, 6-καρβοξυφλουορεσκεΐνη) και ένα 3 ‘5 απόσβεσης χρωστική (TAMRA, 6-καρβοξυτετραμεθυλοροδαμίνη). Αντιδράσεις RealTime PCR διεξήχθησαν εις τριπλούν σε μικροαμπέρ οπτικά πλάκες 384-φρεατίων σε συνολικό όγκο 10 μΙ /φρεάτιο. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με το λογισμικό ΑΒΙ Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας (SDS), χρησιμοποιώντας τη σχετική ποσοτικοποίηση. Οι φορές αλλαγές προσδιορίστηκε με τη μέθοδο ΔΔCt όπως περιγράφεται στο Applied Biosystems User Bulletin Νο 2. Εν συντομία, το επίπεδο του κάθε mRNA στόχου κανονικοποιήθηκε προς το επίπεδο του 18S ριβοσωμικού RNA (housekeeping γονίδιο) προκειμένου να ληφθεί η ΔCt και, στη συνέχεια, ο ΔΔCt υπολογίστηκε κατά τη θεραπεία DMSO.

ανάλυση στυπώματος Western της έκφρασης β-PIX σε Caco-2, ΗΤ29 και SW480 κύτταρα, θεραπεία για 24 ώρες με διαφορετικές συγκεντρώσεις της ροσιγλιταζόνης (1, 10, 50 μΜ) , AS601245 (0.1, 1, 10) και σε συνδυασμό με θεραπεία 50 μΜ ροσιγλιταζόνη και 0,1 μΜ AS601245. Ίση φόρτωση πρωτείνης επιβεβαιώθηκε με έκθεση των μεμβρανών σε αντι-β-ακτίνης αντισώματος. Η ποσοτικοποίηση της πρωτεΐνης προϊόντα (στα δεξιά) πραγματοποιήθηκε με πυκνομετρική σάρωση. Τα δεδομένα κανονικοποιούνται χρησιμοποιώντας το σήμα β-ακτίνης και υποδεικνύονται ως μέσοι ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα. (Α) ανάλυση κηλίδας Western των Caco-2 κύτταρα και τη σχετική πυκνομετρική αξίες. (Β) ανάλυση κηλίδας Western των κυττάρων ΗΤ29 και της σχετικής πυκνομετρική αξίες. (Γ) ανάλυση κηλίδας Western των κυττάρων SW480 και σχετική πυκνομετρική αξίες. ανάλυση διακύμανσης:. * ρ & lt? 0,05, **

σ

& lt? 0,01 έναντι ελέγχου ή ροσιγλιταζόνη επεξεργασμένα κύτταρα

Η

β-PIX Η επιμόλυνση

Η β-PIX πλασμιδίου αγοράστηκε από Qiagen (EIM0195303), πολλαπλασιάστηκε σε Escherichia coli Competent Cells (Promega) ακολουθώντας πρότυπες διαδικασίες και καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας τη EndoFree πλασμιδίου Midi Kit (Qiagen). Για πειράματα παροδικής επιμόλυνσης, Caco-2, ΗΤ29 και SW-480 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε έξι φρεάτια πλάκας σε 80% συρροή, 6 μg καθαρισμένου κατασκευάσματα πλασμιδίου διαμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine 2000 (Invitrogen), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. έκφραση της β-ΡΙΧ αξιολογήθηκε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, με κηλίδα western. Για αρνητικό έλεγχο, pQE-TriSystem-6 Vector (Qiagen) χρησιμοποιήθηκε. Τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα για κάθε κατάσταση διεξήχθησαν.

Στατιστική Ανάλυση

Ο 2-way ANOVA πραγματοποιήθηκε στον πολλαπλασιασμό, προσκόλληση, μετανάστευση, οι δοκιμές απελευθέρωσης του ινωδογόνου και πυκνομετρική ανάλυση των Western blots.

η

Αποτελέσματα

η ροσιγλιταζόνη και AS601245 Επηρεάζουν κυτταρικού πολλαπλασιασμού

Προκαταρκτικά πειράματα έδειξαν ότι ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός επηρεάστηκε από τη ροσιγλιταζόνη και από AS601245 μέχρι 96 ώρες, σε μια συγκέντρωση-εξαρτώμενη τρόπο σε όλες τις τρεις γραμμές κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου που εξετάστηκαν (Εικ. 1). Εντούτοις, οι δόσεις των φαρμάκων αποτελεσματική στην αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού κατά 50% (IC50) ήταν αρκετά υψηλό. Σε κύτταρα Caco-2, IC50 ήταν 150 ± 25 μΜ για τη ροσιγλιταζόνη και 2,5 ± 1 μΜ για AS601245. Οι δόσεις είναι σε θέση να μειώσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων κατά 20% (IC20) ήταν: 50 μΜ ± 12 για τη ροσιγλιταζόνη και 0,1 μΜ ± 0.1 για AS601245. IC50 και IC20 δόσεις ήταν πολύ παρόμοιες σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές που δοκιμάστηκαν. Οι δόσεις IC20 της ροσιγλιταζόνης και AS601245, ορίζεται σε κύτταρα Caco-2, στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για τα πειράματα μικροσυστοιχιών σε αυτή την κυτταρική σειρά.

Η

κυτταρικής προσκόλλησης και Μετανάστευσης Μετά ροσιγλιταζόνη και AS601245 Θεραπείες

στην δοκιμασία προσκόλλησης, εκτελέστηκε μετά από 24 ώρες από την έναρξη της θεραπείας, η προσθήκη 50 μΜ ροσιγλιταζόνη μόνο, οδήγησε σε μείωση της κυτταρικής συγκόλλησης σε HUVEC κατά περίπου 55% σε κύτταρα Caco-2 και κατά 58% και 59% σε ΗΤ29 και SW480 κύτταρα, αντίστοιχα (Εικ. 2). Το επίπεδο της αναστολής μειώθηκε σταδιακά με κατεργασία των κυττάρων με χαμηλότερες δόσεις της ροσιγλιταζόνης. Σε μία πρώτη σειρά πειραμάτων, η ικανότητα προσκόλλησης κυττάρων προσδιορίστηκε σε κύτταρα HCT116, επίσης. Σε αυτή την κυτταρική γραμμή, προσκόλληση κυττάρου αναστάλθηκε κατά 71% μετά από θεραπεία με 50 μΜ ροσιγλιταζόνη και κατά 59% μετά από αγωγή με 10 μΜ ροσιγλιταζόνη (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η θεραπεία με 50 μΜ AS60124 μείωσε την προσκόλληση κατά περίπου 55, 72 και 60% σε Caco-2, ΗΤ29 και SW480 κύτταρα, αντίστοιχα. Το ποσοστό της αναστολής μειώθηκε σταδιακά με κατεργασία των κυττάρων με χαμηλότερες δόσεις AS601245 και την θεραπεία με 0,1 μΜ AS601245 δεν επηρέασε σημαντικά την παράμετρο αυτή. Για να επαληθευθεί αν η συνδυασμένη θεραπεία της ροσιγλιταζόνης και AS601245 θα μπορούσε να έχει ένα προσθετικό αποτέλεσμα στην αναστολή προσκόλλησης κυττάρου, 0.1 μΜ AS601245 συνδέθηκε με αυξανόμενες δόσεις ροσιγλιταζόνης. Σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές ο συνδυασμός 0.1 μΜ ροσιγλιταζόνης με 0,1 μΜ AS601245 έδειξε ένα αθροιστικό αποτέλεσμα στη μείωση κυτταρικής προσκόλλησης. Η συνδυασμένη θεραπεία του 0,1 μΜ AS601245 με τις υψηλότερες δόσεις ροσιγλιταζόνης αύξησε το αποτέλεσμα της ροσιγλιταζόνης και μόνο φθάνοντας το μέγιστο επίπεδο αναστολής. Και οι τρεις τύποι κυττάρων έδειξαν παρόμοια απόκριση στις θεραπείες.

A. έκφραση Western blot του Caco-2, ΗΤ29 και SW480 κύτταρα ελέγχου και επιμολυσμένα με τον άδειο πλασμιδίου και με την πλασμιδίου που φέρει το γονίδιο β-ΡΙΧ. B. Αναστολή της εισβολής των καρκινικών κυττάρων με μια δοκιμασία θαλάμου Boyden σε κύτταρα μορφομετατραπέντα με β-ΡΙΧ μεταφέρουν πλασμιδίου. Τα κύτταρα ελέγχου και τα επιμολυσμένα κύτταρα απλώθηκαν πάνω στην κορυφαία πλευρά του Matrigel επικαλυμμένα φίλτρα σε μέσο ελεύθερο ορού συμπληρωμένο με φάρμακα σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (10, 50 μΜ ροσιγλιταζόνη? 0,1, 1, 10, 50 μΜ AS601245) και με τη σύνδεση των διαφορετικών συγκεντρώσεις φαρμάκου επί 24 ώρες. Χημειοελκτικό που χρησιμοποιήθηκε ήταν 20% FCS συμπληρωμένο μέσο, ​​τοποθετείται στο βασεοπλευρικό θάλαμο. Τα κύτταρα μετανάστευσαν στον πυθμένα των φίλτρων χρωματίσθηκαν χρησιμοποιώντας crystalviolet και μετρήθηκαν (5 πεδία κάθε τριπλούν φίλτρα) χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο. μετανάστευση ελέγχου ήταν 45 ± 8, 51 ± 8 και 33 ± 4 κύτταρα /πεδίο μικροσκοπίου για Caco-2, ΗΤ29, SW480 κύτταρα, αντίστοιχα, και 49 ± 5, 50 ± 6 και 30 ± 6 κύτταρα /πεδίο μικροσκοπίου για Caco-2 , ΗΤ29 και SW480 κύτταρα, αντίστοιχα, μετά από επιμόλυνση με β-PIX μεταφέρουν πλασμιδίου και άδειο πλασμιδίου. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM (n = 5) του ποσοστού αναστολής συναρτήσει της μετανάστευσης ελέγχου.

Η

Μετανάστευση εξετάστηκε σε Caco-2, κυτταρικές σειρές ΗΤ29, και SW480. Ο αριθμός των κυττάρων που μετανάστευσαν πεδίου /μικροσκόπιο σε μη κατεργασμένα κύτταρα ελέγχου ήταν 45 ± 8 για τα κύτταρα Caco-2, 50 ± 3 για τα κύτταρα ΗΤ29 και 40 ± 3 για SW480 κυττάρων. Η αξία της μετανάστευσης των κυττάρων ελέγχου που εκτίθενται στο όχημα (1% DMSO) ήταν 44 ± 6 για τα κύτταρα Caco-2, 51 ± 8 για τα κύτταρα ΗΤ29 και 40 ± 5 για SW480 κύτταρα. Επιπλέον, για να αποκλείσει ότι τα αποτελέσματα που λαμβάνονται σε κατεργασμένα κύτταρα μπορεί να εξαρτάται από τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αναλύσαμε μετανάστευση των κυττάρων σε μη επεξεργασμένα κύτταρα και σε κύτταρα που υπέστησαν κατεργασία για 24 ώρες με τις υψηλότερες συγκεντρώσεις της ροσιγλιταζόνης ή AS601245 (50 μΜ) σε παρουσία μιτομυκίνης C. Αποτελέσματα λαμβάνονται κατέδειξαν ότι οι τιμές μετανάστευση ήταν παρόμοιες σε απουσία ή σε παρουσία μιτομυκίνης C (κύτταρα πεδίο /μικροσκόπιο ήταν 45 ± 8 για Caco-2 κύτταρα ελέγχου και 44 ± 6 για Caco-2 κύτταρα ελέγχου σε επεξεργασία με μιτομυκίνη? 50 ± 3 για τον έλεγχο ΗΤ29 κύτταρα και 49 ± 5 για τα κύτταρα σε επεξεργασία με μιτομυκίνη? 40 ± 3 για τον έλεγχο SW480 κύτταρα και 42 ± 8 για κύτταρα κατεργασμένα με μιτομυκίνη). Τα ποσοστά αναστολής σε κύτταρα κατεργασμένα ροσιγλιταζόνη ήταν: 65% και 64% για τα κύτταρα Caco-2, 79% και 80% για τα κύτταρα ΗΤ29 και 60% και 63% για τα SW480, με και χωρίς μιτομυκίνη, αντίστοιχα? τα ποσοστά της αναστολής της κύτταρα επεξεργασμένα AS601245 ήταν: 55% και 50% για τα κύτταρα Caco-2, 80% και 75% για τα κύτταρα ΗΤ29 και 92% και 87% για SW480 κύτταρα, με και χωρίς μιτομυκίνη, αντίστοιχα)

.

Στο Σχ. 3 αναφέρονται τα αποτελέσματα της μετανάστευσης που λαμβάνονται σε κύτταρα κατεργασμένα με ροσιγλιταζόνη, AS601245 και δύο ουσιών, εκφραζόμενη ως το ποσοστό αναστολής σε σχέση με τη μετανάστευση των κυττάρων που εκτέθηκαν στο όχημα μόνο (1% DMSO). Η μετανάστευση αναστάλθηκε σημαντικά με 10 και 50 μΜ ροσιγλιταζόνης και AS601245 και στις τρεις κυτταρικές σειρές. Οι επεξεργασίες με διαφορετικούς συνδυασμούς των συγκεντρώσεων κάτω των 50 μΜ και των δύο ενώσεων παρήγαγε ένα προσθετικό αποτέλεσμα στην αναστολή της μετανάστευσης των κυττάρων. Η συνδυασμένη θεραπεία με συγκεντρώσεις 50 μΜ ή ροσιγλιταζόνης AS601245 δεν παρήγαγαν προσθετικές επιδράσεις (τα δεδομένα δεν φαίνονται), πιθανώς επειδή αυτές οι συγκεντρώσεις, μόνο, παρήγαγε ένα ποσοστό της αναστολής κοντά στο οροπέδιο.

Microarray ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης σε κύτταρα Caco-2

Για να αναλυθεί το κατά πόσον οι κυτταρικές απαντήσεις στις θεραπείες με ροσιγλιταζόνη, AS601245 ή και με τις δύο ουσίες ήταν συνέπεια μιας συγκεκριμένης διαμόρφωσης γονίδιο οδού, πραγματοποιήσαμε την ανάλυση μικροσυστοιχιών χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα Affimetryx GeneChip. Δεδομένου ότι η αναστολή της κυτταρικής προσκόλλησης και της μετανάστευσης με ροσιγλιταζόνη και AS601245 ήταν πολύ παρόμοια και στις τρεις κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου που εξετάστηκαν, επιλέγουμε Caco-2 κυτταρική γραμμή για να πραγματοποιούν αυτή την ανάλυση, 24 ώρες μετά τις θεραπείες. Οι δόσεις που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν εκείνα σε θέση να επάγει μια αναστολή IC20 του Caco-2 πολλαπλασιασμό των κυττάρων (50 μΜ ροσιγλιταζόνη και 0,1 μΜ AS601245).

Ο αριθμός των γονιδίων που ρυθμίζονται από σημαντικά ροσιγλιταζόνη και με AS601245 ήταν πολύ υψηλό . Η πλήρης λίστα των γονιδίων που ρυθμίζονται από τη ροσιγλιταζόνη, AS601245 και από τη συνδυασμένη θεραπεία αναφέρεται στην Συμπληρωματικές πληροφορίες S1. Το διάγραμμα Venn (Εικ. 4) δείχνει ότι η ροσιγλιταζόνη διαμορφωμένο 1.260 γονίδια, AS601245 διαμορφωμένο 3.245 γονίδια και οι συνδυασμένες θεραπείες διαμορφωμένου 1188 γονίδια. Μεταξύ των γονιδίων που επηρεάζονται από μόνη της ροσιγλιταζόνης ή AS601245 μόνο, 1118 ήταν κοινά σε αμφότερες τις δύο ομάδες. Η συνδυασμένη θεραπεία επηρεάζεται 735 γονίδια τα οποία ήταν παρόντα σε τόσο η ροσιγλιταζόνη και AS601245 ομάδες, και 173 γονίδια τα οποία δεν επηρεάστηκαν από είτε ροσιγλιταζόνη ή AS601245, μόνο. Ο πίνακας 1 δείχνει τα γονίδια που επηρεάζονται από τη ροσιγλιταζόνη, κατά AS601245, και από τη συνδυασμένη αγωγή με ροσιγλιταζόνη και AS601245, διατεταγμένα σε σχέση με τις σχετικές βιολογικές λειτουργίες και που απαριθμούνται με βάση το p-value. Σύκο. Σύκο.