Αφηρημένο

μικροπεριβάλλον του όγκου (TME) είναι ένα ενεργό ρόλο στην καρκινογένεση και οι αλλαγές στη σύνθεση του να τροποποιήσει την ανάπτυξη του καρκίνου. Καρκίνωμα σχετιζόμενη ινοβλάστες, μυελό οστών πολυδύναμα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα (BMMSCs), και φλεγμονώδη κύτταρα μπορούν όλα να επηρεάσουν τη σύνθεση του ΤΜΕ που οδηγούν σε αλλαγές στον πολλαπλασιασμό, την εισβολή και σχηματισμού μετάστασης των καρκινικών κυττάρων. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε επιβεβαιώσει μια αλληλεπίδραση μεταξύ των κυττάρων του στόματος γλώσσα πλακώδες καρκίνωμα (OTSCC) BMMSCs και αναλύοντας το πρότυπο εξέλιξης εισβολή και γονιδιακή έκφραση. Σε μια 3-διαστάσεων μοντέλο εισβολή myoma οργανοτυπικό η παρουσία BMMSCs ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό αλλά αύξησε την εισβολή των κυττάρων OTSCC. Επιπλέον, τα σήματα που προέρχονται από τα κύτταρα OTSCC up-ρύθμιση της έκφρασης των φλεγμονωδών χημειοκινών από BMMSCs, ενώ τα προϊόντα BMMSC που προκαλείται από την έκφραση των γνωστών εισβολής συνδέονται μορίων από τα κύτταρα καρκινώματος. Ιδιαίτερα, μετά τις αλληλεπιδράσεις κυττάρου-κυττάρου, η CCL5 χημειοκίνης ήταν άφθονα εκκρίνεται από BMMSCs και μια λειτουργία αποκλεισμού αντίσωμα έναντι CCL5 ανέστειλε BMMSC ενισχυμένη περιοχή καρκίνο εισβολή. Ωστόσο, το κλείδωμα CCL5 αντίσωμα δεν αναστέλλει το βάθος της εισβολής. Επιπλέον, μετά από έκθεση σε BMMSCs, η έκφραση του κολλαγόνου τύπου Ι mRNA σε κύτταρα OTSCC ήταν εμφανώς τα πάνω ρυθμισμένη. Είναι ενδιαφέρον ότι, επίσης υψηλή έκφραση του κολλαγόνου τύπου Ι Ν-τερματικό προπεπτίδιο (συγκέντρωσης του PINP)

in vivo

συσχετίζεται με τον καρκίνο-ειδική θνησιμότητα των ασθενών OTSCC, ενώ δεν υπήρχε συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων CCL5 καρκινικού ιστού και τις κλινικές παραμέτρους. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ BMMSC και κύτταρα καρκινώματος επάγουν κυτοκίνη και της μήτρας μόριο έκφραση, εκ των οποίων το υψηλό επίπεδο του κολλαγόνου τύπου Ι παραγωγής συσχετίζεται με την πρόγνωση των ασθενών OTSCC.

Παράθεση: Salo S, Bitu C, Merkku Κ, Nyberg P, Bello IO, Vuoristo J, et al. (2013) ανθρώπινου μυελού των οστών μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα Προκαλέστε κολλαγόνο Παραγωγή και Tongue Cancer εισβολή. PLoS ONE 8 (10): e77692. doi: 10.1371 /journal.pone.0077692

Επιμέλεια: Δήμας Tadeu Κόβας, Πανεπιστήμιο του Σάο Πάολο – USP, Βραζιλία

Ελήφθη: 14 Ιουν, 2013? Αποδεκτές: 2 Σεπτεμβρίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 21 Οκτώβρη 2013

Copyright: © 2013 Salo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη έχει υποστηριχθεί από την Ακαδημία της Φινλανδίας, της φινλανδικής Αντικαρκινική Εταιρεία, το Ίδρυμα Sigrid Juselius, η φινλανδική Οδοντιατρικής Εταιρείας Απολλωνία, και τις επιδοτήσεις Emil Ίδρυμα Aaltonen. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το μικροπεριβάλλον του όγκου (ΤΜΕ) υφίσταται εκτεταμένες αλλαγές κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του όγκου [1] και η εξέλιξη ενός όγκου εξαρτάται από στρωματικά στοιχεία [2]. Τα κύτταρα στο μικροπεριβάλλον, συμπεριλαμβανομένου του καρκινώματος που συνδέεται με ινοβλάστες (CAFS), των οστών πολυδύναμα μεσεγχυματικά στρωματικά κύτταρα που προέρχονται από μυελό (BMMSCs), που σχετίζονται με όγκους μακροφάγα (ΤΑΜ) και άλλα φλεγμονώδη κύτταρα όπως επίσης και αγγειακά κύτταρα συμβάλλουν όλα σε διαφορετικό βαθμό με τα χαρακτηριστικά της καρκίνος και ο καρκίνος του οικοσυστήματος [3] [4]. Παράγουν εξωκυττάριας μήτρας, παράγοντες ανάπτυξης, κυτοκίνες, πρωτεάσες και ρυθμιστές τους, και έτσι, παρέχουν ένα μικροπεριβάλλον που υποστηρίζουν τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και την αθανασία, επάγει την αγγειογένεση, τον επαναπρογραμματισμό μεταβολισμό της ενέργειας, αποφεύγοντας ανοσοκαταστροφή, και ευνοώντας εισβολή και μετάσταση [5], [1 , 3,6], [4].

Στον καρκίνο του γλώσσα τα συστατικά των ΤΜΕ έχουν στοιχειώδη ρόλο στις διαδικασίες εισβολή και τη μετάσταση με άμεσο αντίκτυπο στην κλινική έκβαση των ασθενών [7]. Έχουμε δείξει ότι η υψηλή συχνότητα των CAFS σχετίζεται με κακή πρόγνωση σε ασθενείς κινητό καρκίνο της γλώσσας [8], [9]. CAFS έχουν επίσης δειχθεί να εντοπίζεται στη θέση του μεταστατικού λεμφαδένα παρομοίως προς συμφωνημένα πρωτογενών όγκων γλώσσα υποδηλώνει διευκόλυνση της μετάστασης [10]. Πρόσφατη μελέτη μας προφίλ του μοριακού cross-talk μεταξύ της στοματικής καρκινικά κύτταρα και TME και παρουσιάζονται ότι η εξέταση των γνωστών φιλο-ογκογόνο συστατικά του φλεγμονώδους διηθήματος, όπως ρυθμιστικά Τ κύτταρα, TAM2 (δηλαδή TAM υπότυπος υποστήριξη εισβολή και μετάσταση) κύτταρα, και ρυθμιστικά Τ-κυττάρου που επάγουν κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, αποκάλυψε αρνητικές επιπτώσεις για τους ασθενείς είναι παρόμοια με CAFS [11]. Οι

BMMSCs δειχθεί να ενσωματωθούν στο κατεστραμμένο ή φλεγμονή ιστών, καθώς και στο σπίτι σε όγκους και στην περιοχή της μετάστασης όπου ενταχθούν στο ΤΕΜ και παρέχει μια πηγή για τα κύτταρα, όπως CAFS [12], [ ,,,0],13] [14], [15] ,, [2]. Οι κυτοκίνες και οι αυξητικοί παράγοντες που εκκρίνονται από τα καρκινικά κύτταρα μαζί με ενδοκρινείς παράγοντες των φλεγμονωδών ιστών που περιβάλλουν τους όγκους προσελκύσει BMMSCs να στρώματος του όγκου [16]. BMMSCs έχουν δειχθεί ότι προάγει εισβολή και μετάσταση σε διάφορους καρκίνους, όπως του μαστού, του παχέος εντέρου και του λεμφικού καρκίνων [17], [18], [19]. Ωστόσο, ο αντίκτυπος και ο ρόλος των BMMSCs στο TEM και τους μηχανισμούς των πιθανών αποτελεσμάτων τους σε διαφορετικούς όγκους παραμένουν αμφιλεγόμενα [20], [21].

Εκτός από διάφορους τύπους κυττάρων, τα εξωκυττάρια μήτρα (ECM) πρωτεϊνών σε ΤΜΕ μπορούν επίσης να δρουν ως κρίσιμοι παράγοντες στη δυναμική πληροφοριακό σύστημα που επηρεάζουν έκβαση του καρκίνου [22]. Η πιο άφθονη πρωτεΐνη σε ΤΜΕ είναι κολλαγόνο τύπου Ι η οποία οδηγεί στην ανάπτυξη όγκου, εισβολή και εξάπλωση του καρκίνου. Ιδιαίτερα, η απελευθέρωση της αμινοτελικό προπεπτίδιο του προκολλαγόνου τύπου Ι (συγκέντρωσης του PINP) δείχνει την προκαλούμενη από όγκο ινο-πολλαπλασιαστική αντίδραση [22-24].

Ο στόχος αυτής της εργασίας ήταν να διερευνηθεί η επίδραση της BMMSCs και κύτταρα καρκινώματος αλληλεπιδράσεις επί της έκφρασης γονιδίων OTSCC, εισβολή και την κλινική έκβαση των ασθενών OTSCC. Εδώ αποδείξαμε ότι BMMSCs που προκαλείται καρκινικών κυττάρων OTSCC εισβολή

in vitro

εν μέρει μέσω της σηματοδότησης CCL5 χημειοκινών από την αναστολή της μείωσε την περιοχή εισβολή. Σε κύτταρα OTSCC η έκφραση του κολλαγόνου τύπου Ι το mRNA ρυθμίζεται προς τα πάνω με τα σήματα που προέρχονται από BMSCC, και το υψηλό επίπεδο έκφρασης των ανοσοαντιδραστικών προκολλαγόνο τύπου Ι συσχετίζεται με την ειδική για τον καρκίνο θνησιμότητα των ασθενών OTSCC.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Ανθρώπινο γλώσσα κύτταρα πλακώδους καρκινώματος HSC-3 (JCRB 0623? Οσάκα Εθνικό Ινστιτούτο Επιστημών Υγείας, Osaka, Japan), SAS ( . JCRB 0260? Οσάκα Εθνικό Ινστιτούτο Επιστημών Υγείας, Osaka, Japan) και τα ανθρώπινα δυσπλαστικών στόματος κερατινοκύτταρα DOK (Ευρωπαϊκή Συλλογή Καλλιεργειών κυττάρων 94122104, Salisbury, Μαρασμοί, UK) καλλιεργήθηκαν σε 1: 1 DMEM /F-12 (Invitrogen) συμπληρώνεται με 100 U /ml πενικιλλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, 50 μg /ml ασκορβικό οξύ, 250 ng /ml fungizone, 5 μg /ml ινσουλίνη (βόεια πάγκρεας), 0.4 μg /ml υδροκορτιζόνη (όλα από την Sigma-Aldrich), και 10% θερμο-απενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό (FBS). Για ζυμογραφία, βόειο εμβρυϊκό ορό αντικαταστάθηκε από 0,5% λακταλβουμίνη (Sigma-Aldrich). BMMSCs προερχόμενα από μυελό οστών ανθρώπου είχαν αρχικά ελήφθησαν από ασθενείς που λειτουργεί για κάταγμα ισχίου ή της οστεοαρθρίτιδας. Η επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Oulu είχε εγκρίνει το πρωτόκολλο της μελέτης (Δηλώσεις 4 /2000,58 /2009 και 21/2011? Ερευνών Ημερολόγιο 180/2001 και 12/2004) και οι ασθενείς είχαν δώσει ενημέρωσε τη γραπτή συγκατάθεσή τους για τη συμμετοχή στη μελέτη . Οι BMMSCs χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη συλλέχθηκαν και καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25] [26]. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν με κύτταρα με χαμηλούς αριθμούς δίοδο 3 – 4. ινοβλάστες Ανθρώπινα ούλων (GF) χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη ελήφθησαν από βιοψίες υγιών ούλων όπως περιγράφηκε νωρίτερα [27]. Καρκίνωμα σχετιζόμενη ινοβλάστες (CaDEC12) [11] που προέρχεται από ένα δείγμα του SCC γλώσσας, καθώς και κανονικά από το στόμα ινοβλάστες (NOFs) [28] καλλιεργήθηκαν εντός του ίδιου μέσου ως ΤΕ [27]. Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 στους 37 ° C. Σε BMMSC ή GF συν-καλλιέργειες με HSC-3, χρησιμοποιήθηκε κύτταρα SAS ή DOK BMMSC ή μέσα GF πολιτισμό.

Οργανοτυπικές εισβολή δοκιμασία

Η δοκιμασία εισβολή οργανοτυπικό και η ποσοτικοποίηση της εισβολής διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29]. Σε προσδιορισμούς μονοκαλλιέργεια 2,0 χ 10

5 – 4. x 10

5 HSC-3 ή SAS κύτταρα ή 2 x 10

5 κύτταρα DOK καλλιεργήθηκαν στην κορυφή του δίσκου myoma για 10 – 14 ημέρες. Στην συν-καλλιέργειας προσδιορισμούς για 0.5 – 1.5 χ 10

5 BMMSCs προστέθηκαν μαζί με τα καρκινικά κύτταρα στην κορυφή των δίσκων myoma (OTSCC: αναλογία BMMSC κυμαίνεται από 2: 1 έως 5: 1). Οι ιστολογικές τομές των δίσκων myoma βάφτηκαν με μονοκλωνικό αντίσωμα pancytokeratin (DAKO, κλωνοποιήσουν AE1 /AE3). Ο μέσος όρος των περιοχή εισβολής ή βάθος οποιωνδήποτε άλλων κυττάρων ελέγχου αναπτύχθηκαν σε μονοκαλλιέργεια HSC-3, SAS, DOK ή ορίστηκε ως 100%. Για την αναστολή της εισβολής, 50 μg /ml του μονοκλωνικού αντισώματος κατά της ανθρώπινης CCL5 (R λεμφαδένες δωρεάν της μεταστατικής νόσου εξετάστηκαν από D.D. και Μ.ν.). Διαφορετικά πρότυπα ταξινόμησης έκφρασης επιλέχθηκαν. Κατά την πρώτη δείγματα ταξινομήθηκαν με βάση την συνολική διαφορά της χρώσης μεταξύ των επιφανειακών και επεμβατική εμβαδά των όγκων ταξινομήθηκαν (χρώση φαίνεται πιο εντατική σε επιφανειακές περιοχές του όγκου ή χρώση φαίνεται πιο εντατική σε επεμβατική περιοχές του όγκου). Το ποσοστό των θετικών κυττάρων στα στρωματικά κύτταρα και καρκινικά τόσο στις επιφανειακές και επεμβατική περιοχές του όγκου βαθμολογήθηκε σε μια κλίμακα τεσσάρων σημείων (0 = 0%, 1 = 0-25%, 2 = 25-50% και 3 = & gt? 50%, με τον τίτλο όχι, χαμηλή, μέτρια και υψηλή έκφραση, αναλόγως). Επιπλέον, αξιολογήθηκε η παρουσία χρώσης συγκέντρωσης του PINP στο αίμα και λεμφαγγεία. Η υποεπιθηλιακή στρώμα μορφολογικά φυσιολογικό επιθήλιο επίσης χρωματίζονται. Στο δυσπλαστικών sites βλεννογόνο τόσο επιθηλιακά κύτταρα και τα στρωματικά κύτταρα υποεπιθηλιακή αναλύθηκαν.

Παρέμβαση RNA

Τρεις εμπορική CCR5 μικρή φουρκέτα RNA (shRNA) ολιγονουκλεοτίδια (Thermo Scientific # VGH5518-98903425, # VGH5518-99159618, # VGH5518-99294601) και μη φίμωση ελέγχου (Thermo Scientific # RHS4348) ελήφθησαν από Thermo Scientific Open Biosystems GIPZ λεντοϊών shRNAmir Βιβλιοθήκη (Thermo Scientific). Οι μεταγωγές του HSC-3 κύτταρα με ιικό και τον έλεγχο φορέων διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή με πουρομυκίνη (Sigma-Aldrich) επιλογή. Η αποτελεσματικότητα της knockdown από CCR5-shRNA προσδιορίστηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής με τη χρήση μονοκλωνικών anti-CCR5 αντισώματος (BD Pharmingen, # 556903) και ισότυπου IgG (BD Pharmingen, # 555576) σαν μάρτυρα. Περίπου το 70% knockdown του CCR5 ελήφθη σε σύγκριση με μη-σίγηση κύτταρα ελέγχου με ένα από τα εμπορικά ολιγονουκλεοτίδια (Thermo Scientific # VGH5518-99159618).

Η στατιστική ανάλυση

Όλες οι αναλύσεις επαναλήφθηκαν 2 έως 4 φορές, εκτός από τη δοκιμασία εισβολής 3D με κύτταρα SAS και η DOK που έγινε μόνο μία φορά με τριπλούν δίσκοι myoma ανά μονο- ή συν-καλλιέργεια. Οι διαφορές στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την επούλωση των πληγών, περιοχή εισβολή και βάθος αξιολογήθηκαν με τη χρήση t-test του Student. Σε όλα τα πειράματα, μια

σ

-τιμή μικρότερη από 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Για στατιστικές αναλύσεις του υλικού ασθενών που χρησιμοποιήσαμε PASW Στατιστικής 18 (corp. IBM) λογισμικού. Μια chi-square-test χρησιμοποιήθηκε για να υπολογιστεί στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ προγνωστικών και κλινικοπαθολογοανατομικές μεταβλητές. πίνακες επιβίωσης υπολογίστηκαν σύμφωνα με τη μέθοδο Kaplan-Meier, και συγκρίθηκαν με την δοκιμασία log-rank. Πολυμεταβλητή ανάλυση επιβίωσης και στην επανάληψη έγιναν με το μοντέλο αναλογικού κινδύνου του Cox, χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες συμπαράγοντες: το φύλο (αρσενικό ή θηλυκό), ηλικία κατά τη στιγμή της διάγνωσης (& lt? 55 ετών, 55-70 ετών και & gt? 70 ετών), το στάδιο του όγκου (1-4) και του όγκου ιστολογική βαθμός (φρεάτιο = 1, μέτρια = 2 και κακώς = 3 διαφοροποιημένα καρκινώματα σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας ταξινόμηση καρκίνωμα κεφαλής και τραχήλου (2005) μαζί με τις μεταβλητές μοτίβο έκφρασης συγκέντρωσης του PINP όπως υποδεικνύεται. Cox παλινδρόμησης έγινε χρησιμοποιώντας πίσω σταδιακή επιλογή των μεταβλητών, και

σ

αξίας 0,05 υιοθετήθηκε ως όριο για την ένταξη της συμμεταβλητή.

Αποτελέσματα

BMMSCs προκαλέσουν εισβολή των κυττάρων του καρκίνου της γλώσσας στην 3D [29] που είναι πιο πιστοί στην ανθρώπινη TME από τα προηγούμενα μοντέλα που προέρχονται ζωικό ιστό. καρκινικών κυττάρων in vitro οργανοτυπικές μοντέλο

Η επίδραση της BMMSCs στη γλώσσα εισβολή καρκινικών κυττάρων εξετάστηκε στο μοντέλο myoma οργανοτυπικό ανθρώπινη γλώσσα, HSC-3, SAS ή δυσπλαστικών DOK κύτταρα καλλιεργήθηκαν ως μονοκαλλιέργεια ή σε συν-καλλιέργεια με BMMSCs στην κορυφή των δίσκων myoma. Μετά από 10 – 14 ημέρες περιοχή εισβολή και βάθος ποσοτικοποιήθηκαν με ανάλυση εικόνων που λαμβάνονται από pancytokeratin λεκιασμένο ιστολογικές τομές από μονοκαλλιέργεια και συν-καλλιέργεια δίσκων. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1, BMMSCs προκάλεσε μια αύξηση στην περιοχή εισβολή, και ακόμη και μια σαφέστερη επίδραση παρατηρήθηκε με το βάθος εισβολή σε HSC-3-BMMSCs συν-καλλιέργειες (Σχήμα 1Α-1Β). Μια μικρή αύξηση στην περιοχή εισβολή παρατηρήθηκε επίσης με κύτταρα SAS παρουσία BMMSCs, αν και δεν είναι στατιστικά σημαντική. Ωστόσο, φάνηκε να υπάρχει επίδραση επί βάθος εισβολή (Σχήμα 1C-1D) εκεί. Είναι ενδιαφέρον, BMMSCs ανέστειλε την εισβολή των κυττάρων δυσπλαστικών DOK (Σχήμα 1 D-1E) υποδηλώνοντας μια διαφορετική επίδραση των BMMSCs επί κυττάρων καρκινώματος σε σύγκριση με μη-κακοήθη κύτταρα.

Bone BMMSCs προέρχονται από μυελό ενισχύσει την εισβολή των HSC-3 κύτταρα (Α, Β), αλλά όχι δυσπλαστικά κύτταρα (E, F) σε 3D μοντέλο myoma οργανοτυπικό [29]. Μικρή αύξηση, αν και δεν είναι στατιστικά σημαντική, παρατηρήθηκε στην περιοχή της εισβολής της SAS (C, D). Ιστολογικές τομές που λαμβάνονται από τους δίσκους myoma βάφτηκαν με μονοκλωνικό αντίσωμα pancytokeratin (DAKO, κλωνοποιήσουν AE1 /AE3) και φωτογραφήθηκαν σε 100 x μεγεθύνσεις με ένα μικροσκόπιο DMRB φωτογραφία που συνδέονται με DFC 480 κάμερα χρησιμοποιώντας το λογισμικό QWin V3 (Leica Microsystems). Κλίμακα bar 100 μm.

Η

Για να μελετήσουμε αν η αυξημένη εισβολή των HSC-3 κύτταρα οφείλεται σε αυξημένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων, HSC-3 και η SAS κύτταρα καλλιεργήθηκαν πάνω σε δίσκο myoma ως μονοκαλλιέργεια ή συν ΠΑΡΑΔΟΣΗΣ με BMMSCs ή ΤΕ. Οι ιστολογικές τομές λήφθηκαν από αυτές τις δίσκοι ανοσοχρώση με το δείκτη πολλαπλασιασμού Κί67 και θετικά κύτταρα υπολογίστηκαν όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. επίπεδα του πολλαπλασιασμού των κυττάρων ήταν σημαντικά χαμηλότερα σε HSC-3 και η SAS συν-καλλιέργειες με BMMSCs σε σύγκριση με συν-καλλιέργειες με ΤΕ (Σχήμα 2Α-2Β). Για να επιβεβαιωθεί ότι το αποτέλεσμα φαίνεται στο ιστολογικές τομές προήλθε από το μειωμένο πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, HSC-3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν ως μονο- ή συν-καλλιέργεια σε πλακίδια θαλάμου καλλιέργειας κυττάρων με BMMSCs επισημασμένο με μια φθορίζουσα χρωστική. Μετά συν-καλλιέργεια όλη την νύχτα, τα κύτταρα χρωματίστηκαν για Κί67. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 2C, BMMSCs ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων HSC-3 σημαντικά επίσης στον προσδιορισμό κυττάρων συν-καλλιέργεια. Η βιωσιμότητα των κυττάρων HSC παρέμεινε ακόμη υψηλό και κανένα σημάδι απόπτωσης ανιχνεύθηκε (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Οι ιστολογικές τομές που λαμβάνονται από τους δίσκους myoma χρωματίστηκαν με πολυκλωνικό αντι-Κί67 αντισώματα. BMMSCs αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των HSC-3 και SAS κύτταρα σε οργανοτυπικές μοντέλο εισβολή (Α, Β), καθώς και σε προσδιορισμούς κυτταρικής καλλιέργειας (C), και μετατόπιση HSC-3, αλλά όχι δυσπλαστικά κύτταρα DOK προς μια μεταναστευτικών φαινότυπο με λιγότερο κυττάρου-κυττάρου επαφών (D, αιχμές βελών). Κανονική ούλων ινοβλάστες, ΤΕ, προωθούν το κλείσιμο του τραύματος πάνω από BMMSCs δυνητικά εν μέρει λόγω της αύξησης του κυτταρικού πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων (Ε). μπαρ κλίμακα 50 μm.

Η

Καθώς ο πολλαπλασιασμός δεν αυξήθηκε, για να αξιολογήσει εάν η αυξημένη εισβολή ήταν μια συνέπεια του υψηλότερου μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων σε δοκιμασία το μηδέν έγινε με HSC-3 και DOK κύτταρα εμβολιάζονται μόνο του ή μαζί με BMMSCs ή ΤΕ σε πλάκες 24 φρεατίων. BMMSCs μετατοπίστηκε HSC-3 κύτταρα, αλλά όχι δυσπλαστικά κύτταρα DOK, προς μια μεταναστευτικών φαινότυπο με δομές ελασματοπόδια και λιγότερο κυττάρου-κυττάρου επαφές (Σχήμα 2D). Ωστόσο, ΤΕ προωθείται ταχύτερο κλείσιμο πληγών από BMMSCs, η οποία μπορεί να οφείλεται εν μέρει στις επιδράσεις του ορού επί της ικανότητας πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων (Σχήμα 2D-2Ε)

Η έκφραση των χημειοκινών CCL5 είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε BMMSCs μετά αλληλεπίδραση με τα καρκινικά κύτταρα

BMMSCs στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν με ρυθμισμένα μέσα που λαμβάνονται από HSC-3. Παρά το γεγονός ότι αρκετά γονίδια ρυθμίστηκαν προς τα πάνω, η μεγαλύτερη αύξηση στην έκφραση του γονιδίου σε BMMSCs παρατηρήθηκε σε γονίδια χημειοκίνης (Πίνακας 2). Όταν η έκφραση των χημειοκινών εξετάστηκε σε επίπεδο πρωτεΐνης η έκφραση του CCL5 βρέθηκε να είναι κατά κύριο λόγο ένα αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης μεταξύ HSC-3 και BMMSC κύτταρα μάλλον παρά από τις συν-καλλιέργειες των HSC-3 κύτταρα και ΤΕ (Σχήμα 3Α). Παρόμοια ευρήματα ελήφθησαν από συν-καλλιέργειες των SAS και BMMSCs, αλλά όχι από κύτταρα που αλληλεπιδρούν με DOK BMMSCs (Σχήμα 3Α). Στο επίπεδο πρωτεΐνης, το επάνω-ρύθμιση των περισσότερων από τις χημειοκινών εισηγμένη στο πίνακα 2 ευρέθη να προέρχονται από OTSCC κυτταρικές γραμμές αλληλεπιδράσεις με τόσο BMMSCs και ΤΕ. Ορισμένες χημειοκίνες, όπως CCL2, CCL20 και CXCL8, επίσης ρυθμίζεται προς τα πάνω, ως αποτέλεσμα των αλληλεπιδράσεων μεταξύ κυττάρων και BMMSCs DOK, όπως μελετήθηκε σε ανοσοδοκιμασίες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Gene

Σύμβολο

φορές μεταβολής

χημειοκινών (CC μοτίβο) συνδέτη 2CCL2830.66chemokine (CC μοτίβο) συνδέτη 5CCL5194.90chemokine (CC μοτίβο) συνδέτη 20CCL20182.23chemokine (CXC μοτίβο) συνδέτη 1CXCL1134.91chemokine (CXC μοτίβο) συνδέτη 2CXCL280.98chemokine (CXC μοτίβο) συνδέτη 3CXCL380 .14chemokine (CXC μοτίβο) συνδέτη 5CXCL573.90chemokine (CXC μοτίβο) συνδέτη 8 (ιντερλευκίνη 8) CXCL8 (IL8) 18.06chemokine (CC μοτίβο) συνδέτη 13CXCL1316.86Table 2. Μέχρι ρυθμιζόμενων γονιδίων χημειοκινών στην BMMSCs μετά από έκθεση σε κλιματιζόμενο HSC-3 μέσα καλλιέργειας κυττάρων (πάσο αλλαγή & gt? 2).

CSV Λήψη CSV

Συν-καλλιέργεια των κυττάρων OTSCC με BMMSCs αποτελέσματα στην υψηλή έκφραση των χημειοκινών CCL5 σε HSC-3 και η SAS κύτταρα, αλλά όχι σε κύτταρα DOK δυσπλαστικών (ΈΝΑ). Λειτουργία-αποκλειστές μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι CCL5 (Mab CCL5) αναστέλλει ελαφρώς BMMSC ενισχυμένη περιοχή εισβολή, αλλά δεν έχει καμία επίδραση στο βάθος εισβολή, ενώ το αντίσωμα έναντι CXCL1 δεν αυξάνει το ανασταλτικό αποτέλεσμα σε OTSCC εισβολή (Β, C).

Λειτουργία μπλοκαρίσματος αντίσωμα έναντι CCL5 αναστέλλει BMMSC αυξημένη περιοχή εισβολή

Εμείς διερευνηθεί επόμενο τη σημασία της CCL5 στην εξάπλωση του καρκίνου της γλώσσας, δεδομένου ότι CCL5 έχει αποδειχθεί για να προωθήσει την κινητικότητα του στόματος καρκινικά κύτταρα [32]. CCL5 αποδείχθηκε επίσης ότι είναι σημαντική στην πρόοδο του όγκου των διαφόρων μορφών καρκίνου, όπως του μαστού και του παχέος καρκίνωμα [17,33]. Ως εκ τούτου, ελέγξαμε την επίδραση αντισώματος λειτουργία μπλοκαρίσματος CCL5 επί OTSCC και BMMSC συν-καλλιέργειες στο 3D μοντέλο εισβολή. Δοκιμάσαμε επίσης τη δυνητική επίδραση της αναστολής αντισώματος έναντι CXCL1 για εισβολή λειτουργία, αφού CXCL1 εκφράστηκε επίσης από BMMSC-HSC-3 αλληλεπίδρασης και έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι είναι παρόντες σε καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του μαστού, του πνεύμονα, του παχέος εντέρου και του προστάτη είναι υπέρ ή καταστέλλοντας την εξέλιξη του όγκου [34-36]. Στον καρκίνο του στόματος CXCL1 έχει προταθεί να έχει ένα ρόλο στην πρόοδο του όγκου δεδομένου ότι σε δείγματα ασθενών, η έκφραση του CXCL1 έχει δειχθεί να σχετίζονται με διήθηση λευκοκυττάρων, μετάσταση λεμφαδένα, και την αγγειογένεση [37]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, η λειτουργία CCL5-blocking μονοκλωνικό αντίσωμα ήταν σε θέση να μετριάσει σημαντικά την BMMSC-προωθείται HSC-3 περιοχή εισβολή των κυττάρων, αλλά δεν είχε καμία επίδραση επί βάθος εισβολή (Σχήμα 3Β-3C). CXCL1 δεν είχε επίδραση στην εισβολή καθώς δεν αύξησε το ανασταλτικό αποτέλεσμα του CCL5 στο μοντέλο εισβολή 3D (Σχήμα 3Β-3C).

Σε δείγματα ασθενών CCL5 εκφράζεται κυρίως από φλεγμονώδη κύτταρα και μερικά καρκινικά κύτταρα, αλλά μόνο αραιά CAFS είναι CCL5 θετικά

Στη συνέχεια, για να αξιολογηθεί η σημασία της έκφρασης CCL5 σε δείγματα όγκων των ασθενών για τη διάγνωση του καρκίνος της γλώσσας, ιστολογικές τομές που αντιπροσωπεύουν διαφορετικά στάδια δυσπλαστικών αλλοιώσεων και καρκινώματα γλώσσα από ασθενείς ανθρώπους χρωματίστηκαν με αντίσωμα αντι-CCL5. Η έκφραση του CCL5 ήταν ως επί το πλείστον ανιχνεύθηκαν στα φλεγμονώδη κύτταρα και σε μερικά καρκινικά κύτταρα (Σχήμα 4Α-4Β), αλλά μόνο αραιά CAFS ήταν CCL5 θετικά, όπως αξιολογείται με ανοσοϊστοχημική συν-εντοπισμό των CCL5 και CAF δείκτη αSMA (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, η έκφραση του CCL5 δεν συσχετίστηκε με την κλινική έκβαση των ασθενών OTSCC (δεν φαίνεται). Η έκφραση του CCL5 μελετήθηκε περαιτέρω σε φυσιολογικά πρωτογενή στόματος ινοβλάστες (NOF, [28]) και κύτταρα CaDEC12 [11]. Immunoassay ανίχνευση εκκρίνεται CCL5 σε μέσα κυτταρικής καλλιέργειας έδειξαν πολύ χαμηλή ή καθόλου έκφραση CCL5 σε φυσιολογικούς ινοβλάστες, αλλά σημαντική υψηλότερη έκφραση σε κύτταρα CaDEC12 (Σχήμα 4C).

CCL5 εκφράζεται κυρίως από φλεγμονώδη κύτταρα σε ΤΜΕ και μερικά καρκινικά κύτταρα σε δείγματα ασθενών, όπως φαίνεται από ανοσοχρώση με Pab CCL5, αλλά μόνο αραιά CAFS είναι θετικά για CCL5 (Α, Β). κύτταρα CaDEC12, οι πρωτογενείς καλλιέργειες CAFS ελήφθησαν από ασθενείς με καρκίνο της γλώσσας, εκφράζουν σχετική ποσότητα CCL5 σύγκριση με NOFs, κανονικά από το στόμα ινοβλάστες (C). Κλίμακα ράβδου 100 μm.

Η

Ο ρόλος του CCL5 άξονα /CCR5 δεν είναι κρίσιμη σε BMMSC αυξημένη καρκίνο γλώσσα εισβολή

Η σηματοδότηση CCL5 σε καρκινικά κύτταρα έχει προταθεί ότι διαμεσολαβείται κυρίως, αλλά όχι απαραίτητα αποκλειστικά, μέσω του υποδοχέα CCR5 [38]. Αμφότερα τα κύτταρα HSC-3 και SAS έδειξαν να εκφράζουν αυτόν τον υποδοχέα (Σχήμα 5Α). Στην συν-καλλιέργεια περίπου όλα τα καρκινικά κύτταρα εξέφρασαν CCR5, ωστόσο, σε μονοκαλλιέργειες περίπου μόνο το 25% των καρκινικών κυττάρων ήταν θετικό για CCR5 που υποδηλώνει ότι μια επαφή με στρωματικά κύτταρα ή επαγωγή CCL5 απαιτείται για υψηλότερη έκφραση CCR5 (ανάλυση κυτταρομετρίας ροής, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται ). Η ένωση των CCL5 και της έκφρασης CCR5 έχει προταθεί πρόσφατα και από άλλους [39,40]. Καθώς ο άξονας CCL5-CCR5 έχει δειχθεί ότι προάγουν την κινητικότητα των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του στόματος

in vitro

[32] και για να επάγει την έκφραση του ΜΜΡ9 [32], εξετάσαμε επίσης την επίδραση της rCCL5 στην έκφραση ΜΜΡ9 επίπεδα σε HSC-3 και SAS, καθώς και σε δυσπλαστικά κύτταρα DOK. Παρομοίως με τα προηγούμενα παρατήρηση με Chung και συνεργάτες [32] rCCL5 αυξήθηκε σαφώς την έκφραση της ΜΜΡ9 σε HSC-3 κύτταρα και τα κύτταρα SAS, αλλά όχι σε κύτταρα DOK δυσπλαστικά (Σχήμα 5Β). Ωστόσο, rCCL5 δεν προκάλεσε επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ), όπως αναλύθηκε με κηλίδωση Western με αντι-βιμεντίνη αντίσωμα, ή τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Ο υποδοχέας CCL5 CCR5 εκφράζεται σε HSC-3 και τα κύτταρα SAS, αλλά όχι σε BMMSCs (Α). rCCL5 μπορεί να επάγει την έκφραση του ΜΜΡ9 σε HSC-3 και SAS, αλλά όχι σε κύτταρα DOK (Β). Η σίγηση της έκφρασης του υποδοχέα CCR5 σε HSC-3 κύτταρα ρυθμίζει προς τα κάτω την έκφραση του γονιδίου περίπου 70% σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου και μπλοκάρει τη σηματοδότηση αύξηση της έκφρασης της ΜΜΡ9 σε καρκινικά κύτταρα (C, D). CCR5 νοκ ντάουν να έχει μικρή ή καμία επίδραση στην BMMSC αυξημένη εισβολή των HSC-3 κύτταρα σε οργανοτυπικό μοντέλο 3D (E, F).

Η

Για να εξερευνήσουν τη σημασία της άξονα CCL5 /CCR5 στην εξάπλωση του καρκίνου της γλώσσας, πραγματοποιήσαμε μια 3D μελέτη εισβολή με τη SAS και HSC-3 OTSCC κύτταρα με μειωμένη έκφραση CCR5 και με το αντίσωμα λειτουργία αποκλεισμού κατά CCL5. Πρώτον, ανέστειλε την έκφραση του CCR5 με μεταγωγή HSC-3 κύτταρα με CCR5-shRNA και παρήγαγε μια σταθερή κυτταρική σειρά με ~ 70% αναστολή της έκφρασης CCR5 και μειωμένη απόκριση σε rCCL5 επαγωγή (Σχήμα 5C, 5D). Στην δοκιμασία εισβολής 3D συν-καλλιέργειας τα CCR5 knockdown κυττάρων εισέβαλαν εξίσου ή από τον άγριου τύπου ή τον έλεγχο HSC-3 κύτταρα σε μεταγωγή με μη φίμωση shRNA (Σχήμα 5Ε, 5F). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν επίσης με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα κατά του CCR5 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Έκφραση του κολλαγόνου και της επιθηλιακής πλαστικότητας συστατικά επάγονται σε καρκινικά κύτταρα μετά την αλληλεπίδραση BMMSC

Πιθανοί μηχανισμοί της εισβολής προαγωγικό αποτέλεσμα του BMMSCs σε καρκινικά κύτταρα μελετήθηκαν περαιτέρω με ανάλυση μικροσυστοιχιών. HSC-3 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για τα πειράματα, αφού ανταποκρίθηκαν με μεγαλύτερη σαφήνεια σε σχέση με τα κύτταρα BMMSCs SAS, ειδικά στο 3D μοντέλο εισβολή. HSC-3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν ως μονοκαλλιέργεια ή συν-καλλιέργεια με κύτταρα BMMSC σε πλάκες 6 φρεατίων για 24 ώρες μετά από την οποία HSC-3 κύτταρα διευθετηθεί από συν-καλλιέργειες με FACS (δεν φαίνεται) και RNA εκχυλίστηκε για την ανάλυση μικροσυστοιχιών .