Αφηρημένο

Ενδοκυστική Bacillus Calmette-Guérin (BCG) έχει δειχθεί ότι επάγει μια ειδική ανοσολογική απόκριση (

δηλαδή

, η ενεργοποίηση της IL-2 και τελεστές Τ-κύτταρα), ενώ προκλινικές μελέτες με ALT-803 (μεταλλαγμένη IL-15 αναλόγου σε συνδυασμό με IL-15Ra-Fc σύντηξης) έχουν δείξει υποσχόμενα αποτελέσματα με παράταση χρόνου ημιζωής του πράκτορα και την τόνωση CD8 + Τ-κύτταρα. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, υποθέσαμε ότι η ενδοκυστική χορήγηση της ALT-803 μαζί με BCG θα δημιουργήσει μια ανοσολογική απόκριση οδηγώντας σε σημαντική μείωση του φορτίου του όγκου της ουροδόχου κύστης. Χρησιμοποιώντας μια καθιερωμένη καρκινογόνος προκαλείται από αρουραίο μη μυών διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης (NMIBC) μοντέλο, μελετήσαμε τα αποτελέσματα της ενδοκυστική ALT-803 με και χωρίς BCG. ιστούς αρουραίου αξιολογήθηκαν για την τεκμηρίωση της ανταπόκρισης στη θεραπεία. Ενδοκυστική ALT-803 ήταν ασφαλής και καλά ανεκτή μόνο και σε συνδυασμό με BCG. Ως μοναδικός παράγοντας θεραπείας, ALT-803 μείωσε το φορτίο του όγκου κατά 35% σε σύγκριση με τον έλεγχο, ενώ BCG μόνο μείωσε μόνο το φορτίο του όγκου κατά 15%. Ωστόσο, ο συνδυασμός των ALT-803 συν BCG μειωθεί το φορτίο του όγκου κατά 46% σε σύγκριση με τον έλεγχο. Ανοσολογική παρακολούθηση πρότεινε ότι η απόκριση κατά του όγκου συνδεόταν με την παραγωγή και έκκριση της IL-1α, IL-1β και RANTES, το οποίο με τη σειρά του, που προκαλείται από τον πολλαπλασιασμό και την ενεργοποίηση των ΝΚ κυττάρων. Τέλος, όγκων αντιδράσεις του συνδυαστικού θεραπεία σχετίστηκαν με μείωση 76% στην αγγειογένεση, η οποία είναι σημαντικά υψηλότερη από ό, τι όταν αξιολογείται με τον κάθε παράγοντα ξεχωριστά. Το αυξημένο θεραπευτικό δείκτη δει με αυτό το duplet παρέχει αιτιολόγηση για την ανάπτυξη αυτού του σχήματος για τις μελλοντικές κλινικές δοκιμές

Παράθεση:. Gomes-Giacoia Ε, Miyake Μ, Goodison S, Sriharan Α, Zhang G, Μπορείτε L, et al. (2014) Ενδοκυστική ALT-803 και BCG θεραπεία Μειώνει όγκου του φορτίου σε ένα καρκινογόνο Induced καρκίνο της ουροδόχου κύστης Rat μοντέλο? Ένας ρόλος για κυτοκίνης Παραγωγής και ΝΚ κυττάρων επέκτασης. PLoS ONE 9 (6): e96705. doi: 10.1371 /journal.pone.0096705

Συντάκτης: Robert Hurst, Οκλαχόμα Πανεπιστήμιο Επιστημών Υγείας Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 14, Ιανουαρίου 2014? Αποδεκτές: 10 Απριλίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 4 Ιουνίου 2014

Copyright: © 2014 Gomes-Giacoia et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από το James και η Εσθήρ βασιλιάς Βιοϊατρικών Επιστημών Ομάδα Έργου 1KT-01 (CJ Rosser). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Η ακόλουθη συγγραφείς αυγό, ΜΜ, SG, AS, GZ, ASP, KXC και CJR έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα. LY, JOE, PRR και HCW είναι υπάλληλοι της Altor BioScience Corp. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

καρκίνου της ουροδόχου κύστης (BCA) είναι η πέμπτη πιο κοινή κακοήθεια στις Ηνωμένες Πολιτείες, για να διαγνωστεί σε περίπου 74.690 ασθενείς με αποτέλεσμα περίπου 15.580 θανάτους το 2014 [1]. Εβδομήντα έως ογδόντα τοις εκατό των ασθενών με BCA παρούσα με μη μυϊκή διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης (NMIBC), η οποία είναι ο καρκίνος περιορίζεται στο βλεννογόνο της ουροδόχου κύστης [2], [3]. NMIBC αντιμετωπίζεται από διουρηθρική εκτομή των όγκων που ακολουθείται από τη χορήγηση του ανοσοενισχυτικού ενδοκυστικής χημειοθεραπείας ή ενδοκυστική Bacillus Calmette-Guérin (BCG), το οποίο μπορεί να μειώσει τα ποσοστά υποτροπής και παρατείνουν το διάστημα χωρίς εξέλιξη [2] – [4]. Παρά το γεγονός αυτό, περίπου το 50-60% των ασθενών NMIBC που υποβάλλονται σε εκτομή και ενδοκυστική θεραπεία θα βιώσουν μια υποτροπή του όγκου [5]. Επιπλέον, από εκείνους που βιώνουν μια υποτροπή, περίπου το 30% θα προχωρήσουν και να υποκύψει στην ασθένεια τους για μια περίοδο 15 ετών, ενώ ένα άλλο 50% θα υποστούν ριζική κυστεκτομή, σε μια προσπάθεια να ελέγξουν την ασθένειά τους [6]. Ως εκ τούτου, ένα βασικό θέμα στον τομέα παραμένει η ανάγκη για καλύτερη θεραπευτική εναλλακτικές λύσεις για τη μείωση των ποσοστών υποτροπής, να βελτιώσουν τα ποσοστά επιβίωσης και να αποτρέψει την ανάγκη για ριζική χειρουργική επέμβαση.

Ο ακριβής μηχανισμός δράσης μέσω του οποίου ενδοκυστική BCG ασκεί αντι του -tumorigenic αποτελέσματα δεν είναι γνωστή. Ωστόσο, είναι σαφές ότι η δραστηριότητα BCG εξαρτάται από επαγωγή των φλεγμονωδών αποκρίσεων που περιλαμβάνουν την ενεργοποίηση των πολλαπλών τύπων κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος. Αρχικά, ενδοκυστική BCG δεσμεύεται με την επένδυση ουροφόρων και στη συνέχεια εσωτερικεύεται και υφίσταται επεξεργασία από κανονικό και κακοήθη κύτταρα τα οποία πυροδοτούν μια σύνθετη απόκριση προφλεγμονωδών χαρακτηρίζεται από την απελευθέρωση της IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α και GM-CSF [ ,,,0],7], [8]. Στη συνέχεια, μια ποικιλία από κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, συμπεριλαμβανομένων των Τ κυττάρων, φυσικών φονικών (ΝΚ) κύτταρα, ουδετερόφιλα, και μακροφάγα μεταναστεύουν στην κύστη, όπου ενεργοποιούνται και παράγουν επιπλέον προφλεγμονωδών κυτοκινών και χημειοκινών [9], [10]. Αυτό χαρακτηρίζεται από την εμφάνιση των διαφορετικών λευκοκυττάρων και κυτοκινών στα ούρα των ασθενών με BCG θεραπεία. Ενώ ο ειδικός ρόλος που παίζουν διάφορους τύπους κυττάρων και κυτοκινών σε θεραπεία καρκίνωμα ουροθηλίου δεν είναι απολύτως σαφής, ακράτεια Th1 κυτοκίνες (

π.χ.

, ΙΡΝγ, IL-2 και IL-12) έχουν συσχετιστεί με την απόκριση BCG , ενώ υψηλά επίπεδα κυτοκινών Th2 (

π.χ.

, IL-10 και IL-6) συσχετίζονται με ανεπάρκεια BCG [9] – [16]. Συνολικά, η ικανότητα του BCG ενδοκυστική να αλληλεπιδρούν με το ουροθήλιο και διεγείρουν ευρύ, ανθεκτικό Th1- ανοσοαποκρίσεων τύπου είναι μάλλον κρίσιμες για την αποτελεσματικότητά του. Ως αποτέλεσμα, έχει προταθεί ότι η προσθήκη ανοσοδιεγερτικών παραγόντων, όπως οι κυτοκίνες, για θεραπεία με BCG θα μπορούσε να αυξήσει αυτές τις ανοσολογικές αποκρίσεις και να παράσχει μεγαλύτερη ή /και πιο ανθεκτικά αποτελέσματα κατά των όγκων. Ωστόσο, μέχρι σήμερα, φάση 3 κλινικές έρευνες της ενδοκυστικής BCG σε συνδυασμό με IL-2 ή ΙΡΝ-α2Β έχουν περιοριστεί με μία μόνο δοκιμή αναφέρονται, η οποία δεν έδειξε όφελος έναντι της μονοθεραπείας BCG [17]. Έτσι, η βέλτιστη στρατηγική για τη μεγιστοποίηση της αποτελεσματικότητας ανοσοθεραπευτική της ενδοκυστική θεραπεία NMIBC κατά πάσα πιθανότητα θα απαιτήσει νέες προσεγγίσεις.

IL-15 είναι ένας κρίσιμος παράγοντας για την ανάπτυξη, τον πολλαπλασιασμό και την ενεργοποίηση των κυττάρων τελεστών φυσικών φονικών και CD8

+ Τ κύτταρα [18], [19] και έχει καταχωρηθεί ως η πλέον υποσχόμενη παράγοντα μεταξύ δώδεκα φάρμακα ανοσοθεραπεία με υψηλό δυναμικό για χρήση στη θεραπεία ανθρώπινων καρκίνων [20]. Έχουμε απομονωθεί πρόσφατα μια νέα IL-15 μεταλλάκτη με μία 4-πλάσια αύξηση σε βιολογική δραστικότητα [21]. Η φαρμακοκινητική (ΡΚ), βιοκατανομή και η βιολογική δραστικότητα αυτού του IL-15 υπεραγωνιστή (IL-15N72D) έχουν βελτιωθεί περαιτέρω μέσω της αλληλεπίδρασης με τη διαλυτή περιοχή του υποδοχέα IL-15 α πρωτεΐνη (IL-15RαSu) για να δημιουργήσει το IL-15N72D /συγκρότημα σύντηξης της IL-15RαSu-Ρο (που αναφέρεται ως ALT-803). Αυτό το συγκρότημα έχει τουλάχιστον 25-φορές το

in vivo

βιολογική δραστικότητα της φυσικής IL-15 [22], [23]. Έχουμε αποδείξει προσφάτως ότι συστημική αγωγή ALT-803 επάγει ανθεκτικά και προστατευτική ανοσολογική μεσολάβηση κυττάρων κατά του όγκου αποκρίσεις σε διάφορα μοντέλα ποντικού για αιματολογικές κακοήθειες [22], [23]. ALT-803 ξεχωρίζει ως ένας ισχυρός ανοσοδιεγερτικό που είναι ικανό ταυτόχρονα ενεργοποιεί τις έμφυτες και προσαρμοστικές βραχίονες του ανοσοποιητικού συστήματος για την πρόκληση τόσο την ταχεία και μακράς διαρκείας προστατευτικές αποκρίσεις έναντι μολυσματικών ή νεοπλασματικών προκλήσεις στον ξενιστή [24].

Παρακινημένος από τα αναγκάζοντας προ-κλινικά δεδομένα που σχετίζονται με την IL-15, ελέγξαμε την θεραπευτική αποτελεσματικότητα της ενδοκυστικής ALT-803 μόνο και σε συνδυασμό με BCG σε μια καλά εδραιωμένη καρκινογόνος τρωκτικών προκαλείται από NMIBC μοντέλο. Συγκεκριμένα, παρατηρήθηκε ότι α) ενδοκυστική ALT-803 ήταν ασφαλής και καλά ανεκτή μόνο και σε συνδυασμό με BCG, β) ALT-803 συν BCG μειωθεί το φορτίο του όγκου κατά 46% σε σύγκριση με τον έλεγχο, η οποία ήταν υψηλότερη από ό, τι με τον κάθε παράγοντα ξεχωριστά, c ανοσολογική παρακολούθηση) πρότειναν ότι η απόκριση κατά του όγκου που παρατηρείται με το συνδυασμό των ALT-803 συν BCG συνδέθηκε με την παραγωγή και έκκριση της IL-1α, IL-1β και RANTES, το οποίο με τη σειρά του, που προκαλείται από τον πολλαπλασιασμό και την ενεργοποίηση των ΝΚ κυττάρων και d ) όγκων αποκρίσεις που παρατηρήθηκαν με τον συνδυασμό ALT-803 και BCG σχετίστηκαν με σημαντική μείωση της αγγειογένεσης. Τα ενθαρρυντικά αποτελέσματα που παρουσιάζονται στην παρούσα έκθεση θα υποστηρίξει την εξέταση μας για την περαιτέρω ανάπτυξη αυτής της νέας θεραπευτικής duplet στη θεραπεία των ασθενών με NMIBC.

Υλικά και Μέθοδοι

Ζώα, αντιδραστήρια, και το μοντέλο όγκου

Ενενήντα θηλυκοί αρουραίοι Sprague Dawley, ηλικίας μικρότερης των έξι έως οκτώ εβδομάδων, ελήφθησαν από Harlan Laboratories (Indianapolis, ΙΝ). φροντίδα των ζώων ήταν σε συμμόρφωση με τις συστάσεις του

Ο Οδηγός για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου

(Εθνικό Συμβούλιο Έρευνας) και έχουν εγκριθεί από τις τοπικές μας IACUC στο Πανεπιστήμιο της Κεντρικής Φλόριντα. Ν-βουτυλο-Ν- (4-υδροξυβουτυλ) νιτροζαμίνης (ΒΒΝ) αγοράστηκε από την TCI America (Portland, OR), κλασματοποιήθηκε και διαλύθηκε σε 1% Tween. ALT-803 (IL-15N72D:IL-15RaSu /Fc) δημιουργήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21] και αραιώνεται με στείρο αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS). PBS χρησίμευσε ως αρνητικός μάρτυρας. Lyophilized BCG αγοράστηκε από την Sanofi Pasteur Limited (Τορόντο, CA) και να ανασυσταθεί σύμφωνα με τις οδηγίες με αποστειρωμένο PBS και χρησίμευσε ως θετικός μάρτυρας. Αφού αφέθηκε ζώα να εγκλιματιστούν στο νοσοκομείο μας για μία εβδομάδα, όλα τα ζώα εκτός από πέντε έλαβαν 0,05% ΒΒΝ στο πόσιμο νερό τους συνεχώς για οκτώ εβδομάδες επαγωγή του σχηματισμού NMIBC, η οποία είναι καρκινογόνος καθιερωμένη τρωκτικό μοντέλο επαγόμενης BCA [25] – [ ,,,0],30] με έντονη μοριακές αλλαγές παρόμοιες με την ανθρώπινη BCA [31]. Μετά από 8 εβδομάδες έκθεσης BBN, των ζώων συνεχίζεται νερό χωρίς την προσθήκη BBN. ​​

Ενδοκυστική θεραπεία

Μετά την BBN έκθεση (εβδομάδα 9), οι αρουραίοι τυχαιοποιήθηκαν σε μία από τις τέσσερις ομάδες θεραπείας (ελέγχου- PBS? ALT-803 σε 1 μg /δόση? BCG στις 1.35 mg /δόση [26], [27], ή ALT-803 σε 1 μg /δόση συν BCG 1.35 mg /δόση). Κάθε ομάδα περιείχε 20 ζώα. Προκαταρκτικά πειράματα με ALT-803 σημείωσε) θεραπευτική αντιμετώπιση με ενδοκυστική δόση 1 μg και β) βελτιωμένη θεραπευτική απόκριση με την ταυτόχρονη χορήγηση του ALT-803 συν BCG σε σύγκριση με την διαδοχική χορήγηση αυτών των δύο παραγόντων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Όλες οι εγχύσεις έγιναν κύστη σε 200 μΙ στείρου PBS. Οι αρουραίοι αναισθητοποιήθηκαν με ισοφλουράνιο τότε ένα αγγειοκαθετήρα Teflon 22-gauge (διουρηθρική καθετήρας) τοποθετήθηκε μέσα στην ουροδόχο κύστη μέσω της ουρήθρας και τα ούρα ήταν εντελώς στραγγισμένο από την ουροδόχο κύστη [32]. Στη συνέχεια, PBS, BCG, ALT-803, ή συνδυασμό θεραπείας ALT-803 συν BCG παραδόθηκε από διουρηθρική ενστάλαξη διαμέσου του καθετήρα διουρηθρική και αφέθηκε να κατοικούν στην κύστη για 1 ώρα με απόφραξη της ουρήθρας με ένα ράμμα κορδόνι πορτοφόλι. Μετά από 1 ώρα, το ράμμα κορδόνι πορτοφόλι αφαιρέθηκε και οι αρουραίοι διεγέρθηκαν να αποβάλλει τα περιεχόμενα της ουροδόχου κύστης [32]. Η ενδοκυστική θεραπεία χορηγήθηκε εβδομαδιαία για ένα σύνολο έξι εβδομάδες για να μιμηθεί ενδοκυστική θεραπεία με BCG σε ανθρώπους [33]. Δύο εβδομάδες μετά την ολοκλήρωση της ενδοκυστικής θεραπείας, τα ζώα θανατώθηκαν και οι ιστοί (

π.χ.

, Πλήρες αίμα, ορός, ούρα, την ουροδόχο κύστη και σπλήνα) συλλέχθηκαν και επεξεργάστηκαν για μετέπειτα ανάλυση. Το σχήμα 1 απεικονίζει το σχήμα της θεραπείας της μελέτης.

Η θεραπεία με PBS, BCG, ALT-803, ή ALT-803 συν BCG άρχισε μία εβδομάδα μετά την ολοκλήρωση της έκθεσης οκτώ εβδομάδων σε 0,05% Ν-βουτυλο-Ν- ( 4 υδροξυβουτυλο) νιτρωδαμίνη στο πόσιμο νερό. Οι αρουραίοι χωρίστηκαν τυχαία σε τέσσερις ομάδες και έλαβαν εβδομαδιαίως για έξι διαδοχικές εβδομάδες σύμφωνα με το πρόγραμμα. Οι αρουραίοι θυσιάστηκαν και υπέστησαν νεκροψία δύο εβδομάδες αργότερα. CTRL, τον έλεγχο.

Η

απεικονιστικές εξετάσεις υπερήχων

Κατά τη διάρκεια της μελέτης, ενδοκυστική φορτίο όγκου παρακολουθήθηκε

in situ από

διακοιλιακό απεικόνισης υπερήχων χρησιμοποιώντας το σύστημα απεικόνισης Vevo 2100 με ένα MS550D 22-55 MHz χειρός MicroScan σειρά μετατροπέα (Visualsonics, Toronto, ON, Καναδάς). Εν συντομία, οι αρουραίοι αναισθητοποιήθηκαν με ισοφλουράνιο τότε 200 μΐ αποστειρωμένου PBS ενσταλλάχθηκε μέσα στην ουροδόχο κύστη, όπως περιγράφεται παραπάνω για να παράσχει μία ομοιόμορφη εικόνα όλων των κύστεις οπτικοποιούνται. Ενδοαυλική παρατηρήθηκαν όγκοι και ψηφιακές εικόνες που έχουν ληφθεί. πάχος της ουροδόχου κύστης τοίχου (σε χιλιοστά), ένα υποκατάστατο του φορτίου του όγκου, μετρήθηκε με τη δυνατότητα μέτρησης Vevo 2100.

ιστοπαθολογία των τμημάτων του όγκου

διαχωρισμένοι κύστεις αρχικά ζύγιζε τότε 12 κύστεις από κάθε ομάδα γέμισαν με 200 μΙ 10% ουδέτερη ρυθμισμένη φορμαλίνη. Οι λαιμοί κύστη συνδέθηκαν και το σύνολο δείγματα τοποθετήθηκαν σε 10% ουδέτερη ρυθμισμένη φορμαλίνη. Ουροδόχο κύστη φορμαλίνη εγκλείστηκαν σε παραφίνη, τεμαχίστηκαν (5 μm) και τοποθετήθηκαν επί Superfrost συν Micro διαφάνειες (Fisher Scientific, Pittsburgh, ΡΑ). Τα υπόλοιπα οκτώ κύστεις σε κάθε ομάδα γέμισαν με 200 μΙ O.C.T. ενσωμάτωση ένωση (Andwin Scientific, Schaumburg, IL) και οι λαιμοί κύστη συνδέθηκαν. Οι κύστες ήταν βυθισμένο σε Tissue-Tek O.C.T. ένωση (Ted Pella, Inc., Redding, CA) σε cryomolds και κατεψυγμένα σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C. Κύστεις κατεψυγμένα σε O.C.T. κόπηκαν σε τομές (5 μm), ζεστάθηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά, σταθεροποιήθηκαν σε παγωμένη μεθανόλη για 10 λεπτά, και πλένονται με PBS πριν από την ανοσοϊστοχημική χρώση. Αποπαραφινοποιήθηκαν και κατεψυγμένα τμήματα από κάθε αρουραίο υποβλήθηκαν σε χρώση αιματοξυλίνης και ηωσίνης για ιστολογική εκτίμηση. Επιπλέον, αποπαραφινοποιήθηκαν πλακίδια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1% υπεροξείδιο υδρογόνου σε 100% μεθανόλη για να εμποδίσει την ενδογενή δραστηριότητα υπεροξειδάσης που ακολουθείται από ανάκτηση αντιγόνου κιτρικό οξύ. Τα πλακίδια επωάστηκαν για μια νύχτα με αντισώματα έναντι CD3

+ (BD Biosciences? G4.18? Μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, αραίωση 1/250), CD8a

+ (BD Biosciences? ΟΧ-8? Μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, αραίωση 1 /10), CD161

+ (AbDSerotec? 10/78? μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, αραίωση 1/100) (ανίχνευση κυττάρων ΝΚ), CD163

+ (AbDSerotec? ED2? μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, αραίωση 1/50) ( ανίχνευση μακροφάγων), Ki-67 (Dakota North America Inc .; ΜΙΒ-5? μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, αραίωση 1/50), ή διασπασμένη κασπάση 3 (Cell Signaling Technology? 5A1E? μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού, αραίωση 1/1 500). Οι κατεψυγμένες τομές επωάστηκαν για μια νύχτα με αντισώματα έναντι CD4

+ (BD Biosciences? ΟΧ-35? Ποντίκι μονοκλωνικό αντίσωμα, αραίωση 1/250) ή CD31 (Santa Cruz Biotechnology? Η3? Μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, αραίωση 1/250). Στη συνέχεια, οι αποπαραφινοποιήθηκαν και παγωμένες τομές επωάστηκαν με βιοτινυλιωμένα αντισώματα αντι-ποντικού ή αντι-κουνελιού IgG (H + L) σε συγκέντρωση 10 μg /ml (Vector Laboratories INC., Burlingame, CA). Στη συνέχεια, οι τομές χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας το Ultra-Ευαίσθητο κιτ χρώσης ABC Mouse IgG (EMD Millipore, Billerica, ΜΑ) ή το κιτ ανοσοχρώση βιοτίνης /στρεπταβιδίνης (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Όλες οι τομές απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα Nikon Eclipse E400 οπτικό μικροσκόπιο (Nikon Inc., Melville, ΝΥ) με την ψηφιακή φωτογραφική μηχανή CCD QIClick (QImaging, Surrey, BC, Καναδάς) και το λογισμικό απεικόνισης της Nikon ΝΙΕ-Στοιχεία βασική έρευνα.

Λεπτομερής ανάλυση ιστοπαθολογικές της νεοπλασματικής απάντηση στην ενδοκυστική θεραπεία διεξήχθη σε κάθε κύστη από δύο έμπειρους, ανεξάρτητους παρατηρητές (MM και AS). Εν συντομία, CD3

+, CD4

+, CD8a

+ Τ-κύτταρα, ΝΚ κύτταρα και μακροφάγα μετρήθηκαν σε τουλάχιστον τέσσερις τυχαία επιλεγμένους τομείς ανά πεδίο υψηλής ισχύος (HPF) σε κάθε δείγμα. Τα αποτελέσματα βαθμολογήθηκαν με υπολογισμό του αριθμού των διηθητικών ανοσοκηλιδώσεως κυττάρων.

Επιπλέον, αγγειογένεση όγκου διερευνήθηκε σε πλακίδια χρωματίστηκαν με αντι-CD-31 μονοκλωνικού αντισώματος και της πυκνότητας μικροαγγείων (MVD, μικροαγγείων /mm

2) ήταν αξιολογείται όπως περιγράφηκε προηγουμένως από Weidner

et al.

[34]. Ενιαία ενδοθηλιακά κύτταρα ή συστάδες των ενδοθηλιακών κυττάρων θετικών για το CD-31 θεωρήθηκαν ως ένα σκάφος. Τέσσερις περιοχές με την υψηλότερη συγκέντρωση των μικροαγγείων από κάθε δείγμα εντοπίστηκαν σε 4 × μεγέθυνση και οι εικόνες ελήφθησαν για την ποσοτικοποίηση του MVD στα 200 ×. Οι δύο ανεξάρτητους παρατηρητές μετρήθηκε ο αριθμός των μικροαγγείων σε ιστολογικές κάθε πεδίο. MVD του δείγματος υπολογίστηκε ως μέσος όρος των πλοίων σε τουλάχιστον τέσσερις ιστολογική πεδία. Επιπλέον, διαφάνειες χρώση με το μονοκλωνικό αντίσωμα που κατευθύνεται έναντι Ki-67 αξιολογήθηκαν πολλαπλασιασμό. Ki-67 ανοσοχρώση μετρήθηκε σε τέσσερα τουλάχιστον τυχαία επιλεγμένα πεδία από κάθε ομάδα θεραπείας στα 200 × μεγέθυνση. Κύτταρα με αμφίβολο πυρηνική χρώση ήταν μειωμένες. Οι παρατηρητές σημείωσε τα αποτελέσματα με αξιολόγηση του ποσοστού των κυττάρων του όγκου που δείχνει τη χαρακτηριστική πυρηνική χρώση (πολλαπλασιαστική δείκτη). Τέλος, η χρώση διαφάνειες με το μονοκλωνικό αντίσωμα που κατευθύνεται έναντι διασπασμένης κασπάσης-3 αξιολογήθηκε απόπτωση. Διασπασμένη κασπάση-3 ανοσοχρώση μετρήθηκε σε ένα ελάχιστο των 3.000 κυττάρων από κάθε ομάδα θεραπείας στα 200 × μεγέθυνση. Οι δύο παρατηρητές δέχεται τα αποτελέσματα με αξιολόγηση του ποσοστού των κυττάρων του όγκου που δείχνει τη χαρακτηριστική κυτταρική χρώση (αποπτωτικό δείκτη).

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των PMBC και σπλήνα για Τ-λεμφοκύτταρα, κύτταρα ΝΚ και μακροφάγα

μονοπύρηνα Rat κύτταρα περιφερικού αίματος που συλλέγονται από δείγματα ολικού αίματος σε σωληνάρια EDTA βάφτηκαν άμεσα με επώαση με σημασμένα με φθορισμό αντισώματα CD3

+ (eBioscience), CD4

+ (BD Biosciences), CD8a

+ (eBioscience) , NKG2D-θετικό (eBioscience) (ανίχνευσης κυττάρων ΝΚ), F480-ΡΕ (eBioscience) (ανίχνευση μακροφάγα), ή τον έλεγχο ισότυπο αντισώματα (eBiosciences, San Diego, CA) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, που ακολουθείται από λύση ερυθρών αιμοσφαιρίων, χρησιμοποιώντας BD λύσης FACS (BD Biosciences, San Jose, CA) σε θερμοκρασία δωματίου για 3-5 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με PBS που περιέχει 1% ορό εμβρύου μόσχου. Βαμμένα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα FACScan κυτταρόμετρο ροής (BD Biosciences) και τα δεδομένα συλλέχθηκαν για 10.000 γεγονότα /δείγμα. Η ανάλυση των δεδομένων που συλλέγονται πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού Cyflogic (CyFlo LTD, Turku, Φιλανδία). Επιπλέον, αιωρήματα απλών κυττάρων σπλήνας των αρουραίων που παράγεται από ήπια ομογενοποίηση του ιστού σε ένα τρυβλίο Petri και στη συνέχεια διέρχεται από ένα ΟΕΕΕεοίΟΓ Tissue κόσκινο (Bellco Glass, Vineland, NJ). Ερυθρά αιμοσφαίρια απομακρύνθηκαν από σπληνοκύτταρα αρουραίου με BD FACS Λύσης με επώαση για 3-5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, που ακολουθείται από φυγοκέντρηση στις 1200 rpm για 5 λεπτά. Τα σφαιροποιημένα σπληνοκύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS που περιέχει 1% ορό εμβρύου μόσχου που ακολουθείται από άμεση χρώση ανοσοφθορισμού όπως περιγράφηκε ανωτέρω.

ουροποιητικού και ορό φλεγμονώδης κυτοκίνη ELISA δοκιμασία

Άκυροι ούρα από κάθε αρουραίο συλλέχθηκε σε ένας σωλήνας σε πάγο που περιέχει ένα συμπυκνωμένο διάλυμα σταθεροποιητή ούρα (2 Μ Tris-HCI [ρΗ 7,6], 5% BSA, 0.1% αζίδιο του νατρίου, και ένα πλήρες μίνι δισκίο αναστολέα πρωτεάσης (Roche Diagnostics, Indianapolis, ΙΝ)). Ούρα φυγοκεντρήθηκαν και το υπερκείμενο φυλάχθηκε στους -80 ° C. Ομοίως, ο ορός συλλέχθηκε σε σωλήνες που περιέχουν EDTA, φυγοκεντρήθηκε στα 10.000 χ g για 15 λεπτά και φυλάχθηκαν στους -20 ° C. Τα δείγματα ούρων και ορού υποβλήθηκαν σε προφίλ της 12ης φλεγμονωδών κυτοκινών χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία ELISA (RAT Cytokine πολλών-αναλυτών ELISArray, SABiosciences, San Diego, CA). Εν συντομία, δείγματα ούρων και ορού επωάστηκαν σε 96 φρεατίων μικροπλάκες επικαλυμμένο με αντι-αρουραίου πρωτογενή αντισώματα έναντι 12 φλεγμονώδεις κυτοκίνες (IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL -12, IL-13, ΙΡΝ-γ, TNF-α, GM-CSF, και RANTES) και κατόπιν αναπτύχθηκε με δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση ραδικιού. Μετά την προσθήκη του υποστρώματος και διαλύματος διακοπής, μια Fluostar Optima Reader (BMG LABTECH, Ortenberg, Γερμανία) χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της απορρόφησης στα 450 nm.

Στατιστικά

Τα πειραματικά δεδομένα εκφράσθηκαν ως μέση τιμή ± SEM , εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Η στατιστική ανάλυση διεξήχθη χρησιμοποιώντας μη-παραμετρικό τεστ Kraskal-Wallis που ακολουθείται από post-hoc τεστ Dunnet για το βάρος της ουροδόχου κύστης, το πάχος τοιχώματος της ουροδόχου κύστης, ανοσοχρώση της ουροδόχου κύστης, του ουροποιητικού κυτοκίνες και κυτοκίνες ορού. Παραμετρικό τεστ ANOVA ακολουθούμενη από δοκιμή post-hoc Bonferroni για πραγματοποιήθηκε για τα δεδομένα που σχετίζονται με τα λεμφοκύτταρα εντός σπλήνα και τα λεμφοκύτταρα μέσα στο περιφερικό αίμα. Ένα

σ

& lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις και τα στοιχεία διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας λογισμικό GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA).

Αποτελέσματα

Η αντικαρκινική δράση του BCG, ALT-803 και ALT- 803 συν BCG σε NMIBC φέρουν αρουραίους

σε μια καρκινογόνος τρωκτικό που προκαλείται μοντέλο NMIBC, η τακτική παρακολούθηση των όγκων έγινε με σειριακή απεικόνιση με υπερήχους με το σύστημα Vevo 1200. Οι όγκοι ήταν ανιχνεύσιμα ήδη 3 εβδομάδες μετά από έκθεση σε 0.05% Ν-βουτυλο-Ν- (4-υδροξυβουτυλο) νιτροζαμίνης στο πόσιμο νερό. Όπως αποδεικνύεται από απεικόνιση υπερήχων και επιβεβαιώθηκε στις ιστολογική εξέταση, το 100% των ζώων που βρέθηκαν να αναπτύξουν όγκους. Κανένα ζώο δεν είχε ψηλαφητό, προηγμένη όγκους. Για να προσδιοριστεί εάν η απεικόνιση υπερήχων θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για να παρακολουθεί και να αξιολογεί το φορτίο του όγκου, κύστεις απεικονίστηκαν και το πάχος του τοιχώματος της ουροδόχου κύστης (ένα υποκατάστατο για το φορτίο όγκου αναφέρονται σε χιλιοστά) προσδιορίστηκε. Ακολούθως κύστες αποκόπηκαν, ζυγίστηκαν και ιστοπαθολογικά εξετάστηκαν. Σημειώσαμε μια θετική συσχέτιση (Spearman R = 0.55,

σ

& lt? 0,0001) μεταξύ του πάχους του τοιχώματος της ουροδόχου κύστης και τα βάρη της ουροδόχου κύστης /όγκου της ουροδόχου κύστης, έτσι έχουμε αναφέρει για πρώτη φορά ότι η μη επεμβατική

in situ

παρακολούθηση των όγκων της ουροδόχου κύστης τρωκτικών μπορεί να χρησιμοποιηθεί για α) την επιβεβαίωση του όγκου πάρει και β) αναφέρουν θεραπευτική μείωση του όγκου-βάρους.

οι αρουραίοι που φέρουν όγκους της ουροδόχου κύστης αντιμετωπίζονται ενδοκυστικά για 6 συνεχόμενες εβδομάδες με PBS, BCG, ALT -803 ή ALT-803 συν BCG. Εκτός από την ελάχιστη αιματουρία σημειωθεί (ίσως από καθετηριασμό ή /και BCG), ενδοκυστική θεραπεία ήταν καλά ανεκτή χωρίς αξιόλογη τοξικότητα σημείωσε.

Σύμφωνα με την ανάπτυξη των

in situ

όγκους, τα βάρη της ουροδόχου κύστης αυξήθηκε κατά 49% σε ζώα που έλαβαν BBN σε σύγκριση με την κανονική (όχι ΒΒΝ) ζώα ελέγχου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, μετά από έξι εβδομάδες ενδοκυστική θεραπεία με BCG, ALT-803 ή ALT-803 συν BCG μείωσε σημαντικά το βάρος του όγκου σε κύστεις των BBN-αγωγή αρουραίων (Εικ. 2). το βάρος της ουροδόχου κύστης (μέση τιμή +/- SEM) αναφέρθηκε να είναι: PBS-0,2 +/- 0.012 γραμμάρια, BCG- 0,17 +/- 0.012 γραμμάρια, ALT-803- 0,15 +/- 0,0091 γραμμάρια και ALT-803 συν BCG- 0.14+ /-0.0054 γραμμάρια. Εκτός του ότι είναι πριν τη θυσία κατά την εβδομάδα 16, 200 μΙ αποστειρωμένου PBS ενσταλλάχθηκε μέσα σε κάθε κύστη να εξασφαλιστεί η ομοιομορφία ως προς το μέγεθος και μία σειρά εγκάρσιων και οβελιαία εικόνων υπερήχων ελήφθησαν. πάχος της ουροδόχου κύστης τοίχου (μέση τιμή +/- SEM) αναφέρθηκε να είναι: PBS-1 +/- 0,11 χιλιοστών, BCG- 0,7 +/- 0,05 χιλιοστών, ALT-803- 0,65 +/- 0,077 χιλιοστά και ALT-803 συν BCG- 0,54 +/- 0,083 χιλιοστά. Έτσι, από αυτές τις εικόνες, σημειώσαμε με τη θεραπεία με BCG μια μείωση κατά 30% της μέσης πάχος του τοιχώματος της ουροδόχου κύστης, η οποία αντιστοιχεί σε μείωση 15% στην αλλαγή του βάρους της ουροδόχου κύστης σε σύγκριση με τη θεραπεία PBS. επεξεργασία ALT-803 μόνος παρατηρήθηκε να έχουν μια μείωση κατά 25% σε μέσο πάχος τοιχώματος της ουροδόχου κύστης και μια αντίστοιχη μείωση 35% στην αλλαγή του βάρους της ουροδόχου κύστης σε σύγκριση με τη θεραπεία PBS. Είναι ενδιαφέρον ότι η μεγαλύτερη μείωση στην τοίχωμα της ουροδόχου κύστης πάχος και την ουροδόχο κύστη βάρος παρατηρήθηκε όταν ALT-803 συνδυάστηκε με BCG οδηγώντας σε μείωση κατά 30% του πάχους του τοιχώματος της ουροδόχου κύστης και αντίστοιχη μείωση κατά 46% της μεταβολής σωματικού βάρους ουροδόχου κύστης σε σύγκριση με τη θεραπεία PBS (Σχ. 2α -2C). Όλα τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν στη συνέχεια από λεπτομερή ιστολογική εξέταση (Σχήμα 2δ.) Στο οποίο H & amp? E-βάφονται τομές στο μικροσκόπιο εξετάστηκαν και ταξινομήθηκαν ως (α) κανονική ουροφόρων βλεννογόνος χαρακτηρίζεται από το επιθήλιο του λιγότερο από τρία στρώματα χωρίς καμία δυσπλασία ή (β) ουροθηλιακό καρκίνωμα [29].

NMIBC προκλήθηκαν σε θηλυκούς αρουραίους Sprague Dawley από την έκθεση σε 0,05% Ν-βουτυλο-Ν- (4-υδροξυβουτυλο) νιτροζαμίνης στο πόσιμο νερό. Την εβδομάδα 9, οι αρουραίοι τυχαιοποιήθηκαν σε μία από τις τέσσερις ομάδες θεραπείας (PBS, BCG, ALT-803, ή ALT-803 συν BCG). Κάθε ομάδα έλαβε εβδομαδιαία ενδοκυστική θεραπεία για έξι συνεχόμενες εβδομάδες. Στις εβδομάδες 16, οι αρουραίοι θυσιάστηκαν. Α) Πριν από την εκτομή της ουροδόχου κύστης, 200 μΙ αποστειρωμένου PBS ενσταλάχθηκε εντός της ουροδόχου κύστης και την απεικόνιση της κύστης εκτελέστηκε με το Vevo 2100 του συστήματος υπερήχων από VISUALSONICS (καθετήρα 22-55 MHz). Το πάχος του τοιχώματος της ουροδόχου κύστης καταγράφηκε σε χιλιοστά. Μη-παραμετρικό τεστ Kraskal-Wallis ακολουθείται από τεστ post-hoc Dunnet του έγινε. Εκπρόσωπος εικόνες από τις τέσσερις ομάδες (

πάνω αριστερά

) μαζί με μέσο πάχος τοιχώματος της ουροδόχου κύστης (

πάνω δεξιά

) απεικονίζονται. Β) οι διαχωρισμένοι κύστες σταθεροποιήθηκαν σε 10% ρυθμισμένη φορμαλίνη και εγκλείστηκαν σε παραφίνη και εν συνεχεία χρωματίσθηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη. Λεπτομερής ιστοπαθολογική εξέταση κάθε κύστη διεξήχθη για να αξιολογηθεί το φορτίο του όγκου. Αντιπροσωπευτικά εικόνες από τις τέσσερις ομάδες που απεικονίζονται. Η μεγαλύτερη μείωση στο φορτίο όγκου της ουροδόχου κύστης παρατηρήθηκε σε ALT-803 και ALT-803 συν BCG. Γ) το πάχος της ουροδόχου κύστης τοίχο μειώθηκε στις ομάδες που έλαβαν θεραπεία με ALT-803, BCG και ALT-803 συν BCG σε σύγκριση με τον έλεγχο. Μεγαλύτερη μείωση του πάχους του τοιχώματος της ουροδόχου κύστης παρατηρήθηκε στην ομάδα που έλαβε αγωγή με ALT-803 και ALT-803 συν το BCG (

σ

= 0,0001). βάρος D) της ουροδόχου κύστης μειώθηκε στις ομάδες που έλαβαν θεραπεία με BCG μόνο, ALT-803 μόνο και ALT-803 συν BCG σε σύγκριση με τον έλεγχο. Μεγαλύτερη μείωση του βάρους της κύστης παρατηρήθηκε στην ομάδα που υπέστη αγωγή με ALT-803 συν BCG. *,

σ

& lt? 0,05, **,

σ

& lt? 0,01, ***

σ

& lt?. 0.001

Η

Ενδοκυστική ALT-803 συν το BCG προωθεί ένα μοναδικό λεμφοκυτταρικής διήθησης

Οι κύστεις των αρουραίων που έλαβαν θεραπεία επίσης βάφτηκαν για ανοσοποιητικών κυττάρων (CD3

+, CD4

+, CD8a

+ Τ-κύτταρα , κύτταρα και μακροφάγα ΝΚ) διηθήσεις (Σχ. 3 και πίνακα S1). Ο αριθμός των CD3

+ Τ-κύτταρα ήταν σημαντικά αυξημένη σε ALT-803 μόνος σύγκριση με PBS και BCG μόνο. Συνδυασμός ALT-803 συν BCG δεν βελτιώθηκαν από τον αριθμό των διηθητικών CD3

+ Τ-κύτταρα σε σύγκριση με μονοθεραπεία ALT-803, αλλά σε σύγκριση με BCG μόνο του, τον αριθμό των διηθητικών CD3

+ Τ-κυττάρων ήταν σημαντικά υψηλότερη στην ομάδα συνδυασμού. CD4

+ Τ- κύτταρα δεν επηρεάστηκαν σε οποιαδήποτε ομάδα σε σύγκριση με PBS (

δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα

). CD8a

+ Τ-κύτταρα ήταν σημαντικά αυξημένα σε BCG μόνο, ALT-803 μόνο και ALT-803 συν BCG σε σύγκριση με PBS. Ο συνδυασμός της ALT-803 και BCG δεν έχουν μεγαλύτερη επίδραση από BCG μόνο του ή ALT-803 μόνο. Στη συνέχεια, ο αριθμός των ΝΚ κυττάρων δεν αυξήθηκε σε BCG μόνο του ή ALT-803 μόνος σύγκριση με PBS, αλλά ο αριθμός των ΝΚ κυττάρων αυξήθηκε όταν ALT-803 προστέθηκε σε BCG. Επιπλέον, ο συνδυασμός της ALT-803 συν BCG οδήγησε σε αυξημένη διηθητικά κύτταρα ΝΚ συγκριτικά με BCG μόνο του ή ALT-803 μόνο. αλλάζει κανένας σημαντικά σε διήθηση των μακροφάγων παρατηρήθηκαν σε κάθε ομάδα θεραπείας.

καρκινική διήθηση των κυττάρων που είναι θετικά για CD3

+, CD8a

+, CD161 (ΝΚ κυττάρων), ή CD163 (μακροφάγων) (200 ×) παρατηρήθηκαν. Καμία αλλαγή δεν σημειώθηκε στην CD4

+ Τ-κύτταρα (

δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα

). ALT-803 ως μονοθεραπεία αύξησε τις καρκινικές CD8a

+ κυττάρων που εκφράζουν, ενώ ALT-803 συν BCG αυξημένη καρκινικών έκφραση των κυττάρων ΝΚ (Βλέπε Πίνακα S1).

Εισαγωγή

, αριστερό πάνελ θετικός έλεγχος από σπλήνα αρουραίου και δεξιά του πίνακα αρνητικού ελέγχου από σπλήνα αρουραίου χωρίς πρωτογενές αντίσωμα.

Η

PBMC σε όλο το αίμα από αρουραίους που έλαβαν θεραπεία για το πρωτόκολλο αυτό συλλέχθηκαν αμέσως μετά τα ζώα θυσιάστηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για την παρουσία CD3

+, CD4

+, CD8a

+ Τ-κύτταρα, NKG2D-θετικά κύτταρα και μακροφάγα. Δεν αξιοσημείωτες μεταβολές παρατηρήθηκαν για CD3

+ και CD4

+ Τ-κύτταρα, ενώ CD8a

+ Τ-κύτταρα παρατηρήθηκαν να είναι σημαντικά αυξημένα μόνο στην ομάδα της μονοθεραπείας BCG. Όλες οι ομάδες (BCG μόνο, ALT-803 μόνο και ALT-803 συν BCG) έδειξαν σημαντική αύξηση στο NKG2D-θετικά κύτταρα σε σύγκριση με το μάρτυρα. Τέλος, ο αριθμός των κυκλοφορούντων μακροφάγων ήταν σημαντικά μειωμένη σε μόνος ALT-803 και ALT-803 συν BCG, αλλά όχι σε BCG μόνο (Σχ. 4α). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν από την ανάλυση των σπληνικών ιστούς αρουραίου. Συγκεκριμένα, δεν αξιόλογες μεταβολές παρατηρήθηκαν με CD3

+, CD4

+ και CD8a

+ Τ-κύτταρα ανάμεσα στις ομάδες θεραπείας. Ωστόσο, ο αριθμός των NKG2D-θετικών κυττάρων ήταν σημαντικά αυξημένη στις σπλήνες από αρουραίους σε όλες τις ομάδες (BCG, ALT-803 και ALT-803 συν BCG) σε σύγκριση με τον έλεγχο. Συνδυασμός ALT-803 συν BCG δεν σημειωθεί μια αύξηση του αριθμού των NKG2D-θετικών κυττάρων σε σύγκριση με BCG μόνο του ή ALT-803 μόνο. Επιπλέον, ο αριθμός των μακροφάγων εντός του σπλήνα μειώθηκε σημαντικά σε ALT-803 μόνος όταν συγκρίθηκε με PBS και BCG μόνο. Ο αριθμός των μακροφάγων επέστρεψαν στα αρχικά επίπεδα όταν ALT-803 προστέθηκε με BCG (Εικ. 4β). Αυτά τα δεδομένα παρέχουν πειστικές αποδείξεις ότι ο συνδυασμός ALT-803 συν BCG σχετίζεται με τη διέγερση του NKG2D-θετικών κυττάρων, που ήταν πιθανόν ο τελεστής κύτταρο μεσολαβούν υποχώρηση του όγκου κατά τη διάρκεια της ενδοκυστικής συνδυασμός ανοσοθεραπεία.

Α) Περιφερική μονοπύρηνα κύτταρα (PBMC) απομονώθηκαν και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής για έκφραση του CD3

+, CD4

+, CD8a

+ Τ-κύτταρα, NKG2D- θετικό (κύτταρα ΝΚ) και κύτταρα έκφρασης F480 (μακροφάγα). ALT-803 μόνο του, καθώς επίσης και, ALT- 803 συν BCG ως αποτέλεσμα την αύξηση σε NKG2D-θετικά κύτταρα και μία μείωση σε μακροφάγους σε σύγκριση με το PBS. Β) Σπληνοκύτταρα απομονώθηκαν και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής για έκφραση του CD3

+, CD4

+, CD8

+, NKG2D-θετικά και F480 κύτταρα έκφρασης. Παρόμοια με τα αποτελέσματα PBMC, ALT-803 μόνο του, καθώς επίσης και, ALT-803 συν BCG είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση των NKG2D- θετικά κύτταρα και μία μείωση σε μακροφάγους σε σύγκριση με το PBS. *,

σ

& lt? 0,05, **,

σ

& lt? 0,01, ***

σ

& lt?. 0.001

Η

ενδοκυστική χορήγηση ALT-803 συν BCG διευκολύνεται μοναδικό προφίλ κυτοκινών

οι οροί από αρουραίους που έλαβαν θεραπεία για το πρωτόκολλο αυτό συλλέχθηκαν και αποθηκεύονται αμέσως στους -80 ° C. Για την ανάλυση κυτοκίνης, τα δείγματα ορών αποψύχθηκαν και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ανάλυση με τον αρουραίο φλεγμονώδεις κυτοκίνες πολλών-αναλυτών δοκιμασία ELISArray. Μαζί με τον πολλαπλασιασμό και την ενεργοποίηση των ΝΚ κυττάρων σημειώνεται παραπάνω, η ενδοκυστική χορήγηση της ALT-803 σε συνδυασμό με BCG ήταν σχετίζεται με αυξημένα επίπεδα στον ορό των φλεγμονωδών και ανοσολογικών κυτοκίνες απόκριση, IL-1α και IL-1β κατά 52% και 52%, αντίστοιχα, σε σύγκριση με εκείνη της ομάδας ελέγχου PBS. Επιπλέον, η αύξηση σε IL-1α και IL-1β διατηρήθηκε όταν ALT-803 συν BCG συγκρίθηκε με BCG μόνο και ALT-803 μόνο (Σχ. 5α). Στη συνέχεια, τα ούρα από αρουραίους στους οποίους χορηγήθηκε για το πρωτόκολλο αυτό συλλέχθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C αμέσως μετά τα ζώα θανατώθηκαν. Όταν είναι έτοιμο για ανάλυση, τα δείγματα ούρων αποψύχθηκαν και υποβλήθηκαν σε αρουραίο φλεγμονώδεις κυτοκίνες πολλών-αναλυτών δοκιμασία ELISArray. Για άλλη μια φορά, οι κυτοκίνες, IL-1α, IL-1β και RANTES αυξήθηκαν κατά 437%, 437% και 196%, αντίστοιχα, στα ούρα της ALT-803 συν αρουραίων που έλαβαν BCG σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου PBS.